Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisääntynyt glutationin (GSH) ja tioredoksiini (Trx) aineenvaihdunta ovat mekanismeja, jotka ovat laajalti sekaantuneet kestävyys syövän solut kemoterapiaa. Nykyinen tutkimus määritti jos samanaikainen estäminen GSH ja Trx aineenvaihduntaa parantaa solun tappaminen ihmisen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) soluissa järjestelyihin oksidatiivista stressiä. Esto GSH ja Trx aineenvaihduntaa kanssa butioniinisulfoksimiini (BSO) ja auranofin (AUR), tässä järjestyksessä, indusoi merkittävää laskua klonogeeniset eloonjääminen verrattuna kummallakaan lääkkeellä yksin Fadu, Cal-27 ja SCC-25 HNSCC solujen

in vitro

ja

in vivo

Cal-27 ksenografteissa. BSO + AUR huomattavasti glutationin ja tioredoksiinista hapettumista ja tukahdutti peroxiredoxin aktiviteetti

in vitro

. Esikäsittely N-asetyylikysteiini täysin päinvastainen BSO + AUR aiheuttaman solukuoleman Fadu ja Cal-27-solut, kun taas katalaasi ja seleeni supplementation vain esti BSO + AUR aiheuttaman solukuoleman Fadu soluissa. BSO + AUR laski kaspaasi 3/7 aktiivisuutta HNSCC soluissa ja vähensi kannattavuutta sekä Bax /Bak kaksoispoistuma (DKO) ja DKO-Bax rekonstruoitu hematopoieettisia soluja viittaa siihen, että kuolion oli mukana. BSO + AUR myös merkittävästi herkistynyt Fadu, Cal-27, SCC-25 ja SQ20B solujen soluntappokyky indusoi EGFR estäjä Erlotinibi

in vitro

. Nämä tulokset tukevat päätelmää, että samanaikainen estäminen GSH ja Trx aineenvaihdunnan polkuja aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja klonogeeniset tappaminen HNSCCs ja tämä strategia voi olla käyttökelpoinen herkistävät HNSCCs EGFR estäjiä.

Citation: Sobhakumari A, Love-Homan L , Fletcher EVM, Martin SM, Parsons AD, Spitz DR, et al. (2012) herkkyys ihmisen pään ja kaulan syöpäsolut yhdistettyyn esto Glutationi ja tioredoksiini Metabolism. PLoS ONE 7 (10): e48175. doi: 10,1371 /journal.pone.0048175

Editor: Jinah Choi, University of California, Merced, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 21 syyskuu 2012; Julkaistu: 31 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Sobhakumari et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health Avustukset K01CA134941 (ALS), R01CA133114 ja P30CA086862 (DRS), sekä osastot patologian ja Radiation Oncology yliopiston Iowa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittynyt vastustuskyky kemoterapia on merkittävä este onnistuneen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) käsittely. Alkuvaiheen HNSCC potilailla on suuri riski sairastua sekundaarikasvaimia jälkeenkin paikallinen säätö saavutetaan [1] – [3], siis ymmärtäminen molekyylimekanismeja solunsalpaajahoidon vastus syöpäsoluissa voisi johtaa parannuksiin potilaan selviytymistä.

Lisääntynyt glutationin (GSH) ja tioredoksiini (Trx) aineenvaihdunta ovat mekanismeja, jotka ovat laajalti sekaantuneet kemoterapian resistenssin [4] – [7] ja molemmat aineenvaihdunnan reittejä tärkeä rooli reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) vieroitus [ ,,,0],8] – [11]. GSH järjestelmä toimii kautta glutationiperoksidaasi (GPX) entsyymejä, jotka inaktivoivat H

2O

2 ja muut hydroperoksideilla (mukaan lukien alkyyli- ja lipidiperoksidipitoisuus) muuntamalla GSH glutationi disulfidi (GSSG), joka muunnetaan takaisin GSH by glutationireduktaasi (GR) käyttäen NADPH ([12], kuvio 1A). TRX-järjestelmä on mukana vieroitus H

2O

2 ja Hydroperoksidit toiminnan välityksellä peroxiredoxins (Prx). Tämän prosessin aikana hapettunut Trx (Trx [S

2]) muodostuu joka sitten vähennetään tioredoksiinista reduktaasin (TR) myös käyttämällä vähentää vastineet NADPH (kuvio 1A [13]).

V: NADPH on lähde vähentää vastineet glutationin, joka koostuu pelkistyneen glutationin (GSH), glutationi disulfidi (GSSG), glutationiperoksidaasi (GPX), ja glutationireduktaasi (GR) ja tioredoksiini, joka koostuu vähentää tioredoksiinin [Trx (SH)

2], tioredoksiini disulfidi [Trx (S

2)], peroxiredoxin (Prx), ja tioredoksiini reduktaasi (TR). BSO estää γ-glutamylcysteine ​​ligaasia (GCL), joka katalysoi reaktiota välillä kysteiinin ja L-glutamaatin muodostamiseksi γ-glutamyyli-kysteiini. Glutathione syntetaasin (GS) muuntaa γ-GCS osaksi GSH. AUR estää TR aktiivisuutta. Fadu, Cal-27 ja SCC-25-soluja käsiteltiin 0,5 uM AUR ja /tai 1 mM BSO 24 h ja analysoitiin yhteensä GSH (B) ja TR aktiivisuus (C). Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM) N = 3 kokeissa *, p 0,05 verrokkiin nähden.

Useat tutkimukset ovat vuosien varrella tutkittu strategioita erikseen estämällä GSH tai Trx aineenvaihdunnassa lisäksi tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden, mutta ovat tuottaneet vaihtelevia tuloksia, [14] – [16], mikä johtuu todennäköisesti tarpeeton suojaavia tehtäviä näiden järjestelmien [17] – [20]. Koska molemmat järjestelmät myrkyllisyyden H

2O

2 ja käyttää NADPH vähentävän vastineet, on loogista, että molemmat GSH ja Trx järjestelmät ovat päällekkäisiä ja tarpeettomia toimintoja vieroitus ROS. Voittamiseksi redundanssia Näitä reittejä kuin ne liittyvät vastustuskyvyn hoidon HNSCC, nykyinen tutkimus määritti samanaikaisesti estämällä sekä GSH ja Trx aineenvaihduntaa käyttämällä butioniinisulfoksimiini (BSO; estäjä GSH synteesi), ja auranofin (AUR; estäjä TR aktiviteetti

in vitro

ja

in vivo

. Tämä strategia todettiin olevan erittäin tehokkaasti parantaa oksidatiivisen stressin välittämä kasvainsolujen tappaminen ja parantaa herkkyyttä Erlotinibi kemoterapiaa.

Materiaalit ja menetelmät

solut ja viljelyolosuhteet

Fadu, Cal-27 ja SCC-25 ihmisen pään ja niskan levy- karsinooma (HNSCC) solut saatiin American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). SQ20B HNSCC soluihin [21] olivat lahja tri Anjali Gupta (Department of Radiation Oncology, University of Iowa). Kaikki HNSCC solulinjat olivat p53 mutantti. HNEpC solut saatiin Promocell (Heidelberg, Saksa). Kaikki solulinjat todistaa oikeaksi ATCC elinkelpoisuutta (ennen jäädyttämistä ja sulatuksen jälkeen), kasvu, morfologia ja isoenzymology. Solut säilytettiin mukaan tavarantoimittajan ohjeiden ja käyttää yli aikana enintään 3 kuukautta elvytys jäädytettyä erät. Bax /Bak double-pudotuspelit (DKO) ja DKO-Bax rekonstruoitu hiiren hematopoieettisten solujen oli antelias lahja tri Craig Thompson (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA). Fadu, Cal-27 ja SQ20B soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), joka sisälsi 4 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 1,5 g /l natriumbikarbonaattia ja 4,5 g /l glukoosia 10% naudan sikiön seerumia (FBS ; Hyclone, Logan, UT). SCC-25-soluja ylläpidetään 01:01 seos Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa ja Hamin F12 -alustassa, joka sisälsi 1,2 g /l natriumbikarbonaattia, 2,5 mM L-glutamiinia, 15 mM HEPES, 0,5 mM natriumpyruvaattia, 4,5 g /l glukoosia, ja 400 ng /ml hydrokortisonia, jossa on 10% naudan sikiön seerumia. DKO ja DKO-Bax-soluja ylläpidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 g /ml streptomysiiniä ja 50 uM 2-merkaptoetanolia. HNEpC soluja ylläpidettiin hengitystie-epiteelin kasvun Medium (Promocell), joka sisälsi 4 ui /ml naudan aivolisäkeuutetta, 10 ng /ml epidermaalista kasvutekijää, 5 ug /ml insuliinia, 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 0,5 ug /ml epinefriini, 6,7 ng /ml trijodi-L-tyroniini ja 0,1 ng /ml retinoiinihappo. Viljelmiä ylläpidettiin 5% CO

2 ja kostutettiin 37 ° C inkubaattoriin.

Lääkehoito

Pegyloitu katalaasin (CAT), staurosporiinille (STS), ionomysiinillä (ION) ja L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (BSO) saatiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Auranofin (AUR) saatiin ICN Biochemicals (Aurora, OH). Erlotinibi (ERL) markkinoidaan Tarceva ja N-asetyylikysteiini (NAC) markkinoidaan Acetadote (Cumberland Pharmaceuticals, Nashville TN), saatiin sairaalahoidossa apteekki Iowan yliopistossa sairaaloita ja klinikoita. Kaikki lääkkeet käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Lääkkeet lisättiin soluille lopulliset pitoisuudet 1 mM BSO, 0,5 uM AUR, 20 mM NAC, 1000 U /ml CAT, 10 uM ERL, 10 uM STS ja 100 uM ION. BSO, CAT, ja SEL liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). AUR, STS, ERL ja ION liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Tarvittava määrä kunkin lääkkeen lisättiin soluviljelyalustoihin soluihin halutun lopulliset pitoisuudet. Ajoneuvo kontrollia sisällytettiin kuhunkin kokeeseen.

Glutathione määritys

pelkistettyä glutationia (GSH) ja glutationi disulfidia (GSSG) määritettiin käyttäen kaupallista glutationia iinianalyysikitissä (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) . Kaikki glutationi määritykset normalisoituivat proteiinipitoisuus koko homogenaattien käyttäen Bradfordin menetelmällä.

tioredoksiinista reduktaasin Pitoisuus

tioredoksiinista reduktaasin (TR) aktiivisuus määritettiin spektrofotometrisesti käyttäen kaupallista tioredoksiinista reduktaasin iinianalyysikitissä (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Proteiinipitoisuudet määritettiin Bradfordin menetelmällä.

elinkykyyn

Solujen elinkyky mitattiin käyttämällä Prestoblue ™ elinkykyyn reagenssia (Invitrogen, USA) valmistajan protokollan.

klonogeeniset solujen eloonjäämistä kokeita

klonogeeniset eloonjääminen määritettiin aikaisemmin kuvatulla [21]. Yksittäiset määritykset suoritettiin useita laimennoksia ainakin neljä kloonauksen ruokia datapistettä kohti, toistettu vähintään 3 erillisestä kokeesta.

siRNA Transfektio

tioredoksiinista reduktaasin (TR) ja ohjaus siRNA ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). HNSCC solut transfektoitiin 20 nM siRNA 80% konfluenssiin rajoitetun seerumin Eaglen Minimum Essential Medium (EMEM, Santa Cruz, CA) 24 tuntia. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) käytettiin transfektioissa seuraavia protokollia valmistajan toimittamia. Biokemialliset analyysit suoritettiin 48-72 h transfektion jälkeen.

kaspaasi 3/7 Activity

kaspaasi 3/7 aktiivisuus arvioitiin käyttäen ApoTox-Glo ™ Triplex Assay (Promega Corporation, Madison WI) .

tioredoksiini redox western blots

tioredoksiini Western blotit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22] – [25]. Soluja inkuboitiin joko 2 mM dl-ditiotreitolia (DTT) tai 2 mM H

2O

2 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, ennen inkubaatiota 50 mM IAA voidaan käyttää valvontaa apuna tunnistamisessa tioredoksiinin redoksitilassa bändejä.

glutationireduktaasin (GR) Pitoisuus

GR-aktiivisuus mitattiin menetelmällä, ovat kuvanneet Mavis ja Stellwagen [26]. Data normalisoitiin per mg proteiinia määritettynä Lowryn proteiinikokeella.

glutationiperoksidaasi (GPX) Activity

Seleeni riippuvainen GPX-aktiivisuus mitattiin kuten aiemmin on kuvattu [27]. Data normalisoitiin per mg proteiinia määritettynä Lowryn proteiinikokeella.

Peroxiredoxin Activity Assay

2-Cys-Peroxiredoxin aktiivisuus mitattiin kuten on kuvattu [28]. Lyhyesti, alkunopeus NADPH: n hapettumista seurattiin spektrofotometrisesti 340 nm: ssä 30 ° C: ssa reaktioseoksessa (150 ui), joka sisälsi 50 mM Hepes-NaOH (pH 7,0), 0,25 mM NADPH: ta, 46 nM TR, 2,4 mM Trx ja 0,13 mmol H

2O

2. Reaktio aloitettiin lisäämällä H

2O

2 ja seurataan 10 minuutin ajan.

katalaasi Activity Assay

CAT-aktiivisuus mitattiin soluhomogenaattien seuraamalla häviäminen 10 mmol /LH

2O

2 50 mmol /l kaliumfosfaattia (pH = 7,0) spektrofotometrisesti 240 nm. Toiminta ilmaistiin mk yksikköä /mg proteiinia, kuten on kuvattu [29].

Kasvaimen soluistutusryhmä

nainen 4-5 viikkoa vanhoja kateenkorvattomiin-nu /nu-nude-hiiret hankittiin Harlan Laboratories (Indianapolis , SISÄÄN). Hiiriä pidettiin patogeenivapaassa este tilaa Animal Care Facility Iowan yliopistossa ja hoidetaan käyttämällä aseptisia menettelyjä. Kaikki toimenpiteet hyväksynyt IACUC komitean Iowan yliopistossa ja sopeutui asetettujen sääntöjen NIH. Hiirten annettiin vähintään 3 päivää sopeutua ennen alkaa kokeilu, ja ruokaa ja vettä oli vapaasti saatavilla. Kasvainsolut istutettiin nude-hiiriin injektoimalla subkutaanisesti 0,1 ml: n erillä suolaliuosta, joka sisälsi 4 x 10

6 Cal-27-soluja oikeaan kylkeen käyttämällä 26-gaugen neula.

kasvaimen mittauksen

in vivo

kokeissa hiiret alkoivat lääkehoitoa 1 viikon kuluttua kasvaimen istuttamisen kasvaimen keskimääräinen tilavuus 0,025 cm

3. Hiiriä arvioitiin päivittäin ja kasvaimen mittaukset kolme kertaa viikossa käyttäen Vernier jarrusatulat. Kasvaintilavuudet lasketaan kaavalla: kasvaimen tilavuus = (pituus x leveys

2) /2, jossa pituus on pisin ulottuvuus, ja leveys oli ulottuvuus kohtisuoraan pituuteen.

In vivo

lääkkeet hallinto

hiiret jaettiin 4 ryhmään (n = 6-10 hiirtä /ryhmä). BSO ryhmä: BSO liuotettiin suolaliuokseen ja annettiin 400 mg /kg i.p. joka päivä 2 viikkoa. AUR ryhmä: AUR kantaliuos laimennettiin suolaliuoksella ja annettiin i.p. 1 mg /kg joka päivä 2 viikkoa. BSO + AUR ryhmä: hiirille annettiin 400 mg /kg BSO plus 1 mg /kg AUR i.p. joka toinen päivä 2 viikon ajan. Kontrolliryhmä: hiirille annettiin suolaliuosta päivittäin i.p. Hiiret tapettiin CO

2 kaasua tukehtumisen tai tappava yliannos natriumpentobarbitaalia (100 mg /kg), kun kasvain halkaisija ylitti 1,5 cm missään ulottuvuus.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi oli tehdään käyttäen GraphPad Prism versio 5 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Erot 3 tai enemmän keinoja määritettiin yksisuuntaisella ANOVA Tukey post-testit. Lineaarinen sekoitettu vaikutuksia regressiomalleja käytettiin arvioida ja verrata ryhmäkohtaiset muutos kasvaimen kasvukäyrät. Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin p 0,05 tasolla merkitys.

Tulokset

BSO ja AUR laski GSH synteesiä ja TR aktiviteetti

BSO ja AUR ovat laajalti tunnettuja estäjiä solu GSH synteesi ja TR aktiivisuus vastaavasti kuten on havainnollistettu yksinkertaistetussa kaavamainen kuviossa 1A. Vahvista nämä vaikutukset BSO ja AUR in HNSCC soluissa, eksponentiaalisesti kasvava Fadu, Cal-27 ja SCC-25-soluja käsiteltiin 1 mM BSO ja /tai 0,5pM AUR 24 tuntia sitten analysoitiin yhteensä GSH tasoilla ja TR toimintaa. GSH tuotantoa merkittävästi köyhdytetty sekä BSO ja BSO + AUR käsitellyt solut kaikissa 3 solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että BSO oli todellakin kykenee inhiboimaan GSH synteesiä (kuvio 1 B). BSO myös merkitsevästi lisääntynyt TR aktiivisuus Fadu ja SCC-25-solujen ja osoitti suuntaus kohti kasvoi TR aktiivisuus Cal-27-solut (kuvio 1 C). Lisäksi TR aktiivisuus estyi AUR ja BSO + AUR käsitellyissä soluissa vahvistetaan vaikutusmekanismi AUR (kuvio 1 C). AUR lisäsi myös GSH tuotannon kaikissa 3 solulinjoissa (kuvio 1 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että BSO ja AUR estävät GSH tuotanto ja TR aktiivisuus vastaavasti 24 tunnin kuluttua hoidon HNSCC soluissa

in vitro

.

BSO ja AUR laski solujen elinkelpoisuuden ja klonogeeniset selviytymisen

tutkimiseksi sytotoksisia vaikutuksia BSO ja AUR on HNSCC soluihin, solujen elävyyden ja klonogeeniset selviytymistä testattiin jälkeen BSO ja AUR hoito eksponentiaalisesti kasvavissa Fadu, Cal-27 ja SCC-25-soluissa. BSO ja AUR yksittäisinä aineina ei aiheuttanut merkittävää vähenemistä aineenvaihdunnan solujen elinkelpoisuuden vaikka lisäys elinkelpoisuutta havaittiin BSO hoitoon (Cal-27 ja SCC-25-solut) ja AUR hoito (in Fadu soluissa, kuvio 2A). Sen sijaan yhdistelmä BSO ja AUR vähensi solujen elinkelpoisuuden kaikki 3 solulinjoissa verrattuna muihin hoitoryhmiin (kuvio 2A). Samoin merkittäviä klonogeeniset soluntappokyky havaittiin yhdistelmällä BSO ja AUR kaikki 3 solulinjoissa verrattuna kumpaakin annettaisiin erikseen viittaa siihen, että BSO ja AUR on käytettävä samanaikaisesti saadakseen aikaan solukuoleman HNSCC soluissa (kuvio 2B) . Kun solujen elinkelpoisuus vastauksena BSO + AUR testattiin yli 24 tunnin ajan, vaikutti siltä, ​​että huomattavia vähennyksiä solujen elinkelpoisuutta ei havaittu vasta 16 h (Cal-27 ja SCC-25) ja 24 h (Fadu) käsittelyn jälkeen (kuvio 2C). Sen sijaan merkittävä väheneminen klonogeeniset selviytymisen vastauksena BSO + AUR alkoi näkyä heti 1 tunnin käsittelyn jälkeen SCC-25-solujen ja 4 h kuluttua hoidon Fadu soluissa (kuvio 2D). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että seuranta muutoksia solujen elinkelpoisuuden ajan funktiona ei välttämättä vastaa huumeen aiheuttama soluntappokyky mitattuna pesäkkeenmuodostuskyvyn. Olemme lisäksi havaittu, että BSO + AUR-indusoitu sytotoksisuus mitattiin klonogeenisten määrityksessä, oli merkittävästi vähemmän konfluentteja HNSCC soluissa verrattuna eksponentiaalisesti kasvavia syöpäsolujen (kuvio 3A) viittaa siihen, että BSO + AUR oli tehokkaampi eksponentiaalisesti kasvavissa soluissa. Lisäksi, Fadu solut olivat huomattavasti herkempiä kuin normaalin ihmisen epiteelisolujen (HNEpCs) ja BSO + AUR 24 tunnin kuluttua, mikä viittaa siihen, että BSO + AUR oli ensisijaisesti myrkyllistä HNSCC solut verrattuna normaaleihin ”transformoimattomien” soluja (kuvio 3B). Kaikkiaan tulokset sekä kannattavuuden ja klonogeeniset kokeet viittaavat siihen, että BSO + AUR näyttävät johtavan yli lisäaine solukuoleman Fadu, Cal-27 ja SCC-25-solujen

in vitro

.

Fadu, Cal-27 ja SCC-25-soluja käsiteltiin 0,5 uM AUR ja /tai 1 mM BSO 24 tuntia ja analysoitiin solujen elinkykyisyys (A) ja klonogeenisten solujen eloonjääminen (B). Soluja käsiteltiin kuten edellä on mainittu ja elinkelpoisuuden (C) ja klonogeenisten solujen eloonjääminen (D) mitattiin ajan 8 h (klonogeeninen selviytymisen, [D]) tai 24 h (elinkelpoisuus, [C]). Virhepylväät edustavat standardi keskivirhe (SEM) ja N = 3 kokeissa. *, P 0,05 vs. kontrolli; ¥, p 0,05 versus BSO tai AUR.

V: Eksponentiaalinen viljely ja yhtyviä Fadu, Cal-27 ja SCC-25-soluja käsiteltiin 0,5 uM AUR ja /tai 1 mM BSO 24 tuntia ja analysoitiin klonogeeniset selviytymisen. Klonogeenisten solujen eloonjääminen data normalisoitiin eksponentiaalisesti kasvavia ja konfluentteja kontrollisoluja (ei esitetty). B: Fadu ja HNEpC soluja käsiteltiin BSO + AUR määrä ja elinkelpoisten kiinnittyneitä soluja laskettiin 24 tunnin kuluttua. Numbers elinkelpoisten BSO + AUR käsiteltyjä soluja normalisoitiin niiden valvontaa (CON). Virhepylväät edustavat standardi keskivirhe (SEM) ja N = 3 kokeissa. *, P 0,05 versus EXP; ¥, p 0,05 versus CON.

tioredoksiinista reduktaasin (TR) Knockdown säteilyherkälle Fadu solujen BSO

Vahvista AUR aiheuttamiin muutoksiin sytotoksisuuden johtuivat tukahduttaminen TR aktiivisuuden , TR ilmentyminen tippuu alas siRNA suunnattu TR Fadu soluissa ja käsitelty tai ilman BSO 24 tuntia. TR pudotus johti merkittävään poistaminen TR (taulukko 1) ja herkistyneet Fadu solujen BSO määritettynä klonogeenisten määrityksessä (kuvio 4). Nämä tulokset tukevat edelleen hypoteesia, että esto Trx aineenvaihdunnan herkistää HNSCC solujen solun tappaminen läsnäollessa estäjiä GSH aineenvaihduntaan.

TR ilmentymistä pudotettiin vuonna Fadu soluissa käyttämällä siRNA suunnattu TR ja analysoitiin klonogeeniset selviytymisen ja ilman 1 mM BSO hoitoa 24 tuntia. Klonogeeniset Eloonjääntitulokset normalisoitiin valvonta (CON). Virhepylväät edustavat standardi keskivirhe (SEM) ja N = 3 kokeissa. *, P 0,05 vs. kontrolli; ¥, p 0,05 versus BSO tai SITR.

BSO + AUR aiheuttama nekroottinen solukuolema

sytotoksinen vaste BSO + AUR voitiin havaita morfologisesti käyttämällä faasikontrastimikroskopiaa . Cal-27-solujen käsitelty BSO ja /tai AUR vain 6 tuntia pyöristettiin ja irrotettiin kudosviljelylautasiin verrattuna BSO tai AUR-käsitellyt solut, jotka oli kiinnitetty ja näytti ehjä (kuvio 5A). Samat huomiot nähtiin Fadu ja SCC-25-soluja (tietoja ei esitetty). Sen määrittämiseksi, apoptoosin tai nekroosin oli mukana BSO + AUR-solukuolema, analysoimme kaspaasi 3/7 toimintaa vastauksena BSO ja /tai AUR 24 h Fadu ja Cal-27 soluihin. Solut, jotka käsitelty staurosporiini (STS, 10 uM, 6 h) ja ionomysiinin (ION, 100 uM, 6 h) käytettiin positiivisina kontrolleina apoptoosin ja kuolion vastaavasti. Olemme havainneet, että AUR huomattavasti kaspaasi 3/7 aktiivisuus verrattuna hallita käsiteltyjä soluja vain Cal-27-soluissa (kuvio 5B). Kuitenkin BSO + AUR merkittävästi vähentynyt kaspaasi 3/7 aktiivisuus Fadu ja Cal-27-soluissa, mikä oli verrattavissa ionomysiinillä käsitellyissä soluissa (kuvio 5B), mikä viittaa siihen, että nekroosi eikä apoptoosia oli mukana mekanismi solukuoleman. Tueksi Näiden tulosten me lisäksi tutkittiin vaikutusta BSO + AUR on Bax

– /- Bak

– /- kaksinkertainen knock out (DKO) hiiren hematopoieettisia soluja. Apoptoottisen reitin kumotaan vuonna DKO soluissa geneettisellä poistetaan proapoptoottisten tekijät, Bax ja Bak tekee nämä solut riippuvat kuolion altistuessaan tappava solvausten [30]. Käytimme myös DKO-soluja, jotka oli rekonstruoitu Bax (DKO-Bax) transfektiolla vektorilla, joka sisältää Bax (pCDNA3 /Bax), kuten aiemmin on kuvattu [30]. Liuottaminen Bax osaksi DKO soluihin on osoitettu palauttaa niiden herkkyyden apoptoottisille ärsykkeille [30], [31]. Havaitsimme, että BSO yksinään ei vaikuttanut elinkelpoisuutta joko DKO tai DKO-Bax soluissa (kuvio 5C). Kuitenkin, DKO-Bax, mutta ei DKO-solut olivat erittäin herkkiä AUR hoitoon (kuvio 5C), joka tukee ennalta raportoi, että AUR indusoi apoptoottisen vasteen [32]. Sekä DKO ja DKO-Bax-solut olivat erittäin herkkiä BSO + AUR viittaa siihen, että nekroosia on solukuolemareitin mukana vastauksena BSO + AUR (kuvio 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että BSO + AUR annoksina ja käsittelyajat Näissä tutkimuksissa käytetyt aiheuttama nekroottisen solukuoleman.

V: Faasikontrasti- kuvia Cal-27-solut otettiin 6 h hoidon 0,5pM AUR ja /tai 1 mM BSO. B: Fadu ja Cal-27-soluja käsiteltiin 0,5 uM AUR ja /tai 1 mM BSO: ssa 24 tuntia, sitten analysoitiin kaspaasi 3/7, jossa käytetään luminesenssia määritystä. Cell hoito staurosporiinille (STS) ja ionomysiinin (ION) 6 tuntia käytettiin positiivisina kontrolleina apoptoosin ja nekroosin vastaavasti. Kaikki hoidot olivat normalisoitu hallita. *, P 0,05 vs. kontrolli; ¥, p 0,05 versus BSO tai AUR. C: Bax /Bak kaksoispoistuma (DKO) solut ja DKO solujen rekonstruoitu Bax (DKO-Bax) käsiteltiin 0,05 mmol BSO ja 2 uM AUR 24 tuntia sitten analysoidaan solujen elinkelpoisuus. Virhepylväät edustavat standardi keskivirhe (SEM) ja N = 3 kokeissa. *, P 0,05 vs. kontrolli; ¥, p 0,05 versus BSO tai AUR; £, p 0,05 versus DKO soluja.

BSO + AUR aiheuttama GSH ja Trx hapetus

Koska kasvu hapettunut GSSG (% GSSG) uskotaan merkitsevän siirtymistä korkeasti hapettava solunsisäinen ympäristö osoittaa oksidatiivisen stressin [12], tutkimme muutokset% GSSG vastauksena BSO ja AUR. BSO + AUR indusoi merkittävää kasvua% GSSG verrattuna BSO ja AUR yksin Fadu soluissa, kun taas sekä BSO ja BSO + AUR käsiteltyjen ryhmien indusoi merkittävää kasvua% GSSG vertailuryhmän Cal-27-solut (kuvio 6A). Analyysi tioredoksiini-1 (Trx-1) redox western blot kokeet osoittivat, että hoito BSO + AUR in Fadu soluissa johti lisääntymiseen hapettunut Trx-1 (TRX1 [S

2] ja TRX1 [S

2 ]

2) ilmaisu katsottuna lisääntynyt ilmentyminen ylemmän 2 bändejä kuvassa 6B verrattuna muihin hoitoryhmissä. Samanlainen vaikutus havaittiin Cal-27-soluissa vasteena BSO + AUR hoitoa, vaikka kokonaismäärä Trx (alennettu + hapetettu), näytti olevan vähemmän kuin muissa hoitoryhmissä (kuvio 6B). Ennen raportit ovat osoittaneet, että vähennys yhteensä Trx ilmentyminen voi johtua muodostumista suuria tioredoksiinin sekoittaa proteiini disulfidi kompleksit, jotka eivät pysty antamaan geeli elektroforeesin aikana [23]. Me vahvisti tämän inkuboimalla BSO + AUR saaneilla lysaatit DTT vähentää mitään sekoittaa proteiinia disulfideina ennen analyysiä alentuneen ja hapettunut TRX1. Olemme havainneet, että DTT on onnistunut vähentämään hapetetaan TRX1 muodostettu BSO + AUR ja palauttaa tasoa alennetaan TRX1 lähellä valvonnan tasoille sekä Fadu ja Cal-27-solut (kuvio 6B), mikä viittaa, että seka-proteiini disulfidit on muodostettu vastauksena BSO + AUR. Lopuksi, muutokset aktiivisuudessa muita GSH ja Trx liittyviä entsyymejä, kuten glutationireduktaasi (GR), glutationiperoksidaasi (GPX) ja peroxiredoxin (Prx) vastauksena BSO ja AUR tutkittiin Fadu ja Cal-27 soluihin. Ei tapahtunut merkittäviä muutoksia GR (kuvio 7A) tai GPX (kuvio 7B) vastauksena BSO + AUR kummassakaan solulinjassa verrattuna kontrolliin. Prx aktiivisuus oli lisääntynyt BSO saaneilla Cal-27-soluissa mutta merkittävästi vaimentaa AUR ja BSO + AUR saaneista Fadu ja Cal-27-solut (kuvio 7C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että BSO + AUR aiheuttamaa oksidatiivista stressiä kautta lisääntynyt GSH ja Trx hapettumista HNSCC soluissa.

A, B: Fadu ja Cal-27-soluja käsiteltiin 0,5 uM AUR ja /tai 1 mM BSO 24 h, sitten analysoitiin prosentteina glutationin disulfidia (% GSSG, (A)) ja tioredoksiini redox tilan (B). Dithiotrietol (DTT, 2 mM) tai 2 mM H

2O

2 lisättiin 15 min hallita lysaatit positiivisina kontrolleina alennetaan ja hapettuneen tioredoksiinista vastaavasti (B). *, P 0,05 vs. kontrolli (CON); ¥, p 0,05 versus BSO tai AUR.

A-C: Fadu ja Cal-27-soluja käsiteltiin 0,5 uM AUR ja /tai 1 mM BSO 24 tuntia, sitten analysoitiin glutationireduktaasin (GR) aktiivisuus (A), glutationiperoksidaasi (GPX) aktiivisuus (B), ja peroxiredoxin aktiivisuus (C). Virhepylväät edustavat standardi keskivirhe (SEM) ja N = 3 kokeissa. *, P 0,05 verrokkiin nähden.

BSO + AUR aiheuttama sytotoksisuuden estyy antioksidantit

analysoimiseksi edelleen rooli oksidatiivisen stressin BSO + AUR aiheuttama solun tappaminen, Fadu ja Cal-27-soluja esikäsiteltiin 20 mM NAC (tioli antioksidantti) 1 tunnin aikana ja sitä ennen BSO + AUR hoitoa, sitten analysoitiin klonogeenisten selviytymisen. NAC kykeni täysin kääntämään sytotoksiseksi aiheuttama BSO + AUR vuonna Fadu ja Cal-27 soluihin viittaa siihen, että esto BSO + AUR indusoi oksidatiivista stressiä kautta häiriöihin tioli aineenvaihdunnassa (kuvio 8A). Sen vahvistamiseksi, että H

2O

2 oli mukana BSO + AUR aiheuttama sytotoksisuuden, Fadu ja Cal-27-soluja esikäsiteltiin 1 tunti 1000 U /ml pegyloidun katalaasin (CAT) ennen hoidon BSO + AUR. CAT merkittävästi käänteinen BSO + AUR aiheuttama sytotoksisuuden Fadu soluissa mutta ei Cal-27-solut (kuvio 8A). Analyysi CAT toiminnan BSO + AUR versus CAT + BSO + AUR-käsitellyissä soluissa paljasti, että hoito CAT eivät lisääntyneet CAT aktiivisuutta Cal-27 soluja verrattuna Fadu soluihin (kuvio 8B), mikä viittaa siihen, että CAT ehkä ole riittävästi kirjattu soluja. Lisäksi Cal-27-solut hallussaan huomattavasti suurempi CAT-aktiivisuuden verrattuna Fadu soluihin (kuvio 8B). Kaikkiaan tulokset kuvissa 6, 7 ja 8 tukevat hypoteesia, jonka H

2O

2 indusoimaan disrutions in tiolia aineenvaihdunnan johtavat oksidatiivista stressiä ovat mukana solun tappaminen aiheuttama BSO + AUR ihmisen HNSCC soluissa.

: Fadu ja Cal-27-soluja käsiteltiin 20 mM NAC tai 1000 U /ml pegyloidun katalaasin (CAT) 1 tunnin ajan ennen ja sen aikana 24 h hoidon 0,5 uM AUR ja /tai 1 mM BSO. Drug käsiteltyjä soluja mitattiin solujen elinkelpoisuuden. Kaikki hoidot olivat normalisoitu hallita. B: BSO + AUR ja CAT + BSO + AUR saaneista Fadu ja Cal-27-solut analysoitiin CAT-aktiivisuus. Virhepylväät edustavat standardi keskivirhe (SEM) ja N = 3 kokeissa. *, P 0,05 vs. kontrolli; ¥, p 0,05 versus BSO + AUR; **, P 0,05 versus vastaavaan hoitoa Fadu soluissa.

BSO + AUR tukahdutettu Cal-27 kasvaimen kasvua

in vivo

aktiivisuutta BSO ja AUR Cal-27 syöpäkasvaimia sisältävistä kateenkorvattomissa nude-hiirissä tutkittiin. Tulokset osoittivat, että hiiret, joita käsiteltiin 400 mg /kg BSO yhdistettynä 1 mg /kg AUR i.p. vuorokaudessa 10 vuorokauden ajan, osoitti kasvaimen kasvun estoa verrattuna kontrolliin ja BSO käsiteltyjen kasvainten (kuvio 9A) ilman haitallisia vaikutuksia kehon paino (kuvio 9B) vahvistaa tulokset nähdään

in vitro

. Vaikka BSO + AUR-käsitellyt tuumorit osoittivat suuntaus hitaampi kasvu verrattuna AUR-käsiteltyjen kasvainten, tämä ero ei ollut merkitystä (kuvio 9A).

A, B: Kateenkorvattomia (nu /nu) hiirillä Cal-27 ksenograftikasvaimissa käsiteltiin alkaa keskimäärin kasvaimen 0,025 cm

3 450 mg /kg BSO ip ja /tai 1 mg /kg AUR i.p. päivässä 10 päivän ajan. Kontrollihiiret saivat 10% etanolia suolaliuoksessa i.p. päivässä 10 päivän ajan. Kasvaimen tilavuus (A) ja paino (B) mitattiin päivänä 1, 3, 5, 8, 10 ja 12 hoidon. Data pistettä edustavat keskiarvot 10 hiirtä. B: Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM) N = 3 kokeita. *, P 0,05 versus CON.

BSO + AUR herkistyneet HNSCC solujen Erlotinibi

Koska vastustuskyvyn kemoterapeuttisten aineiden, kuten EGFR: n estäjien, on merkittävä rajoitus HNSCC hoidossa [33], päätimme jos BSO + AUR olisi herkistää konfluentteja HNSCC solujen EGFR estäjä Erlotinibi. Olemme havainneet, että BSO ja AUR kun niitä käytetään yksin eivät pystyneet herkistämään soluja erlotinibi (10 uM, 24 h (kuvio 10)). Kuitenkin BSO + AUR huomattavasti herkistynyt kaikissa solulinjoissa testattu Erlotinibi (kuva 10) viittaa siihen, että BSO + AUR tulee käyttää yhdessä EGFR: n estäjien maksimaalisen kemoterapian herkistymistä.

Confluent Fadu, Cal-27, SCC-25 ja SQ20B soluja käsiteltiin 1 mM BSO ja tai 0,5pM AUR yhdessä 10 uM Erlotinibi (ERL) 24 tuntia. Klonogeeniset solujen selviytymistä tiedot normalisoitiin valvonta (CON) soluja. Virhepylväät edustavat standardi keskivirhe (SEM) ja N = 3 kokeissa. *, P 0,05 versus CON; ¥, p 0,05 versus CON, BSO ja AUR; £, p 0,05 versus ERL; §, p 0,05 verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmissä.

Keskustelu

Lisääntynyt GSH ja Trx aineenvaihduntaan ovat olleet tiedossa jo vuosia korreloivan korkea kasvaimen aggressiivisuutta ja kestävyys kemoterapiaa [4 ] – [7]. Seurauksena tästä tiedon, estyminen GSH tai Trx yhdessä kemoterapian kanssa on laajasti tutkittu, mutta on hyvin solulinja erityisiä ja on tuottanut pettymyksen, joka voi johtua päällekkäisiä ja tarpeettomia antioksidantti toiminnot GSH ja Trx järjestelmät [17 ] – [20]. Itse asiassa, meidän ennen tutkimukset ovat osoittaneet, että kyky BSO tai AUR herkistää HNSCC solujen Akt-inhibiittorit on hyvin joka on spesifinen [16].