Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kyky Tetra-

O

metyyli nordihydroguaiaretic happo (M

4N) aiheuttaa nopeasti solukuoleman yhdistettynä Etoposide, Rapamysiini tai UCN-01 oli tarkastellaan LNCaP, sekä soluviljelmässä ja eläinkokeista. Hiiret käsiteltiin M

4N lääkeyhdistelmää joko Etoposide tai Rapamysiini ei havaittu kasvaimen ja oli 100% eloonjääneitä 100 päivän kuluttua kasvaimen istutuksen. Vertailun kaikissa muissa ajoneuvoissa tai yksittäinen lääke käsitellyissä hiirissä ei hengissä kauemmin kuin 30 päivää istutuksen jälkeen. Tämä synergistinen parantaminen syövänvastainen vaikutus vahvistettiin myös yli 20 syöpäsolulinjaa. LNCaP-solut, M

4N havaittiin vähentävän solujen ATP sisältöä, ja estää NDUFS1 ilmaisu, kun taas indusoimiseksi hyperpolarisaation mitokondrion kalvon potentiaalia. M

4N käsiteltyjä soluja puuttui autophagy pienemmällä ilmaus BNIP3 ja ATG5. Ymmärtää mekanismit tämän syövän vastaisen aktiivisuuden M

4 N, vaikutus tämän lääkkeen kolmella syöpäsolun riviä (LNCaP, AsPC-1, ja L428-solut) tutkittiin tarkemmin kautta transcriptome ja metabolomiikka analyysejä. Metabolomic tulokset osoittivat, että oli olemassa vähennykset 26 aineenvaihduntatuotteiden olennaisen energiantuotantoa ja /tai tuotannon solun komponenttien yhteistä näillä kolmella solulinjojen seuraavat 8 tuntia M

4N hoitoa. Deep RNA sekvensointi analyysi osoitti, että oli olemassa kuusitoista geenejä, joiden ilmaisuja havaittiin moduloitu seuraavat 6 tuntia M

4N hoitoa samalla näiden kolmen solulinjoissa. Kuusi näistä 16 geenejä toiminnallisesti liittyivät 26 aineenvaihduntatuotteet kuvatulla tavalla. Yksi näistä jopa geenien koodaa CHAC1, avainentsyyminä vaikuttavat stressi polkuja sen hajoamista glutationin. Itse M

4N todettiin tukahduttaa Glutationipitoisuus ja aiheuttaa reaktiivisten happiradikaalien tuotantoa. Tiedot yleinen osoittavat, että M

4 N on syvällinen erityisiä kielteisiä vaikutuksia monenlaisia ​​syövän aineenvaihdunnan käyttöä tukevat M

4N yhdistelmä syöpähoitojen.

Citation: Kimura K, Huang RCC ( 2016) Tetra-

O

metyyli Nordihydroguaiaretic Acid Laajasti vaimentaa Cancer Aineenvaihdunta ja synergistisesti indusoi Strong syövän vaikutusta yhdessä Etoposide, Rapamysiini ja UCN-01. PLoS ONE 11 (2): e0148685. doi: 10,1371 /journal.pone.0148685

Editor: Han-Chung Wu, Academia Sinica, Taiwan

vastaanotettu 22 lokakuuta, 2015 Hyväksytty: 20 tammikuu 2016; Julkaistu: 17 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Kimura, Huang. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Tutkimukset toimitettiin NCBI BioSample tietokantaan ja määrättiin seuraavat BioSample liittymisen: SAMN04407347 (LNCaP-M4N-RNA), SAMNO4407348 (LNCaP-Ctrl-RNA), SAMN04407349 (AsPC-1-M4N-RNA), SAMN04407350 (AsPC- 1-Ctrl-RNA), SAMN04407351 (L42 8-M4N-RNA) ja SAMNO 4407 3 52 (L428-Ctrl-RNA).

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Institutes of Health ( R01DE12165), Biocuremedical, LLC, ja Dorothy jeniä Trust (P 690-C25-2407) ja RCH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Ru Chih C. Huang on pääasiallinen keksijä ja Kotohiko Kimura on keksijä patenttihakemuksen ”Termeprocol 7-Hydroxystaurosporine” (PCT WO 2011/103586 A2 – patentti sallittu 01 huhtikuu 2015). Tohtori Huang on myös pääasiallinen keksijä useita JHU patentteja M4N. JHU on vuokrannut huumeiden (M4N, Terameprocol) liittyviä patentteja, mutta ei tämä PCT WO 2011/103586 A2 Erimos Pharmaceuticals vuoteen 2017 asti Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Olemme aiemmin raportoitu, että tetra

O

metyyli nordihydroguaiaretic happo (M

4N), joka tunnetaan myös EM1421 ja terameprocol, hallussaan antiviraalista ja anti-syöpä toiminnan [ ,,,0],1-4] ja että M

4 N voisi olla potentiaalisesti käyttökelpoisia syöpälääkkeen. Osoitimme myös, että yksi pääasiallinen farmakologinen toiminta M

4N oli inhiboida SP1 transkriptiotekijän sitoutumalla GC-rikkaisiin alueisiin (SP1 konsensussekvenssit) geenin promoottorit kilpailukykyisesti SP1 [4]. Todettiin myös, että M

4N, koska tätä toimintaa, pystyi tukahduttamaan SP1-säänneltyjen

CDK1

ilmaisun ja aiheuttaa solusyklin pysähtyminen G2 vaiheessa solusyklin [4], joka suoritettiin osittain selitystä M

4 N aiheuttama syövän vastaista aktiivisuutta, kun säätelemätön kasvu pidetään yhtenä tunnusmerkkejä syöpä. Lisäksi Wang et al. osoitti, että yli-ilmentyminen SP1 helpottaneet kehittymistä ja etenemistä mahasyövän [5], lisäksi viittaa siihen, että tukahduttaminen SP1-säänneltyjen transkriptio voi aiheuttaa syövän vastaista toimintaa. Muut kuin nämä tutkimukset transkriptio esto on ollut vain muutamia liittyviä tutkimuksia farmakologisia vaikutuksia M

4N. Etenkin Pardini et al. osoittivat, että nordihydroguaiaretic happoa (NDGA, prekursoriyhdistettä M

4 N) esti mitokondrioiden elektronin liikennejärjestelmän ja vaimentaa oksidatiivisen fosforylaation [6-7]. NDGA oli ehdokkaana syöpälääke, mutta se oli lopulta osoittautunut kliinisesti sopimatonta johtuen merkittävistä sivuvaikutus. Koska samankaltaisuutta molekyylirakenne välillä M

4N ja NDGA (kuvio 1A), nämä tiedot koskevat NDGA ovat merkityksellisiä meidän tutkimuksia M

4N. Kaiken kaikkiaan nämä aiempia havaintoja M

4N näyttävät osoittavan, että M

4N saattaa olla useita farmakologisia vaikutuksia.

. Molekyylirakenteesta nordihydroguaiaretic happoa (NDGA) ja tetra-O-metyyli-nordihydroguaiaretic happo (M

4 N). B: n synergistinen solukuoleman induktioon LNCaP kudosviljelmäsoluissa. C: ohjaus, E: Etoposidi (20 uM), Ra: Rapamysiinin (20 uM), U: UCN-01 (2 uM), M: M

4N (80 uM), ME: M

4N + Etoposide, MR: M

4N + Rapamysiini, MU: M

4N + UCN-01. Solukuolema mitattiin TUNEL määrityksen ja trypaanisiniekskluusiolla määritys 24 tunnin hoidon jälkeen. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmena kappaleena. C A Chou-Talalay tontin TUNEL-positiivisten solukuoleman aiheuttama yhdistelmähoitojen LNCaP-soluissa. Yhdistelmä-indeksi (CI) 1, +1, ja 1 osoittavat synergismiksi lisävaikutus, ja antagonismia. D: vaikutus yhdistelmähoidot M

4N kanssa Etoposide tai rapamysiini selviytymisen nude (nu /nu) hiirissä orthotropically istutettiin LNCaP kasvaimia. Prosenttiosuus hiiristä, jotka ovat selvinneet mennessä tuumorin istuttamisen jälkeen osoitettiin kullekin ryhmälle.

M

4N on parhaillaan faasi I /II kliinisissä kokeissa potilailla, joilla oli eri pitkälle edennyt syöpä [8 , 9]. Tulokset näistä kliinisten tutkimusten toistaiseksi osoittavat, että M

4 N on tietty syövän vastaista aktiivisuutta, mutta ei voinut aiheuttaa remission missään näistä potilaista kehittyneitä syöpiä. Yksi useimmin yrittivät strategiaa kasvattaa syövän vastaisen tehokkuuden kemoterapiaa huumeita on yhdistelmä käsittely yhdellä tai useammalla sopivasti valittu lääkkeitä [10]. Tärkeä havainto päässä kliinisissä tutkimuksissa M

4 N on, että toksisuus oli erittäin alhainen [8, 9]. Potilaat sietivät suuria annoksia M

4N mahdollisimman vähän sivuvaikutuksia, jotka tekevät tätä lääkettä hyvin sopiva ollessa käytettäväksi monilääke hoitoja (esimerkiksi LD

50 M

4N hiirille on suurempi yli 1000 mg /kg kun taas NDGA on vain 75 mg /kg [11, 12]). Optimointi monilääke hoitoja tarvitaan syvää tietoa farmakologinen mekanismeja syövän vastaisen toimien lääkkeitä voidaan käyttää yhdistelmänä. Kuitenkin tarkkaa mekanismia syövän vastaista aktiivisuutta M

4 N on edelleen suurelta osin tuntemattomia. Vaikeus ymmärtää farmakologian M

4 N on juurtunut, että tämä huume voi odottaa vaikuttavan useita biokemiallisia toimintaa, koska sen farmakologisen kohteen, SP1 transkriptiotekijän, ohjaa lukuisia talon pitäminen geenejä [13]. Koska itse asiassa, tutkimus 22633 tunnettujen geenien Ensemble Human Genome tietokanta (https://www.ensembl.org/index.html) osoitti, että hieman yli puolet (52,5%) sisälsi SP1 sitovan motiivin niiden välittömässä (500bp) ylävirran alueilla.

tässä tutkimuksessa ensin käyttänyt parhaamme löytää tietyn lääkkeen yhdistelmä, jossa M

4N joka saavutettiin lupaavia syövänvastainen tehoa kudosviljelmässä ja hiiri vierassiirrekokeissa. Näiden ponnistelujen olemme menestyksekkäästi havainneet, että M

4N yhdistelmä hoitoja Etoposide ja Rapamysiini pystyivät täysin poistaa ortotooppisesti istutettu LNCaP johdettu kasvaimia ja etäpesäkkeitä nude-hiirissä. M

4N yhdistelmä käsitellyillä hiirillä oli 100% eloonjääneitä 100 päivän kuluttua kasvaimen istutuksen. Vertailun kaikissa muissa ajoneuvoissa tai yksittäinen lääke käsitellyissä hiirissä ei hengissä kauemmin kuin 30 päivää istutuksen jälkeen. Tämä havainnollistaa ylimääräisessä kyvystä M

4N parantaa syövän vastaista tehokkuutta yhdistämällä hoitoja. Ymmärtää farmakologinen mekanismeista, tutkimme biokemiallisia ja fysiologisia vaikutuksia M

4 N hoidon syöpäsolujen avustuksella suuren suorituskyvyn seulontamenetelmiä kuten GC /LC-MS (kaasukromatografia /nestekromatografia-massaspektroskopia) -pohjainen aineenvaihduntatuotteen määritys ja syvä RNA sekvensoinnilla. Koska tavoite molekyylejä M

4 N voisi olla lukuisia luonteen vuoksi sen farmakologinen aktiivisuus kuin SP1 estäjä, suurikapasiteettisten seulonta sen valtuudet kerätä tietoja tilasta lukuisia aineenvaihduntatuotteiden ja mRNA: ta kerran oli erittäin hyödyllistä tulkita monimutkainen M

4N aktiivisuutta. Tutkimuksemme on tähän mennessä paljastanut, että oli huomattava väheneminen aineenvaihduntatuotteiden välttämättömiä kasvaimen kasvua kaikilla kolmella syöpäsolulinjoissa tutkittu jälkeen lyhyen ajan M

4N hoitoa, ja että synergistinen induktio kaspaasi pilkkominen ja nopea reaktiivisia happiradikaaleja tuotanto tapahtui M

4N käytettiin toisen syöpälääkkeiden yhdistelmänä.

tulokset

synergistinen induktion syövänvastainen vaikutus M

4N-pohjainen yhdistelmähoito

arvioimme käyttö M

4N useita lääkeyhdistelmä hoitoja soluviljelmäkokeita ja paljaan hiiren ksenografti-tutkimukset. Näissä tutkimuksissa käytettiin LNCaP ihmisen eturauhassyövän solulinja pääasiallisena kokeellisen aineiston, koska sitä on käytetty eläinmalleissa metastaattisen eturauhassyövän [14]. Lisäksi on osoitettu, että syövän geneettisiä mutaatioita usein tapahtunut LNCaP-solulinjasta [15], mikä viittaa siihen, tämä solulinja toimii samalla tavalla syöpien kliinisissä asetuksia, jotka joutuvat usein eri geenimutaatioita aikana etenemistä [16]. Pilottitutkimuksena määrittää sopivin lääkkeitä voidaan käyttää yhdessä M

4N kliinisiin sovelluksiin, valitsimme kolme syöpälääkkeet, nimittäin Etoposide [17], Rapamysiini [18], ja UCN-01 [19] ja arvioitiin syövän vastaisen tehoa yhdistelmähoidot ja näiden lääkkeiden LNCaP-soluissa käyttäen sekä TUNEL määrityksen ja trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Tulokset (kuvio 1 B) osoittivat, että M

4 N synergistisesti solukuolema kaikkien kolmen syöpälääkkeiden tutkittu. Chou-Talalay juoni [20] vahvistettiin, että kaikki yhdistelmähoidot olivat suuresti synergistinen (kuvio 1 B). Lisäksi määrä solukuoleman havaittujen trypaanisinieksluusiolla määritys ylittivät joka havaitsee TUNEL määrityksessä (kuvio 1A), mikä osoittaa, että TUNEL-negatiivinen solukuolemaa ollut merkittävä rooli synergistinen solukuoleman, erityisesti M

4N yhdistelmä hoidon Rapamysiinin. Yhdistelmä hoidot olivat tehokkaita paneelia syöpäsolun linjat, jotka valittiin niiden geneettinen monimuotoisuus (S1 Kuva). Tehostemateriaalit kuolema kuitenkaan ei havaittu HL-1, normaali hiiren sydänlihaksen solulinja (meidän julkaisematon data). Annoksen pienentäminen indeksi (DRI) ja LNCaP osoitettiin S2 kuvassa. Hyöty yhdistelmähoidot arvioitiin myös käyttämällä ksenograftin hiirillä LNCaP kasvaimia. Eloonjäämisaste käyrä (kuvio 1 D) osoitti, että kaikki LNCaP kasvain hiirillä, jotka saivat yhdistelmää M

4N kanssa Etoposide tai Rapamysiini selviytyi yli 100 päivää tuumorin implantaation jälkeen, kun taas yksikään saaneista yhdellä lääkkeen selvisi yli 34 päivää johtuu useista etäpesäkkeitä [21]. Lisäksi useat muut ksenograftin hiiret vahvistivat, että M

4N-pohjainen yhdistelmä hoidot olivat tehokkaita useissa syöpäsolulinjoissa muu kuin LNCaP [22]. Tiedot yleinen osoitti paremmuus yhdistelmähoidot verrattuna yhden lääkehoidot ja se osoitti, että M

4N tuntui toimivan hyvin erilaisten lääkeaineiden joiden farmakologiset mekanismit niiden syövänvastainen aktiivisuus olivat hyvin erilaisia ​​keskenään.

yhdistetty hoito M

4N indusoi kaspaasi-7 pilkkominen

Tutkiakseen mahdolliseen osallistumiseen caspases solukuoleman mekanismeja M

4 N yhdistelmähoidot [23], tutkimme kaspaasi pilkkominen profiilin LNCaP-soluissa yksittäisen lääkkeen (M

4N, etoposidi, Rapamysiini tai UCN-01) ja M

4N yhdistelmä (M

4 N /Etoposide, M

4 N /Rapamysiini, ja M

4N /UCN-01) hoitoja Western blot -analyysillä. Kerta-lääkehoidot, UCN-01, mutta ei Etoposide tai Rapamysiini voimakkaasti aktivoitunut caspases-9, -3, ja -7 (kuvio 2 aa ja 2AB). Toisaalta, ainoastaan ​​pieni määrä kaspaasi-9 ja -3 aktiivisuutta havaittiin seuraavat tahansa M

4 N yhdistelmähoidot (kuvio 2 aa). Ilmeisesti M

4N häiritsi kykyä UCN-01 aktivoimaan kaspaasi-9 ja -3. Päinvastoin, Western blot-analyysi kaspaasi-7 (kuvio 2 aa) osoittivat, että M

4N ei estä pilkkominen tämän kaspaasin mukaan UCN-01. Lisäksi pilkkominen kaspaasi 7 ilmennyt myös seuraavia M

4 N /Etoposide hoitoa ja vähäisemmässä määrin seuraavat M

4 N /Rapamysiini hoitoon (kuvio 2 aa ja 2AB). Kolorimetristä kaspaasi-7-aktiivisuus (kuvio 2B) vahvisti tulokset Western blot-analyysi (kuvio 2 aa ja 2AB). Nämä tiedot yleistä osoittivat, että yhdistelmähoidot aktivoitu kaspaasi 7 paljon enemmän kuin mikään yksittäinen lääkehoitoa. Mielenkiintoista joko UCN-01 hoidon tai M

4 N yhdistelmähoidot tuotti kaksi erilaista kaspaasi-7-fragmentit, suuri (p30) ja pieni (p17) fragmentti (kuvio 2 aa ja 2AB). Boucher

et al

. osoitti, että yksi tärkeimmistä toiminnoista kaspaasin 7 oli pilkkomiseksi ja inaktivoimaan poly-ADP riboosi-polymeraasi (PARP) [24]. Tästä syystä tutkimme pilkkomisen PARP soluissa käsitelty M

4N-pohjainen yhdistelmä hoitoja. Tiedot (kuvio 2 aa) osoitti, että kaiken kaikkiaan huomattavasti suurempi PARP pilkkominen havaittiin soluja käsiteltiin yhdistelmähoidot kuin yhden lääkehoitoon. Lisäksi tiedot osoittivat myös, että yhdistelmä hoito M

4N kanssa Etoposidi tai UCN-01 tuotti suuremman määrän sekä P89 ja p24-fragmentteja kuin että Rapamysiinin. Tämä data sopinut kaspaasin 7 liittyvät tiedot (kuvio 2A ja 2B), mikä osoittaa, että kaspaasi-7-aktiivisuus oli suurempi yhdistelmähoidon sisältävien Etoposidi tai UCN-01 kuin että Rapamysiini.

AB: Analyysi kaspaasin -riippuvaisella solukuoleman mekanismeja aiheuttama yhdistelmähoidot M

4N kanssa Etoposide, Rapamysiini tai UCN-01. Aa Ab: lohkaisu kaspaasi-3, -4, -7 ja -9 yhdessä poly-ADP riboosi-polymeraasi (PARP) LNCaP-soluja käsiteltiin yhdistelmähoidot 17 tuntia. p-Actin käytettiin kontrollina. B: Caspase-7 entsyymiaktiivisuus LNCaP hoitaa yhdistelmähoidot 13 tuntia. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmena kappaleena. A B: C: ohjaus, E: Etoposidi (10 uM), Ra: Rapamysiinin (10 uM), Ra30μM: Rapamysiinin (30 uM), U: UCN-01 (2 uM), M4N: M

4N (80 uM ), ja Casp: Caspase. C: Effect of yhdistelmähoidot mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨ

m). LNCaP-soluja käsiteltiin M

4N (80 uM) yhdessä Etoposidi (10 uM), Rapamysiiniä (10 uM), tai UCN-01 (2 uM) 4 tuntia. ΔΨ

m mitattiin JC-1 väriaine. Kuvassa näkyy suhdeluvut saadaan jakamalla intensiteetti 568 nm-virityksen valoa (J-aggregaatit) kyseisen 488 nm-virityksen valoa (J-aggregaatit + monomeeri). Väripalkkia näkyy oikealla puolella luku (H: korkea, L: alhainen suhde).

aktivoituminen mitokondrioiden liittyvän kaspaasi-9/3-riippuvaista solukuolemaa mekanismi on liittyy yleensä depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨ

m) [25]. Tästä syystä seuraava kokeita käyttäen JC-1 väriaine mitata ΔΨ

m (kuvio 2C). JC-1 väriaine kokeet osoittivat, että UCN-01 hoito, mutta ei Etoposide tai Rapamysiini indusoi depolarisaatio ΔΨ

m lyhyessä ajassa. Vielä tärkeämpää on se osoitti myös, että M

4N indusoi hyperpolarisaa- ΔΨ

m ja esti depolarisaation ΔΨ

M aiheuttama UCN-01.

M

4N hoito alasajaa autophagy

autophagy on prosessi, joka heikentää vaurioituneet tai tarpeettomat solun komponentteja varten kierrättämällä niitä resursseja, ja aktivoidaan ravinteiden puutteesta olosuhteet osana solun puolustusmekanismit [26]. LC3B-II ekspressio on laajalti tiedetään korreloivan hyvin autophagic aktiivisuus ja sitä käytetään indikaattorina autophagy [27] .western blot tiedot (kuvio 3A), osoittivat, että M

4N tukahdutetaan LC3B-II net muodostuminen lähes kokonaan, mikä osoittaa, että M

4N estyy autophagy. Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus M

4N ekspressioon BNIP3 mukaan pohjoisen ja Western blot. BNIP3 on BH3 vain proteiinia ja sen tiedetään olevan osallisena sekä apoptoosin ja autophagy [28-30]. Koska BNIP3 indusoivat hypoksia, sen ilmentyminen tutkitaan sekä normoxic ja hypoksinen olosuhteet. Hoito M

4N 6 h vähentää tehokkaasti sekä mRNA ja proteiini ilmentymistä BNIP3 (kuvio 3B ja 3C), mikä osoittaa, että M

4 N tukahdutetaan

BNIP3

ilmaisu transkriptiotasolla. Tiedot osoittivat myös, että M

4N pystyi tukahduttaa pohjapinta sekä hypoksian indusoima

BNIP3

lähes nolla (kuvio 3C). Lisäksi Western blotting (kuvio 3C) osoitti, että M

4N ei muuttanut ilmaus BNIP3L, proteiini liittyy BNIP3 [28]. Vaikutus M

4 N ilmentymistä koskevat ATG5, avainasemassa autophagy koneet [31], tutkittiin sitten ja western blot-analyysi (kuvio 3D) osoitti, että M

4 N merkittävästi tukahdutti ATG5 ilmentymistä alle 18h . Tiedot siten osoittanut, että M

4 N tukahdutti autophagy muuntamalla useiden solun komponenttien ratkaiseva autophagic mekanismeja, kuten ATG5 ja BNIP3.

V: vaikutus M

4N on autophagy LNCaP-soluissa. Ilmentyminen LC3B-I ja II tutkittiin Länsi-blottauksella LNCaP-soluissa käsitelty yhdistelmähoidot M

4N etoposidia, rapamysiini, tai UCN-01 18 tuntia, kun läsnä on bafilomysiini

1 ( 100 nM), joka on autophagosome hajoamisen estäjä. Bafilomysiini

1 lisättiin mitata net aktiivisuuden autophagy. Pitoisuudet M

4 N, etoposidi, rapamysiini, ja UCN-01 olivat 80, 20, 20, ja 5 uM vastaavasti. C: Ohjaus, E: etoposidi, Ra: rapamysiini, U: UCN-01. B: mRNA ilmaus

BNIP3

geeni, tutkittiin Northern-blottauksella, LNCaP-soluissa käsiteltiin M

4N (80 uM) alle normoxic tai hypoksinen ehto 2 tai 6 tuntia. Hyp: hypoksinen kunnossa. C: n ilmentyminen BNIP3 ja BNIP3L, tutkinut western blotting, LNCaP-soluissa käsiteltiin M

4N (80 uM) alle normoxic tai hypoksinen edellytys 6 tai 18 tuntia. D: n ilmentyminen ATG5, tutkinut western blotting, LNCaP-soluissa käsiteltiin M

4N (80 uM) 18 tunnin ajan. β-Actin käytettiin kontrollina.

M

4 N laajasti moduloi metaboliareitit

ymmärtää mekanismia synergiaa syöpää torjuva vaikutus (kuvio 1, S1 kuvassa) , solu sisältö biokemiallisten metaboliittien ja profiileja mRNA tutkittiin etsivät mahdollisia fysiologisia muutoksia seuraaviin M

4N hoito LNCaP ihmisen eturauhassyöpään, AsPc-1 ihmisen haimasyövän, ja L428 ihmisen Hodgkinin lymfooman soluissa. Ensin tutkittiin, mikä vaikutus M

4 N on aineenvaihduntatuote sisällöstä näissä soluissa (suorittamien Metabolon, Co. Ltd) [32]. Aineenvaihduntatuotteen määritys (S1 taulukko) osoittivat laajaa vaikutteita M

4N eri pääasiallinen metaboliareitteihin. Koska pula erityisen aineenvaihduntatuotteiden on merkittävämpiä vaikutuksia solujen fysiologiaa kuin runsaasti niitä, valitsimme aineenvaihduntatuotteita, joiden solun sisältöä johdonmukaisesti vähentää M

4N vähintään kaksi kolmesta solulinjojen ja muuttu- mattomia tai määrittelemätön vuonna kolmas (kuvio 4).

LNCaP, AsPC-1 ja L428-soluja käsiteltiin M

4N (pakotettiin 80 um) 8 tuntia ja metaboliitin sisällön näytteistä mitattiin LC /GC massaspektroskopia by Metabolon (S1 taulukko). Niistä aineenvaihduntatuotteita tutkittiin vain aineenvaihduntatuotteita, joiden sisältö oli merkitsevästi (p≤0.05) tukahdutti M

4N vähintään kaksi kolmesta solulinjat valittiin ja lueteltu tässä ja edellyttäen lisäksi, että vaikutus M

4N sisällöstä aineenvaihduntatuotteiden kolmannella solulinjassa oli tukahduttaminen, ei merkittävää muutosta tai ei tutkittu. ”M /C” osoittaa suhde metaboliitin sisältöjä käsitellyt näytteet M

4N vs. kontrolli. N. A. ilmaisee ”tietoja ei ole saatavilla”. Poikkeuksia varten nämä säännöt olivat ADP ja UDP-glukoosi (jonka sisältö molemmat tukahdutti M

4N kahdessa kolmesta solulinjojen mutta ero oli tilastollisesti merkitsevä vain yhdessä kahden solulinjan. Kolmannessa solulinjassa tietoja ei ollut saatavilla). Numerot suhteelle tummennetut vihreänä osoittaa, että aineenvaihduntatuotteen sisältö oli tilastollisesti pienempi käsitellyssä näytteissä kuin kontrolli, kun taas ilman sävyjä mukaan ei ollut tilastollista eroa ohjaus ja käsiteltyjen näytteiden.

Monet TCA cycle-metaboliittien (sitraatti, sukkinaatti, fumaraatti ja malaatti) on tyhjentynyt, jonka M

4N käsittely (kuvio 4). Vain pitoisuus α-ketoglutaraatin lisääntyi hieman M

4 N joukossa TCA-sykli-metaboliittien (S1 taulukko). Vaikutus M

4 N on Glukolyysissä /glukoneogeneesia metaboliittien oli vaihteleva riippuen solulinjasta (S1 taulukko) vaikka sisältö glukoosi-6-fosfaatti ja glukoosi-1-fosfaatti johdonmukaisesti vähennettiin M

4N jälkeen (kuvio 4). Glukoosi-1-fosfaatti muutetaan UDP-glukoosin glukosyylitransferaasia reaktioita UTP. Sisällön sekä UDP-glukoosi ja UTP väheni M

4N sekä (kuvio 4), mikä osoittaa, että aineenvaihdunta liittyy glukoosi-6-fosfaatti /glukoosi-1-fosfaatti /UDP-glukoosia yleistä tukahduttaa M

4N. Pitoisuus 3-fosfoglyseraattia, keskeinen metaboliittia glukolyysin /glukoneogeneesiä polku, lisääntyi merkitsevästi M

4N LNCaP-soluissa, mutta ei AsPC-1 tai L428-soluissa, kun taas sisältö pyruvaatti, joka on myös keskeinen Glykolyysivaiheen aineenvaihduntatuote, lisääntyi merkitsevästi M

4 N AsPC-1 ja L428-soluissa, mutta ei LNCaP (S1 taulukko). Tämä osoitti, että vaikka vaikutus M

4N on Glykolyysivaiheen metaboliittien oli vaihteleva riippuen solulinjoissa, M

4N pysähtynyt Glykolyysivaiheen kaikissa kolmessa solulinjoissa tutkittiin ja kertynyt jonkin verran glykolyysiin liittyviä metaboliittien kuten 3-fosfoglyseraatti ja pyruvaatti. Samaan aikaan sisällön laktaatin johdonmukaisesti vähentää M

4N jälkeen (kuvio 4), joka osoitti, että muuntaminen pyruvaatin laktaatti tukahdutettiin M

4N. Johtopäätöksenä liittyvät tiedot hiilihydraattiaineenvaihdunnan (kuvio 5A) yleinen osoitti, että M

4 N vähensi sisältöä TCA cycle liittyvien aineenvaihduntatuotteet taas kertynyt tietty Glykolyysivaiheen metaboliittien ja siten indusoi cataplerosis (cataplerosis on määritelty tässä metabolisen sairaus, joka ilmenee alla pulaa TCA cycle liittyvien aineenvaihduntatuotteet) [33].

A: kaava glycolysis-, TCA-cycle-, ja mitokondrioiden elektroni liikennejärjestelmään liittyviä metaboliareitti. Raakadata aineenvaihduntatuotteen määritys on esitetty S1 taulukossa. Valinta S1 Taulukko löytyy kuvassa 4. ylöspäin osoittavat nuolet osoittavat, että sisältö aineenvaihduntatuotteiden liittyy näihin nuolet olivat huomattavasti (p≤0.05) aiheuttama M

4N vähintään kaksi kolmesta solulinjojen (LNCaP, AsPC-1, ja L428-solut) edellyttäen lisäksi, että vaikutus M

4 N sisällöstä näiden metaboliittien kolmannella solulinjassa oli induktio ilman tilastollista merkittävää eroa, ei merkittävää muutosta tai ei tutkittu . Samaan aikaan alaspäin osoittava nuolet osoittavat, että sisältö aineenvaihduntatuotteiden liittyy näihin nuolet olivat huomattavasti (p≤0.05) tukahdutti M

4N vähintään kaksi kolmesta solulinjojen (LNCaP, AsPC-1, ja L428-solut) ja edellyttäen lisäksi, että vaikutus M

4 N sisällöstä näiden metaboliittien kolmannella solulinjassa oli tukahduttaminen ilman tilastollista merkittävää eroa, ei merkittävää muutosta tai ei tutkittu. Poikkeuksia näiden sääntöjen on glukoosi-6-fosfaatti (jonka pitoisuus tukahdutettiin M

4N kaikissa kolmessa solulinjoissa, mutta ero oli tilastollisesti merkitsevä vain L428-soluissa), 3-fosfo- (jonka pitoisuus oli merkittävästi indusoi M

4N LNCaP muttei AsPC-1 ja L428-solut) ja pyruvaattia (jonka pitoisuus oli merkittävästi indusoi M

4 N AsPC-1 ja L428-soluissa, mutta merkittävästi tukahdutti LNCaP-soluissa). 3-fosfo- ja pyruvaatti on merkitty niihin liittyvien ylöspäin osoittavat nuolet koska tiedot (S1 taulukko) osoitti, että M

4 N kertyneet nämä aineenvaihduntatuotteet ja pysähtynyt glykolyysin, vaikka kuinka M

4N vaikuttaa näiden metaboliittien muuttuja riippuen solulinjasta (katso teksti). Vaikutus M

4 N ATP-pitoisuus koko soluissa on esitetty kuviossa 6A. Vaikutus M

4 N on NDUFS1 ilmentyminen on esitetty kuviossa 6C. Osoittava tulos lisäys mRNA: n ilmentymisen on fosfoenolipyruvaattikarboksikinaasi 2 (PCK2) ja asparagiini-syntaasi (ASNS) M

4N (80 uM) hoitoon 6 tuntia oli syvä RNA sekvenssianalyysi on esitetty taulukossa 1. B: kaava rasvan metaboliareitti. Merkitykset ylöspäin ja alaspäin osoittavat nuolet tässä schema ovat samat kuin ne, jotka skeema glucolysis-, TCA-cycle-, ja mitokondrioiden elektroni liikennejärjestelmään liittyvää metaboliareitti (kuvio 5A). Pitkäketjuisten rasvahappojen asyyli-karnitiini sisältää palmitoyylikarnitiini (16: 1) ja oleoylcarnitine (18: 1). Kun rasvahapot hajoavat kautta β-hapetus-kierto, ne täytyy muuntaa asyyli-karnitiinien voidaan kuljettaa sisällä mitokondrioissa. Siten tulokset osoittivat, että M

4N pitäisi tukahduttaa β-hapetus syklin vähentämällä tuotantoa pitkäketjuisten asyyli-karnitiinien.

Metaboliittia tiedot osoittivat myös, että M

4 N vähensi sisältöä aspartaatin kaikissa kolmessa solulinjoissa (kuvio 4). Koska aspartaatti valmistetaan joko oksaaliasetaatti jonka transaminaatiolla reaktion tai fumaraatti kautta adenylosukkinaatin, M

4N välittämää cataplerosis (kuviot 4 ja 5A) oli heikentyneen tuotannon aspartaatti [33]. Aineenvaihduntatuotteen data osoitti lisäksi, että M

4 N moduloitu rasva-aineenvaihduntaan samoin. Vaikka M

4 N eri moduloitu sisällön erityyppisistä lipideistä riippuen solulinjoissa (S1 taulukko), M

4 N johdonmukaisesti vähentää sisällön pitkäketjuiset asyyli-karnitiinia, kuten palmitoyylikarnitiini ja oleoylcarnitine (kuvio 4), ja lisännyt sisällön karnitiinin ja sen johdannaisten kaikissa kolmessa solulinjoissa (S1 taulukko). Koska pitkäketjuiset asyyli-karnitiini on välttämätöntä kuljettamiseen pitkäketjuisten rasvahappojen throughthe mitokondrion kalvon [34] tulokset osoittivat, että M

4N pitäisi vähentää β-rasvahappojen hapettumista (kuvio 5B).

M

4 N tukahduttaa energia-aineenvaihduntaa

Pardini

et al

. osoittivat, että NDGA, prekursoriyhdistettä, johon M

4N perustuu, esti mitokondrioiden elektronin liikennejärjestelmän [6-7], joka viittaa siihen, että M

4 N voi moduloida energia-aineenvaihduntaan (kuviot 4 ja 5, ja S1 Taulukko ) vaikuttamalla mitokondrioita. Tämän hypoteesin testaamiseksi, luminenssi perustuvan entsymaattinen määritys suoritettiin mittaamaan koko solun ATP-pitoisuus LNCaP käsiteltiin M

4N. Määrityksessä (kuvio 6A) osoitti, että M

4 N vähensi ATP sisältöä 5 h. AMPK tiedetään toimivan solun signalointi anturi ATP, ADP, ja AMP ja aktivoidaan (fosforyloidun), kun suhde AMP /ATP-pitoisuus on korkea [35, 36]. Suhde AMP /ATP täydennettiin M

4 N hoidon jälkeen AMP pitoisuus oli muuttumattomana M

4N mukaista hoitoa metaboliitin määritystä (S1 taulukko). Kuten odotettua, western blot-analyysi osoitti, että M

4 N indusoi ilmentymistä sekä täydellistä AMPK ja sen fosforyloitua muotoa (T174) 5 h (kuvio 6B), mikä osoittaa, että AMPK aktivoitiin M

4 N ja M

4N saaneilla solut ravintoa ATP. NADH dehydrogenaasi (ubikinonin) Fe-S-proteiinin 1 (NDUFS1) on alayksikkö mitokondrion kompleksin I On osoitettu, että toiminta elektronin liikennejärjestelmän vaimennetaan, kun geeni, joka koodaa tätä proteiinia, on mutatoitunut [37]. Olemme havainneet, että ilmentyminen NDUFS1 tukahdutettiin LNCaP-soluissa, sen jälkeen 5 h M4N jälkeen (kuvio 6C), mikä osoittaa, että M

4N pystyi häiritä tiettyjä osia elektronin liikennejärjestelmää. Hyperpolarisaa- ΔΨ

m pidetään yleisesti olla ehto liittyy tukos elektronin liikennejärjestelmän ja alhainen ATP sukupolvi [38]. Näin ollen tuloksena JC-1 väriaine Edellä kuvattujen kokeiden (kuvio 2C) sekä muut mitokondrioiden liittyvät tiedot on kuvattu tässä (kuvio 6) tuettu edellä mainitun oletuksesta, että M

4N sekä NDGA oli inhibitorinen vaikutus mitokondrion elektronin liikennejärjestelmän [6, 7], tukahduttaa oksidatiivisen fosforylaation ja vähentää solujen ATP sisältöä. Vaihtoehtoisesti lasku ATP voisi olla seurausta M

4N riippuva väheneminen glykolyyttisiä muutostilassa. Kuvio 5A tiivistää vaikutus M

4 N on TCA kierto /elektroni liikennejärjestelmään liittyviä metabolisms. Sukkinaattidehydrogenaasi joka muuntaa sukkinaatin fumaraattimuotoon TCA cycle tunnetaan myös tärkeä osa monimutkaisia ​​II elektronin liikennejärjestelmän. Kiinnostavaa sisältöä sekä sukkinaattia ja fumaraatin vähensi merkittävästi M

4N (kuvio 4), mikä osoittaa, että M

4 N tukahdutti metabolista aktiivisuutta sekä TCA sykli ja elektronin liikennejärjestelmän. Kuviossa 7 esitetty vaikutus M

4 N on nukleiinihappoa läheisesti aineenvaihdunta, joka perustuu metaboliitin tietoja (kuvio 4, S1 taulukko) ja ATP-määritys (kuva 6A). Sen lisäksi vähentää määrää ATP (kuvio 6A), sisältö nukleosiditrifosfaattien kuten CTP, GTP ja UTP myös laski M

4N kun taas esiaste aineenvaihduntatuotteiden nukleosiditrifosfaatte- kuten CMP, GMP, UMP, adeniini, guanosiini, ja sytidiinin olivat kaikki kertyneet jälkeen M

4N hoitoa. [14].