Krooninen sairaus

tiivistelmä

genomi on järjestetty ja pakataan tumaan vuorovaikutusten kautta ydinhistonin proteiineja. Kehittyvät todisteet osoittavat, että kasvaimet ovat erittäin herkkiä epigeneettiset muutokset, jotka aiheuttavat kromatiinin perustuvia tapahtumia ja dynaamisesti vaikuttaa kasvaimen käyttäytymiseen. Tutkimme chromatin organisaatio pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) käyttäen asetylaatio tasot histoni 3 markkerina kromatiinin tiivistymistä. Kontrollieläimiin verrattuna suun keratinosyyttejä, olemme huomanneet, että HNSCC solut hypoacetylated ja että microenvironmental vihjeitä (esim hiussuonten endoteelisolujen) indusoi kasvaimen asetylaatio. Lisäksi olemme havainneet, että kemiallinen inhibitio histonideasetylaaseja (HDAC) vähentää syövän kantasoluja (CSC) ja estää klonogeenisten alalla muodostumista. Paradoksaalisesti, esto HDAC indusoi myös epiteeli- mesenkymaalitransitioon (EMT) in HNSCC soluissa, kertyminen BMI-1, joka on onkogeeni liittyy kasvaimen aggressiivisuus, ja ekspressio vimentiinista mesenkymaalisten markkeri. Tärkeää on, havaitsimme koekspressio vimentiinista ja asetyloidun histoni 3: n hyökkäyksen edessä ihmisen HNSCC tuumorikudoksissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että ympäristön ärsykkeille, kuten endoteelisoluspesifiseksi erittyy tekijät, moduloida kasvain plastisuus rajoittamalla väestö CSC ja asiakkuutta EMT. Siksi esto HDAC voi muodostaa uutta strategiaa häiritä väestöstä CSC pään ja kaulan kasvaimet luoda homogeenisen populaation syöpäsolujen biologisesti määritelty allekirjoituksia ja ennustettavissa käyttäytymisestä.

Citation: Giudice FS, Pinto DS Jr, NOR JE, Squarize CH, Castilho RM (2013) esto histonideasetylaasin vaikutukset Syöpä Kantasolut ja indusoi epiteelisolujen mesenchyme Siirtyminen pään ja kaulan syöpä. PLoS ONE 8 (3): e58672. doi: 10,1371 /journal.pone.0058672

Editor: Irene Söderhäll, Uppsalan yliopisto, Ruotsi

vastaanotettu 6 marraskuuta, 2012 Hyväksytty: 05 helmikuu 2013; Julkaistu: 20 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Giudice et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Institutes of Health (NIH /NCI) P50-CA97248 (University of Michigan Head and Neck SPORE); ja avustus R01-DE21139 NIH /NIDCR (JEN). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

joukossa pahanlaatuisten pään ja kaulan kasvaimia, pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on yleisin epiteelin neoplasia ja on yksi kuudesta yleisin pahanlaatuinen kasvain maailmanlaajuisesti [1]. HNSCC on ominaista vaurioista suuontelon, kurkunpään ja nielun. Huolimatta pyrkimyksiä kehittää biomarkkereita varhaista havaitsemista ja ennusteen, selviytymisen HNSCC potilaista ei ole parantunut merkittävästi [2]. Uusien hoitomuotojen parantavia selviytymistä ja elämänlaatua potilailla, joilla HNSCC tarvitaan kipeästi.

aloittaminen ja eteneminen syövän ensisijaisesti ohjataan geneettinen ja epigeneettiset tapahtumat, jotka vaikuttavat geenien ilmentyminen [3]. Epigeneettisiä muutoksia voidaan säädellä geeniekspressiota riippumatta geenimutaatioiden. Epigeneettiset alternations yleisesti huomioitava DNA: n metylaation ja histonimodifikaation [4], [5]. Histonit voidaan modifioida translaation jälkeen läpi lysiini asetylaatio ja ubikitinaatio, seriinin fosforylaatio, sumoylation ja metylointi lysiinejä ja arginiinista [6]. Histoni ase- tyylitransferaaseja (HAT) katalysoivat siirto asetyyliryhmä asetyyli- co-A e-Aminokohdan lysiinin, jolloin kromatiinin decondensation. Sen sijaan histonideasetylaaseja (HDAC) teko lysiinijäännöksissä kompaktin chromatin ja tukahduttaa geenin transkriptio [7], [8]. Mielenkiintoista, vaikutus HDAC on chromatin järjestämisestä liittyy myös sääntelyä ja ylläpito kantasolujen pluripotenttisuuden koordinoidusti lukuisia signalointipolkujen [9], [10]. Kuitenkin, kromatiinin kondensaatio liittyy myös chemoresistance kasvaimissa [11] – [14]. Tämä fenotyyppi on osittain johtua erikoistuneita soluja, jotka aktivoida kantasolujen kaltaisia ​​transkription ohjelmia [15]. Nämä syövän kantasolut (CSC) on ominaista korkea lisääntymisnopeus, aggressiivinen käytös, metastaattisen potentiaalin ja kyky itse uudistaa [16] – [25]. CSC ovat tärkeitä terapeuttisia kohteita syöpään [26], ja kliinistä hyötyä suoraan kohdistaminen CSC on tutkittavana. Halusimme selvittää häiritsee kromatiinin tiivistyminen, tiedetään olevan keskeinen rooli normaaleista kantasolujen [9], [10], joilla voi olla vaikutusta kasvaimen käyttäytymisen ja CSC sisältöä. Havaitsimme hypoacetylated kromatiinin paneelin HNSCC solulinjat ja tunnistettu erillinen populaatio CSC näissä soluissa. Nämä havainnot sai meidät kysyä chromatin asetylointi sanelee biologisesta käyttäytymisestä kasvaimia ja onko farmakologinen puuttuminen HDAC muuttaa CSC käyttäytymistä. Huomasimme, että esto HDAC häiritsee kertymistä CSC ja paradoksaalisesti indusoi kasvainsoluissa tehdään epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT).

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Käytimme HNSCC solulinjat syntyvät kirurginen poisto primaarikasvainten lokalisoitu kielen (HN6, HN13 ja Cal 27), nielu (HN30), kurkunpään (Hep2) ja on johdettu kielen kasvain, joka etäpesäkkeitä imusolmukkeissa (HN12 ) [27], [28]. Normaali suullinen keratinosyyttien spontaanisti kuolemattomaksi solulinja (NOK-SI) oli aiemmin vahvistettu ja toimitti ystävällisesti Dr. Gutkind National Institute of Dental ja kallon ja kasvojen tutkimus (NIDCR /NIH) [29]. NIH /3T3-normaali fibroblastisolulinja saatiin American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, USA) ja viljeltiin käyttäen DMEM (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), johon oli lisätty 10% naudan vasikan seerumia ( Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 250 ng /ml amfoterisiini B (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Soluja ylläpidettiin 5% CO 2-kostutetussa inkubaattorissa. Ensisijainen ihmisen ihon mikroverisuonten endoteelisoluja (HDMEC, Lonza, Walkersville, MD, USA) valmistettiin seerumittomassa endoteelin Peruselatusaineen (Lonza, Walkersville, MD, USA).

Western blotting

kasvaimen solut hajotettiin solujen hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita ja sonikoitiin. Kokonaisproteiinia erotettiin 10-15% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin Immobilon-FL polyvinyylifluoridista (Millipore, Billerica, MA, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa, joka sisälsi 0,1 M Tris (pH 7,5), 0,9% NaCl ja 0,05% Tween-20: ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Membraanit inkuboitiin vimentiinista (klooni V9, 1 500, Dako, Carpinteria, CA, USA), BMI-1 (1 500, Millipore, Billerica, MA, USA), asetyyli-Histone H3 Lys9 (1 1500, Cell Signaling, Danvers , MA, USA) tai asetyyli-histoni H4 Lys 5, 8, 12 ja 16 (1 2000 EMD Millipore, Billerica, MA, USA) ensisijainen vasta 4 ° C: ssa yön yli. Membraanit inkuboitiin sitten sopivan sekundäärisen vasta-aineilla konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (Santa Cruz Biotechnology, Sta. Cruz, CA, USA) ja 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Signaali kehitettiin käyttämällä ECL SuperSignal West Pico Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), ja proteiinit visualisoitiin käyttäen UVP kone (BioSpectrum Imaging System). GAPDH toimi latauskontrollina (1:20.000, Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA).

FACS pään ja kaulan CSC

Pään ja kaulan alueen syöpä kantasolun kaltaisia ​​soluja tunnistettiin solulajittelussa ALDH (aldehydidehydrogenaasille) toimintaa. Aldefluor kit (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden solujen tunnistamiseksi, joilla on korkea ALDH entsymaattista aktiivisuutta. Lyhyesti, HN6 ja HN13 soluja käsiteltiin 300 nM Trichostatin A (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) 24 tunnin ajan ja suspendoitiin aktivoidulla Aldefluor substraatin (BODIPY-aminoasetaatti) tai negatiivinen kontrolli (diethylaminobenzaldehyde erityinen ALDH-inhibiittoria) 45 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Näytteet analysoitiin FACSDiVA Cell Sorter (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA).

Cell invaasiomääritys

HN6 ja HN13 soluja (5 x 10

4) oli ympättiin 24-kuoppaisille levyille yli homogeeninen ohut kerros fibronektiinin (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) Millicell Cell Culture lisäosien (Millipore, Billerica, MA, USA), joka sisälsi polykarbonaatti suodatinmembraanit 8 um halkaisijaltaan huokosiin. Olemme todenneet, että optimaalista hyökkäys aikaan HNSCC kasvainsolujen oli 8 tuntia ymppäyksen jälkeen, mistä on osoituksena huomattava määrä soluja, jotka tunkeutuivat pohjaan polykarbonaattisuodatin kalvon (~60-70% soluista /kokonaispinta-alasta) (Fig. S1). Kasvainsoluja kontrolliryhmän pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% antibiootteja, ja HDAC-inhibiittori ryhmä sai 300 nm Trichostatin A (TSA), laimennettu media. Alempi kammio sisälsi DMEM täydennetty 20% FBS: ää ja 1% antibiooteilla. Sen jälkeen, kun pinnoitus, soluja inkuboitiin 8 tuntia, joka perustuu optimaaliseen invaasio ajan (Fig. S1), 37 ° C: ssa 5% CO 2-kostutetussa inkubaattorissa. Invasiivinen solut alemmassa kammiossa värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05; * P 0,05; ** P 0,01 ja *** P 0,001).

Tulokset ja keskustelu

chromatin asetylaatio ja solujen käyttäytymistä HNSCC

roolin tutkimiseksi kromatiinin remodeling in HNSCC käyttäytymistä, tarkastelimme chromatin asetylointi paneeliin 6 HNSCC solulinjoissa. Spontaanisti kuolemattomaksi suun limakalvon solulinja (NOK-SI) käytettiin verrokkina [29]. Histoniproteiineista pelata rakenteellisia ja toiminnallisia rooleja kaikissa ydin- prosesseihin ja tehdään erilaisia ​​muunnoksia [30], kuten asetylaatio, metylaatio, fosforylaatio, ubikitinaatiosta SUMOylation, ja poly-ADP-ribosylaation säännellä kromatiinirakenteeseen ja geenien ilmentymisen [31]. Asetylaatio histoni H3, yleisesti havaittiin Lys9, 14, 18, 23, 27, ja 56, on rooli geeni toimintaa [32], [33]. Erityisesti toiminnalliset asetylaatio histoni 3 Lys 9 on tutkittu laajasti ja se on yhdistetty histoni laskeuman, kromatiinin kokoonpano, ja geenin aktivointi [34] – [36]. Tuumorisolut ovat vaihtelevia asetylaatio tasot histoni 3 lysiinin 9, joka on merkki aktiivisen geenien [32], [33]. Kaikki HNSCC solulinjat analysoimme näkyvissä hypoacetylation kromatiinin verrattuna NOK-SI ohjaa (Fig. 1A), mikä viittaa HNSCC tiivistyä chromatin alle pohjapinta viljelyolosuhteissa. Alennettu asetylaatio tasot histoni 3 lysiinin 9 raportoitiin myös kasvaimia keuhkoissa ja ruokatorven [37] – [39], ja 3D-viljelmiä neuroblastoomasoluja ja kasvaimen pallosia, jotka ovat peräisin melanoomasoluja [40] – [42]. Muutoksia chromatin organisaatiossa rooli monissa ihmisten sairauksia, kuten syöpää [43], jossa niitä pidetään arvokkaana prognostinen markkeri [44].

(A) Western blot-analyysi osoittaa maailmanlaajuisen chromatin hypoacetylation of HNSCC, kuten osoituksena alhainen ekspressiotasot asetyyli-histoni H3 Lys9 (Ac.H3) verrattuna kontrolliin normaaliin suun keratinosyyttien (NOK-SI). (B) Kuvat ovat sekä pylväsdiagrammi hyökkäystä määrityksiä. HN6 osoittavat merkittävää invasiivisia kapasiteetti verrattuna HN13 (*** p 0,001). Invasion määritettiin laskemalla HNSCC solut pohjaan kalvon (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja) useista kentistä (20X). (C) Western blot -analyysi, joka esittää korkean ekspression endogeenisten vimentiinin, kanoninen markkeri EMT, on HN6 soluissa, mutta ei HN13 soluissa. (D) arviointi CSC markkerin ALDH osoittaa, että HN6 on suuri määrä ALDH + -solujen, yhteen yli 11% koko tuumorisolupopulaatioon. Noin 6% HN13 solut ovat ALDH +. (E) Havaintoesimerkki holoclones (nuoli), meroclones (nuolenkärki) ja paraclones (tähti) aikana muodostunut HN6 klonogeeniset määrityksessä. HN13 kasvainsolujen pääasiassa muodostamiseksi erilaistumaton holoclones (nuoli). Kvantifiointi pallojen paljastaa lisääntyneen kyvyn HN6 solun tuottamaan palloja verrattuna HN13 (** p 0,01).

vieressä tutki aggressiivisuus HNSCC solujen alhainen asetylaatio tasolla. HN6 kasvainsolut, jotka ovat herkkiä sisplatiinin (Almeida OA ja Castilho RM, julkaisematon data), tehostunut invasiivisuus (Fig. 1 B, *** p 0,001) ja korkea endogeenistä vimentiinista, välissä hehkulanka löytyy usein aggressiivinen pahanlaatuisen kasvaimia, joita ollaan epiteelin-mesenchyme siirtyminen (EMT) [45] – [47] (Fig. 1 C). Seuraavaksi pyrittiin luonnehtimaan olemassaolon alapopulaatio CSC tiedetään vahvistavan kasvaimen aloittamista, kasvua ja etäpesäkkeiden [16] – [25] ja jotka liittyvät kehittämiseen EMT [48] – [50]. Vaikka useita markkereita on ehdotettu tunnistaa CSC perusjoukko pään ja kaulan alueen syöpien, aktiivisuus tasot entsyymin aldehydidehydrogenaasin (ALDH) pidetään erittäin selektiivinen merkkiaine CSC ja kantasolujen biomarkkeri erilaisissa normaaleissa ja syövän kantasoluja [51] – [54]. Invasiivinen HN6 on esitetty suuri määrä ALDH-positiivisia (ALDH +) solujen yhteen enemmän kuin mikä vastaa yli 11% koko väestöstä (Fig. 1D_HN6). Toisin kuin HN6 soluihin, HN13 solut eivät ilmaista vimentiinin, oli vähentynyt invasiivisuus, ja vain 6% niiden koko solupopulaatio koostuu ALDH + -solujen Mielenkiintoista, HN13 kasvainsolujen käyttäytyi eri tavalla verrattuna HN6 esitteleville soluille populaatio 6% ALDH + -solujen, puuttuessa vimentiinistä ilmaisun, ja vähentää haitallisten kapasiteetti (Fig. 1 B, C, ja D_HN13). Vuonna klonogeeniset määrityksessä HN6 ja HN13 solut muodostivat 3 erilaista pallo malleja, tunnistettiin holoclones, meroclones ja paraclones, jotka liittyvät suoraan ”stemness” jälkeen, klonogeeniset määritys pään ja kaulan kasvainten solulinjoissa näytetä muodostumista 3 eri pallo malleja joka liittyy suoraan sen ”stemness” käyttäytymistä, holoclones, meroclones ja paraclones [55] – [57]. Holoclones ovat ominaisia ​​hyvin rajatut reunat ja niillä suurin kasvupotentiaali, mikä todennäköisesti muodostuu eriytymättömiä kantasoluja. Paraclones on ominaista nopea kasvu, mutta se on rajoitettu solujen elinkelpoisuutta. Meroclones sijaitsevat kahden muun alalla kuvioita ja niille on tunnusomaista kaksi edellistä on kuvattu CSC spheres kuvioita, esittämällä pesäkkeet ryppyinen kehät ja parantaa solujen elinkelpoisuuden verrattuna paraclones [55]. Havaitsimme, että invasiivisia HN6 kasvainsolujen syntyy enemmän klooneja verrattuna HN13. Varsinkin palloja muodostavan soluja HN6 olivat sekoitus holoclones (Fig. 1E_arrow), meroclones (Fig. 1E_arrow pää) ja paraclones (Fig. 1E_asterisk). Kuitenkin HN13 pallojen sisälsi ainoastaan ​​suuret holoclones eikä meroclones tai paraclones (Fig. 1E_arrow), mikä viittaa homogeenisen populaation CSC.

Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että pään ja kaulan syöpäsolut johdonmukaisesti ylläpitää hypoacetylated chromatin huolimatta aggressiivinen käyttäytymistä. Lisääntynyt kromatiinin kondensaatio korreloi kasvaimen vastustuskykyä chemotherapies [11] – [14], johtui todennäköisesti häiritsi tulva DNA: n korjaukseen molekyylien tumaan ja heikentynyt apoptoosin [58]. Itse asiassa, kromatiinin decondensation on välttämätöntä DNA: n korjaukseen [59] – [62], jolloin jäsenten DNA: n korjauksen koneen rooli chromatin uudelleenjärjestely laajamittaisen chromatin kehittymässä [59], [63]. Läsnäolo CSC, kuten havaitaan ALDH entsymaattista aktiivisuutta, ihmisen pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoissa on mielenkiintoinen ja osoittaa kykyä kasvainsolujen säilyttää heterogeenisen populaation. Erityisesti olemme huomanneet, että aggressiivinen kasvainsolut koostuvat heterogeenisen populaation pallo muodostavien solujen koostuu holoclones, meroclones ja paraclones ja yleinen suuri määrä aloilla (Fig. 1 E, ** p 0,01). Heterogeeninen CSC kuvio ei havaittu veltto pään ja kaulan syöpäsoluja. Nämä havainnot viittaavat siihen, rinnakkaiselo kasvainsolujen vaihtelevalla ”stemness”, joka kattaa sekä niiden CSC väestön ja invasiivisuus.

Kasvain microenvironment ja HDAC estäjä moduloi chromatin asetylaatio ja CSC sisällön

Sen jälkeen meidän Aiempien huomautusten että kasvain soluja löytyy hypoacetylated, päätimme etsiä ympäristön ärsykkeille, jotka voivat vaikuttaa chromatin asetylointi aikana kasvaimen invaasion. Valitsimme arginiini-rikas histonien H3 ja H4 markkereina chromatin asetylointi perustuu niiden kykyyn järjestää DNA sisällä nukleosomeissa. Asetyloitu histonien H3 ja H4 vapautuminen superkierteisen DNA nukleosomit tehdä geeneihin helpommin [64]. Lisäksi asetylaatio histonien H3 ja H4 vaikuttaa korkeamman asteen chromatin rakenteita ja tekee DNA sitoutumiskohtien saatavilla trans-toimivat tekijät [65], [66]. Olemme kasvaimen solut kunnostetun alustan (CM), jotka ovat peräisin fibroblasteista ja endoteelisolujen kaksi pääosaa kasvaimen mikroympäris- [67] – [69]. Vaikka fibroblastit edustavat suurinta solukomponenttiin dermis ja sub limakalvo, CM näistä soluista onnistunut indusoimaan muutoksiin asetylaatio histonien H3 (Ac. H3) ja H4 (Ac. H4) (Fig. 2A_Fibroblast CM). Kuitenkin CM endoteelisoluista oli voimakas vaikutus järjestämisestä kasvaimen kromatiinin (Fig. 2A_Endothelial CM – Ac. H3 ja Ac. H4). Mielenkiintoista on, että vastauksena CM endoteelisoluista, HN6 solut näytetä asetyloitu kromatiinin ja lisääntyneen ilmentymisen vimentiinin, joka on pääasiassa havaittu EMT [45] – [47]. BMI-1, jäsen Polycomb repressorin monimutkainen 1, joka on mukana chromatin remodeling ja erittäin ilmaistaan ​​syöpäsoluissa [70] – [72], on yliaktiivista HN6 vasteena endoteelin CM (Fig. 2A_ Endothelial CM_HN6). Yllättäen, endoteelin CM indusoi kromatiinin tiivistyminen HN13-soluissa (kuvio. 2A_ Endothelial CM_HN13) samalla tavalla kuin nykyisen kaksivaiheinen prosessi transkription repression välittämien Polycomb-ryhmän geenien perhe (PcG). Tämä prosessi vaikuttaa negatiivisesti DNA saavutettavuus transkription ja remontin tekijöitä, jolloin kromatiinin tiivistyminen (tarkistaa Sparmann A

et al

. [73]). Deasetyloitumisen HN13 soluja ei muuttanut BMI-1 ja vimentiinista ilmaisun (Fig. 2_Endothelial CM). Eroavuudet kasvaimen käyttäytymisen ja chromatin vaste ympäristön muutokset voivat johtua mutaatioista PcG perheenjäseniä, jotka aiheuttavat aggressiivista käyttäytymistä havaittiin HN6 kasvaimen soluihin (Fig. 1 B ja C).

(A) Western blot-analyysi osoittaa, että fibroblasti-väliaine (FCM-vasen paneeli) joka ei säätele chromatin asetylaatio (Ac. H3 ja Ac. H4), BMI-1 tai vimentiinista tasoilla tuumorisolulinjoissa. Endoteliumin johdettuja kunnostetun alustan (ECM-oikea paneeli) vaikuttaa kasvaimen asetylaatio kuvailema kohonnut Ac. H3 ja Ac. H4 tasot HN6 soluissa ja ablaatio Ac. H3 ja Ac. H4 tasot HN13 soluissa. Huomaa, että yhdessä Ac. H3 ja Ac. H4, HN6 solut osoittavat lievää BMI-1 ja vimentiinista tasolla. (B) Kasvaimen leviämisen arvioi Ki67 näyttävät toteen pienentää leviämisen annon jälkeen HDACi TSA (300 nM) 24 tuntia. (C) antaminen TSA (300 nM) 24 tuntia vähentää koko väestö CSC HN6 ja HN13 soluja, mistä on osoituksena läsnäolo ALDH + soluja. (D) HDACi (TSA) häiritsee kasvain holoclones kuten esitetään edustavat kuvat kasvain palloja ja kvantifiointiin pallojen (HN6 ** p 0,01, HN13 * p 0,05).

seuraava ratkaistava, onko chromatin asetylointi yksin vaikutteita pään ja kaulan kasvainten käyttäytymistä. Käytimme Trichostatin A (TSA) HDAC estäjä kemiallisesti aiheuttaa chromatin asetylaatio. TSA estää selektiivisesti HDAC luokat I ja II, joilla epigeneettiset aktiivisuutta. Viimeksi TSA on myös osoitettu inhiboivan ei-histoni transkriptiotekijöitä ja co-säätimet, mukaan lukien p53, STAT, ja NFKB [74], [75]. Sen jälkeen, kun määritetään optimaalinen pitoisuus TSA (300 nM), joka pystyy indusoimaan pään ja kaulan alueen syöpä solujen asetylaatio (Fig. S2) [76] – [82], olemme havainneet, että inhibitio HDAC: t suoraan heikentynyt leviämisen HNSCC soluja (Fig. 2B , HN6 * p 0,05, HN13 *** p 0,001). Havaitsimme myös odottamaton väheneminen osa CSC käsittelemällä TSA (Fig. 2C_TSA), jossa on 7%: n vähennys ALDH + eristetyt solut HN6 ja noin 6%: n vähennys ALDH + solujen HN13 (Fig. 1D_Vehicle). Toiminnallisena määritystä, arvioimme vaikutus TSA on klonogeeniset muodostumista CSC aloilla. Käyttämällä ultra-low tarttuvuus levyt, me viljeltiin kasvainsolut alhaisella yhtymäkohdassa 5 päivää ja noudatettava, kunnes muodostumista hyvin määritelty aloilla. Sen jälkeen pallo muodostumista, TSA annettiin, ja pallojen seurasi tiiviisti. Yllättäen, induktio kromatiinin asetylointi johti nopeaan ja hajoaa progressiivisesti aloilla (Fig. 2D, HN6 ** p 0,01, HN13 * p 0,05). Häiriöt kasvaimen pallojen viittaa siihen, että chromatin asetylaatio aiheuttama HDAC esto häiritsee fysiologisia vaatimuksia CSC huoltoa. Todellakin, kromatiinin asetylointi on pitkään tiedetty aiheuttavan solujen erilaistumista ja rajoittaa solu- transformaation [83], [84]. Siksi HDAC-estäjät (HDACi) voi olla uusi hoitostrategia heikentävää haitallisia vaikutuksia CSC. Nämä tulokset viittaavat siihen, dynaaminen prosessi, jossa pään ja kaulan alueen syöpä solut ovat erittäin herkkiä ympäristön ajettu epigeneettiset muutokset, tukee käsitystä, että epigeneettiset kohdentaminen voi olla tehokas ja arvokas lähestymistapa kemoterapian ja kemopreventiolle syövän [4]. HDAC-inhibiittorit (HDACi) ovat lääkkeitä, jotka kohdistuvat tiettyihin osallistuvia entsyymejä epigeneettiset geenin ilmentymisen säätelyyn ja mahdollisesti uuden luokan syöpälääkkeiden [4], [5], [7], [12], [85]. Vaikka HDACi onnistuvat hoidettaessa hematologisia syöpiä, niiden käyttö kiinteissä kasvaimissa yhä kiistanalainen [86], [87].

kemiallisesti aiheuttama chromatin asetylointi edistää EMT vuonna HNSCC soluissa

Vaikutus HDACi on CSC sai meidät onko anto TSA muuttaisivat ylimääräisiä ominaisuuksia pään ja kaulan alueen syöpä. Pahanlaatuisia kasvaimia on johdettu epiteelisolujen (karsinoomat) käyvät hieno prosessia kutsutaan EMT, joka edeltää hyökkäys ja eteneminen syöpäsolujen [46], [88] – [91]. EMT on ominaista menetys soluadheesion, lisääntynyt liikkuvuus, aggressiivista käyttäytymistä, ja hankinta pitkänomaisen fibroblastit morfologia ja ilmaus vimentiinista, kanoninen merkkiaine EMT [45] – [47]. Erityisesti, aggressiivinen HN6 soluilla oli konstitutiivista ilmentymistä vimentiinista (Fig. 1 C) ja pääasiassa mukulakivi ulkonäkö (Fig. 3A_Vehicle_HN6). Farmakologinen esto HDAC aiheutti solujen nopeasti muuttamaan morfologiaa osaksi karan muotoon ja lisätä vimentiinista ilmentymisen (Fig. 3A_ TSA_HN6). Lisäksi anto TSA aiheuttama karan morfologia ja vimentiinista ilmentymisen HN13 soluissa (Kuva. 3A_ TSA_HN13), jotka eivät yleensä ilmaista tämä väli hehkulampun (Fig. 1C_HN13_Vimentin). Emme havainneet TSA-indusoitua morfologisia muutoksia tai vimentiinista ilmentyminen normaaleissa soluissa (kuvio. 3A_NOK-SI), mikä viittaa siihen, että hyperasetylaation kromatiinin differentiaalisesti moduloi normaalit ja neoplastiset solut. Vaikka kokonaismäärä HN6 soluja, jotka ilmentävät vimentiinista vain marginaalisesti vasteena TSA (Fig. 3B_HN6, * p 0,05), kasvainsolujen näytetään fibroblastit morfologia olivat pääosin positiivisia vimentiinin (Fig. 3C_HN6, *** p 0,001). Yhdistelmä vimentiinista ilmaisun ja fibroblastit morfologia havaittiin myös HN13 soluissa chromatin asetylaatio (Fig. 3B ja C_HN13 *** p 0,001). Nämä tulokset viittaavat vahvan aseman chromatin decondensation aikana hankinta EMT fenotyypin HNSCC soluissa.

Inhibition histonideasetylaasi indusoi vimentiinista ilmentymistä HNSCC soluissa ja hankkiminen karan muotoisen morfologia. (A) Edustavia esimerkkejä morfologisia muutoksia ja ilmaus sytokeratiini 14 (CK14) epiteelisolujen markkeri ja vimentiinin mesenkymaaliset markkeri. Huomaa, että normaali keratinosyytit ilmaista CK14 läsnäollessa ajoneuvon tai TSA ja solujen morfologia on jatkuvasti epithelioid (mukulakivikadut tai diskoidia ulkonäkö). Sekä HN6 ja HN13 solut ilmentävät CK14 ja epithelioid muoto (A, ajoneuvo). Sen jälkeen TSA hoito, HN6 ja HN13 ilmaista vimentiinista ja tulla kara muotoinen. (B) Graafinen prosenttiosuutta positiivisten solujen vimentiinista seuraavat TSA tai ajoneuvon hoitoon. TSA aiheuttama chromatin asetylointi johtaa lisääntyneeseen vimentiinista ilmentymistä HN6 ja HN13 soluja (* p 0,05 ja *** p 0,001). (C) Graafinen edustavat vimentiinista ilmentymistä Karan muotoinen soluissa (kasvainsolujen EMT kaltainen morfologia). HN6 ja HN13 solujen näyttää merkitsevä vimentiinista ilmaisun jälkeen TSA hoidon (*** p 0,001).

Kromatiini hyperasetylaatio parantaa hyökkäyksen ja ilmentymistä BMI-1 pään ja kaulan syöpien

BMI-1

geeni yliaktiivista erilaisia ​​syöpiä ja liittyy lisääntynyt kasvaimen aggressiivisuus ja huono eloonjäämisasteesta [71], [92] – [97]. Kasvaimia synnyttävän vaikutuksen BMI-1 välittyy ensisijaisesti estämällä p16

ink4 tuumorisuppressorigeeniä, aktivoitumiseen johtavat pRB ja p53 signalointi [98], [99]. Olemme havainneet, että TSA-käsitellyt tuumorit osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä BMI-1 (Fig. 4A) tumassa (Fig. 4B), kehittää karan muotoinen fenotyyppi, ja polarisaation F-aktiini filamentit (Fig. 4B). Mielenkiintoista on, että polarisaatio aktiinisäikeiden havaittiin vain kasvainsoluissa käsitelty TSA. Normaalit ihmisen epiteelisolujen ei muuttanut niiden morfologiaa vastauksena chromatin decondensation, mikä viittaa selektiivinen vaikutus HDACi kasvainsoluissa (Fig. S3_NOK-SI). Ylössäätely BMI-1 myös liittyy lisääntynyt invasiivisuus ja HN6 ja HN13 solut (Fig. 4C, HN6 * p 0,05 ja HN13 *** p 0,001). Yhdessä huomasimme, että riippumatta alkuperäisen invasiivisen kapasiteetti HN6 ja HN13 solut (Fig. 1 B ja C), kemialliset aiheuttama chromatin asetylointi aiheutti HNSCC tehdään EMT (Fig. 3) ja upregulate BMI-1 (Fig. 4A ja B ). Paradoksaalisesti esto HDAC: t myös heikentynyt CSC väestöstä (Fig. 2C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että asetylaatio HNSCC kromatiinin suoraan heikentää alaryhmästä ALDH + syöpäsolujen, jolloin valitaan homogeenisen alapopulaation riistää multipotenttisuus ominaisuuksista [16] – [25]. Lisäksi kliininen käyttö HDACi on erittäin onnistunut hoidettaessa hematologisia syöpiä, jotka usein käyttäytyvät homogeeninen sairauksia. Siten epigeneettiset tekijöitä, jotka moduloivat chromatin asetylaatio voi olla vastuussa liipaisu muutosten HNSCC käyttäytymisen vuorottelemalla kasvainsolujen välillä lepotilassa ja ”stemness” vaihe, joka kestää kemoterapiaa aggressiivisempi ja invasiivisen käyttäytymisen, joka edistää kasvaimen etäpesäke. Tämä mekanismi on linjassa kehittyvillä tuumorigeenisyyteen mallia solun ”plastisuus”, ja saattaa olla tärkeä mekanismi, jota HNSCC samanaikaisesti hankkia invasiivisen käyttäytymisen ja chemoresistance. Alkuperäinen käyttö HDACi voi tarjota molekyylitasolla määritellään avautuu mahdollisuus potilailla, joilla on pään ja kaulan alueen syöpä kemiallisesti ablatoimiseksi kasvain ”plastisuus” ennen hallinnon genotoksinen kemoterapiaa.

(A) Western blot-analyysi kuvaa lisääntynyt BMI -1 ilmentyminen HNSCC soluissa TSA hoitoa. (B) Kuvat ovat ydin- BMI-1 (FITC /vihreä) ja polarisaation F-aktiinisäikeiden (TRITC /punainen) tuumorisoluissa olevien EMT jälkeen TSA hoidon. (C) Edustavia esimerkkejä lisääntynyt kasvainsolujen invaasio hoidon jälkeen HDAC-inhibiittorit. Huomautus merkittävän kasvun invaasiokyvyssä HN6 ja HN13 soluja (* p 0,05 ja *** p 0,001 vastaavasti). (D) Edustavia esimerkkejä ihmisen näytteitä normaalista suun limakalvojen ja HNSCC (H & E-värjättyjä). Huomautus asetyloitu kasvainsolujen (Ac. H3-FITC), jotka ilmentävät korkeita vimentiinista (vanhuspalvelut /vihreä) on hyökkäyksen edessä HNSCC.