Krooninen sairaus

tiivistelmä

Regulator Cullins-1 (ROC1) on keskeinen alayksikkö on Cullin-RING ligaasia (CRL) proteiini monimutkainen. Yliekspressio ROC1 proteiinin liittyy kasvaimen etenemiseen ja huonon ennusteen ei-lihaksen invasiivinen virtsarakon siirtymäkauden cell carcinoma (NMIBC). Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida vaikutuksia ROC1 Knockdown virtsarakon syövän solujen ja selvittää mahdollisia mekanismeja. Kaikkiaan 112 virtsarakon syöpä kudosnäytteiden rekrytoitiin immunohistokemiallinen analyysit ROC1 yli-ilmentymisen. Virtsarakon syöpä solulinjoja käytettiin pudotus ROC1 ilmentymisen käyttäen ROC1 siRNA. Tuloksemme osoittivat, että ROC1 pudotus estettiin merkittävästi virtsarakon syövän solujen kasvua, pidätettiin solujen G2 vaiheen solusyklin ja indusoi p53-riippuvaista solun vanhenemista. Molekyylirakennetta, G2 pidätys liittyi säätelyä p21, P27, sykliini B1, ja Cdc2 proteiineja. ROC1 Knockdown aiheuttama-vanhenemista toimi kautta p53 /p21-reitin. Knockdown p21 ilmaisun osittain pelastettiin ROC1 Knockdown aiheuttama kasvun esto syöpäsoluissa. Lisäksi nude mouse ksenografti- analyysit vahvistivat nämä

in vitro

tietoja. Lopuksi data nykyisestä tutkimuksen mukaan ROC1 olennainen rooli virtsarakon syövän etenemiseen ja voisi toimia uutena syövänvastainen tavoite transitionaalista rakkosolukarsinoomaa (BTCC).

Citation: Wang W, Liu Z, Qu P, Zhou Z, Zeng Y, Tuuletin J, et al. (2013) knockdovvn Regulator of Cullins-1 (ROC1) Expression indusoi virtsarakon syövän solusyklin pysähtymiseen G2-vaiheen ja Vanheneminen. PLoS ONE 8 (5): e62734. doi: 10,1371 /journal.pone.0062734

Editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 tammikuu 2013; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 08 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Shanghai Academic johtajat ’Program Health System (nro XBR2011038). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja on kahdeksas johtava syy syöpäkuolemista miehillä maailmassa [1]. Histologisesti, virtsarakon välimuotoisen epiteelin karsinooman (BTCC) on yleisin alatyyppi ja osuus ~90% kaikista virtsarakon syöpien [2]. Kliinisesti, 20%: sta 30% vasta diagnosoitu virtsarakon syöpä tapauksia ovat tunkeutuneet lihakseen kerros (kutsutaan lihas-invasiivisen siirtymäkauden cell carcinoma, MI-TCC), kun taas 10% 30% nonmuscle invasiivisia virtsarakon syöpien lopulta edistystä MI-TCC [3]. Tähän mennessä hoitoon virtsarakon syöpä riippuu syvyydestä kasvain tunkeutuu rakkoon seinään; MI-TCC potilailla, sisplatiini-kemoterapian suositellaan yleensä leikkauksen jälkeen [2]. Kuitenkin vakava myrkyllisyys kemoterapian ja suhteellisen alhainen syövänvastainen tehokkuus rajoittanut laajasti sovellettavaksi klinikalla ja suurin osa MI-TCC lopulta edetä ja toistuminen, mikä johtaa huonoon ennusteita MI-TCC potilailla [2], [4]. Siksi tunnistaminen uusia tehokkaita syövän vastaisia ​​tavoitteita ja aineita on suuri kliininen merkitys ja pikaisesti.

Tätä tarkoitusta varten olemme keskittyneet Cullin-RING ligaasit (CRL) (tunnetaan myös Skp1, Cullin tai F -box proteiini [SCF]), jotka ovat suurimmat perheen E3 ubikitiinipromoottori ligaasit. Johtuen kyky välittää -20% ubikitinoituja proteiinia substraatteja proteasomin kohdistetuissa hajoaminen [5], CRL tärkeä rooli ubikinaa- solukierron liittyvien proteiinien tai muiden proteiinien (esim DNA-replikaation proteiinia, signaalitransduktion proteiinia, geeni transkriptiotekijä) [6]. Sen toimintahäiriö assosioituu kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen, mikä viittaa siihen, että CRL voisi olla potentiaalinen syövän vastaisen kohde. MLN4924, pieni molekyyli inhibiittoria inaktivoitu CRL inhiboimalla CULLINS aktiivisuutta, voi tehokkaasti estää kasvua erilaisten syöpäsolujen [7], joka lisäksi viittaa siihen, että on tärkeää CRL ylläpitämisessä kasvaimen kasvu [8], [9]. Kuitenkin Regulator Cullins-1 (ROC1), toinen keskeinen alayksikkö CRL että heterodimerizes erillisistä CULLINS muodostaa katalyyttisen ytimien, joiden toiminta liittyy syövän huonosti ymmärtää [5]. ROC1, joka tunnetaan myös rengas proteiini-1 (RBX1), sisältää pienen sinkkiä sitovan domeenin nimeltään nimetön sormi, on evoluutiossa konservoituneen proteiinia hiivasta ihmisen ja on keskeinen rooli alkion kehitykseen [5]. Poikkeava ilmentymä ROC1 johtaa CRL toimintahäiriö ja aiheuttaa alkion kuolleisuutta [10]. Äskettäin muutamat tutkimukset ovat korostaneet sen merkitys ihmisen syövissä koska ROC1 saattaa olla välttämätöntä, jotta genomin eheys [11]. Vuonna perustelut, yliekspressio ROC1 aiheutti aberraation proteiinien aineenvaihduntaan vuoksi vapauttamiseen proteiinin translaation jälkeisestä ubiquitylation, ja lopulta vaikuttavia syövän kehittymisen ja etenemisen. Todellakin, ROC1 ilmaisu kehitykseen vaikuttavat ihon melanooma säätelemällä cyclinD1 hajoaminen [12]. Johdonmukaisesti, alustavien tietojen mukaan ROC1 proteiini yli-ilmentyy ei-lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä, mikä viittaa sen mahdollisen roolin virtsarakon syövän kehittymisen ja etenemisen. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme määrittäneet vaikutuksia ROC1 pudotus virtsarakon syöpä ja mahdolliset taustalla mekanismeja aikaan uusi kohde hoitoon virtsarakon syövän tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteet

tässä tutkimuksessa ensin palvelukseen 112 tapauksessa BTCC kudosnäytteiden potilailla, joille tehtiin leikkaus Shanghain Jiao Tong-yliopiston Kumppani ensimmäinen sairaala tammikuusta 2004 toukokuussa 2006. potilaista 83 urosta ja 29 naarasta ja oli patologisesti diagnosoitu primaaristen BTCC ja ikä näistä potilaista oli välillä 30 ja 86 vuotta (mediaani-ikä 64 vuotta). Seitsemänkymmentäyksi potilaalle tehtiin höyläysleikkaus, 24 potilaalle tehtiin osittainen cystectomy, ja 17 potilaalle tehtiin radikaali cystectomy. Arvosana ja vaihe kasvaimet arvioitu maailman terveysjärjestö (WHO) 1973 perusteet ja Amerikan sekakomitean Cancer (AJCC) 2002 TNM järjestelmä. Lisäksi kaukainen normaalissa virtsarakossa kudokset kerättiin myös, että oli enemmän kuin 5 cm: n päässä kasvaimen marginaali tässä tutkimuksessa. Protokolla käyttää ihmisen kirurgisten näytteiden hyväksyi Medical Ethics komitean Shanghai First ihmisten sairaalan Shanghain Jiao Tong-yliopiston (Luvan numero: 2011K047) ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

Immunohistokemia

Arkistoidut parafinoidut formaliinikiinnitetyt kudosblokeista näistä potilaista leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä ja käytetään immunohistokemia, ja käytetty protokolla mukaan oli Pan kuvaus [13]. Polyklonaalinen vasta-aine ROC1 (Abcam, Cambridge, MA) tai Ki67 (Epitomics, Kiina) laimennettiin klo 1:300 ja käytetään immunohistokemiallisesti tahraa nämä kudosleikkeiden tavallisella protokollaa kanssa Envision Dual leimatun Polymer Kit (BioGenex, San Ramon, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä ja itsenäisesti arvioida kaksi patologia.

Solulinjat ja kulttuurin

Ihmisen virtsarakon syöpä RT4, 5637, BIU87, 253J, T24, ja EJ solulinjat ostettiin Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina) ja viljeltiin RPMI 1640 (Gibco, CA, USA), jossa 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco). Soluja kasvatettiin kosteutetussa 5% CO

2 ympäristössä lämpötilassa 37 ° C. Lisäksi, normaali urothelial solut (NUC) saatiin tuoreista virtsarakon kudoksissa 2 nuorten luovuttajien (30 ja 32 vuotta vanha), ja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 keratinosyyttien seerumia (KSFM; Gibco) täydennettynä 1% FBS, 100 IU ml

-1 penisilliiniä ja 100 IU ml

-1 streptomysiiniä.

ROC1 siRNA ja transfektio

eri siRNA oligonukleotidejä eri geenit (kuten ROC1 tai p21) saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA) ja käytettiin transfektiota virtsarakon syövän soluissa. Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille yli yön ja seuraavana päivänä, transfektoitiin ROC1 siRNA käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden. ROC1 siRNA sekvenssit olivat 5′-GACTTTCCCTGCTGTTACCTAA-3 ’; p21, 5’-GACCAUGUGGACCUGUCAC-3 ’; ja sekoitettu kontrollipeptidi, 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3 ’. Sitten solut altistettiin proteiini uuttamalla tai muita määrityksiä, kuten alla.

Protein Extraction ja Western Blot

Cellular proteiini uutettiin soluista tai ilman geenin transfektio käyttäen lyysipuskuria. Seuraavat kvantifiointi, proteiini lysaatit erotettiin SDS-PAGE-geelissä, siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore, Billerica, MA), ja immunoblotattiin vastaisen vasta-aineen ROC1 (Abcam), GAPDH, Rb, sykliini B1 (Epitomics), p16 , p21, p27, p53, pRb, sykliini D1, ja cdc2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ja sitten piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Sitoutunut vasta-aine visualisoitiin käyttäen normaaleja kemiallisia luminesenssin menetelmiä.

Cell Proliferation ja Colony Formation Analyysit

arvioimiseksi muuttuneen solun fenotyyppejä mukaan knockdovvn ROC1 ilmaisun, me transfektoitujen solujen siROC1 tai siCONT 24 h ja sitten jakaa ja ympättiin soluja 96-kuoppaisille levyille 2000 solua kuoppaa kohti kolmena kappaleena. 24, 48, 72, 96 ja 120 h transfektion jälkeen, proliferaatiota arvioitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 kit (Beyotime, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden.

pesäkkeiden muodostumista, kahdennettu -solut ympättiin 35 mm: n viljelymaljoihin 400 solua (253J) tai 1000-soluja (5637) kuoppaa kohti kolmena kappaleena. Seuraavat 9 päivän inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, pesäkkeitä värjättiin kristallivioletilla 50% metanolia ja pesäkkeiden lukumäärä on 20 tai enemmän soluja laskettiin.

Virtaussytometrinen määritys

havaitsemiseksi muuttunut solusyklin jakelu, ensin transfektoitu siRNA osaksi virtsarakon syövän soluihin ja sitten kiinteät ne jääkylmään 70% etanolia yön yli. Seuraavana päivänä solut pestiin kahdesti jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja sitten värjättiin propidiumjodidilla (PI; 20 ug /ml, Sigma) liuosta 5 min. Solun analysoitiin sitten käyttäen BD FACScan-virtaussytometrillä solusyklin jakaumat. Mitoosia varten vaiheessa arviointi, solut värjättiin PH3 /PI käyttämällä Alexa 647-konjugoidun fosfo-histoni H3-spesifistä vasta-ainetta (Cell Signaling Technology) mukaan valmistajan ohjeiden.

Cell Vanheneminen Associated-β-galaktosidaasin määritys

Cell vanhenemista liittyvän ilmentymisen-β-galaktosidaasi (SA-β-Gal) aktiivisuus mitattiin käyttämällä solun vanhenemista detektioreagenssipakkaus (Beyotime, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Solut positiivista β-galaktosidaasin aktiivisuus (sininen väri) pH: ssa 6,0 laskettiin valomikroskoopilla ja keskiarvo.

Arvio Solumorfologia ja Immuno fl uorescence värjäys fosfo-γH2AX

jälkeen transfektio siROC1 tai siCONT 24 tuntia, virtsarakon syövän solut jaettiin ja uudelleen ympättiin 24-kuoppaisille viljelylevyille ja viljeltiin 72 tuntia. Solujen morfologia havaittiin alle käännettyä mikroskooppia. Solut ovat suurentuneet ja litistetty morfologisten muutosten katsottiin senescent-positiivisia. Sillä γH2AX pesäkkeitä värjäys, solut transfektoitiin siROC1 tai siCONT 96 tuntia, ja sitten kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,5% Triton X 10 min, ja sitten estettiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA). Sitten soluja inkuboitiin anti-fosfo-γH2AX primääristä vasta-ainetta (Epitomics) 4 ° C: ssa yön yli. Soluja inkuboitiin edelleen seuraavana päivänä Alexa 548-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja vastavärjättiin 4, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) liuosta (1 ug /ml Sigma), ja tarkistetaan ja sijoitettiin fluoresenssimikroskoopilla.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) ja sitten päinvastaiseen suuntaan cDNA: ksi käyttäen PrimeScript Käänteinen transkriptio System (Takara, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. CDNA Sitten näytteet monistettiin käyttämällä SYBR Green master mix (Takara). Alukkeiden sekvenssit käytetyt ovat saatavilla pyynnöstä. Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena kappaleena. Amplikoni analysoitiin käyttämällä ΔΔCt menetelmää [14].

In vivo

Mouse ksenoqraftit Pitoisuus

vaikutusten arvioimiseksi ROC1 Knockdown

in vivo

, suoritimme nude-hiirtä (joilta puuttuu kateenkorva, BALB /C nu /nu) -ksenografti määrityksessä, eli 5 x 10

6 5637 solua 50 ul: ssa PBS: ää sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen Matrigel (BD Biosciences) injektoitiin subkutaanisti nude-hiiriin (iältään 4-6 viikkoa vanhoja). Yhden viikon kuluttua tuumorisoluinokulaation, 12 hiiret jaettiin 2 ryhmään (6 hiirtä kussakin ryhmässä, halkaisija kasvain on noin 0,5 cm) ja kasvaimen injektoitiin 5 x 10

8 kopiota Lenti-shROC1 LT- -ROC1 ryhmä tai 5 x 10

8 kopiota Lenti-shCONT että LT-CONT, vastaavasti. ShROC1 tai ohjaus shRNA sekvenssit olivat mukainen aikaisemmassa tutkimuksessa [15]. Tuumorin koko mitattiin joka toinen päivä käyttäen paksuus, ja tuumorin tilavuus laskettiin käyttäen yhtälöä (L x W

2) /2 (jossa L ja W edustaa pisimmän pitkittäiset ja poikittaiset halkaisija, vastaavasti). Seuraavat 7 viikkoa havainto, hiiret tapettiin ja kasvaimen ksenografteja poistettiin, punnittiin ja valokuvattiin. Tässä tutkimuksessa seurattiin eläinten käsittelyyn ja kokeellisia toimenpiteitä ja hyväksytty eläinten hoidon ja käytön komitea Shanghai First ihmisten sairaalan Shanghain Jiao Tong-yliopiston.

TILASTOANALYYSI

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Bonferronin t-testi menetelmää sen jälkeen kun yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) ja multi-vertailuihin. Kaksi ryhmää vertailut analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset arvioinnit suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Tulokset

yli-ilmentyminen ROC1 Proteiini BTCC kudosnäytteet ja Solulinjat

tässä tutkimuksessa olemme ensimmäinen havaittu ilmentyminen ROC1 proteiinin avulla immunohistokemia 112 tapauksessa normaali ja BTCC kudosnäytteitä, ja kuusi solulinjoissa. Tuloksemme osoittivat, että ROC1 proteiinia heikosti ilmaistu 18 24 (75%) normaalissa virtsarakossa uroteeliin, kun taas ROC1 proteiini ilmentyy suuresti virtsarakon syövän kudoksissa (Fig. 1), eli näiden joukossa 112 BTCC kudosnäytteet, ROC1 proteiini oli kohtalaisen tai ilmentyy voimakkaasti 29 (25,9%), ja 66 (58,9%) näytteet, vastaavasti. Lisäksi ROC1 proteiini ilmentyy kaikissa ihmisen BTCC solulinjoissa (RT4, 5637, BIU87, 253J, T24, ja EJ) verrattuna ihmisen primaaristen urothelial solut (Fig. 1).

A ja B, immunohistokemia (suurennos x 400). Stained kudos microarray osat pisteytettiin mukaan neljään ryhmään värjäystä intensiteettiä. C, Western blot analyysit ROC1 ilmaisun eri BTCC solulinjoissa ja normaalit urothelial solut (NUC).

esto BTCC Cell Growth jälkeen knockdovvn ROC1 Expression

roolin arvioimiseksi of ROC1 virtsarakon syövän, me pudotti ROC1 ilmentyminen BTCC solulinjoissa käyttämällä ROC1 siRNA ja salatun siRNA kontrollina. Tuloksemme osoittivat, että ROC1 siRNA onnistuneesti pudotti ilmentymistä ROC1 proteiinin 253J ja 5637-soluissa (kuvio 2A ja B).

A, C, E, 253J soluja. B, D, F, 5637 soluja. Nämä kaksi solulinjaa transfektoitiin ohimenevästi siROC1 tai siCONT varten 24-120 tuntia, ja sitten alistettiin western blot (A ja B) analyysit ROC1 ekspression 72 tuntia transfektion jälkeen solujen elinkykyisyys CCK8 (C ja D), tai pesäkemuodostuksen (E ja F) määritystä. Edustavia tuloksia kolmen itsenäisen kokeen on esitetty keskiarvona ± SEM. **

P

0,01.

Seuraavaksi arvioimme vaikutuksia siROC1 pudotus näissä virtsarakon syövän solujen ja havaitsi, että siROC1 solut kasvoivat merkittävästi hitaammin kuin sen siCONT solujen (

P

0,01 72 tunnin, 96 tunnin ja 120 h, Fig. 2C ja D). Pesäkemuodostusta osoitti lisäksi, että pesäkkeiden määrä oli vähentynyt 5- 10-kertaiseksi siROC1 soluissa verrattuna siCONT solut (

P

0,01; Fig. 2E ja F).

ROC1 knockdown Arrested solut G2 vaiheen Cell Cycle

määritetään solukierron jakelu seuraavat ROC1 knockdown virtsarakon syöpäsoluja ja totesi, että molemmat 253J ja 5637 solua jälkeen ROC1 knockdown pidätettiin G2-M vaiheen solusyklin. Erityisesti 253J soluissa transfektoitu ROC1 siRNA 48, 72, 96, 120h lisäsi G2-M-vaiheessa 11,88 ± 0,27%, 15,68 ± 0,56%, 16,8 ± 0,42%, ja 10,8 ± 0,78%, vastaavasti, verrattuna 6 8% valvonta-soluissa (kuvio 3A), kun taas 5637-solut olivat 18 ± 1,41%, 35,5 ± 0,73%, 54,5 ± 2,12% ja 46,27 ± 4,62%, vastaavasti, verrattuna 11-14% kontrollisoluissa ( kuvio 3B). Nämä tiedot osoittavat, että G2-M pidätetty molemmissa soluissa saavutti huippunsa 96h transfektion.

A ja B, ROC1 knockdown aiheuttama G2-M solukierron pysähtymisen 253J (A) ja 5637 (B-solut). Solut transfektoitiin siROC1 tai siCONT varten 48-120h, ja solusyklin profiili havaittiin käyttäen FACS-analyysit Seuraavat propidiumjodidia (PI) -värjäyksellä. C ja D, ROC1 knockdown aiheuttama G2 solusyklin pysähtymiseen. 253J (C) ja 5637 (D) transfektoitiin siROC1 tai siCONT 96 h, ja altistettiin FACS-analyysi sen jälkeen, kun fosfo-histoni 3 (PH3) /PI kaksinkertainen värjäys. E ja F, Expression of solukierron liittyvä proteiini in 253J (E) ja 5637 (F) solua tutkittiin käyttäen western blot transfektion osoitetussa aikaväli. Edustavia tuloksia kolmen itsenäisen kokeen on esitetty. Pylväät, keskiarvo kolmen erillisen kokeen; baareja, SEM. **

P

0,01.

Sitten tutkittiin ilmentymisen G2-M siirtyminen liittyvät sääntelyviranomaisten, eli G2-M siirtyminen solusyklin säädellään monimutkainen cdc2 ja B-tyypin sykliini. Todellakin, meidän tiedot osoittivat, että Cdc2 ja sykliini B1 ilmaisut olivat huomattavasti sääteli seuraavat ROC1 Knockdown molemmissa 253J (Fig. 3E) ja 5637-soluissa (kuvio. 3F). Olemme myös päättäneet ilmaisun CDK-inhibiittorit, kuten p21 ja p27, ja totesi, että p21 ja p27 olivat merkittävästi kertynyt heti ROC1 Knockdown molemmissa solulinjoissa (kuvio 3E ja F). Sykliini D1, tunnettu solusyklin säätelijä G1 vaiheessa, oli myös merkittävästi aiheuttama ROC1 Knockdown molemmissa solulinjoissa (kuvio. 3E F).

tarkastella edelleen ROC1 pudotus pidätettiin syöpäsolujen G2 tai M vaiheet, suoritimme FACS-analyysit seuraavat fosfo-histoni H3 (PH3) /propidiumjodidia (PI) kaksinkertainen värjäys näistä solulinjoista. Histoni H3 on osoitus mitoosin kun fosforyloitiin Ser10 aikana M vaiheessa, mutta ei G2 vaiheessa [16]. Verrattuna siCONT soluja, siROC1 osoitti vähemmän fosfori-histoni H3-positiivista värjäytymistä sekä 253J ja 5637-soluja (kuvio 3C ja D), mikä osoittaa, että siROC1 pidätetty solut G2-vaiheessa sen sijaan, että M-vaiheessa. Yhdenmukaisesti näiden tulosten, western blot tiedot osoittivat, että ROC1 pudotus vähentää PH3 ilmentymistä (Fig. 3E F). Vähentynyt ilmentyminen PH3 proteiinin ja vähentää mitoosi soluissa osoittaa, että ROC1 Knockdown pidätetty solut G2 vaiheessa, mutta esti soluja pääsemästä M-vaihe.

ROC1 Knockdown aiheuttama virtsarakon syövän 253J Cell Vanheneminen kautta p53 /p21 Pathway

morfologisesti, ROC1 pudotti 253J solut tuli laajentunut ja litistetty, morfologia yleisesti havaittu senescent soluissa (kuvio. 4A, ylälevyissä), mutta ei esiintynyt 5637-soluissa. Olemme edelleen määritetty vanhenemista liittyvä β-galaktosidaasi (SA-β-gal) aktiivisuus (Fig. 4A, keskimmäinen paneeli), spesifinen merkki senescent soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, noin 25% 253J solut värjättiin positiivisesti seuraavat 96t ROC1 siRNA transfektion, verrattuna alle 4% positiivista värjäytymistä kontrollisoluissa (

P

0,01). Lisäksi arvioimme fosfo- γH2AX ilmaisun käyttäen immunologiseen fl uorescence värjäytyminen, joka on merkkiaine solun vanhenemista. Tuloksemme osoittivat, että 253J transfektoitujen solujen siROC1 oli enemmän γH2AX pesäkkeitä verrattuna on siCONT solujen (Fig. 4A, alapaneelit), osoittaa edelleen, että ROC1 pudotus indusoi 253J solujen vanhenemista.

A ja B, 253J solut transfektoitiin siROC1 tai siCONT 96 h, jonka jälkeen morfologinen havainnointi (A, yläpaneelit, suurennus x 400), SA-β-gal-värjäys (A, keskimmäinen paneeli, suurennus x 400) ja kvantitoitiin positiivisesti värjäytyneiden solujen (B) ja immuno fl uorescence värjäytymisen fosfo-γH2AX (A, pohja-paneelit, suurennus × 400). C, Expression vanhenemisen liittyvän reitin proteiinin 253J-soluissa tutkittiin käyttäen western blot transfektion jälkeen osoitettuina aikaväleinä. D, ROC1, p53, p21-mRNA: n 253J soluissa 72 tuntia transfektion tutkittiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Edustavia tuloksia kolmen itsenäisen kokeen on esitetty. Pylväät, keskiarvo kolmen erillisen kokeen; baareja, SEM. **

P

0,01.

p16 /RB ja p53 /p21 akselit ovat kaksi suurta vanhenemista liittyviä reittejä vastauksena eri stressitekijöitä. Koska p16-geeni on homozygousely poistetaan 253J soluissa [17], p16-proteiini oli havaitsematon 253J soluissa ennen ja jälkeen ROC1 siRNA transfektion (Fig. 4C). Kuitenkin sekä kokonais- ja fosforyloidun Rb-proteiinin tasot eivät olleet kertynyt yhteydessä ROC1 pudotus (Fig. 4C), mikä osoittaa, että ROC1 pudotus aiheuttama 253J solun vanhenemista on riippumaton p16 /RB-geenin kautta. Tuloksemme osoittivat merkittävää voimistumista p53 ja p21 proteiinien siROC1 solujen 96h ja 120h seuraava ROC1 siRNA transfektion (Fig. 4C), ja

p53

yhdessä

p21

mRNA voimistumista havaittiin myös käyttämällä kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä (Fig. 4D). Nykyinen data osoitti, että p53 /p21-geenin reitin välittämä vaikutuksia ROC1 Knockdown virtsarakon syövän solujen vanhenemista, koska 253J solut eivät ilmennä p16, mutta on villityypin p53, kun taas 5637-solut ilmaisi p53.

vaikutukset ROC1 knockdown on esto kasvainsolujen kasvua Through p21 Expression

Harkitaan p21 on kertynyt sekä G2 pidätyksen ja vanhenemista aiheuttama ROC1 knockdown, me edelleen määritelty rooli p21 vaikutukset välittyvät ROC1 siRNA sääntelyä virtsarakon syövän solujen kasvua. Tuloksemme osoittivat, että samanaikainen kumoamisen p21 ja ROC1 käyttäen siRNA merkittävästi heikennetty p21-proteiinin ilmentymistä (Fig. 5A B) ja heikennettyä solujen kasvun aiheuttama esto ROC1 pudotus sekä 253J ja 5637-soluissa (kuvio. 5C baareja, SEM. **

P

0,01 ja ***

P

0,001.

Effects of ROC1 siRNA sääntelyyn 5637 Cell ksenoqraftit ja kasvua

Olemme osoitti

in vitro

vaikutuksia ROC1 knockdown virtsarakon syövän solulinjoissa. Olemme pyrkineet vahvistamaan nämä tiedot paljaan hiiren ksenografteissa. Kuten on esitetty kuviossa. 6A 0,01). Immunohistokemia värjäys Ki67 osoitti, että LT-ROC1 injektio vähensi karvattomia hiiriä ksenografteja lisääntymistä (Fig. 6B). Kasvain paino LT-ROC1 ksenografteissa oli merkittävästi alhaisempi kuin LT-CONT ryhmä (

p

0,05). Western blot tiedot osoittivat, että p21-proteiini voimistussäädellään LT-ROC1 injektio ryhmä (Fig. 6E).

, edustaja valokuvia kasvainten eristettyjen nude hiirtä kussakin ryhmässä 7 viikkoa injektion jälkeen LTR ja LTC. B, IHC värjäys ksenograftien kudosten kanssa ilmoitetun vasta-aineen molemmissa ryhmissä. C ja D, Kasvaimen kasvu käyrän (C) ja kasvaimen paino (D) molemmissa ryhmissä. E, ROC1 ja p21 proteiinin uutettu proteiini vierassiirrännäiset molemmissa ryhmissä määritettiin käyttämällä western blot-analyysit. Lopussa kokeiden, kasvaimen kudokset leikattiin kustakin hiirestä ja punnitaan. Pylväät, keskipaino 5 kasvainten yksittäisistä hiiristä kussakin ryhmässä; baareja, SEM. *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001.

Keskustelu

esillä olevassa tutkimuksessa olemme raportoitu, että ROC1 proteiini yli-ilmentyy 112 virtsarakon syövän kudosnäytteet ja 6 solulinjoja verrattuna normaaleihin kudoksiin ja soluihin. Knockdovvn ROC1 ilmaisun esti virtsarakon solujen kasvuun ja indusoi G2 solusyklin pysähtymiseen ja p53-riippuvaista solun vanhenemista. Molekyylirakennetta, knockdovvn ROC1 ilmaisun ylössäädellään ilmentymistä p21, P27, sykliini B1 ja Cdc2 proteiineja. ROC1 pudotus aiheuttama 253J solujen vanhenemista oli välittyvä p53 /p21-geenin koulutusjakson, ja knockdown p21 ilmaisun osittain pelastettiin ROC1 pudotus aiheuttama syövän kasvun eston BTCC soluissa. Meidän nude mouse ksenografti analyysit entisestään vahvistaneet

in vitro

tietoja. Nykyiset tiedot viittaavat siihen, että ROC1 on tärkeä rooli virtsarakon syövän etenemiseen ja kohdistaminen ROC1 proteiini on potentiaalinen syövän vastaisen strategian virtsarakon syövän.

Aiemmat tutkimukset osoittivat ROC1 yli-ilmentyminen erilaisissa syövissä ja liittyy kasvaimen etenemiseen [15], [18]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme vahvistaneet nämä tiedot virtsarakon syövän kudoksissa ja solulinjoissa. Olemme edelleen arvioitu roolia ROC1 proteiinin virtsarakon syövän knockdovvn ROC1 proteiinin ilmentymistä kahdessa eri virtsarakon syövän solulinjoissa. Osoitimme, että ROC1 Knockdown esti voimakkaasti virtsarakon syöpäsolujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

. Mekanistisesti ROC1 knockdown aiheuttama solusyklin G2-vaiheen pysähtymisen ja solujen vanhenemista virtsarakon syövän solulinjoissa.

Cell cycle G2-M-vaiheessa on yhteinen solusyklin Checkpoint mekanismi vastauksena ulkoisille rasituksille ja induktio G2-M-pidätys on hyödyllinen strategia hoidettaessa erilaisia ​​ihmisen syövissä [19]. Molekyylirakennetta, Cdc2 kinaasi ja sykliini B1 muodostavat M-vaihe edistäjänä (MPF), jotka ohjaavat G2-M siirtymävaiheen ja M vaiheen etenemisen [20], kinaasiaktiivisuutta joka säätelee negatiivisesti CDK-inhibiittorit (CDKIs, kuten p21, P27) ja Cdc2 estävä kinaasien (esimerkiksi WEE1-) [21]. Meidän nykyinen tutkimuksessa olemme huomanneet, että ROC1 pudotus huomattavan aiheuttama G2-M pidätys säätelemällä ilmaus sykliini B1 /Cdc2 proteiinin sekä 5637 ja 253J soluja. Lisäksi meidän lisätiedot osoittivat, että ROC1 Knockdown pidätetty virtsarakon syövän solut G2 vaiheessa, vaikka on määritelty mekanismit ovat epäselviä. Ajateltavissa selitys voi olla, että ROC1 Knockdown aiheuttama CRL inaktivaation, joka aiheutti kertyminen joitakin erityisiä CRL alustoille (kuten p21, P27 ja WEE1-). Nykyinen tiedot osoittivat, että ROC1 knockdown indusoima p21 ja p27. Lisäksi sykliini D1, toinen tunnettu CRL alustan [22], oli myös merkittävästi aiheuttama ROC1 Knockdown molemmissa solulinjoissa. Emme kuitenkaan eivät havainneet merkittäviä muutoksia sykliini D1-liittyvä G1-S-vaiheessa pidätyksen, joka voi olla, koska ROC1 Knockdown pidätettiin solut G2-vaiheen soluja estetään pääsemästä G0-G1 vaiheessa.

Lisäksi olemme myös paljasti, että ROC1 knockdown indusoi p53 villityypin virtsarakon syöpä 253J solujen vanhenemista kautta p53-riippuvainen tavalla. Induktio solun vanhenemisen pidettiin tärkeänä kasvain tukahduttava mekanismi [23], [24]. Erilaiset rasitukset (esim telomere toimintahäiriö, onkogeeni aktivointi, DNA-vaurioita, ja muut ärsykkeet) voivat kaikki aloittaa solujen vanhenemista [23]. Vanheneminen on pääasiassa välittävät kaksi tuumorisuppressoriproteiinia väyliä: p53 /p21 ja p16 /pRB [23], [24]. Nykyinen tutkimus osoitti, että ROC1 Knockdown indusoi merkittävää solujen vanhenemista p53 villityypin 253J soluissa, mutta ei aiheuttanut p53 mutatoitunut 5637 solua. Lisäksi saarto p53 /p21-reitin knockdovvn p21 ilmaus lievittää merkittävästi ROC1 pudotus aiheuttamaa vanhenemista. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ROC1 pudotus aiheuttama vanhenemista liittyy toiminnallinen p53 /p21-reitin. Kuitenkin, Jia et al. osoittivat, että ROC1 Knockdown aiheuttama vanhenemista keuhkojen ja kohdunkaulan syövän solulinjoissa on p53- tai pRB- riippumattomalla tavalla [15]. Toinen samantapainen kysymys on, mitä määrittää solujen läpi solusyklin pysähtymisen tai vanhenemista tai muita solukuoleman tyyppejä. Tarkkaa mekanismia ei edelleenkään tunneta, ja oletamme, että tämä valinta voi liittyä solulinjan riippuvuuden (kuten

p

53 geenin asema, spesifisyys CRL substraattien, kesto stressi, et.al) ja intensiteetti ulkoisten stressi [25] (esimerkiksi DNA-vaurioita vastaus, oksidatiivisen stressin, et.al). Siten lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään määritellyn mekanismeja vastuussa ROC1 pudotus aiheuttama virtsarakon syöpä solukuolemaa.

Lisäksi meillä on myös havaittu, että ROC1 Knockdown estää kasvaimen kasvua 5637 solujen

in vivo

nude mouse ksenografti kanssa samanlaisia ​​mekanismeja. Eri vaiheissa virtsarakon syövän osoitti ero terapeuttinen reagoida sädehoidon ja kemoterapian [26]. Yksi ratkaiseva tekijä terapeuttinen alttiuden on

TP53

gene asema [27]. Solut, joissa toimimattomia p53-proteiini osoitti lisääntyneen resistenssin sädehoitoa tai kemoterapiaa johtuu alentunut DNA-vaurioita vastaus [3], [26]. Tämä tutkimus osoitti, että ROC1 Knockdown esti virtsarakon syöpäsolujen kasvua riippumatta p53 asemasta. Tämä tulos voi olla merkittävä vaikutus hoitoon virtsarakon syöpään. ROC1 pudotus geenien häiriöitä tai farmakologinen esto voisi olla uusi lähestymistapa vahvistaa reagointikykyä sädehoidon ja kemoterapia virtsarakon syöpäpotilailla. Joten, lisätutkimuksia tutkii tällaisia ​​lähestymistapoja tehokkaasti valvoa virtsarakon syöpään.

Yhteenvetona esillä tutkimus osoitti, että ROC1 tärkeä rooli BTCC etenemistä, ja ROC1 voisi olla uusi syöpälääkkeen tavoite BTCC. Lisätutkimukset selvennetään yksityiskohtaisesti mekanismeja ROC1 osallistumista BTCC tarvitaan vahvistamaan meidän ensisijainen tuloksia.