Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Semaforiinien (SEMAs) koostuvat suuren perheen eritetyn ja kalvoon ankkuroitua proteiineja, jotka ovat tärkeitä hermosolujen Polunetsintä ja aksoniohjauksen valituilla alueilla kehittyvälle hermostolle . Niistä SEMA7A on raportoitu olevan kemotaktinen aktiivisuus neurogenesis ja olla immunomodulaattori; kuitenkin tiedetään vain vähän merkitystä SEMA7A in käyttäytymistä suun okasolusyöpä (OSCC).

Methods

Kartoitimme SEMA7A ilmentymistä OSCC solulinjat ja ensisijainen OSCC näytteitä kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio, immunoblottaus, ja semikvantitatiivinen immunohistokemia (sq-IHC). Lisäksi, SEMA7A pudotus solut (shSEMA7A solut) käytettiin toiminnallisia kokeita, mukaan lukien solujen proliferaatio, invasiivisuus ja siirtyminen määritykset. Olemme myös analysoineet kliininen korrelaatio SEMA7A tilan ja kliinisen käyttäytymistä potilailla, joilla OSCC.

Tulokset

SEMA7A mRNA ja proteiini oli säädelty merkitsevästi (P ​​ 0,05) OSCC solulinjat verrattuna ihmisen normaalia suun keratinosyyttien. ShSEMA7A solut osoittivat laski solujen kasvua solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa johtuvat säätely ylöspäin sykliiniriippuvaisen estäjät (p21

CIP1 ja p27

Kip1) ja alas-säätely Sykliinien (sykliini D1 sykliini E) ja sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK2, CDK4 ja CDK6); ja laski invasiivisuus ja muuttoliikettä toiminnan erityksen väheneminen matriksimetalloproteaaseja (MMP) (MMP-2, proMMP-2, pro-MMP-9), ja ilmaus kalvon tyypin 1- MMP (MT1-MMP). Olemme myös löytäneet inaktivointi solunulkoisen säänneltyjen kinaasi 1/2 ja AKT polkuja, ylävirran molekyyli solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa, ja erityksen väheneminen MMP: iden shSEMA7A soluissa. sq-IHC osoitti, että SEMA7A ilmaisua ensisijainen OSCCs oli merkitsevästi (P ​​= 0,001) suurempi kuin normaalissa kollegansa ja korreloi ensisijaisen kasvaimen koko (P = 0,0254) ja alueelliset imusolmuke etäpesäke (P = 0,0002).

Johtopäätös

Tuloksemme antaa näyttöä keskeinen rooli SEMA7A vuonna tuumorien kasvua ja etäpesäkkeiden OSCC ja ilmoitti, että SEMA7A voi olla potentiaalinen diagnostinen /terapeuttinen kohde käytettäväksi potilailla, joilla OSCC.

Citation: Saito T, Kasamatsu A, Ogawara K, Miyamoto I, Saito K, Iyoda M, et al. (2015) Semaphorin7A edistäminen Kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden Human Oral Cancer asetuksella G1 Cell Cycle ja Matrix Metalloproteaasit: Mahdollista Osuus Kasvaimen angiogeneesi. PLoS ONE 10 (9): e0137923. doi: 10,1371 /journal.pone.0137923

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2015 Hyväksytty: 23 elokuu 2015; Julkaistu: 17 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Saito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Semaforiinien (SEMAs), erittynyt ja kalvoon liittyvien proteiinien, tarjoavat ympäristön ärsykkeille sovitella erilaisia ​​kehitysprosesseja lukien hermosolujen solumigraatiota, aksoniohjauksen, vaskulogeneesiä haarautumisineen morphogenesis, ja sydämen organogeneesiin [1]. SEMA poikkeavuuksia on patogeneesiin neurologisten häiriöiden, kuten Alzheimerin taudin ja liikehermosolusairaudet rappeuma. SEMAs myös ilmaistaan ​​immuunivasteen, mukaan lukien B-solujen, T-solujen, luonnollisten tappajasolujen, ja makrofagit, ja on osallisena säätelyssä organogeneesin, angiogeneesi, apoptoosi, ja neoplasia [2].

SEMA1 -8 on tunnusomaista, että läsnä on konservoitunut suuri sema verkkotunnuksen (~500 aminohappoa) N-terminaalinen domeeni ja jotka eroavat toisistaan ​​C-päähän [3]. SEMA1 ja SEMA2 löytyy elävistä SEMA3-7 löytyy selkärankaisten, ja SEMA8 löytyy virusten [4]. SEMA4-7 olemassa pääasiassa membraaniin sitoutuneet muodot, kun taas SEMA3 erittyy liukoisen molekyylin. Diffusible SEMAs voi saada autokriininen /parakriininen signalointi, kun taas kalvoon sitoutuneita perheenjäsenet voivat välittää lyhyen kantaman juxtacrine signaaleja.

Vaikka syöpäsolut tyypillisesti ilmentävät epätavallisen korkeat SEMAs, rooli SEMA7A syövän etenemisessä ei juuri tunneta. SEMA7A, uusi transmembraaninen glycosylphosphatidylinisotol-ankkuroitu proteiini, tunnistettiin ensimmäistä kertaa immuunijärjestelmän ydinsoluissa ja Imusukuisten solut [5-7] ja toiminnot kautta β-integriinien useissa järjestelmissä [8]. Esitämme tulokset kattavan analyysin molekyyli- /solu alatyyppejä SEMA7A suun levyepiteelisyöpä (OSCC), jotka on linkitetty toiminnallisesti ja edistää kliinisesti kasvaimen etenemisen ja ennusteen OSCCs.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen

Eettinen komitea Graduate School of Medicine, Chiba University (hyväksymisnumero, 236) hyväksynyt tutkimussuunnitelman, joka suoritettiin mukaisesti opinkappaleisiin Helsingin julistuksen. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoisen suostumuksensa.

OSCC solulinjat ja kudosnäytteiden

Ihmisen OSCC solulinjat (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Sa3, Ca9- 22, SAS, KOSC-2, Ho-1-u-1, ja Ho-1-N-1) saatiin Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japani) tai RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japani) kautta National Bio-Resource projekti opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology Japanissa. Lyhyt tandem repeat profiilit vahvisti solun identiteetti. Ensisijainen viljellyissä ihmisen normaalia suun keratinosyyttejä (HNOKs) saatiin terveiltä suun limakalvon epiteelin kerätyt näytteet nuorten potilaiden Chiba University Hospital. Kolme riippumatonta HNOKs olivat ensisijainen viljeltiin ja ylläpidettiin suun keratinosyyttien väliaineessa (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), joka koostuu 5 ml: n suun kautta keratinosyyttien kasvun täydennysosa (ScienCell Research Laboratories) ja 5 ml penisilliini /streptomysiiniä liuosta (ScienCell Research Laboratories) [9-12]. Kaikki OSCC johdettuja soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Sigma-Aldrich) ja 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä (Sigma-Aldrich).

sata ja viisikymmentä ensisijainen OSCC näytteitä ja potilaan vastaaviin normaaleihin epiteelin saatiin leikkausten aikana suoritetaan Chiba University Hospital. Resektoitua kudokset fiksattiin 20% puskuroidussa formaldehydiliuosta patologista diagnoosin ja immunohistokemia (IHC) värjäys. Suoritimme histopatologinen diagnoosi jokaisen OSCC näytteen mukaan Maailman terveysjärjestön kriteerien patologian osaston Chiba University Hospital [13]. Kliinis vaiheet määritettiin perustuen TNM luokittelu International Union syöpää vastaan ​​[14].

mRNA: n ilmentymisen analyysi

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA synnytettiin käyttäen ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo Life Science, Osaka, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden. Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiolla (qRT-PCR) suoritettiin 20 ul: n reaktiotilavuudessa käyttäen Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo) on LightCycler 480 laitetta (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Yleinen monistusolosuhteita suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15-18]. Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer 3Plus (on-line ilmainen ohjelmisto, https://primer3plus.com/), joka määrittää sopivimmat asetettu. Aluke sekvenssejä käytetään qRT-PCR olivat:

SEMA7A

, eteenpäin, 5′-TGTGTATTCCCTCGGTGACA-3 ’; käänteinen, 5’-GAGTGGAACAATGGCGTCTT-3 ’; ja

glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin

(

GAPDH

), eteenpäin, 5′-AACATCATCCCTGCCTCTACTGG-3 ’; käänteinen, 5’-TTGAAGTCAGAGGAGACCACTG-3 ’; ja

MMP2

, eteenpäin, 5′-CCCCAAAACGGACAAAGAG-3 ’; käänteinen, 5’-CTTCAGCACAAACAGGTTGC-3 ’; ja

MMP-9

, eteenpäin, 5′-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 ’; käänteinen, 5’-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 ’; ja

kalvotyyppi 1- MMP

(

MT1-MMP

), eteenpäin, 5′-GCCTTGGACTGTCAGGAATG-3 ’; käänteinen, 5’-AGGGGTCACTGGAATGCTC-3 ’. Otteen määrä SEMA7A arvioitiin asiaa koskevaa standardia käyrät ja normalisoitiin

GAPDH

transkriptio määritetyn määrän, joka vastaa näytteistä.

Immunoblottausmääritys analyysi

Solut pestiin kolme kertaa kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja varovasti ja sentrifugoitiin lyhyesti. Solujen pelletit inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuuttia lyysipuskurissa (7 M urea, 2 M tioureaa, 4% paino /tilavuus CHAPS, 10 mM Tris, pH 7,4), jossa on proteinaasinestäjä cocktail (Roche Diagnostics). Koko proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä väriainetta sitovaa menetelmää, joka perustuu Bradfordin menetelmällä Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Protein-uutokset ajettiin elektroforeesissa 4-12% bis-Tris geelillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Invitrogen) ja blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa estäminen Yksi (Nacalai Tesque, Inc., Kioto, Japani). Membraanit pestiin kolme kertaa 0,1% Tween-20: Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS-T) ja inkuboitiin affiniteettipuhdistetun hiiren anti-SEMA7A monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin anti- GAPDH polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-sykliini D1 polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-sykliini E1 polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-p21

CIP1 polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) , kanin anti-AKT polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti fosforyloidun-AKT (Pakt) polyklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti kalvotyyppi-1 matriisin metalloproteinaasi (MT1-MMP) monoklonaalinen vasta-aine (Cell Signaling Technology , Danvers, MA, USA), kanin anti-ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) 1/2 (Cell Signaling Technology), kanin anti-fosforyloitu-ERK1 /2 (pERK1 /2) (Cell Signaling Technology), kanin anti P27

Kip1 polyklonaalista vasta-ainetta (Cell Signaling Technology), kanin anti-sykliini-riippuvaisen kinaasin (CDK) 2 monoklonaalinen vasta-aine (Cell Signaling Technology), kanin anti-CDK4 monoklonaalinen vasta-aine (Cell Signaling Technology), ja kanin anti-CDK6 monoklonaalinen vasta-ainetta (Cell Signaling Technology) yön yli 4 ° C: ssa. Membraani pestiin TBS-T: n ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani tai anti-hiiri-IgG kuin sekundaarisen vasta-aineen (Promega, Madison, WI, USA), 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi kalvot havaittiin käyttäen Super-Signal West Pico Chemiluminescent alustan (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), ja immunoblottaus tehtiin näkyväksi valottamalla kalvojen ChemiDoc XRS Plus-järjestelmä (Bio-Rad Laboratories). Signaalin voimakkuudet määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen Image Lab järjestelmä (Bio-Rad Laboratories). Densitometristä SEMA7A proteiini data normalisoitiin GAPDH-proteiinin tasot.

Transfektio shRNA plasmidilla

OSCC peräisin olevia soluja (SAS ja KOSC-2) transfektoitiin SEMA7A shRNA (shSEMA7A) tai kontrolli shRNA ( shMock) vektoreita (Santa Cruz Biotechnology) kanssa Lipofectamine 3000 ja Plus reagenssit (Invitrogen), mukaan valmistajan ohjeiden. Transfektion jälkeen solut eristettiin viljelmän elatusainetta, joka sisälsi 1 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen). Useita viikkoja transfektion jälkeen, pieni pesäke oli elinkelpoinen. Solu pesäkkeitä poimittiin, siirrettiin kuusi-kuoppalevyille, ja laajentaa vähitellen 10 cm ruokia. Arvioida tehokkuuden SEMA7A Knockdown, suoritimme qRT-PCR ja immunoblottauksella.

Cellular kasvu

vaikutuksen arvioimiseksi SEMA7A Knockdown on soluproliferaatioon analysoimme solujen kasvua shSEMA7A ja shMock solujen . Nämä solut ympättiin 6-cm: n maljoihin tiheydellä 1 x 10

4 elävää solua. Tällä ilmoitettuina ajankohtina solut trypsinoitiin ja laskettiin kolmena kappaleena hemosytometrillä.

invasiivisuus määritys

vaikutuksen arvioimiseksi SEMA7A Knockdown on invasiivisuus, yhteensä 2,5 x 10

5-solut suspendoitiin uudelleen seerumia ympättiin Matrigelillä

®-pinnoitettu Transwell

® insertit (8 um huokosia) (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Alemmassa kammiossa, 2 ml DMEM 10% FBS lisättiin kemoattraktantti. Sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa, insertti pestiin PBS: llä, ja soluja päällä sisäkkeen poistettiin vanutupoilla. Solut kiinni alapinnan kalvon kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Solujen lukumäärä, jotka tunkeutuivat huokosten läpi viisi satunnaista kenttää laskettiin valomikroskoopilla on x 100 suurennuksella.

Migration määrityksessä

Solut siirrostettiin kuuteen-kuoppalevyillä 10% FBS /DMEM, kunnes yksisolukerros on muodostettu. Mikropipetin avulla kärki, yksi haava luotiin keskelle jokaiseen levyyn. Me inkuboitiin levyillä 37 ° C: ssa 5% hiilidioksidia free-seerumiväliaineessa. Tulokset visualisoitiin mittaamalla haava-alue, joka oli vapaa-soluihin käyttäen Lenaraf220b ohjelmiston (https://www.vector.co.jp/soft/dl/win95/art/se312811.html). Keskiarvo laskettiin saadut kuusi kuoppaa.

Cell-syklin analyysi

transmutants käsiteltiin 200 ng /ml nokodatsoli (Sigma-Aldrich) 16 tuntia synkronoida solujen G2 /M siirtyminen [19-21]. Kuusitoista tuntia hoidon jälkeen nokodatsoli, solut kerättiin, pestiin PBS: llä, ja koettimena CycleTEST Plus DNA reagenssipakkauksen (Becton-Dickinson). Virtaussytometristä DNA: n määrittämisen pitoisuus analysoitiin käyttämällä BD Accuri

TM C6 -virtaussytometrillä (Becton-Dickinson).

Zymografia

havaitsemiseksi erittyy MMP päässä shSEMA7A ja shMock soluja, toteutimme gelatiinitsymografialla määritys (Ensisijainen Cell, Sapporo, Japani), mukaan valmistajan ohjeiden vähäisin muutoksin. Esikäsitelty väliaine sekoitettiin SDS-näytepuskurissa ja erotettiin gelatiinigeelejä. Pesun jälkeen geelit inkuboitiin 32 tuntia 37 ° C: ssa entsymaattisen reaktion puskuriin. Geelit sitten värjättiin Coomassie brilliant blue ja väri poistettiin metanoli /etikkahappoliuos varovasti sekoittaen on tärisevän levyn. MMP: t tunnistettiin läsnäolo selkeä letityskuminauhaa tausta yhtenäinen värjäys.

Sykloheksimidi (CHX) käsittely

CHX, yhteinen reagenssi esto proteiinisynteesiä, on raportoitu inaktiivisiksi MMP-toiminnot. Koska useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Ki on CHX vaihtelee 1-50 ug /ml [22-27], käytimme CHX (WAKO, Osaka, Japani) pitoisuutena 1 ug /ml 48 tunnin ajan. Hoidon jälkeen immuuniblottausanalyysi ja zymografialla tehtiin.

Transient ylössäätöä in SEMA7A pudotus soluissa

Tuoreessa tutkimuksessa on raportoitu, että TGF-β

1 (R 1+, heikko; 2+, kohtalainen; ja 3+, voimakas. Värjäytymisintensiteettiä ja solujen lukumäärät kerrotaan tuottaa SEMA7A sq-IHC pisteet. Määrittämään raja kohtia SEMA7A m²-IHC tulokset, analysoimme m²-IHC tulokset 150 käyttävistä potilaista vastaanotin toimii (ROC) käyriä ja Youdenin indeksin. Tapaukset, joiden pistemäärä yli 69,5 määriteltiin SEMA7A-positiivisia. Kaksi itsenäistä patologia Chiba University Hospital, joista kumpikaan ei ollut tietoa potilaiden kliininen tila, teki nämä tuomiot. Laskea 5 vuoden pysyvyys, me kartoitettiin kunkin potilaan elämän ja kuukausi kuoleman.

Tilastollinen

Jos haluat vertailla SEMA7A ilmentymisen tasoja, tilastollista merkittävyyttä arvioitiin käyttämällä U-testi . Väliset suhteet SEMA7A sq-IHC värjäys tulokset ja kliinis profiilit arvioitiin käyttämällä χ

2 testiä, Fisherin testiä, Studentin t-testi, ja U-testi. 5 vuoden pysyvyys arvioitiin käyttämällä log-rank-testi. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

Tulokset

arviointi SEMA7A ilmentymisen OSCC solulinjat

tutkimiseksi ilmentymisen tila SEMA7A, suoritimme qRT-PCR: llä ja immunoblot -analyysejä käyttämällä yhdeksän OSCC solulinjat (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Sa3, Ca9-22, SAS, KOSC-2, Ho-1-u -1, ja Ho-1-N-1) ja HNOKs.

SEMA7A

mRNA säädelty merkittävästi (P ​​ 0,05) kaikissa OSCC solulinjat verrattuna HNOKs (kuvio 1A). Olemme myös suorittaa immunoblottauksella analyysi tutkia SEMA7A proteiinin ilmentymistä OSCC solulinjat ja HNOKs (kuvio 1B). Merkittävä kasvu SEMA7A proteiinin ekspressio havaittiin kaikissa OSCC solulinjat verrattuna HNOKs.

(A) kvantifiointi

SEMA7A

mRNA: n ekspression OSCC solulinjat mukaan qRT- PCR-analyysillä. Merkittävät (

✽P 0,05, Studentin t-testi) säätely ylöspäin

SEMA7A

mRNA nähdään seitsemän OSCC solulinjat verrattuna HNOKs. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmena kappaleena tuloksia. (B) Immunoblottaus analyysi SEMA7A proteiinin OSCC solulinjat ja HNOKs. SEMA7A proteiinin ilmentyminen on säädelty vahvistavasti OSCC solulinjat verrattuna että HNOKs. Densitometrinen SEMA7A proteiini Aineisto on normalisoitu GAPDH-proteiinin tasoja. Arvot on ilmaistu prosentteina HNOKs.

perustaminen SEMA7A pudotus solujen

Koska usein säätely ylöspäin SEMA7A havaittiin OSCC peräisin olevia soluja (kuvio 1), transfektoimme SEMA7A shRNA tai shMock in OSCC peräisin olevia soluja (SAS ja KOSC-2). Tutkia SEMA7A mRNA: ta ja proteiinia ilmaisuja shSEMA7A soluissa, qRT-PCR ja immunoblottauksella analyysit suoritettiin (kuvio 2A ja 2B).

SEMA7A

mRNA: n ekspression shSEMA7A soluissa oli merkittävästi (P ​​ 0,05) alempi kuin shMock soluissa (kuvio 2A). SEMA7A proteiinin taso shSEMA7A soluissa oli myös vähentynyt verrattuna shMock-soluissa (kuvio 2B).

(A) ilmentyminen

SEMA7A

mRNA: shMock ja shSEMA7A soluja (SAS ja KOSC-2 -johdannainen transfektantit).

SEMA7A

mRNA ilmentyminen shSEMA7A soluissa on merkittävästi (

✽P 0,05, Studentin t-testi) vähemmän kuin shMock soluissa. (B) Immunoblottaus analyysi osoittaa, että SEMA7A proteiinipitoisuuden lasku shSEMA7A soluissa myös vähenevät merkittävästi verrattuna shMock soluihin.

Functional analyyseistä SEMA7A pudotus solujen

vaikutuksen tutkimiseksi of SEMA7A pudotus on soluproliferaatioon me seurataan solujen kasvua 168 tuntia. Cellular kasvu shSEMA7A solujen vähentynyt merkittävästi (P ​​ 0,05) verrattuna shMock-soluissa (kuvio 3A). Olemme myös suorittaa solujen invasiivisuus ja muuttoliike määrityksiä arvioimaan biologisia vaikutuksia SEMA7A knockdown soluja. Eräässä invasiivisuus määrityksessä, määrä läpäisemään shSEMA7A solujen merkittävästi (P ​​ 0,05) vähentynyt verrattuna shMock-soluissa (kuvio 3B). Vuonna migraatiokokeessa, kun visuaalisesti seurata alueen yhtenäinen haavojen konfluenteissa soluviljelmässä, haavat on shSEMA7A soluissa kiinni merkitsevästi (P ​​ 0,05) myöhemmin kuin niille shMock soluissa (kuvio 3C). Siksi shSEMA7A solut osoittivat paitsi vähentynyt soluproliferaatiota vaan myös vähentynyt invasiivisuus ja muuttavien kykyjä.

(A) Solujen lisääntyminen määritystä shMock ja shSEMA7A soluja (SAS ja KOSC-2-johdetun transfektantit). Sen vaikutuksen määrittämiseksi shSEMA7A on solujen lisääntymisen, shMock ja shSEMA7A-soluja siirrostettiin 6 cm: n maljoille tiheydessä 1 x 10

4 elävää solua /kuoppa. Solujen kasvun shSEMA7A solujen estyy merkittävästi verrattuna shMock soluissa, sen jälkeen 4 päivää (96 tuntia). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM-arvot kolmesta määritykset (

✽P 0,05, Studentin t-testi). (B) invasiivisuus määritystä shMock ja shSEMA7A soluja (SAS ja KOSC-2-johdetun transfektantit). Arvioidaan vaikutus SEMA7A Knockdown on invasiivisuus, jaoimme 2,5 × 10

5 solut seerumivapaassa väliaineessa matrigeelin

®-pinnoitettu TranswellTM

® insertit (8 um huokosia) ja lisätään seerumi täydennetty väliaine alemmassa kammiossa kuin kemoattraktantti. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan, solut, jotka tunkeutuivat huokosten läpi kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin valomikroskoopilla on x 100 suurennuksella. Lukumäärä shSEMA7A solujen läpäisemään huokosten vähentynyt merkittävästi (

✽P 0,05, Studentin t-testi) verrattuna shMock soluihin. Keskiarvo laskettiin saadut kolme erillistä kammiota. (C) Migration määritystä shMock ja shSEMA7A soluja (SAS ja KOSC-2-johdetun transfektantit). Arvioidaan vaikutus SEMA7A Knockdown muuttoliikettä, yhtenäinen haavat tehtiin konfluentteja viljelmiä ja shSEMA7A ja shMock solut ja laajuudesta päättämisen tarkkailtiin visuaalisesti joka 6. tunti 12 tunnin ajan. Keskiarvo laskettiin saadut kolme erillistä kammiota. Haava-alue on pienentynyt merkittävästi (

✽P 0,05, Studentin t-testi) kulttuurissa shMock solujen 12 tunnin kuluttua, kun taas aukko jäi shSEMA7A soluissa.

solu- sykli analyysi shSEMA7A solujen

Koska matkapuhelinjärjestelmä kasvua SEMA7A pudotus solut vähenivät (kuvio 3A), tutkimme solusyklin jakaumat virtaussytometriaa käyttämällä. Prosenttiosuus soluja G1 vaiheeseen shSEMA7A soluissa oli merkittävästi (P ​​ 0,05) korkeammat kuin että shMock-soluissa (kuvio 4A) Meillä arvioitiin myös ekspressiotasot G1 pidätys liittyviä proteiineja, kuten CDKIs (p21

CIP1 ja p27

Kip1), sykliinejä, ja CDK. Kuten odotettua, CDKIs oli säädelty, ja sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4 ja CDK6 olivat alassäädetty merkitsevästi (P ​​ 0,05) shSEMA7A soluissa (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittivat, että shSEMA7A solut inhiboi solujen lisääntymistä solun syklin pysähtymisen G1-vaiheessa.

(A) virtaussytometrinen analyysi suoritettiin tutkimaan solusyklin etenemisen on shSEMA7A ja shMock soluja (SAS ja KOSC- 2-johdetun transfektantit) synkronoinnin jälkeen G2 /M vaiheessa käyttämään nokodatsoli. Prosenttiosuus solujen G1 vaihe shSEMA7A soluissa on lisääntynyt merkittävästi verrattuna shMock soluja. (B) immunoblotting analyysi osoittaa ylös-säätely p21

CIP1 ja p27

Kip1 ja alas-säätely sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4 ja CDK6 että shSEMA7Acells (SAS ja KOSC-2-johdetun transfektantit ) verrattuna shMock soluihin.

erityksen väheneminen MMP ja expressin of MT1-MMP in SEMA7A pudotus soluissa

Koska invasiivisuus ja muuttavien kykyjä SEMA7A pudotus soluissa vähentynyt (kuvio 3B ja 3C), arvioimme MMP välittämää matriisi proteolyysi qRT-PCR ja MMP zymografia määritystä.

MMP2

ja

MMP-9

mRNA lausekkeita shSEMA7A solut olivat merkitsevästi (p 0,05) vähemmän kuin shMock soluissa (kuvio 5A). Vuonna shSEMA7A soluja, eritystä MMP2, proMMP-2, ja proMMP-9 selvästi laski verrattuna shMock soluihin. CHX käsiteltiin shMock soluissa esti eritystä MMP-2, proMMP-2, ja pro-MMP-9. Tasot eritetyn MMP olivat edustettuina normalisoitu eritystä indeksi, joka on laskettu prosenttiosuutena eritetyn MMP suhteessa kuin shMock-soluissa (kuvio 5B). Olemme myös arvioitiin MT1-MMP by qRT-PCR ja immunoblottaus analyysit (kuvio 6A ja 6B, vastaavasti).

MT1-MMP

mRNA ilmaisun shSEMA7A soluissa oli merkitsevästi (P ​​ 0,05) vähemmän kuin shMock soluissa (kuvio 6A). MT1-MMP-proteiinin taso shSEMA7A soluissa oli myös vähentynyt verrattuna shMock soluihin (kuvio 6B). CHX käsitelty shMock soluja myös inihibited ilmaus MT1-MMP ilme. Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että SEMA7A oli olennainen molekyyli MMP ”eritystä ja ilmaisun.

(A) ilmaisujen MMP-2 ja MMP-9 mRNA: n shMock ja shSEMA7A soluja (SAS ja KOSC-2-johdetun transfektanttien). MMP-2 ja MMP-9 mRNA ilmaisuja shSEMA7A solut ovat merkittävästi (✽p 0,05, Studentin t-testi) vähemmän kuin shMock soluissa. (B) eritteiden MMP-2, proMMP-2, ja proMMP-9 shMock ja shSEMA7A solut analysoitiin gelatiinitsymografialla. Vuonna shSEMA7A soluja, eritystä MMP2, proMMP-2, ja proMMP-9 on selvästi vähentynyt verrattuna shMock soluihin. Lisäksi, CHX käsiteltiin shMock soluissa esti eritystä MMP-2, proMMP-2, ja pro-MMP-9. Densitometrinen MMP-2, proMMP-2, ja proMMP-9 tasoa on normalisoitu shMock tasolle.

(A) ilmentyminen

MT1-MMP

mRNA: shMock ja shSEMA7A soluja ( SAS ja KOSC-2-johdetun transfektantit).

MT1-MMP

mRNA ilmentymisen shSEMA7A solut ovat merkittävästi (

✽P 0,05, Studentin t-testi) vähemmän kuin shMock soluissa. (B) Immunoblottaus analyysi osoittaa, että MT1-MMP-proteiinin tasot shSEMA7A solut ovat myös pieneni merkittävästi verrattuna shMock soluihin. CHX käsitelty shMock soluja myös inihibited ilmaus MT1-MMP ilme. Densitometristä MT1-MMP-proteiinin Aineisto on normalisoitu GAPDH-proteiinin tasot.

inaktivointi ERK1 /2 ja AKT reittejä SEMA7A pudotus soluissa

arvioinut fosforylaation tasoja ERK1 /2 ja AKT in shSEMA7A immunoblottauksella analyysi. Tasot pERK1 /2 ja Pakt proteiinin väheni merkittävästi (p 0,05) shSEMA7A soluissa verrattuna shMock soluissa (kuvio 7A ja 7B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ERK1 /2 ja AKT signalointireitteihin voitiin vähentää usein on shSEMA7A soluissa.

(A, B) Immunoblottaus analyysi osoittaa, että SEMA7A pudotus johtaa alentuneet pERK1 /2 ja Pakt verrattuna shMock soluja (SAS ja KOSC-2-johdetun transfektantit). Densitometrinen pERK1 /2, ERK1 /2, Pakt, ja AKT-proteiinin Aineisto on normalisoitu GAPDH-proteiinin tasoja.

SEMA7A ilmentymisen SEMA7A pudotus soluissa sen jälkeen, TGF-β

1 hoidon

vaikutuksen tutkimiseksi TGF-β

1 SEMA7A ilmaisun, käsittelimme transfektantteja TGF-β

1.

SEMA7A

mRNA: n TGF-β

1 käsiteltiin shSEMA7A solut olivat merkittävästi säädelty verrattuna TGF-β

1 ei-käsiteltyjen shSEMA7A soluissa (kuvio 8).

mRNA-tasot on

SEMA7A

TGF-β

1 inkuboitiin shSEMA7A soluja (SAS ja KOSC-2) on lisääntynyt merkittävästi (SAS, * P = 0,0022, ** P = 0,0021, † P = 0,0001, †† P = 0,0005, Studentin t-testi) (KOSC-2, * P = 0,0003, ** P = 0,0003, † P = 0,0029, †† P = 0,0045, Studentin t-testi) verrattuna, että TGF -β

1 unincubated shSEMA7A soluja.

fosforylaatio tasot ERK1 /2 ja AKT in SEMA7A pudotus solujen /ilman TGF-β

1

arvioinut fosforylaation tasoja ERK1 /2 ja AKT sekä SEMA7A ilmentyminen SEMA7A pudotus solujen /ilman TGF-β

1 immunoblot-analyysillä. SEMA7A proteiinipitoisuutta TGF-β

1 käsitelty shSEMA7A soluissa lisääntyi verrattuna käsittelemättömien shSEMA7A soluissa. Lisäksi TGF-β

1 käsiteltyjen shSEMA7A solut osoittivat lisääntynyttä Perk ja Pakt tasolla verrattuna käsittelemättömien shSEMA7A soluissa (kuvio 9).

immunoblottianalyysi fosforylaation tasojen SEMA7A, ERK1 /2, ja AKT. SEMA7A pudotus johtaa alentuneet pERK1 /2 ja Pakt verrattuna shMock solujen (SAS ja KOSC-2-johdetun transfektanttien). TGF-β

1 käsiteltyjen shSEMA7A solut osoittavat lisääntynyt SEMA7A tasolla verrattuna TGF-β

1 käsittelemättömien shSEMA7A soluissa. PERK1 /2 ja Pakt tasolla osoittavat myös lisääntynyt TGF-β

1 käsitelty shSEMA7A soluja.

arviointi SEMA7A ilmaisun ensisijainen OSCCs

ilmentymisen tutkimiseksi asemaa SEMA7A perusasteen OSCCs ja suhteessa kliinis ominaisuuksia, olemme analysoineet SEMA7A proteiinin ilmentymisen ensisijaisen OSCCs 150 potilasta käyttäen sq-IHC pisteytysjärjestelmä. SEMA7A proteiinin ilmentyminen primaaristen OSCCs oli merkitsevästi (P ​​ 0,05) korkeampi kuin normaaleissa kudoksissa (kuvio 10A-10C). SEMA7A sq-IHC arvosanat OSCCs ja viereisten normaali suukudosten vaihtelivat 36,7-203,8 (mediaani, 109,3) ja 13,5-87,5 (mediaani, 37,9), vastaavasti (kuvio 10C). Määrittämään optimaalinen sulku pisteen tunnistettu m²-IHC tulokset, käytimme ROC käyräanalyysi ja Youdenin indeksin. ROC-käyrä analyysi alue käyrän alla (AUC) oli 0,91 (95% luottamusväli [CI], +0,8749-,9378, P 0,05) ja Youdenin indeksi (herkkyys, 70,5%, spesifisyys, 96,7%, P 0,05) osoitti, että kynnysarvon oli 69,5 (kuvio 10D ja 10E). Väliset korrelaatiot kliinis ominaisuudet potilaiden OSCC ja tilan SEMA7A proteiinin ekspressio on esitetty taulukossa 1. Yksi kliinisen luokittelun, SEMA7A-positiiviset OSCCs korreloivat merkittävästi (P ​​ 0,05) suurempia kasvaimia, usein alueellisten imusolmukkeiden etäpesäke, ja kehittynyt kliiniset vaiheet. 5 vuoden eloonjäämisluvut vuonna SEMA7A-positiivisten OSCCs (n = 106) ja SEMA7A-negatiivinen OSCCs (n = 44) olivat 76,3% ja 85,3%, tässä järjestyksessä. Mittaviivat 50 pm.