Krooninen sairaus

tiivistelmä

Me raportoimme tässä kehittämistä, toiminnalliset ja molekyylitason karakterisointiin isogeenisen, pariksi virtsarakon syöpä soluviljelymalli järjestelmän tutkimista varten platinaa lääkeresistenssin. 5637 ihmisen virtsarakon syövän solulinjaa viljeltiin yli kymmenen kuukauden portaittain korotukset oksaliplatiinipitoisuuden tuottaa lääkkeille vastustuskykyiset 5637R sub solulinjassa. MTT-määritystä käytettiin mittaamaan sytotoksisuuden useita virtsarakon syöpä lääkkeitä. Nestetuikelaskenta sallittu kvantifiointiin solun lääkkeen oton ja ulosvirtaus radioleimatun oksaliplatiinin ja karboplatiinin. Vaikutus solunsisäinen lääkeaineen inaktivaatio arvioitiin kemiallisella modulaatio glutationitasoihin. Oksaliplatiinia ja karboplatiini-DNA adduktin muodostumista ja korjausta mitattiin kiihdytin massaspektrometriaa. Resistance tekijät, kuten apoptoosin, kasvutekijän signalointi ja muut kartoitettiin RNAseq sekä solulinjoja ja mukana vahvistus valitaan transkriptien RT-PCR: llä. Oksaliplatiini, karboplatiini, sisplatiini ja gemsitabiinin olivat huomattavasti vähemmän sytotoksinen 5637R soluihin verrattuna 5637 soluihin. Sen sijaan, doksorubisiini, metotreksaatti ja vinblastiinin ollut solulinja riippuvainen ero sytotoksisuuden. Altistettaessa terapeuttisesti merkityksellisinä annoksia oksaliplatiinia, 5637R solut oli alhaisemmat huume-DNA adduktin tasolle kuin 5637 solua. Tämä ero oli osittain osuus esi-DNA-vaurioita mekanismeja, kuten huumeiden otto ja solunsisäiset inaktivointia glutationi sekä nopeampi oksaliplatiinia DNA adduktin korjaus. Sitä vastoin sekä solulinjoilla ei ollut merkittäviä eroja karboplatiini sisäänoton soluun, ulosvirtauksen ja huumeisiin DNA adduktin muodostumista ja korjausta, mikä viittaa erillisten resistenssimekanismit näiden kahden läheisesti huumeita. Toiminnallinen tutkimukset täydennetty RNAseq analyysi, joka osoitti merkittävän muutoksen ilmentymistä 83 selostukset, mukaan lukien 50 tunnettuja geenejä ja 22 romaani selostukset. Useimmat selostukset joita ei aiemmin liittynyt virtsarakon syöpä chemoresistance. Tämä malli järjestelmä ja siihen liittyvät fenotyyppiset ja genotyypin tietojen avulla on mahdollista tunnistaa joitakin uusia yksityiskohtia resistenssimekanismeja kliinistä merkitystä virtsarakon syövän.

Citation: Wang S, Zhang H, Scharadin TM, Zimmermann M, Hu B Pan AW, et ai. (2016) Molecular Dissection Indusoidun Platinum Resistance kautta Toiminnalliset ja Gene Expression Analysis soluviljelmässä malli virtsarakon syövän. PLoS ONE 11 (1): e0146256. doi: 10,1371 /journal.pone.0146256

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 08 heinäkuu 2015; Hyväksytty 15 joulukuuta 2015 Julkaistu: 22 tammikuu 2016

Tämä on avoin pääsy artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kaikki RNA seuraavat tiedot ole esitetty paperi ovat saatavilla verkossa osoitteessa https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SRA. RNA seuraavat tiedot on osoitettu liittymisen tunnistenumerot SRR1820076 ja SRR1820077 varten 5637 vanhempien linja; ja SRR1820079 ja SRR1820080 varten 5637R rivi (edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta kullekin solulinja).

Rahoittajat: AMS näytteet analysoitiin Lawrence Livermore National Laboratory alaisuudessa DOE sopimuksen DE-AC52-07NA27344 ja tuettu NIH /NCRR Resource for Biomedical Accelerator massaspekrometria P41 RR013461 ja DOE LDRD myöntää 08-LW-100 (PTH ja KT), ja American Cancer Society Institutional Research Grant (CXP). Tutkimus tukee myös VA urakehityssuunnitelmaan Award-2 (CXP), joka on NCI Cancer Center Support Grant (RDW) Syöpä Clinical tutkija Team Leadership Award (CXP), ja NIH palkinnot HHSN261201200048C, HHSN261201200084C, R01CA155642 (PTH) ja T32 CA108459-08 (TS). Kirjoittajat kiitollisena tunnustavat Susan ja Gerry Knapp Family Fund. Tämä työ on tehty, osittain alaisuudessa Yhdysvaltain Department of Energy Lawrence Livermore National Laboratory alle Sopimus DE-AC52-07NA27344. Työ raportoitu tässä ei edusta näkemyksiä tai mielipiteitä veteraaniviraston tai Yhdysvaltain hallituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja laatijat käsikirjoituksen ovat seuraavat kilpailevien etujen : Chong-Xian Pan, Paul Henderson ja George Cimino ovat osakkaina Accelerated Medical Diagnostics Incorporated, jonka tavoitteena on kaupallistaa käyttö huumeiden DNA addukteja biomarkkereina kemoterapia resistenssin.

Johdanto

platina-pohjainen lääkkeet ovat yleisimmin määrätty syöpälääkkeet, kuten sisplatiini, karboplatiini ja oksaliplatiini. Sisplatiini on käytetty hoitamaan monenlaisia ​​maligniteettien, kuten kives-, keuhko-, munasarja-, virtsarakko-, pään ja kaulan alueen karsinoomat, ja muut. Kaikille platinapohjaisen aineita, luontaisia ​​tai hankittuja lääkeaineresistenssin on merkittävä syy hoidon epäonnistumiseen (Kuva 1A).

(A) tärkeimmät reitit platinan (Pt) lääkkeen aiheuttama solukuolema. Annon jälkeen, sisäänottoa soluihin ja ulosvirtaus määrittää solunsisäisen kertymisen Pt aineita, jotka voidaan inaktivoida solunsisäisen tiolia sisältävien molekyylien. Lopulta Pt aineet aiheuttaa DNA-vaurioita, kuten huumeiden-DNA addukteja, mikä laukaisee solusyklin pysähtymiseen ja DNA: n korjaukseen. DNA adduktin muodostumista ja korjausta määrittää kohtalo solujen, vaikka muut tekijät myös tärkeä asema, kuten pro- ja anti-apoptoottisia proteiineja. (B) Kaavio muodostumista carboplatin- ja oksaliplatiinia DNA addukteja ja kannoista radiohiilimenetelmän tarrojen kunkin lääkkeen Tässä tutkimuksessa käytetään, jotta kvantifiointia huumeisiin DNA adduktin muodostumista ja korjauksista kiihdytin massaspektrometrialla.

syövän vastainen toiminta platinapohjaisen lääkkeet tunnetaan parhaiten sisplatiinin, joka tulee soluissa sekä passiivisen diffuusion ja aktiivinen kuljetus. Esimerkiksi kupari kuljettimen (CTR1) tiedetään osaltaan sisplatiinin virtaa ja moduloi lääkeaineen herkkyys in vitro [1, 2]. Kaksi kupari-ulosvirtaus-kuljettavat P-tyypin adenosiini trifosfaateiksi (ATP7A ja ATP7B) myös välittävät solunsisäisiä sisplatiinitasot [3]. Muita aktiivisia kuljettajat kuuluvat ihmisen orgaanisten kationikuljetusjärjestelmän (hOCT) ja ihmisen monilääke ja toksiini puristamiseen (hMATE), joita löytyy vain tietyntyyppisten ihmissolujen, johdonmukainen sen havainnon, että eri kudoksissa voi vaihdella niiden platina kertymiseen [4] .

kun sisplatiini on solun sisällä, glutationi (GSH) ja muut tiolit toimivat pelkistimenä sammuttamiseksi platinaa myrkyllisyys. On korkea korrelaatio solunsisäisten GSH tasoilla ja kestävyys sisplatiinin

in vitro

[5-7]. Metallotioneiinin proteiinit ovat perheen Sulfhydryyliä rikas proteiineja, jotka osallistuvat raskasmetalli sitovia ja vieroitus ja lisätään joissakin sisplatiinin kestävä rakkokasvaimista [8]. Muutokset GSH tasoilla ja osallistuvia geenejä GSH synteesissä sekä metalloproteiinien, on myös raportoitu oksaliplatiinin resistenttejä syöpäsolulinjoilla [9, 10].

Sisplatiini ja sen aquated tai hydroksylaattimetaboliittien toimivat kaksitoiminen alkyloiva aineina DNA [11]. Tuloksena lääke-DNA additiotuotteiden estää replikaatio ja solujen jakautumista, ja aktivoi apoptoosin [2]. Muut lajit, kuten sisplatiini-DNA-proteiini siltoja, ovat myös omiaan edistämään sisplatiinin myrkyllisyyttä [12, 13].

Cellular vastauksena karboplatiinin (katso rakenne kuviossa 1B) arvellaan olevan hyvin samankaltainen sisplatiinin altistuminen koska molemmat lääkkeet muodostavat identtiset ristikytkentäsidoksia huume-DNA rakenteet, paitsi että karboplatiini reagoi DNA hitaammin sisplatiinin [14]. Kliinisesti, sisplatiini ja karboplatiini on samankaltainen, mutta ei identtinen tehoa, todennäköisesti eroista johtuen biokemian ja annosten.

Oksaliplatiini (kuvio 1 B) toimii samalla tavalla kuin sisplatiini aiheuttamalla sen myrkyllisyydestä kautta lääke-DNA adduktin muodostumisen [15 -17]. Koska oksaliplatiini-DNA adduktit on erilaiset kemialliset ja biologiset ominaisuudet alkaen sisplatiini-DNA additiotuotteet, se ei näytä täysin ristiresistenssiä sisplatiinin ja on tehokkaampi, esimerkiksi estämällä DNA-synteesiä [18-20]. Myös erot sisplatiinin ja oksaliplatiini on kuvattu solunsisäisen laskeutuu aiheuttama huumeisiin DNA aiheutuvia vahinkoja apoptoosin ja solukierron pysähtymisen [21].

Lähes kaikki Platinapohjaisen huume-DNA addukteja substraattien nukleotidin poisto korjaus (NER) [2]. Lisääntynyt DNA korjaukseen hinnat on dokumentoitu korreloivat kestävyys platinaa huumeita [5, 22-25]. Platina-DNA addukteja ovat myös substraatteja DNA yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmän (MMR). MMR proteiinit on paljon suurempi affiniteetti sisplatiinipohjaisen kuin oksaliplatiinia DNA addukteja [26, 27]. On raportoitu, että viallisen MMR aktiivisuus johtaa kasvaneeseen vastus solulinjat sisplatiini, mutta ei oksaliplatiini [19], mikä voi selittää suhteellisesta tehokkuudesta oksaliplatiinin ja peräsuolen syöpiä, jotka ovat usein viallinen MMR, [28, 29] .

Molecular koulutusjakson analyysi on ollut erittäin onnistunut laboratoriotutkimuksissa selvittämiseksi platinapohjaisen lääkeresistenssimekanismien. Kuitenkin tuloksena molekyyli allekirjoitukset lääkeresistenssin ovat harvoin sovellettavissa klinikalle. Yksi merkittävä syy valtava kuilu laboratorion tutkimuksen ja kliinisten sovellusten on erittäin monimutkainen luonne resistenssimekanismeja vastaan ​​sytotoksiset lääkkeet. Solutasolla, yli 700 geenit ovat mukana soluvastetta platinapohjaisen hoidon [30].

Tämä monimutkaisuus motivoi meitä tuottamaan lähes isogeenisiin virtsarakon syövän solulinja varten laajentaa mekanistinen analyysi platinaa vastus virtsarakon syövän, jolle platinapohjaisen hoito on ensimmäinen rivi vaiheessa II ja korkeampi tauti [31, 32]. Esitämme tässä asiakirjassa fenotyypin ja genotyypin analyysi vanhempien virtsarakon syövän solulinja 5637 ja tytär solulinja, joka oli sulatettu vastustuskykyisiä platinapohjaiseen lääkkeiden altistuminen kasvavia pitoisuuksia oksaliplatiinin useita kuukausia. Oletimme, että tämä pari solulinjojen osoittaisi eroja platina huumeiden kertymistä, solunsisäinen inaktivoitumisen ja huumeiden DNA muodostumista ja korjaus sopusoinnussa niiden herkkyyttä kunkin lääkkeen, ja että geenien ilmentymisen analyysi näistä lähes isogeenisten solulinjojen johtaa kohtuulliseen määrään kokeellisia hypoteeseja, jotka saattavat olla ominaisia ​​virtsarakon syöpään. Solulinjoja testattiin herkkyyttä useita kemoterapia-aineisiin, joita käytetään yleisesti hoidettaessa virtsarakon syöpä. Solulinjat arvioitiin myös yksityiskohtaisesti suhteessa mekanistinen erot vastauksena [

14C] oksaliplatiinin ja [

14C] karboplatiinia. Tunniste

14C merkkiaineen käytössä määritettäessä lääkkeen oton ja ulosvirtaus nestetuikelaskennalla (LSC) ja huumeiden-DNA adduktin muodostumista ja korjauksista kiihdytin massaspektrometrialla (AMS). Solulinjat analysoitiin myös RNA-transkriptin ilmentyminen muuttuu RNAseq, joka johti tunnistamiseen useita tunnettuja ja joitakin uusia selostukset suhteen platinapohjaisen lääkeresistenssin. Osuus geenien edustavat nämä selostukset chemoresistance ei juuri tunneta. Selvittäminen nämä mekanistinen yksityiskohtia myöhemmässä työssä voi lopulta auttaa suunnittelemaan henkilökohtaista hoitoa voittaa chemoresistance ja ohjata kehitystä uusia terapeuttisia aineita vastaan ​​virtsarakon syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Drugs

oksaliplatiini (5 mg /ml) ostettiin Sanofi-Aventis (Bridgewater, NJ, USA) ja

14C-leimattua oksaliplatiinin ([

14C] oksaliplatiinin) (spesifinen aktiivisuus 58 mCi /mmol) ja [

14C] karboplatiinin (54 mCi /mmol) ostettiin Moravek Biochemicals. Seoksia radiohiili-leimattua ja leimaamatonta oksaliplatiinia tai karboplatiini (USP Pharmaceutical Grade) käytettiin minimoimiseksi käytön radiohiili, ja saavuttaa erilaisia ​​konkreettisia toimia tarvitaan tässä tutkimuksessa. Drug liuokset valmistettiin välittömästi ennen käyttöä. Muut lääkkeet saatiin UC Davis Cancer Center Pharmacy (USP Pharmaceutical Grade).

Solulinjat

Ihmisen virtsarakon syövän solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA ) ja viljeltiin suositeltu väliaineen, ellei toisin mainita. Kehitetään Pt kestävät sub-solulinjoissa, 5637 (HTB-9) Soluja viljeltiin noin IC

50 pitoisuuksia oksaliplatiinia jaksoittain asteittaisen lisäämisen oksaliplatiinipitoisuuden. Oksaliplatiini käytetyt pitoisuudet vaihtelivat 1,5 uM 15 uM, jotka ovat fysiologisesti relevantti huomioon suurin plasmapitoisuus ihmisillä on noin 10 uM [33]. Kun 10 kuukauden viljelyn resistenttejä Saharan solulinja 5637R kehitettiin. Sen vahvistamiseksi, että 5637R peräisin vanhempien 5637 solulinja, näytteitä molemmissa kulttuureissa lähetettiin ATCC Cell Line Authentication Service solun tarkastusta kohden ATCC protokollaa. Erityisesti viisitoista lyhyitä tandem-toisto (STR) loci plus sukupuoli määritetään lokuksessa amelogenin, monistettiin käyttäen kaupallisesti saatavilla PowerPlex

® 16HS Kit Promega. Solulinjaa Näyte käsitellään käyttäen ABI Prism

® 3130 xl Genetic Analyzer. Aineisto analysoitiin GeneMapper ID v 3.2 ohjelmisto (Applied Biosystems). Asianmukaisten positiivisten ja negatiivisten kontrollien käytettiin koko testin menettely.

MTT-määritys määrittää IC

50

IC

50-arvot määritettiin inkuboinnin jälkeen soluista 72 tuntia erilaisilla pitoisuudet kemoterapeuttisten aineiden, joita käytetään yleisesti virtsarakon syövän hoitamiseksi, kuten aiemmin on kuvattu [34].

Oksaliplatiini ja karboplatiinin valotuksen ja AMS analyysi

Solut siirrostettiin 60 mm: n maljoille tiheydessä 1 x 10

6 solua /malja ja annettiin kiinnittyä yön yli 37 ° C kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Tällä tunti 0 solut annostellaan ja inkuboitiin 10 pM oksaliplatiini täydennetty 5000 dpm /ml [

14C] oksaliplatiinia tai 100 uM karboplatiini, täydennetty 50000 dpm /ml [

14C] karboplatiinia. 24 tunnin inkubaation käytettiin jäljittelemään

in vivo

oksaliplatiinia puoliintumisaika (16,8 tuntia) potilailla [35, 36]. Sitten solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla liuoksella (PBS) ja pidettiin sen jälkeen lääkkeettömiin elatusaineet. DNA kerättiin aikapisteissä 24-48 tuntia, kuten, ja puhdistettiin Promega Wizard DNA: n puhdistus kit. Kymmenen mikrogrammaa DNA näytettä kohti muutettiin grafiitti ja mitataan AMS

14C kvantifiointiin kuten aikaisemmin on kuvattu [37]. Kolme rinnakkaista sarjaa AMS kokeet tehtiin ja tulokset piirrettiin aika vs oksaliplatiinia DNA additiotuotteiden per 10

8 nt.

määritys solunsisäisen glutationin pitoisuuksia

Solunsisäinen kokonais glutationin (GSH) havaittiin, kolorimetrisellä GSH havaitseminen kitillä valmistajan ohjeiden mukaisesti (BioVision, Mountain View, CA). Noin 10

7-solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, ja hajotettiin GSH hajotuspuskuria. Sen jälkeen kun oli inkuboitu jäillä 10 minuutin ajan, sulfosalisyylihappoa lisättiin, ja supernatantti kerättiin mittausta varten absorbanssi 410 nm: ssä. GSH standardi sisältyy sarjaan käytettiin standardikäyrän muodostamiseksi määrittämiseksi näytteen GSH pitoisuuksia.

Tilastot

Käytimme kvantitatiivinen tiivistelmät DNA-vaurioita, IC

50 ja AUC ( ala käyrän alla) arvot erikseen kokeellisesti solulinja ja aika (keskiarvo ja keskihajonta). Tilastot laskettiin n = 3 kullekin solulinjan. ANOVA-IC

50 ja AUC tiedot perustuvat yksipuoliseen

t

-testi. Kaikki testit olivat kokeilu-viisasta virheprosentti 0,05 ja kaikki analyysit, joita SAS /STAT

® tai MedCalc

® ohjelmisto.

RNAseq ja qRT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen Qiagen RNeasy mini kit. Co-puhdistettua genomista DNA kvantifioitiin käyttäen 18S geenispesifisiä kvantitatiivinen PCR-määritys ihmisen genomista DNA: ta määrä vakiona. Koska kokonais-RNA oli korkea genomisen DNA-kontaminaation (ennakoidaan olevan 15-68% koko lukee), ylimääräinen DNaasikäsittely vaiheessa lisättiin RNA puhdistus-protokollaa. Tämä vaihe vähensi DNA saastumista tasolle odotetaan tuottavan 0,33% koko lukee. rRNA oli tyhjentynyt näytteistä käyttämällä Epicentre n RiboZero H /M /R kit. Sekvensointi kirjastot tehtiin 40 ng rRNA köyhdytetyn RNA käyttämällä Epicentre n ScriptSeq v2 RNA-Seq Kirjasto valmistelu Kit. Nämä näytteet sekvensoitiin 1/3 HiSeq PE 101 kaista kukin Los Alamos National Laboratory.

Raaka sekvenointitulosten käsittelivät CASAVA 1,8 ohjelmisto (Illumina, San Diego, CA) ja leikataan laadun (Q

30, Phred asteikko). Analyysi RNA-Seq data suoritettiin käyttäen standardia Tophat-kalvosinnapit työnkulku ihmisen genomin kokoonpano (helmikuu 2009, GRCh37 /hg19) [38, 39]. Ilmaus transkriptin pidettiin merkittävästi säännelty jos FDR (p-arvo korjataan useita testaus) oli alle 0,05.

qRT-PCR RNA eristettiin subkonfluenteista annoksia käyttäen Qiagen RNeasy Mini Kit mukaan valmistajan ohjeita. cDNA syntetisoitiin käyttäen Thermo Scientific RevertAid RT kit. qRT-PCR suoritettiin käyttäen EconoTaq PLUS 2X master mix BioRad CFX96 Real-Time -mittarijärjestelmä. Seuraavia alukkeita käytettiin: TSPAN7 (ACCAAACCTGTGATAACCTGTCT, AGGGAGATATAGGTGCCCAGA), AKR1C2 (ATTGGAATGACATACTGCATCCT, GTTCAACCGTTTCTTACCTGTGG), AKR1C1 (CGCCTGCAGAGGTTCCTAAAA, ATCAATATGGCGGAAGCCAG), Cyr61 (CCCGTTTTGGTAGATTCTGG, GCTGGAATGCAACTTCGG), HTRA1 (TCCCAACAGTTTGCGCCATAA, CCGGCACCTCTCGTTTAGAAA), ja AQP3 (CCGTGACCTTTGCCATGTG, CGAAGTGCCAGATTGCATCATAA). Mikä tahansa RNA seuraavat tiedot eivät esitetty paperi on saatavilla verkossa osoitteessa https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra. Raaka RNA seuraavat tiedot on osoitettu liittymisen tunnistenumerot SRR1820076 ja SRR1820077 varten 5637 vanhempien linja; ja SRR1820079 ja SRR1820080 varten 5637R rivi (edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta kullekin solulinja).

Tulokset

sukupolvi 5637R solulinjan kautta aiheuttama lääkeresistensseihin kuvataan alla, yhdessä erilaisia ​​fenotyyppisiä ja genotyyppisiä luonnehdintoja. Ellei toisin mainita, vertailuja kahden solulinjoista on esitetty järjestyksessä 5637R vs. 5637, vastaavasti.

induktio Platinum Drug Resistance

5637R solulinja kehitettiin yli 10 kuukauden kulttuuri vaiheittaisella pitoisuuden kasvu oksaliplatiinille median. Sytotoksisuus Oksaliplatiinin että 5637R linjan pieneni noin 10-kertainen verrattuna emosolulinjassa (IC

50 26,1 uM vs. 2,45 uM, p 0,0001, taulukko 1). Yllättäen emme pystyneet kehittämään kestävä 5637 johdannainen upon laajennettu altistuminen karboplatiinia. Sen varmistamiseksi, että 5637R peräisin vanhempien 5637 solut, yksi alikvootti kustakin solulinjasta lähetettiin ATCC määrittämiseen klonaalisen uskollisuus. 15 Lyhyen tandem-toisto (STR) loci plus amelogenin on 5637 solulinjan käytetty tässä tutkimuksessa olivat täydellinen vastaavuus ATCC ihmisen solulinjassa 5637 (HTB-9) ATCC tietokantaan. 5637 linja oli kolme alleelien että 5637R puuttui kun taas muut alleelit tutki olivat samat molemmissa solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että 5637R on johdannainen 5637.

Kemoterapia huumeiden sytotoksisuus

Cells oli viljelty eri sisplatiinin, karboplatiinin, gemsitabiinin, doksorubisiinin, metotreksaatti ja vinblastiini 72 tuntia ja sen jälkeen arvio elinkelpoisuuden MTT-määritystä (keskiarvot on esitetty taulukossa 1). Nämä lääkkeet valittiin, koska niiden usein käyttöä hoidettaessa virtsarakon syöpään. 5637R solulinja oli myös resistentti sisplatiinia, mutta paljon vähäisemmässä määrin kuin oksaliplatiinin (IC

50 2,99 uM vs. 0,59 uM 5637, p = 0,049), ja karboplatiinin (IC

50 = 72,18 uM vs. 24,34 uM, p 0,0001). Se oli myös resistentti gemsitabiinia (IC

50 = 1,44 uM vs. 0,12 uM, p = 0,0015), mutta molemmissa solulinjoissa olivat yhtä herkkiä doksorubisiini (IC

50 = 0,27 vs. 0,29 uM, p = 0,45) metotreksaattia (IC

50 = 1,24 uM vs. 2,01 uM, p = 0,18) ja vinblastiinin (IC

50 = 0,61 nM vs. 0,60 nM, p = 0,48).

otto ja ulosvirtausta

määrittämiseksi lääkkeen ottoa, soluja inkuboitiin [

14C] oksaliplatiinia tai [

14C] karboplatiinin, ja näytteitä eri ajankohtina yli 24 tuntia, mitä seurasi eristäminen soluista ja LSC analyysi solunsisäisten lääkeaineen kertymistä . 5637R linja oli vaatimaton, mutta huomattavasti pienempi huippu solunsisäisen oksaliplatiini tasolla 24 tuntia (248,6 ± 24,7 x 10

6 molekyylejä solua kohti verrattuna 303,7 ± 14,2 x 10

6 molekyylejä solua kohti for 5637 soluja, p = 0,290 ) (kuvio 2A). Sitä vastoin molemmissa solulinjoissa oli samalla tasolla karboplatiinin oton 24 tuntia (1241 ± 192 X 10

6 molekyyliä solua kohti vs. 1113 ± 58 X 10

6 molekyyliä solua kohti, p = 0,334), (kuvio 2B ).

(AB) vertailu solujen oton ja ulosvirtausta. A. solu ottoa oksaliplatiinin. 5637R solut olivat laskeneet solun oton. B: 5637 ja 5637R oli samanlaisia ​​solujen ulosvirtausta hinnat. (CD) Oksaliplatiini ja karboplatiinin solujen ulosvirtaus eroja kahden solulinjat eivät olleet tilastollisesti merkitseviä.

määrittämiseksi lääkevuoto-, solut altistettiin [

14C] oksaliplatiinia tai [

14C ] karboplatiinin 4 tuntia, pestiin PBS: llä ja viljeltiin huumeeton väliaineessa 24 tunnin ajan. Elatusaine näytteet LSC eri ajankohtina määrittämiseen määrä ulosvirtausta. Ei ollut mitään merkittävää eroa oksaliplatiinin tai karboplatiini ulosvirtaus kahden solulinjoista (ulosvirtausta 24 tuntia oli 1514 ± 78 x 10

6 molekyylejä versus 1693 ± 244 x 10

6 molekyylejä solua kohti varten oksaliplatiini, p = 0,293 (kuvio 2C) ja 542,3 ± 44,5 x 10

6 molekyylejä vs. 482,5 ± 35,9 x 10

6 molekyylejä solua kohti karboplatiinin, p = 0,14) (kuvio 2D).

Solunsisäinen inaktivaatiota

5637R soluja oli huomattavasti suurempi keskimääräinen GSH pitoisuus kuin 5637-soluja (53,91 ± 0,83 nmol /mg proteiinia verrattuna 46,93 ± 1,20 nmol /mg proteiinia. p = 0,003) (kuvio 3A). Sen määrittämiseksi, onko suurempi GSH pitoisuus osaltaan chemoresistance, sekä solulinjoja viljeltiin, kun läsnä on buthionine sulphoximine (BSO), joka on inhibiittori gamma-glutamylcysteine ​​syntetaasin, joka vaaditaan GSH biosynteesiin [40]. BSO käsittely laski GSH molemmissa solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3B). Altistaminen 5637R solujen 50gM BSO jälkeen [

14C] oksaliplatiini altistus suureni tarkoittaa oksaliplatiinia DNA adduktia tasot 24 h 285,4 ± 15,3 addukteja per 10

8 nukleotidin 424,6 ± 67,7 addukteja per 10

8 nukleotidin, mutta tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,113). Kuitenkin BSO hoito vähensi oksaliplatiinin IC

50 alkaen 26,08 uM 5637R solujen 12,95 uM BSO hoitoon (p = 0,002, Kuva 3C). Sen sijaan, BSO hoito oli vähän vaikutusta herkkyyteen 5637 solujen oksaliplatiinille (IC

50 2,45 uM käsittelemättömän vs. 2,36 uM BSO altistumista, tietoja ei ole esitetty. Yllättäen BSO altistuminen ei ollut vaikutusta karboplatiinin IC

50-arvot joko solulinja (tietoja ei esitetty).

(A) vertailu karboplatiini-DNA adduktin muodostumisen välillä 5637 ja 5637R. (B) vertailu ja korrelaatio IC

50-arvoja carboplatin- addukti AUC, addukti tasot neljä tuntia annostuksen jälkeen ja DNA korjaus. (C) vertailu solujen oton ja ulosvirtaus karboplatiinin välillä 5637 ja 5637R soluja.

Drug-DNA adduktin muodostumista ja korjaus

Soluja viljeltiin [

14C] oksaliplatiiniannoksella 10pM (likimääräinen huippu ihmisen oksaliplatiini plasmassa kemoterapian aikana) 24 tuntia, jota seurasi pesu ja kulttuurin vielä 24 tuntia [33]. Tämä protokolla karkeasti jäljittelee

in vivo

altistumista oksaliplatiinin (eksponentiaalinen lasku veressä pitoisuutena noin päivässä). Solut kerättiin eri ajankohtina 48 tunnin aikana DNA: n eristämisessä ja kiihdytin massaspektrometriaa (AMS) analyysi käyttämällä menetelmiä aiemmin raportoitu [41]. Lyhyesti, AMS toimii molekyylejä pilkotaan näytteessä atomeiksi, jotka sitten tunnistetaan ja määrällisesti pieni hiukkaskiihdytin [42]. Jos näyte on leimattu harvinaisen isotoopilla, kuten

14C, pitoisuus radiohiili atomien hiukkasen säde voidaan laskea lääkkeen pitoisuus veressä, kudokset, solut ja osa solun komponentteja, kuten proteiineja ja DNA: ta. AMS-analyysi edellyttää yleensä muuntaminen näytteiden grafiitti ennen analyysiä, joka voidaan tehdä käyttämällä korkean suoritustehon rinnakkainen prosessi. Oli aika-riippuva kasvu oksaliplatiini-DNA-adduktia tasot aikana 24 tunnin inkubaation, jota seuraa asteittainen väheneminen yli seuraavien 24 tunnin aikana, koska yhdistelmä-DNA-korjaukseen ja laimentaminen signaalin DNA-synteesiä. Kaikkina ajankohtina, oksaliplatiini-DNA-adduktia tasot 5637R solut olivat alhaisemmat kuin additiotuotteen tasot 5637-soluissa (kuvio 4A). 48 tuntia, 5637R soluilla oli paljon pienempi DNA additiotuotteiden kuin vanhempien 5637 soluja (78 ± 4 versus 505 ± 63 addukteja per 10

8 nukleotidin, p 0,0001, taulukko 2). AUC oksaliplatiinia DNA additiotuotteiden integroidaan koko 48 tunnin opiskeluaika oli merkittävästi pienempi 5637R soluja (9426 ± 2457 addukteja tunnin per 10

8 nukleotidin versus 27720 ± 2985 addukteja tunnin per 10

8 nukleotidia, p = 0,001, taulukko 2).

vertailu oksaliplatiinia ja karboplatiinin-DNA adduktin muodostumisen välillä 5637 ja 5637R soluja. Solunsalpaajaresistentti 5637R soluilla oli korkeampi oksaliplatiinia DNA adduktia tasot kaikkina ajankohtina verrattuna enemmän hoitoon herkkien 5637 solua.

DNA korjaukseen tutkimuksia, solut altistettiin [

14C] oksaliplatiinin 24, pestään ja viljellään edelleen oksaliplatiinia väliaineessa. Väheneminen oksaliplatiinia DNA additiotuotteiden useissa aikapisteissä seuraavien 24 tunnin aikana käytettiin laskemiseen huumeisiin DNA adduktin korjaus nopeus. 5637R solut oli korjaus nopeudella 3,48 ± 0,15 addukteja per 10

8 nukleotidin /tunti ja 1,34 ± 0,30 addukteja per 10

8 nukleotidin tunnin for 5637 soluja (p = 0,0004, taulukko 2).

muodostuminen ja korjaaminen karboplatiinin-DNA additiotuotteiden määritettiin samalla, mutta lyhyemmillä emtrisitabiinialtistukset (4 tunnin altistus seuraa pesu ja kahdenkymmenen tunnin inkubaation lääkkeettömässä media), jotta jäljitellä nopeammin

in vivo

puoliintumisaika plasmassa verrattuna oksaliplatiinia. Karboplatiini-DNA adduktin tasoilla ja huumeisiin DNA korjaus hinnat eivät eronneet merkittävästi kahden solulinjoista (AUC-arvot 4527 ± 895 vs. 4211 ± 1678 monoadduct-h /10

8 nukleotidia, p = 0,69, taulukko 2, ja huumeiden -DNA korjaus hinnat 6,30 ± 3,10 vs. 9,31 ± 6,74 addukteja /10

8 nukleotidin /h, p = 0,34 5637R ja 5637-soluissa, vastaavasti (kuvio 4B).

RNAseq analyysi 5637 ja 5637R solut

kokonais-RNA eristettiin subkonfluenteista soluja, jotka viljeltiin ilman kemoterapiaa huumeita, ja sitä käytetään analyysiin RNA-seq. alkaen kahtena itsenäisestä kokeesta oli yhteensä 83 RNA: iden tilastollisesti merkitsevä ilmaisu muutoksia, joista 50 liittyi tunnettujen geenien, yksi tunnettu microRNA ja 22 novel selostukset (p 0,05, S1 kuvassa ja S1 taulukko). loput 10 selostukset edustavat geenejä, jotka eivät antaneet mitattavissa ilmaisua kaikissa rinnakkaisnäytteiden mutta saattaa silti on merkitystä lääkeresistenssin. Neljä geenien tunnettujen merkitystä chemoresistance (TSPAN7, AKR1C2, AKR1C1, ja Cyr61) osoitettiin merkittävästi voimistussäädellään resistenttiä solulinjaa 5637R ja kaksi geeniä (HTRA1 ja AQP3) on vaimentua verrattuna vanhempien solulinja 5637 (taulukko 3). RNA-seq tulokset vahvistettiin edelleen qRT-PCR-analyysi on valittu selostukset RNA eristettiin subkonfluenteista kasvatetuissa viljelmissä ilman lääkkeitä kahtena (kuvio 5).

neljä geeneistä (TSPAN7, AKR1C2, AKR1C1, ja Cyr61) ovat lisääntyneet tasot 5637R soluissa ja kaksi geeniä (HTRA1 ja AQP3) ovat vähentyneet tasot resistentit solut. (A) Taita muutokset chemoresistance geenin tasoja suhteessa 5637 vanhempien solut määritettynä RNA-seq. (B) Taita muutos chemoresistance Geenitranskriptikuvion tasoa suhteessa 5637 vanhempien solut määritettynä qRT-PCR.

Keskustelu

Kymmenen kuukauden soluviljelmässä paineen alaisena oksaliplatiini altistumisesta , tuloksena kestävä solulinja säilyttänyt 5637 linjaa määritettynä STR analyysi, joiden perusteella se nimitys 5637R. Tuloksemme ovat verrattavissa muihin aiempien tulosten vanhempien ja oksaliplatiinin kestävä syöpäsolulinjat solujen [43-46]. Se on hämmentävä ja yllättävää, että karboplatiinin altistuminen 5637 solujen samanlaisissa koeolosuhteissa ei tuottanut karboplatiini kestävä solulinja, vaikka 5637R solut ovat merkittävästi resistenttejä karboplatiinia. Tämä on odottamaton tulos ottaen huomioon lähes universaali kliinisten oireiden resistenssin edenneisiin syöpiin käsiteltäessä platinapohjaisen hoito. Vaikeus asiakkuutta karboplatiinin resistenssin 5637 solut voivat johtua tunnetuista huono rajat resistenssin välillä oksaliplatiinin ja karboplatiinin tai sisplatiinin [2]. Oksaliplatiini voi aiheuttaa eri joukko mutaation spektrien verrattuna karboplatiini, jota on raportoitu käytettäessä

HPRT

geenimutaatiokoe CHO solujen vertailua sisplatiinin ja oksaliplatiini [47]. Riippumatta siitä, miten ne ovat syntyneet, tuloksena pari solulinjojen on hyödyllinen malli järjestelmän aiheuttama lääkeresistenssin, varsinkin kun otetaan huomioon niiden suhteellisen harvat fenotyyppisiä ja genotyyppisiä eroja.

5637R /5637 pari arvioitiin MTT-menetelmää vastustuskyvyn oksaliplatiinin ja useita lääkkeitä, joita käytetään hoidettaessa virtsarakon syöpä. Oksaliplatiini, karboplatiinin ja gemsitabiinin olivat huomattavasti vähemmän sytotoksinen 5637R soluihin. Doksorubisiini, metotreksaatti ja vinblastiini olivat yhtä myrkyllisiä molemmissa solulinjoissa. Tämä tulos ei ole yllättävää ottaen huomioon hankittu resistenssi yhtä lääkettä usein valitsee yhden tai useamman mekanistiset reitit, että on useita lääkkeitä substraatteina. Klinikalla, kun ensimmäinen linja platinaa perustuva terapia on 40-50% lihasten invasiivisia virtsarakon syövän, mutta kun vastus ensues, myöhemmät hoidot ovat vain 10-25% hoitovaste [48, 49]. Vaikka paljon lisätyötä tarvitaan, MTT tiedot mallimme järjestelmästä osoittavat, että on mahdollista saada merkittävää sytotoksista vastetta myöhemmin kemoterapiaa alkamisen jälkeen platinaa lääkeresistenssin jos oikea hoito on valittu.

Ehkä kaikkein yhteinen lääkeresistensseihin mekanismi on modulaatio solunsisäisen lääkkeen kertymisen kautta koron muutokset oton ja ulosvirtaus [42].