Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin kaikista gynecologic pahanlaatuisia ja korkealaatuista vakavien munasarjasyöpä (HGSC) on yleisin alatyyppi munasarjasyöpä. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, kuinka usein ja tyypit pisteen somaattisten mutaatioiden HGSC käyttäen mutaation havaitseminen protokollaa nimeltä OncoMap joka käyttää massaspektrometrisia-pohjainen genotyypitys teknologia.

Menetelmät /Principal Havainnot

Center for Cancer Genome Discovery (CCGD) Program Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) on sovitettu suurikapasiteettisten genotyyppitestien alustan määrittää mutaatio aseman suuren paneelin tunnettujen syövän geenien. Mutaatio havaitseminen protokolla, jota kutsutaan OncoMap on laajennettu havaita yli 1000 mutaatioita 112 onkogeenien formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudosnäytteistä. Suoritimme OncoMap joukkoon 203 FFPE edennyt vaiheittain HGSC yksilöitä. Olemme eristetty genominen DNA näistä näytteistä, ja sen jälkeen akku laadunvarmistus testejä, yritti kukin näistä näytteistä on OncoMap v3 alustalle. 56% (113/203) kasvainnäytteestä kanna ehdokas mutaatioita. Kuusikymmentä viisi näytettä oli yksi mutaatioista (32%), kun taas jäljellä olevat näytteet oli ≥2 mutaatioita (24%). 196 ehdokas mutaatio puhelut tehtiin 50 geenejä. Yleisin somaattiset onkogeenimutaatiot löydettiin

EGFR

,

KRAS, PDGRFα, KIT, ja PIK3CA

. Muut mutaatiot löydettiin uusia geenejä havaittiin alemmilla taajuuksilla (alle 3%).

Johtopäätökset /merkitys

Sequenom analyysillä käyttäen OncoMap DNA uutetaan FFPE munasarjasyöpä näytteet on mahdollista ja johtaa havaitseminen mahdollisesti druggable mutaatioita. Seulonta HGSC somaattisten mutaatioiden onkogeenien voidaan ottaa hoitoja tässä potilasryhmässä.

Citation: Matulonis UA, Hirsch M, PALESCANDOLO E, Kim E, Liu J, van Hummelen P, et al. (2011) High Throughput kuulustelu somaattisista mutaatioista High Grade seroosit munasarjasyövän. PLoS ONE 6 (9): e24433. doi: 10,1371 /journal.pone.0024433

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 elokuu 2011; Hyväksytty: 09 elokuu 2011; Julkaistu: 08 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Matulonis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli antamat seuraavista lähteistä: munasarjasyöpä erikoistunut tutkimus- Excellence (P50CA105009), Madeline Franchi munasarjasyöpä Fund, ja naisten toimeenpanevan neuvoston Dana-Farber Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Drs. Hahnin ja Drapkin molemmat toimivat konsultit ja ovat saaneet tutkimus avustusta Novartis Pharmaceuticals. Tämä ei muuttanut tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Toinen kirjoittajat ole eturistiriitoja raportoida.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin kaikkien gynecologic pahanlaatuisia ja uusia hoitoja tarvitaan sekä vasta diagnosoitua potilasta samoin kuten potilailla, joilla on uusiutuva syöpä [1]. Sisällä epiteelin munasarjasyöpä, HGSC on yleisin alatyyppi ja se liittyy alkuperäiseen kemoterapian reagointikykyä kun ensimmäinen diagnosoitu. Kuitenkin useimmat syövät toistuisi ja yhä kemoterapiaa kestäviä. Onnistuminen tavanomaisen kemoterapian hoidossa munasarjasyöpä osoittaa tasapainotilaa, ja uusia keinoja molecularly ja geneettisesti luonteenomaiset munasarjasyövän jotta ”personoida” ja parantaa hoidon tarvitaan [2], [3].

aktivointi pistemutaatiot esikasvaintekijät on havaittu monissa ihmisen syövissä, ja tällaiset mutaatiot voivat antaa ”onkogeenin riippuvuus” asiaa koskevia syöpäsolut [4]. Tämä onkogeeni riippuvuus muodostaa pohjan kohdistaminen aktivoitu onkogeenien kohtelu esimerkkinä menestys imatinibin ja erlotinibin syöpiä että satama

BCL-ABL

ja

EGFR

muutoksia vastaavasti. Runsaasti todisteita nyt, että nämä voitto-of-function mutaatioita ei esiinny satunnaisesti onkogeenien, mutta sen sijaan, mutaatiot vaikuttavat suhteellisen pieni määrä kodoneita osuus valtaosa aktivoivan tapahtumien syöpä. Esimerkiksi yhden emäksen muutokset kodoneissa 12, 13 ja 61

KRAS

mutaatiot muodostavat enemmistön aktivoivan onkogeenisten mutaatioiden [5]. Vastaavasti,

BRAF

vaikuttavia mutaatioita kodonissa 600 muodostavat 90% melanooman

BRAF

mutaatioita; geneettisiä muutoksia ylimääräinen 10-12 kodonit muodostavat suurimman osan jäljellä syöpään liittyvien

BRAF

mutaatioita mennessä tunnistetut [6], [7].

tunnistaa nämä onkogeeninen mutaatiot arkistointiin kudoksia, olemme mukautettu suurikapasiteettisten genotyyppitestien alustan määrittää mutaatio aseman suuren paneelin tunnettuja syövän onkogeenien [8], [9]. Erityisesti olemme kehittäneet mutaation havaitseminen protokolla, kutsutaan OncoMap, joka työllistää massaspektrometrinen-pohjainen genotyypityksen teknologia (Sequenom) tunnistaa onkogeenisia mutaatioita. Nykyinen versio Tämän protokollan pystyy havaitsemaan yli 1000 mutaatioita 112 yleisesti muuntunut geenejä sekä tuore ja parafinoidut kudosnäytteistä. Tässä raportissa kuvataan menestyksekkään soveltamisen OncoMap jotta kohortin joilla on pitkälle edennyt HGSC tunnistamiseksi onkogeenista mutaatioita.

Tulokset

Alkuperäisessä OncoMap analyysi, 56% (113/203) kasvain näytteiden kanna ehdokas onkogeenisia mutaatioita. Kuusikymmentä viisi näytettä oli yksi mutaatioista (32%), kun taas loput olivat ≥2 mutaatioita (24%). Yhteensä 196 ehdokas mutaatio puhelut tehtiin 50-geenit.

Yleisimmin mutatoitu onkogeenien olivat

EGFR

(9,4%),

KRAS

(4,5%),

PDGFRα

(4,5%),

KIT

(3,0%), ja

PIK3CA

(3%); muut, jotka olivat harvemmin mutatoitunut sisältyvät:

BRAF

(1%),

CUBN

(0,5%),

ja sääntelyviranomaisten

(2,5%). Havaitsimme myös mutaatioita monien muiden geenien alemmilla taajuuksilla, kuten:

ABL1

(2,5%),

STK11

(2,5%),

EPHA1

(2%),

RET

(1,5%),

SMARCB1

(1,5%),

ATM

(1%),

FLT3

(1%),

MLL3

(1%),

MYC

(1%),

NF2

(1%),

Notch1

(1%),

NTRK1

(1%),

PIK3R1

(1%),

ROBO2

(1%),

APC

(0,5%),

FES

(0,5%),

FYN

(0,5%),

GATA1

(0,5%),

NF1

(0,5%),

NTRK3

(0,5 %),

palb2

(0,5%),

PKHD1

(0,5%),

PTEN

(0,5%),

RUNX1

(0,5%)

SMO

(0,5%),

SPTAN1

(0,5%), ja

TSHR

(0,5%).

yleisin somaattinen mutaatio tunnistettiin mukana tuumorisuppressorigeenin

TP53

, joka havaittiin 24,8% näytteistä. Koska OncoMap kuulustelee vain osa

TP53

mutaatioita ja ei havaitse poisto tapahtumia, havaitun taajuus

TP53

muutoksia yhtyy viimeaikaisissa Cancer Genome Atlas Project (TCGA) [10] joka on vahvistanut havainto, että

TP53

mutaatiot ovat yleisimpiä somaattisen mutaation HGSC syöpiä. Lisäksi tunnistimme mutaatiot muissa tuumorisuppressorigeeneille lukien

RB1 ​​

(3%) ja

VHL

(3,5%).

Somaattiset mutaatiot sitten vahvistanut HME, ja joista seuraavia validoitu:

EGFR

,

HRAS

,

KRAS

,

sääntelyviranomaisten

,

PIK3CA

,

BRAF

,

RB1 ​​

,

TP53

,

ATM

,

CUBN

, ja

FLNB

. Taulukko S1 luetellaan validoitu mutaatiot löytyy meidän kohortissa HGSC.

Keskustelu

Ryhmämme on osoittanut, että somaattiset onkogeenimutaatiot voidaan havaita HGSC käyttäen Sequenom perustuvan määrityksen nimeltään OncoMap joka käyttää DNA johdettu alkaen FFPE kudoksesta. Vaikka HGSC on tunnusomaista geenin kopioluvun muutoksia [11], matalan taajuuden mutaatiot useissa onkogeenisten geenien havaittiin 56%: n syövistä meidän 203 näytteen kohortissa, ja monet näistä mutaatioista ovat mahdollisesti druggable käyttäen uusia biologisia. Useimmat mutaatiot löydettiin matalataajuista, ja tarkinta mutaatioita havaittiin alle 5% näytteistä. Validointi käyttäen HME suoritettiin kiinnostuksen kohteena olevia geenejä, ja useita tärkeitä geenejä havaittiin mutatoitunut; kaikki mutaatiot eivät validoitu, koska kustannukset ja tasolla. Kliinisessä käytössä odotamme kaikki mutaatiot tunnistetaan OncoMap profilointia validoidaan CLIA-hyväksytyissä laboratorioissa.

Näin OncoMap joka käyttää Sequenom tekniikka kykenee edullisesti seuloa useita mutaatioita käyttämällä DNA uutetaan FFPE näytteistä syöpien, kuten HGSC että on useita mutaatioita esiintyy matalataajuista. Muita etuja OncoMap kuuluu kyky nopeasti laajentaa ”hotspot” mutaatio kirjasto ylimääräisinä mutaatiot havaitaan ja uuden romaanin biologisia onnistuneesti testattu. Rajoitukset OncoMap, että ainoastaan ​​”hotspot” mutaatiot sijaitsevat ja validointi mutaatioiden on tarpeen; muut mutaatiot eivät sisälly OncoMap paneeli saa hukata. Vaikka koko exome tai kokonaan Genomikartoituksen on nyt mahdollista tutkimuslaboratorioissa, rutiininomaista käyttöä näiden teknologioiden parafiiniin näytteistä ei ole mahdollista. Siten OncoMap tarjoaa nopean, kohtuullisin kustannuksin menetelmää tunnistaa onkogeenisen mutaatioita ihmisen syövän yksilöitä.

kliininen merkitys somaattisten mutaatioiden HGSC ovat tuntemattomia ja täytyy tutkia tarkemmin. Somaattiset mutaatiot syövissä voi johtaa konstitutiivisen aktivaation signalointipolkujen jotka normaalisti aktivoituvat aktivoitu kasvutekijän reseptoreita, ja nämä mutaatiot voivat johtaa yleiseen perimän epävakaisuuden [12]. Muutoksia geenikopiomäärä ja geeniekspressiota ovat molemmat osoitettu olevan tärkeitä munasarjasyöpä, kun taas mutaatiot ovat tuntuneet olevan vähemmän tärkeitä [11].

Useat mutatoitunut onkogeenien kohteisiin löydettiin meidän kohortin HGSC testatussa ja analysoitiin OncoMap.

EGFR

todettiin satama mutaatioita lähes 10%: ssa tapauksista, ja EGFR: n estäjien, kuten erlotinibi voitaisiin testata tässä osajoukko syöpiä. Vuonna keuhkosyöpä, nämä estäjiä käytetään hoitamaan syöpiä, jotka satama eksoni 20 variantteja, kodonissa 719 variantteja, ja L858R substituutioiden lisäksi muun tyyppisiä

EGFR

mutaatioita [13], [14]. Tunnistimme HGSC kodoniin 719 varianttia, joka todensi HME. Siten testaus EGFR: n estäjien vaikuttaa syytä, kun EGFR mutaatioita havaitaan. EGFR: n estäjien on testattu munasarjasyöpää kanssa hoitovasteen 10% tai vähemmän [15] – [17]; Kuitenkaan mikään näistä tutkimuksista takautuvasti testattu munasarjasyöpiä EGFR mutaatioita, käytäntö nyt rutiininomaisesti tehty ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, joka on johtanut siihen, että molekyylirakennetta kohdennettua käyttöä EGFR: n estäjien.

EGFR

mutaatioita ja ilmaisun testattiin takautuvasti Schilder et al, ja osittainen vaste havaittiin 1 potilaalla teki ovat EGFR-mutaatio [17].

nopeudella

PIK3CA

mutaatiot 3% löytyy HGSC yhtymäkohtia löytämä Sanger Centerin [18]. Muut ryhmät ovat raportoineet alhainen sekä

AKT

ja

PIK3CA

mutaatiota mutta tiheämmin geenimonistuman varten

PIK3CA

[19]. Estäjiä PI3kinase reitin parhaillaan tutkitaan munasarjasyövän, ja aktiivisuus näistä aineista on raportoitu munasarjasyövän [20], [21]. Esimerkiksi MK2206, AKT- estäjällä, testattiin vaiheen 1 tutkimuksessa potilailla, joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia. Kaikki 3 munasarjasyöpä potilasta, jotka oli otettu Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat lasku niiden CA125 tasolla, mikä viittaa antituumorivaikutuksen MK-2206 munasarjasyöpään. GDC0941, joka on PI3kinase estäjä on myös osoittanut aktiivisuutta munasarjasyövän erityisesti tilanteissa

PIK3CA

vahvistusta. Kehittämisen kanssa ylimääräistä estäjiä PI3kinase reitin ja siksi syövän vastaista aktiivisuutta näiden aineiden munasarjasyövän, tunnistaminen poikkeavuuksien tämän reitin tulee yhä tärkeämmäksi HGSC.

Muut validoitu kiinnostavia geenejä löydetty Tutkimuksemme sisältävät

BRAF

,

KRAS

,

HRAS

, ja

sääntelyviranomaisten

, ja kaikki nämä geenit ovat käytettävissä biologisia että voitaisiin kohdistaa vaikutukset näiden onkogeenisten mutaatioita.

TP53

mutaatioita esiintyy yleisesti munasarjasyövän [22], ja meidän tietojen tukee ja yhtäläisyyksiä tämän tiedon.

Tämä työ vahvistavat äskettäin julkaistun TCGA data [10]; tulevissa tutkimuksissa on tarpeen korreloida läsnäoloa mutaatioiden kanssa biologinen aktiivisuus ja ennusteen syöpä ja ovatko nämä mutaatiot ennustaa syövän vastaista aktiivisuutta kohdennettuja biologisia. Lisäksi korreloivat somaattiset mutaatiot muiden tavoite arviointeja geneettisen muodostavat sekä syöpien, kuten geeniekspressioprofilointi ja geenin kopioluku on elintärkeää ymmärrystä täydellisemmän geneettinen kuvan HGSC.

Materiaalit ja menetelmät

potilaiden ja potilaiden näytteistä

Patologian tiedot on tarkistettu vuodesta 1999 vuoteen 2004 Division of naistentautien patologian Brigham and Women sairaalassa Boston MA, ja International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) vaihe III tai IV HGSC munasarjasyöpä tapausta valittiin. Dana-Farber /Harvard Cancer Center Institutional Review Board (IRB) hyväksynnän myöntäneen kerätä FFPE näytteitä. Koska kaikki näytteet olivat de-identifioitu, IRB antanut meille luopumista kerätä näytteitä ilman potilaan suostumusta.

FFPE näytteet tarkistaa gynekologista onkologian patologi (MH) joka tutki patologiaraporteista sekä FFPE kudosblokeista ja valittujen alueet prosentuaalisesti eniten syöpä, joka lopulta täytelanka DNA: n eristämiseksi. Potilaat, joiden tiedetään BRCA ituradan mutaatioita jätettiin tässä asettaa ja tutkitaan toisessa tietokokonaisuutta. Yhteensä 203 näytettä valittiin.

DNA: n eristämistä ja kvantifiointiin

Genominen DNA uutettiin täytelanka FFPE potilaan kudosnäytteistä kanssa QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, ytimet poistettiin parafiini ksyleenillä ja edelleen hajotetaan denaturoivissa hajotuspuskuria, joka sisälsi proteinaasi-K: kudosta lysaattia inkuboitiin 90 ° C: ssa kääntää formaliinia silloittumisen. Käyttäen QiaCube, lysaatti levitettiin DNA sitova pylvääseen ja pylväs pestiin sarjatuotantona, ja eluoitiin sitten 30 ul: aan tislattua vettä. Perimän DNA kvantifioitiin käyttäen Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen) valmistajan protokollan mukaisesti. 250 ng genomista DNA: ta käytettiin analyysiä varten.

OncoMap v3.0 suoritettiin kaikissa näytteissä, ja geenit ja määrä mutaatioita testattu tässä versiossa OncoMap versio on lueteltu taulukossa 1. Aluksi alukkeet suunniteltiin, jotka mahdollistavat mutaation havaitsemisen. Tuumorista peräisin genomista DNA: ta altistettiin koko genomin monistamisen. Seuraavaksi multiplekseri PCR suoritettiin kasvaimen genominen DNA monistamaan alueille kätkeminen loci kohteisiin, tai ”kysely” nukleotidin. Denaturoinnin jälkeen, PCR-tuotteet inkuboitiin oligonukleotidejä, jotka pariutuvat välittömästi vieressä kyselyn nukleotidin, ja primer extension reaktio suoritettiin kun läsnä oli ketjun päättyvä di-deoksinukleotidien, jotka tuottavat alleeli-spesifisen DNA-tuotteita. Primer laajentaminen tuotteet nähtiin päälle suunniteltu siru ja analysoitiin MALDI-TOF-massaspektrometrialla määrittää mutaatio aseman. Koska alleelin (tai mutaatio) kutsuvan riippuu yksinomaan massasta saadun alukepidennystuotteen, The Sequenom määritys ei vaadi kalliita fluoresenssia pohjamaali merkintöjä ja on erittäin alhainen virheprosentti. Kustannukset ainoastaan ​​käynnissä OncoMap mutaatiostatuksesta määritys on noin $ 200 per näyte riippumaton näytteiden määrä ajaa.

Kun mutaatioita tunnistettiin, validointi suoritettiin valitun osajoukon mutaatioita käyttäen multi-base HME laajennus kemiaa, kuten on kuvattu aiemmin [8], [9]. Alukkeiden ja koettimien suunniteltiin käyttäen Sequenom MassARRAY Pitoisuus Design 3.0 ohjelmisto soveltaen oletus usean emäksen pidennyksestä parametrit mutta seuraavin muutoksin: enimmäismäärä multiplex tason panos säädettävä 6; maksimi pass iteraatio base säätää 200.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Validoitu Mutaatiot mukaan HME. Tässä taulukossa luetellaan validoitu mutaatiot löytyy meidän kohortin HGSC. Validointi suoritettiin HME.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0024433.s001

(DOC) B

Kiitokset

Tekijät haluavat tunnustaa Robert T. Jones, Christina K. Go, ja Christine A. Roden työstään teknisten näkökohtien käynnissä OncoMap Näille näytteille.