Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA-vaurioita vastaus kinaasi ATR voi olla hyödyllinen syövän terapeuttinen kohde. ATR esto synergoi menetys ERCC1, ATM, XRCC1 ja DNA vahingoittamatta solunsalpaajiin. Kliiniset tutkimukset ovat alkaneet käyttää ATR-inhibiittorit yhdessä sisplatiinin kanssa. Kirjoittajat raportoivat ensimmäinen synteettinen kuolleisuutta näytön yhdistelmällä hoitoa ATR estäjän (Atri) ja sisplatiinia. Yhdistelmähoito kanssa Atri /sisplatiinia on synteettisesti tappava menetys TLS polymeraasin ζ ja 53BP1. Muut DNA: n korjaukseen reittejä, mukaan lukien homologisen rekombinaation ja yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä niillä ole synteettisiä tappava vuorovaikutus ATRI /sisplatiini, vaikka menetys joitakin näistä korjaus reittien herkistää soluja sisplatiinin yhtenä-ainetta. Olemme myös ilmoittaa, että ATRI voimakkaasti synergoi PARP esto jopa homologisen rekombinaation-taitavia taustoja. Lopuksi ATR inhibiittorit pystyivät resensitize sisplatiinilla resistenttejä solulinjoja sisplatiinia. Nämä tiedot tarjoavat kattavan analyysin DNA korjaukseen väyliä, joilla on synteettinen kuolleisuutta ATR estäjien yhdistettynä sisplatiinin kemoterapiaa, ja auttaa ohjaamaan potilaan valinnan strategioita ATR estäjät edetä syöpä klinikalle.

Citation: Mohni KN, Thompson PS, Luzwick JW, Glick GG, Pendleton CS, Lehmann BD, et al. (2015) synteettinen Lethal Screen Osoittaa DNA korjaus Pathways että Kiinnitetään syöpäsolujen Yhdistetty ATR esto ja sisplatiinia Hoidot. PLoS ONE 10 (5): e0125482. doi: 10,1371 /journal.pone.0125482

Academic Editor: Robert W. Sobol, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 16 marraskuu 2014; Hyväksytty 18 maaliskuuta 2015 Julkaistu: toukokuu 12, 2015

Copyright: © 2015 Mohni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Institutes of Health [CA102792 DC, T32CA093240 että KNM, CA95131 ja JAP], Susan G. Komen [SAC110030 ja JAP, PDF14302198 että KNM] ja Breast Cancer Research Foundation [DC]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA vahingoittamatta solunsalpaajiin kuten sisplatiini ovat hoidon taso hoitoja moniin kiinteitä kasvaimia kuten triple-negatiivinen rintasyöpä (TNBC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Nämä aineet toimivat asettamalla lisääntynyt riippuvuus DNA-vaurioita vastauksista selviytymisen ja leviämistä. Mutaatiot DNA korjaus geenit ovat yleisiä TNBC ja NSCLC, ja genomin tutkimukset osoittavat merkittävää genomin epävakautta osajoukko TNBC viittaa puutteita DNA: n korjaukseen [1-5]. TNBC on usein hyvä ensimmäinen vastaus kemoterapiaa lukien platina huumeiden mutta potilaat lähes poikkeuksetta relapsi ja voivat kehittää resistenssin [6, 7]. NSCLC potilaat saavat platinaa ensilinjan lääke ja yleensä elää alle vuoden [8].

DNA-vaurioita vastaus kinaasia ATR (ATM- ja Rad3 liittyvä) koordinoi monia soluvasteiden DNA-vaurioita ATR on välttämätöntä vakauttaa pysähtynyt replikointi haarukat ja anna haarukka uudelleenkäynnistyksen jälkeen vahinkoja [9]. Koska ATR, pysähtynyt replikointi haarukat romahtaa double katkeamisen, mikä voi johtaa genomista uudelleenjärjestelyihin tai solukuolemaan [10, 11]. ATR aktivointi tarvitaan myös hidastamaan solusyklin antaa aikaa korjata, fosforylaation kautta sen efek- kinaasin CHK1 [9]. ATR on olennainen kinaasi, ja monet syöpäsolut ovat lisääntynyt riippuvuus ATR kompensoimiseksi onkogeenin aiheuttaman replikaation stressiä [12-14].

valikoiva ATR-inhibiittoreita ovat kuvanneet Vertex Pharmaceuticals [15, 16] ja AstraZeneca [17] ja on tällä hetkellä vaiheen I kliinisissä kokeissa yhdistelmänä DNA vahingoittamatta kemoterapiaa huumeiden tai sädehoitoa. Tunnistaa jossa genominen yhteydessä ATR estäjiä voitaisiin parhaiten käyttää monoterapiana olemme aiemmin tehty synteettinen tappava siRNA seulomaan geenien kun inaktivoitu herkistyneet solut ATR esto. Inaktivointi ERCC1-XPF endonukleaasi sekä menetys tunnettujen ATR-reitin proteiinit ja DNA: n replikaation proteiinien voimakkaasti herkistyneet solut ATR inhibition [18]. ATR estäminen on myös synteettisesti tappava menettäminen XRCC1 ja ATM sekä yliekspressio sykliini E [18-21].

ATR esto synergoi DNA vahingoittamatta kemoterapiaa huumeiden, kuten sisplatiinin ja gemsitabiinin tappaa syöpäsoluja [15 19]. ATR esto on osoittanut tehoa hiirimallissa haimasyövän yhdistettynä gemsitabiinin ja potilaasta peräisin keuhkojen tuumoriksenografteja yhdistelmänä sisplatiinin [16, 22]. Niinpä kliiniset kokeet sisältyy yhdistelmä hoidot ATR estäjän ja sisplatiinin, gemsitabiinin tai etoposidi (ClinicalTrials.gov: NCT02157792). Kirjoittajat raportoivat ensimmäinen systemaattinen siRNA synteettinen kuolleisuutta näytöllä yhdistämällä ATR esto ja sisplatiinihoitoon etsiä lisää kohdennettuja sovelluksia ATR estäjä yhdistettynä kemoterapiaan. Kuten odotettua, tunnistimme ATR koulutusjakson, DNA replikaatiogeenit, ja ERCC1-XPF. Ei ollut mitään lisähyötyä yhdistämällä Atri ja sisplatiinin joko homologinen rekombinaatio (HR) vajausta tai mismatch korjaus (MMR) vajausta soluja. Teimme löytää että menetys translesion DNA-polymeraaseja ja 53BP1 hyper-herkistää solut Atrin /sisplatiiniyhdistelmähoidon hoitoa. Koska inaktivoivat mutaatiot löytyvät näiden geenien syöpien, meidän tiedot viittaavat siihen terapeuttista arvoa yhdistettyyn Atrin /sisplatiiniin nämä asetukset.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja reagenssit

U2OS ja HCT-116 saatiin Stephen Elledge, elokuussa 2002. MDA-MB-468 (HTB-132), HCC1806 (CRL-2335), BT549 (HTB-122), H157 (CRL-5802), ja A549 (CCL -185) saatiin ATCC: stä ja ylläpidetään kuten aikaisemmin on kuvattu [18]. Seuraavat solulinjat on kuvattu aikaisemmin: BRCA2 vialliset ja täydentää VC8 solujen [23], HCT-116 + kromosomin 3 [24], hec59, ja hec59 + kromosomi 2 [25]. MDA-MB-468 sisplatiini-resistentit solut syntyvät jatkuva valinta sisplatiinia, ja ylläpidetään alusta täydennettynä 3 uM sisplatiinia. Sisplatiini-resistenttejä soluja kasvatettiin ilman sisplatiinin 7 päivää ennen alkua kunkin kokeen kontrolloida mitään vaikutuksia sisplatiinihoitoon. ATR-estäjä (Atri) VE-821 [19] syntetisoitiin Vanderbilt Institute for Chemical Biology Chemical Synthesis Facility. PARP-estäjä (PARPi) BMN673 [26] ostettiin Selleck Chemicals. Sisplatiini ostettiin Calbiochemistä.

Synthetic tappava siRNA näytön

Synteettiset tappava siRNA näytöllä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, me hyödyntää mukautetun siRNA kirjasto kohdistaminen 240 tunnetaan DNA: n korjaukseen ja replikaatiogeenit 4 siRNA kohden geenin 96-formaatissa. U2OS solut transfektoitiin siRNA kirjasto ja jaettu neljään 96-kuoppaisille levyille 72 tuntia transfektion jälkeen. Sitten solut joko jätettiin käsittelemättä tai käsitelty 1 uM Atri, 0,5 uM sisplatiini, tai 1 uM Atri ja 0,5 uM sisplatiinia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin jälkeen vielä 72 tuntia käyttäen alamarBlue (Invitrogen). Prosentuaalinen elinkelpoisuus määritettiin kummankin näytteen vertaamalla lääkkeellä käsiteltyjen näytteen käsittelemätön näyte kunkin geenin valvoa minkä tahansa siRNA-erityisiä vaikutuksia solujen kasvun. Tukeva z-arvoja laskettiin mediaani ja mediaani absoluuttinen poikkeama log

10 (prosenttia elinkelpoisuus) arvoja. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja vankka z-arvoja kolmesta itsenäisestä transfektioiden. Geenit valittu esiintyneen synteettinen tappava suhteita tahansa lääkehoitoon on vähintään 2 siRNA: t, joissa vankka z-arvoja alle -1,3. Atri vain varsi näytön on aiemmin julkaistu [18].

RNA-interferenssi ja solujen elinkelpoisuuden määritykset

Kaikki siRNA transfektiot suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu 10 nM siRNA ja Dharmafect 1 (Invitrogen) [ ,,,0],18]. Seuraavat siRNA-sekvenssejä käytettiin: siREV3L-2 GAAGUUAUCUGGCUGCUUU, siREV3L-4 CAAAGAUGCUGCUACAUUA, si53BP1-2 GGACAAGUCUCUCAGCUAU, si53BP1-3 GAUAUCAGCUUAGACAAUU. Ei-kohdistaminen siRNA oli Qiagen All Star Negatiivinen kontrolli. Lyhyen aikavälin solujen elinkelpoisuuden määritykset tehtiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [18]. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille 72 tuntia transfektion jälkeen siRNA ja sitten käsiteltiin lääkkeiden 72-96 tuntia kuten kuviossa legendoja. Solujen elinkelpoisuus verrattuna käsittelemättömään kontrolliin vähentämisen jälkeen tyhjä ja arvot kaikki tiedot. Suurin DMSO-pitoisuus korkeimmalla lääkeannoksen oli 0,01% ja ei ollut vaikutusta solujen kasvuun. Klonogeenisten määrityksiä, joissa U2OS solut suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27]. Kaikki solujen elinkelpoisuuden määritykset arvot edustavat keskiarvoa (n = 3) ja virhepalkit edustavat keskihajonta yhdessä kokeessa. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kaksi kertaa.

Synergy Analysis

Bliss riippumattomuus log synergiaa määriä (iM

2%) laskettiin käyttäen MacSynergy II ja raportoitu 95%: n luottamusväli yksi rinnakkaisnäytettä (n = 3) [28]. Peaks kaavion vastaavat synergiaa ja korkeampi huippu mitä voimakkaampi synergia. Isobologrammi-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [29, 30]. Fractional estävät pitoisuudet määritettiin jakamalla IC

50 Atri kiinteällä pitoisuus sisplatiinin tai PARPi IC-

50 Atri yksin (x-koordinaatti). Y-koordinaatti on kiinteä pitoisuus sisplatiini /PARPi jaettuna IC

50 sisplatiini /PARPi yksin. Kiinteä poikkiviiva kaaviossa edustaa additiivisuuteen ja arvojen alapuolella linja edustaa synergiaa. IC

50-arvot määritettiin käyttämällä Prism versio 6.

Immunofluoresenssianalyysi

Esityskielet ja määrällisesti kuten aikaisemmin on kuvattu [27].

Tulokset

ATR esto synergizes sisplatiinin ja herkistää sisplatiini-resistenttejä syöpäsoluja

ATR estäjät (Atri) osoittavat synergiaa sisplatiiniin tappavilla HCT-116 koolonsyöpäsoluihin viittaa yhdistelmiä Atri ja sisplatiinin voivat olla hyödyllisiä terapeuttisesti [15, 19] . Tämän mukaisesti tulos, kasvavia määriä Atrin vähentävät pitoisuutta sisplatiinin vaaditaan tappamaan U2OS luusarkoomasoluissa ja molemmat aineilla merkitty synergiaa lyhyen aikavälin elinkelpoisuuden määritykset (kuvio 1A ja 1B). Synergia on raportoitu 3-ulotteinen kuvaaja kanssa kaksi yhden aineet (Atri tai sisplatiini) piirretty X- ja Z mitat ja Bliss riippumattomuus tukin synergiaa tilavuus piirretään Y-mitta. Peaks kaavion vastaavat synergia korkeammat huiput osoittavat suurempia määriä synergian [28]. Synergy arvioitiin myös käyttämällä isobologram- analyysi (kuvio 1 C). Murto estävä pitoisuudet (FIC) Atri ja sisplatiinin näkyvät x-akselin ja y-akselin vastaavasti. Arvot alapuolella kiinteä viiva edustaa synergiaa. Vahvista nämä havainnot pitkän aikavälin elinkelpoisuuden määritykset, U2OS soluja käsiteltiin Atri, sisplatiinin tai Atrin /sisplatiiniyhdistelmähoidon 24, 48 tai 72 tuntia ja annettiin muodostaa pesäkkeitä 14 päivää (kuvio 1 D). Käytetyissä pitoisuuksissa, sekä Atrin ja sisplatiinia hoito yksinään hieman vähensi solujen kyky muodostaa pesäkkeitä. Atri /sisplatiiniyhdistelmähoidon vähensi pesäkkeiden muodostumisen lähes kaksi kertaluokkaa enemmän kuin yhden hoitoja yksin. Näin ollen on olemassa suuri synergiaa Atri ja sisplatiinin pitkän aikavälin elinkelpoisuuden määritykset. Lisäksi lähes kaikki solun tappava vaikutus yhdistetyn hoidon välitetty ensimmäisen 24 tunnin altistuksen, koska enää inkubointiaikoja eivät edelleen vähentää pesäkkeenmuodostuskyvyn soluista.

(A ja B ) U2OS soluja käsiteltiin kasvavia annoksia sisplatiinia tai ATR-estäjä (ATRI) yksinään tai yhdessä 72 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin Alamar Blue -väriaineen ja ilmoitetaan prosentteina käsittelemättömään kontrolliin soluja. Analyysi synergiaa sisplatiinin ja Atri käyttämällä Bliss Independence (B) ja isobologram- analyysi (C), kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. (D) U2OS soluja käsiteltiin 1 uM sisplatiinilla, 1 uM Atri, tai molemmat (ATRI + Cis); solut vapautunut media ilman lääkkeitä 24, 48 tai 72 tuntia ja annettiin muodostaa pesäkkeitä. (E) Soluja käsiteltiin 1 uM sisplatiinilla tai 1 uM Atri 24 h ajan, Atri (24 h) ja sen jälkeen sisplatiinia (24 h) A → C, tai sisplatiinin (24 h) ja sen jälkeen Atri (24 h) C → a. Virhepalkkien kaikki paneelit ovat keskihajonta (n = 3).

Seuraavaksi kysyimme, onko järjestys hoito on tärkeää synergiaa. U2OS soluja joko käsitellään Atri tai sisplatiinia yksinään 24 tunnin ajan, tai käsitelty Atri 24 tuntia ja sen jälkeen sisplatiinia 24 tunnin tai päinvastoin (kuvio 1 E). Solut, jotka käsitelty Atri, sisplatiini, tai Atrin jälkeen sisplatiinia omaavat 2-5-kertainen pieneneminen kyky muodostaa pesäkkeitä. Silmiinpistävän, solut sisplatiinia seuraa Atri osoitti 1000-kertainen väheneminen niiden kyky muodostaa pesäkkeitä. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että suurin synergia havaitaan, kun soluja käsitellään Atri ja sisplatiinin samanaikaisesti tai kun sisplatiinihoitoon edeltää Atri. Ei synergiaa ei havaittu ATRI hoitoa edeltänyt sisplatiinilla.

voimakas synergia havaittu Atri ja sisplatiini sai meidät oletuksen, että Atrin voisi resensitize sisplatiini kestävä syöpiä. Tämän ajatuksen testaamiseksi, me syntyy sisplatiini-resistenttejä MDA-MB-468 Triple rintasyöpä (TNBC) solujen jatkuva portaittain altistuminen lisääntyy sisplatiinin (kuvio 2A). Näitä soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla Atri yksinään tai yhdistelmänä 0,5 uM tai 3 uM sisplatiinin (kuvio 2B ja 2C). Kuten odotettua, emosolulinjassa näytteillä synergia 0,5 uM sisplatiinin ja oli täysin tappoi 3 uM sisplatiinin (kuvio 2D). Sisplatiini kestävä solulinjaa ei esiintynyt synergiaa 0,5 uM sisplatiinin mutta ei näytteille synergiaa 3 uM sisplatiinin, joskaan ei tasolle vanhempien soluissa (kuvio 2E). Näin ollen, ATR inhibitio pystyi resensitize sisplatiinilla resistenttejä soluja sisplatiinin, mutta nämä solut olivat vielä ole niin herkkä kuin emo-soluja. Näissä kokeissa, synergiaa havaittiin, kun Sisplatiinin alkaa vaikuttaa solujen elinkykyä (5-10 prosentin vähennys elinkelpoisuus) ja maksimaalinen synergia havaittiin, kun sisplatiinin annosta pienennetään solujen elinkelpoisuus 25-50 prosenttia käsittelemättömän ohjaus. Yllättäen sisplatiini kestävä solulinja oli hieman herkempi ATR estäjä yksin viittaa siihen, että mekanismi resistenssin sisplatiinin teki solut riippuvaisempia ATR signalointi hengissä.

(A) MDA-MB-468 (468) ja MDA-MB-468 sisplatiini-resistenttejä (468-CR) soluja käsiteltiin kasvavia annoksia sisplatiinia 96 h, ennen kuin mitattiin solujen elinkelpoisuuden kanssa alamar blue. (B ja C) MDA-MB-468 ja MDA-MB-468 sisplatiini-resistenttejä soluja käsiteltiin ATRI yksin tai ATRI ja sisplatiinia 0,5 uM (B) tai 3 uM (C) 96 tuntia, ennen kuin mitattiin solujen elinkelpoisuutta Alamar blue . (D ja E) Bliss riippumattomuus synergiaa sisplatiinin ja Atrin MDA-MD-468 (D) ja MDA-MB-468 sisplatiini-resistenttien solujen (E). Virhepalkkien kaikki paneelit ovat keskihajonta (n = 3).

tunnistaminen synteettisten tappavan yhteisvaikutukset ATRI /sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito

Tunnistaa geneettisiä tekijöitä havaitun synergiaa Atri ja sisplatiinia, teimme kolme synteettistä tappava siRNA näytöt etsiä geenejä, että kun tyhjentynyt, herkistyneet solut Atrin tai sisplatiinia yksinään sekä ATRI /sisplatiiniyhdistelmähoidon hoitoa. Käytimme mukautetun siRNA kirjasto, joka sisältää 240 tunnetaan DNA: n korjaukseen ja replikaatiogeenit 4 yksittäisten siRNA geeniä kohti erillisissä kuopissa 96-kuoppalevyillä [18]. U2OS solut transfektoitiin siRNA kirjasto. 72 tuntia myöhemmin kullekin 96-kuoppaiselle levylle on jaettu neljään 96-kuoppalevyille ja joko jätettiin käsittelemättä tai käsiteltiin 1 uM Atri, 0,5 uM sisplatiinin, tai yhdistelmä 1 uM Atri ja 0,5 uM sisplatiinia 72 tunnin ajan (kuvio 3A). Solujen elinkelpoisuus mitattiin Alamar Blue, ja prosentuaalinen elinkelpoisuus kunkin siRNA laskettiin vertaamalla Alamar Blue arvo käsitelty siRNA verrattuna käsittelemättömiin siRNA. Tämä menetelmä ohjaa mihinkään siRNA-erityisiä vaikutuksia solujen kasvuun. Lääke annokset valittiin siten, että niillä oli minimaalinen vaikutus solujen elävyyden ei-kohdistuksen siRNA ja oli maksimaalinen vaikutus ATR siRNA valvontaa lisättiin kunkin levyn näytön (Kuva 3B). Olemme ehdottaneet, että pienillä annoksilla Atri riittävät tappamaan ATR-köyhdytettyä solujen koska vähemmän ATRI tarvitaan kokonaan estää loput ATR-proteiinia [18]. Kaikki kolme lääkehoitojen analysoitiin itsenäisesti ja prosentuaalinen elinkelpoisuus käytettiin laskemiseen vankka z-pisteet kullekin lääkehoitoa, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Näyttö valmistui kolmena kappaleena, ja keskimääräinen vankka z-arvoja piirrettiin jokaiselle siRNA kullekin lääkehoitojen (Kuva 3C-3E). Sisäinen positiivinen kontrolli siRNA: t kohdistaminen ATR ja atrip on korostettu punaisella ja kiinteä punainen viiva ilmaisee kynnyksen cutoff valitaan siRNA. S1 Dataset esittelee täydelliset tulokset kaikki kolme näytöt. Geenit, joilla on vähintään 2 siRNA, jolla on vankka z-pisteet -1,3 tai vähemmän valittiin esiintyneen synteettinen tappava suhteita. Suhteellisen vaatimaton vankka z-sulku valittiin, koska tämä on puolueellinen kirjaston DNA-vaurioita vastaus ja replikointi proteiineja, jotka odotamme on korkeampi taajuus synteettisten tappava vuorovaikutusten kuin satunnainen kirjasto.

(A) Kaavamainen siRNA näytön. U2OS-solut transfektoitiin siRNA: t ja sitten joko jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin 1 uM Atri, 0,5 uM sisplatiinin tai Atri ja sisplatiinia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin alamarBlue. (B) elinkelpoisuus ei-kohdistuksen (NT) ja ATR siRNA käyttäviin näytön olosuhteissa. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta riippumatonta rinnakkaista näytön. (C-E) Kestävä z-arvoja käsiteltyjen verrattuna käsittelemättömien solujen elinkelpoisuus määritettiin kullekin siRNA kirjastossa varten Atri (C), sisplatiini (D), ja Atri ja sisplatiini (E). Punainen ympyrät edustavat 8 ainutlaatuista siRNA: t kohdistaminen ATR ja atrip läsnä kirjastossa ja punainen viiva osoittaa vankka z pisteet -1,3. (F) Yhteenveto päällekkäisyys synteettisten tappavan suhteita Atri, sisplatiinin tai Atri ja sisplatiinia. (G) Täydellinen geenejä, jotka ilmentävät synteettistä tappava suhde Atri, sisplatiini, tai Atri ja sisplatiinia. Geenit vähintään 2 siRNA: t, joissa vankka z-arvoja alle -1,3 pidetään synteettisiä tappava. Atri single-aine näyttö on aiemmin julkaistu ja mukana verrattuna muihin lääkehoitoja [18].

kolme ruutua tunnistettu geenejä, jotka osoittivat synteettinen tappavaa suhteita yhden tai useamman lääkkeen yhdistelmät ja useaan eri DNA: n korjaukseen väyliä (kuvio 3F ja 3G). Atri varsi näytön on aiemmin julkaistu ja mukana täällä verrattuna yhdistelmähoito näyttö [18]. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, suurin perheen geenien tunnistettu, joilla on synteettinen kuolleisuutta kanssa Atri yksin olivat ATR-reitin geenit ja DNA replikaatiogeenit, kuten aiemmin ilmoittamattoman synteettinen tappava vuorovaikutus ribonukleotidireduktaasi (

RRM1

ja

RRM2

). Havaitsimme myös kromatiinin remodelers, Fanconin anemia reitin geenit translesion DNA-polymeraasit, ja

ERCC1

[18].

ATM

ja

XRCC1

eivät pääse meidän raja, joissa on enemmän kuin yksi siRNA ja eivät kuuluneet luetteloon synteettisten tappava vuorovaikutusta. Nämä vuorovaikutukset aiemmin tunnistettu käyttäen nolla ja täydennetään solu- linjat sekä pienmolekyylisalpaajien [19, 20]. On mahdollista, että äänenvaimennusjärjestelmän /esto on noudatettava synteettisen kuolleisuutta raportoitu ja ei toteutunut siRNA käytetty meidän kirjastossa.

Käyttäen sisplatiinia ainoana lääkkeenä, havaitsimme synteettinen kuolleisuutta HR geenejä odotetusti koska tämä on merkittävä mekanismi vaaditaan korjaamaan sisplatiinin additiotuotteiden. Solut puutteellisia

ATR

, translesion DNA polymeraasi väyliä, XPF (

ERCC4

),

XAB2

, ja

XRCC1

ovat myös yliherkkiä sisplatiinia.

yhdistetty Atri /sisplatiinia herkkyys näytön tehtiin saman annoksen Atri ja sisplatiinia, joita käytettiin yhden huumeiden näytöt. Tämä näyttö on myös tunnistettu ATR-reitin geenit ja osajoukon DNA replikaatiogeenit, joita todennäköisesti läsnä perustuu niiden synteettiset kuolleisuutta kanssa Atri yksin. Uusi geeni perheet löytyy yhdistettyyn hoitoon sisältävät virhepariutumista korjaavan geenejä, ylimääräisiä translesion DNA-polymeraaseja, XPF (

ERCC4

),

TP53BP1

,

DDB2

, ja Soss-A (

INTS3

). Yhdistelmällä Atri /sisplatiinihoitoon,

ATM

,

RAD50

, ja

RAD54

L lähestymistapa meidän merkitys sulku raja yhdellä siRNA kutakin saadaan z-arvoksi vähemmän kuin -1,3 ja toinen siRNA tukevalla z-pisteet alle -0,9.

Synthetic suhteita HR tai MMR ja Atri /sisplatiini

Mielenkiintoista, menetys HR geenit eivät aiheuta synergiaa kanssa Atri /sisplatiinia vaikka se on synergistinen sisplatiinilla yksinään. Me todentaa tämän tuloksen käyttämällä BRCA2-puutosta VC8 soluissa. Nämä solut ovat erittäin herkkiä sisplatiinille verrattuna isogeenisiin muokatut solut uudelleen ilmaista villityypin BRCA2 (kuvio 4A). Ne eivät kuitenkaan ole yliherkkiä Atrin yksin ja yhdistelmähoito Atri /sisplatiinia ei johtanut mihinkään synergistisiä tappaminen matalalla tai kohtalainen sisplatiinin annosta (kuvio 4B ja 4C). Suuri määrä kuolema nähdään suuren annoksen sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito on lähes kaikki johtuu lisääntynyt toksisuus sisplatiinin HR-viallisia soluja. Puute synteettisiä kuolleisuutta voi johtua esto ATR vähentää tehokkuutta HR joten enää synergiaa havaitaan HR-puutosta taustat [31].

BRCA2-puutosta VC8 soluja tai VC8 solut täydennetään BRCA2 ilme vektori hoidettiin Atri, sisplatiini, ja Atri /sisplatiiniyhdistelmähoidon. (A) herkkyys BRCA2-vajaiden solujen sisplatiinia. (B ja C) herkkyys BRCA2-vajaiden solujen Atri yksin ja Atri joko 0,05 tai 0,1 uM sisplatiinia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin alamarBlue 72 tunnin kuluttua ja ilmoitetaan prosentteina käsittelemättömään kontrolliin soluja. Virhepylväät ovat keskihajonta (n = 3).

Useat MMR geenien näytteillä synteettistä kuolleisuutta kanssa Atri /sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito näytössä. Koska MMR-puutos on yleinen piirre monissa syövissä, pyrimme varmista, että kasvainsolut MMR-puutos ovat yliherkkiä yhdistetyn Atrin /sisplatiinia hoitoja. Paksusuolen syöpä solulinja HCT-116 on MPR-puutteellinen johtuen puutteesta MLH1. Yllättäen verrattuna HCT-116 + Kromosomi 3, jossa MLH1 ilmentyminen on palautettu [24], löysimme eroa herkkyydessä Atri yksin tai yhdistelmän Atri /sisplatiinia sekä lyhyen aikavälin ja pitkän aikavälin elinkelpoisuuden määritykset ( kuvio 5A ja 5B). Testasimme myös roolia MMR vuonna HEC59 kohdun limakalvon syövän solut, jotka ovat puutteellisia MSH2 ja näin ollen ne eivät ilmaista MSH3 tai MSH6. Nämä solut eivät osoittaneet mitään synteettisiä kuolleisuutta kanssa Atrin yksinään tai yhdistelmän Atri /sisplatiinia verrattuna täydennetään solulinjaan sekä lyhyen aikavälin ja pitkän aikavälin elinkelpoisuuden määritykset (kuvio 5C ja 5D). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että epäsuhta korjaus ei ole mielekäs indikaattori synteettisiä kuolleisuutta kanssa Atri tai ATRI /sisplatiiniyhdistelmähoidon hoitoa. Siten useat DNA korjaukseen reittejä ei havaita mitään synteettisiä kuolleisuutta ATR estoa tai yhdistelmä ATR /sisplatiinia kuten HR ja MMR.

(A ja C) Soluja käsiteltiin kasvavia annoksia Atri yksinään tai yhdessä 0,5 uM sisplatiinia 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin Alamar sininen ja ilmoitetaan prosentteina käsittelemättömään kontrolliin soluja kustakin solulinjasta. (B ja D) Soluja käsiteltiin 1 uM Atri, 0,5 uM sisplatiinin, tai molemmat (A + C); solut vapautunut media ilman lääkkeitä 24 tunnin kuluttua ja sen annettiin muodostaa pesäkkeitä. (A ja B) MLH1-puutteellinen HCT-116-solut ja HCT-116-solujen täydennetty MLH1. (C ja D) MSH2 puutteesta HEC59 solut ja HEC59 solut täydennetty MSH2. Virhepalkkien kaikki paneelit ovat keskihajonta (n = 3).

ATR esto on synteettinen tappava kanssa PARP esto

PARP-inhibiittorit näytteille synteettinen kuolleisuutta menetys HR, ja tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa hoitoon BRCA-puutosta kasvaimia [32-34].

PARP1

,

PARP2

, ja

PARP4

oli kirjastomme eikä aiheuttanut synteettisiä kuolleisuutta minkä tahansa lääkehoitoon osoittaa, että geneettinen menetys PARP ei herkistää soluja että ATR esto. Kuitenkin ATR todettiin kolmanneksi eniten pisteitä geenin näytön etsivät synteettistä tappava vuorovaikutus PARP esto [35] ja ATR esto herkistyneet munasarjasyöpäsoluja kuin PARP inhibiittori Veliparib [36]. PARP esto voi tuottaa erilaisia ​​tuloksia verrattuna geneettinen menetys PARP-geenien johtuu useista PARPs soluissa ja tarve ansastusta PARP komplekseja DNA solujen tappamista [34, 37-39]. U2OS solut käsiteltiin kasvavia annoksia BMN673 merkittävästi vähentänyt Atri tarvittiin tappamaan soluihin ja osoittivat huomattavaa synergiaa laajalla annoksia lyhyen aikavälin elinkelpoisuuden määritykset (kuvio 6A-6C). Tämä havainto oli vieläkin selvempää pitkäaikaiseen pesäkkeenmuodostuskyvyn määrityksissä, joissa yhdistelmä hoitoon Atri ja BMN673 vähensi solujen kyky muodostaa pesäkkeitä yli 1000-kertaisesti (kuvio 6D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin HCT-116-solut.

(A) U2OS soluja käsiteltiin kasvavia annoksia ATR ja PARP-inhibiittorit 96 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin Alamar sininen ja ilmoitetaan prosentteina käsittelemättömään kontrolliin. Välinen synergia ATR ja PARP eston käyttämällä Bliss Independence (B) ja isobologram- analyysi (C), kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. (D) Soluja käsiteltiin 1 uM Atri, 2 nM PARPi, tai molemmat (A + P) ja solut vapautetaan media ilman lääkkeitä 72 tunnin jälkeen ja sen annettiin muodostaa pesäkkeitä. Virhepalkkien kaikki paneelit ovat keskihajonta (n = 3).

Menetys REV3 ja 53BP1 herkistää syöpäsolut Atri ja sisplatiinin

Muita geenejä tunnistettu ruudulla esillä vahva synteettiset kuolleisuutta kanssa Atri /sisplatiiniyhdistelmähoidon olivat

REV3L

ja

TP53BP1

.

REV3L

oli neljänneksi eniten pisteitä geeni (sen jälkeen kun

POLD2

,

ATR

, ja

atrip

) tunnistettu. REV3 on katalyyttinen alayksikkö translesion (TLS) polymeraasi ζ. Rakenteellinen alayksikköä Pol ζ, REV7, määriteltiin myös synteettisiä tappava kanssa Atri /sisplatiini yhdistettynä 2 out of 4 siRNA: iden. TLS on jaettu kahteen vaiheeseen, insertio nukleotidin vaurioitunut pohja ja laajennus insertion jälkeen [40]. Laajennus asetuksen jälkeen useat TLS polymeraasien usein suorittavat Pol ζ. Tämä polymeraasi-kytkentä tapahtuma vaatii REV1. 3 4

REV1

siRNA aiheutti synteettinen kuolleisuutta kanssa Atri /sisplatiini (vankka z-arvoja -1,9, -1,0, ja -0,9), vaikka suuruus kaksi niistä juuri jäänyt meidän merkitys kynnys. Ulkonäkö molempien alayksiköiden Pol ζ ja polymeraasi tarvitaan sen lataamista viittaa vahvasti siihen menetys tämän monimutkaisen luo yliherkkyys Atri /sisplatiinia.

validoimiseksi saatujen tulosten näytön ja arvioida niiden yleistettävyyttä me pudotettiin REV3 käyttämällä kahta erityistä siRNA in NSCLC solulinjassa H157. H157-solut köyhdytetty REV3 olivat hieman herkempiä korkeille sisplatiinin kuin soluissa, jotka ilmentävät ei-kohdistuksen siRNA (kuvio 7A). REV3-köyhdytettyä soluja käsiteltiin sitten kasvavia annoksia Atri yksinään tai yhdistelmänä sisplatiinin kanssa. Ehtyminen REV3 kohtalaisen herkistynyt H157 soluja Atrin yksin sekä siRNA (kuvio 7B ja 7C). Lisääntynyt synteettinen kuolleisuutta ei havaittu, kun soluja käsiteltiin ATRI /sisplatiiniyhdistelmähoidon (kuvio 7B ja 7C). Sen sijaan, H157 transfektoitujen solujen ei-kohdistuksen siRNA näytteillä synergia Atri ja sisplatiinin vain suurilla annoksilla Atri /sisplatiiniyhdistelmähoidon (kuvio 7D). Solut tyhjentynyt REV3 näytteillä suuria määriä synergiaa laajalla annosvälillä Atri ja sisplatiinin (kuvio 7E ja 7F). Maksimaalinen synergia havaittiin sisplatiinin annosta juuri ennen kuin se esiintyy jokin yksittäinen-agentti tappamista. Havaitsimme myös samanlaisia ​​tuloksia pesäkettä muodostavaa määrityksessä (S1 kuvio) ja lyhyen aikavälin elinkelpoisuuden määritykset muihin NSCLC ja TNBC syöpäsolulinjoissa (S2-S4 kuviot).

(AF) H157 NSCLC-soluja transfektoitiin non -targeting siRNA (Sint) tai kaksi siRNA kohdistaminen REV3 (numero 2 ja 4 viittaavat tiettyihin sekvensseihin on kuvattu materiaalit ja menetelmät). Soluja käsiteltiin sitten Atri, sisplatiini, ja Atri ja sisplatiinia. Solujen elinkyky määritettiin Alamar Blue -väriaineen ja ilmoitetaan prosentteina käsittelemättömään kontrolliin soluja. (A) herkkyys REV3 Knockdown solujen sisplatiinia. (B ja C) herkkyys REV3 Knockdown solujen Atri ja Atri kanssa 0,1 uM sisplatiinia. Bliss riippumattomuus synergiaa Atri ja sisplatiinin kontrolli (D) ja REV3 taintumisen solut (E ja F). Virhepalkkien kaikki paneelit ovat keskihajonta (n = 3).

Kun REV3,

TP53BP1

oli toiseksi eniten pisteitä geeni, joka ei ollut ATR polku tai DNA-replikaation geeni . 53BP1 on DNA-vaurioita vastaus proteiinin rooli kaksinkertaisen lohkon murtuma korjaus. 53BP1 estää resektio kaksinumeroisin säikeen katkoksia ja vaikuttaa reitin valinta DNA: n korjaukseen edistämällä ei-homologisen end liittymällä [41-43]. 53BP1 tarvitaan myös suojata kromosomi hauras sivustoja ja muita alle monistaa alueet mitoosin aikana mahdolliseen korjaamiseen myöhemmissä G1 [44, 45].

yleistää 53BP1 geneettinen suhde ATRI /sisplatiiniyhdistelmähoidon, analysoimme vähentäminen 53BP1 että H157 NSCLC solulinjassa. Ehtyminen 53BP1 ollut vähäinen vaikutus herkkyyteen solujen yhden agentti sisplatiinihoitoon (kuvio 8A). 53BP1 vaje eivät soluissa esiintyy erityisen herkkiä Atrin hoito yksinään sekä siRNA testattiin (kuvio 8B ja 8C). Solujen elinkelpoisuus edelleen vähentää yhdistetyn hoidossa Atri /sisplatiinia. Kuten edellä on todettu, yhdistelmä hoito ATRI /sisplatiinia näytteillä synergiaa vain suurilla annoksilla molempien lääkkeiden transfektoiduissa soluissa ei-kohdistuksen siRNA (kuvio 8D).