Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja c-MET reseptorit ilmentyvät monissa ei- pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin. Nykyinen ainoana lääkkeenä terapeuttiseen kohdentaminen mutantti EGFR on korkea tehoa klinikalla, mutta ei ole parantava. Täällä, tutkimme yhdistelmä kohdistaminen EGFR ja c-MET reittejä NSCLC resistenttejä soluja reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), käyttäen RNA-interferenssi ja esto TKI. Eri NSCLC solulinjoissa erilaisilla genomista ominaisuudet (H358, H1650 ja H1975) transfektoitiin EGFR-specific-siRNA, T790M-specific-siRNA, c-MET siRNA tai yhdistelmän. Myöhemmin EGFR TKI (gefitinibi, erlotinibi tai afatinib) tai monoklonaalinen vasta-aine setuksimabi yhdistettiin vastaavasti c-MET-erityisiä TKI su11274 NSCLC solulinjoissa. Solulisäkasvumäärityk-, elinkelpoisuutta, kaspaasi-3/7-aktiivisuus ja apoptoottista morfologiaa seurattiin spektrofotometrisesti, fluorimetriaa ja fluoresenssimikroskopiaa. Yhdistetty vaikutus EGFR TKI tai setuksimabi ja su11274, arvioitiin käyttämällä yhdistelmä indeksiä. Tulokset osoittivat, että solulinjat, jotka olivat suhteellisen resistenttejä EGFR TKI, erityisesti H1975-solulinja, joka sisältää vastuksen T790M mutaatio, havaittiin olevan herkempi EGFR-spesifisiä-siRNA. Yhdistelmä EGFR siRNA sekä c-MET siRNA parantaa solujen kasvun estäminen, apoptoosin induktio ja inhibitio alavirran signaloinnin EGFR-TKI resistenttejä H358, H1650 ja H1975-solut, puuttumisesta huolimatta aktiivisuus c-MET siRNA yksin. EGFR TKI tai setuksimabi plus su11274 olivat johdonmukaisesti parempia kumpaakin annettaisiin erikseen. Vahvin biologinen vaikutus havaittiin, kun afatinib, peruuttamaton pan-HER esto yhdistettiin su11274, joka saavutetaan synergistinen vaikutus, että T790M mutantti H1975-soluissa. Vuonna johtopäätös, meidän havainnot tarjoavat prekliinisissä periaatteen todiste yhdistettyjen esto on lupaava hoito strategia NSCLC, erityisesti potilaille, joille nykyinen EGFR kohdistetut hoidot epäonnistuvat johtuen läsnäolo T790M-EGFR-mutaatio tai korkea c-MET ilme .

Citation: Chen G, Noor A, Kronenberger P, Teugels E, Umelo IA, De Grève J (2013) synergistinen vaikutus Afatinib kanssa Su11274 in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä solut Kestää Gefitinibi tai erlotinibi. PLoS ONE 8 (3): e59708. doi: 10,1371 /journal.pone.0059708

Editor: Ramon Andrade de Mello, Porton yliopisto, Portugali

vastaanotettu: 7. joulukuuta 2012 Hyväksytty: 17 helmikuu 2013; Julkaistu 18 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Projekti rahoittivat National Cancer Plan Belgia (Grant NKP-29-011), Stichting Tegen Kanker, Belgia. Tämä tutkimus oli osittain tuettu tutkimusrahasto Boehringer Ingelheim GmbH. Gang Chen tukivat Kiinan Scholarship neuvosto (CSC). Gang Chen ja Ijeoma Adaku Umelo tukivat Vrije Universiteit Brussel (VUB) PhD stipendi. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: Tämä tutkimus oli osittain tuettu tutkimuksen rahasto Boehringer Ingelheim GmbH. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Joissain ei – pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla, epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR, joka tunnetaan myös nimellä erbB1 tai HER1), sisältää ”herkistävä” mutaatioita, jotka lisäävät tehoa EGFR-spesifisen tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) [1], [2]. Kaksi anti-EGFR-strategiat ovat tällä hetkellä kliinisissä sovellus: alhaisen molekyylipainon TKI jotka kilpailevat ATP sitoutumisesta tyrosiinikinaasi osan mutantti EGFR-reseptorin, ja monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t), jotka on suunnattu ligandia sitovan solunulkoisen verkkotunnuksen, mikä estää ligandin sitoutumisen ja näin ollen reseptorin dimerisaatio, ja reseptorin signalointi. Nämä kaksi luokkaa aineita ovat osoittaneet kiinteitä prekliinisen ja kliinisen aktiivisuuden erilaisissa kasvaintyypeissä [3].

joukossa reseptorin TKI, erlotinibi (Tarceva, Genentech, Inc, South San Francisco, CA, ja OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY) eloonjäämistä kehittyneissä pienisoluista keuhkosyöpää joka edistyi yhden tai kaksi ennen solunsalpaajahoitoa [4], [5], [6], [7]. Sekä gefitinibin ja erlotinibin ovat parempia kemoterapiaa ensilinjan hoitoon keuhkojen adenokarsinooma, jossa EGFR-reseptorin suhtautuu herkistävät mutaatiot eksonissa 19/21 [8], [9], [10]. Yhteenlasketun kliininen kokemus tänään osoittavat, että vain potilaat, joiden kasvaimet sisältävät herkistävä mutaatio, johtaa merkitsevää kliinistä hyötyä EGFR TKI. Itse asiassa, satunnaistetussa tutkimukset osoittavat, että potilailla ei valita tällaisia ​​mutaatioita, näitä lääkkeitä voi olla haitallinen vaikutus lopputulokseen [10], [11].

tehoa estäjien on ajallisesti rajoitettu johtuen ulkonäkö solujen resistenssimekanismeja, lähes puolessa tapauksista treoniinin-to-metioniini korvaaminen on EGFR aminohappoasemassa 790 (T790M). Afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), on peruuttamaton estäjä sekä EGFR, HER2 ja HER4 kinaasien ja säilyttää joitakin aktiivisuus kasvaimissa T790M mutaatioita, mutta annoksilla, jotka ovat log suurempi kuin mitä tarvitaan syöpien kätkeminen herkistäviä mutaatioita [ ,,,0],12], [13], [14], [15], [16], [17].

kimeerinen IgG1 monoklonaalinen EGFR-vasta-aine setuksimabi (ERBITUX, ImClone Systems Incorporated, New York, NY, ja Bristol -Myers Squibb Company, Princeton, NJ) estää ligandi-reseptori-vuorovaikutus ja siten alas-säätelee EGFR signalointia, ja estää siten solujen lisääntymisen ja angiogeneesiä, ja apoptoosin induktio [3]. Setuksimabi kemoterapiaan yhdistettynä, on hyväksynyt FDA ja EMEA metastasoituneen kolorektaalisyövän (CRC) ja samanaikaisesti sädehoidon hoidossa paikallisesti levinneen pään ja kaulan alueen syöpä (HNC) [18], [19]. Setuksimabi on osoittanut vaatimaton aktiivisuus yksittäisenä aineena sekä yhdistettynä doketakseliin potilailla, joilla on edennyt, kemoterapia-tulenkestäviä NSCLC [20]. Monikansallinen monikeskustutkimus, avoimessa vaiheen III tutkimuksessa on ilmennyt, että lisäys setuksimabin platinapohjaisen kemoterapian että ennuste parani potilailla, joilla on edennyt NSCLC [21]. Yleinen etu on kuitenkin rajallinen, joten ei ole yksimielisyyttä merkitystä kliiniseen käyttöön.

RNA-interferenssi (RNAi), jonka lyhyt häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) tai lyhyt hiusneula-RNA: iden (shRNAs), on edellyttäen tehokas väline, jolla voidaan moduloida geenin ilmentymisen tutkimiseen geenin toiminnan. RNAi on tällä hetkellä myös harkitaan terapeuttisena välineenä, laboratoriossa ja klinikan [22], [23], [24]. Useat raportit kuvattu vaikutuksia EGFR-kohdennettuja RNAi estävän solun kasvua [25], [26], [27], [28], [29], mutta yrittää kaataa T790M sisältävää alleelin (käyttäen lentiviraalinen shRNA konstruktit) olivat epäonnistunut [26].

kehittynyt resistenssi TKI voi myös kehittää kautta ”kinaasi kytkin”, jossa c-MET vahvistusta ja yli-ilmentyminen [30], [31]. Monistaminen c-MET, transmembraaninen tyrosiinikinaasireseptori, voi ilmetä jo ennen hoidon TKI NSCLC [32], [33], [34], [35], ja c-MET ilmentyy 60% NSCLC kasvaimista mitattuna immunohistokemiallisesti [34]. Korkea hepatosyyttikasvutekijän (HGF), c-MET-ligandi, joka on tuotettu stroomasolut [36], on myös korreloitu huonoon ennusteeseen NSCLC potilaiden [37]. c-MET vahvistusta ja ylössäätöä tunnistettiin joillakin potilailla, joilla on hankittu vastustuskyky gefitinibi /erlotinibi [30], [31]. Lisäksi c-MET voidaan aktivoida mutaatiot sekä [38]. Siksi C-MET esto voisi tulla arvokas hoitostrategia näille potilaille.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme ensin tutkineet yhdessä vaikutukset EGFR-erityisiä siRNA: t, joissa c-MET siRNA eri NSCLC solulinjoissa erilliset genomista ominaisuudet. Tutkimme myös yhdistelmä EGFR TKI (gefitinibi, erlotinibi tai afatinib) tai monoklonaalinen EGFR-vasta-aine setuksimabi, jossa c-MET estäjä su11274 samassa joukko keuhkosyövän solulinjat.

Methods

siRNA

Aiemmin kahdeksan siRNA kohdistaminen villityypin EGFR ja T790M sekvenssit (NCBI referenssisekvenssissä: NM_005228.3) suunniteltiin käyttämällä algoritmeja Invitrogen, Eurogentec, Dharmacon, Maurice HO Rational siRNA suunnittelu (http: //ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html), Reynolds [39], Ui-Tei [40] ja Jagla [41]. Kapasiteetti Näiden siRNA: iden ehdokkaiden kaataa EGFR tai T790M-mutantti EGFR mRNA-tasolla, ja niiden kykyä tukahduttaa soluproliferaatiota testattiin [42]. Tehokkain siRNA: ita valittiin kokeissa nykyisessä tutkimuksessa (taulukko 1). c-MET siRNA (NCBI referenssisekvenssissä: NM_001127500.1) ostettiin kuin ”kohde smartpool” (Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, Englanti) ja siRNA sekvenssit esitetään yhteenveto taulukossa 1. Salatut siRNA: ita muodostettiin www.sirnawizard. com ja tarkastettava BLAST haku (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) positiivinen kontrolli siRNA Invitrogen (ref. Tuotenumero # 12935-140 Stealth RNAi GAPDH Positiivinen kontrolli, Merelbeke, Belgia) käytettiin ensisijaisena testi siRNA transfektion tehokkuutta. TOX transfektio Ohjaus ja siglo Green transfektio indikaattorit tehtiin positiivisena kontrollina transfektiotehokkuuden (vrt. D-001630-01-02; D-001500-01-05, Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, Englanti). Negatiivinen kontrolli siRNA oli oma sekvenssi, joka ei vastaa mitään eukaryoottinen geeni (OR-0030-neg 05, Eurogentec S.A., Liege, Belgia). SiRNA-dupleksit transfektoitiin ohimenevästi käyttäen lipofektamiinia

TM 2000 (Cat. No. 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Belgia) RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ilman antibiootteja, kuten aiemmin on kuvattu [43], [44 ], [45]. Jokainen koe suoritettiin vähintään kolmena kappaleena ja kolme kertaa itsenäisesti.

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen NSCLC solulinjat H292 (CRL-1848 ™, limakalvon epidermaalista keuhkojen karsinooma), H358 (CRL-5807 ™, bronkoalveolaarisen karsinooma), HCC827 (CRL-2868 ™, adenokarsinooma), H1650 (CRL-5883 ™, adenokarsinooma, bronkoalveolaarisen karsinooma), ja H1975 (CRL-5908 ™, adenokarsinooma) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Alankomaat). Solulinja H292 on ilmoitettu olevan EGFR ja K-Ras villityypin solulinjan [46], [47], [48], [49], jota vahvistetaan käyttäen reaaliaikaista RT-qPCR ja sekvenssianalyysi (tietoja ei ole esitetty ). H358 on EGFR villityypin, on kodoni 12 K-Ras-mutaatio [50], ja homotsygoottinen deleetio p53 [51]. H1650 ja HCC827 on in-frame-deleetiomutaatio, että EGFR-tyrosiinikinaasi-domain (E746-A750 poistetaan, eksoni 19). H1650-solujen on myös COOH-terminaalinen deleetio PTEN ja menetys PTEN-proteiinin [52] ja ilmaista insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptori (IGF1 R) [53]. Solulinja H1975 on herkistävä L858R kinaasidomeeni eksonissa 21, ja toinen T790M eksonissa 20,

cis

, että EGFR kinaasidomeenista, tekevät niistä kestävät palautuva TKI gefitinibi ja erlotinibi [54 ]. Lisäksi kaikki nämä viisi solulinjat ilmentävät c-MET-reseptorin geenin monistaminen [28], [30], [53], [55], [56]. Kaikki viisi solulinjoja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen Corp., Gent, Belgia), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Perbio Science NV, Erembodegem, Belgia), 2 mM L-glutamiinia ja 1 mM natriumpyruvaattia 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Kymmenen mM varastot EGFR-erityinen TKI gefitinibin (AstraZeneca, Cheshire, Yhdistynyt kuningaskunta), erlotinibi (AstraZeneca, Cheshire, Yhdistynyt kuningaskunta), peruuttamattoman yleiseurooppalainen HER estäjä afatinib (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Saksa) ja c-MET estäjä , su11274 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgia) valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Nämä lääkkeet laimennettiin tuoreeseen RPMI 1640, jossa on DMSO: n loppukonsentraatio pienempi kuin 0,1% kaikissa kokeissa. EGFR-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine setuksimabi (2 mg /ml) ostettiin Merck KgaA, Darmstadt, Saksa.

RT-qPCR

RNA: n eristys RNA normalisointi käänteistranskriptio ja qPCR olivat aiemmin on kuvattu [43], [44], [45].

Western blot-analyysi

Sen jälkeen, kun on käsitelty siRNA: t tai eri aineita ilmoitettu aikana, solut pestiin PBS: llä ja hajotettiin puskurissa, joka sisälsi Tris /HCl (pH 7,6) 20 mM, NaCl 150 mM (pH 6,85), EDTA 1 mM (pH 8), TRITON-X 1%, Na-pyrofosfaatti 2,5 mM, natriumortovanadaattia (Na3VO4) 1 mM, leupeptiiniä 1 ug /ml, proteaasi-inhibiittori cocktailit 1% ja fosfataasin estäjä cocktailit 1% (Sigma-Aldrich NV /SA, Bornem, Belgia). Lysaatteja sentrifugoitiin 12000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja keitettiin 5 min. Proteiinipitoisuus lysaatin havaittiin Bio-Rad Bradford-proteiinin määrityksen (Nazareth Eke, Belgia) ja 25 ug denaturoitua proteiinia tehtiin SDS-PAGE (10% SDS-akryyliamidigeelille) kanssa latauspuskuria, joka sisälsi 80 mM Tris HCl: lla (pH 6,8), 5% SDS, 10% glyseroli, 5 mM EDTA (pH 8), 5% 2-merkaptoetanolia, 0,2% Bromophenolblue ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia. Erotetut proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille (BioRad) 2 tunnin ajan 100 mA. Kalvo inkuboitiin seuraavat ensisijaiset vasta-aineet kuten: EGFR (Cell Signaling), fosfo-EGFR (Tyr1173, klooni 9H2, Upstate), c-MET (L41G3, Cell Signaling), fosfori-c-MET (Tyr1234 /1235, 3D7, Cell Signaling), fosfori-AKT /PKB (pS473, Invitrogen), fosfori-ERK1 /2 (pTpY185 /187, Invitrogen), fosfori-STAT3 (Tyr705, 3E2, Cell Signaling), fosfori-Stat5: n (pY694, BD Biosciences ) ja β-aktiini (Sigma-Aldrich NV). Peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:4000 laimennus, ECL anti-hiiri tai anti-kani-lgG-HRP liittyy, Na 931, GE Healthcare Bio-Sciences /Amersham, Diegem, Belgia) lisättiin, ja kalvot alistettiin kemiluminesenssidetektiolla (ECL Plus Western blotting tunnistus reagenssit, GE Healthcare Bio-tieteet /Amersham, Diegem, Belgia).

leviämisen

Solun kasvu arvioitiin kolorimetristä tetratsolium määritys (alustan MTS, CellTiter96 vesikerros liuos proliferaatiomääritystä G3580, Promega, Madison, USA). Protokolla oli seuraava: Eri aineiden ja yhdistelmiä lisättiin 96-kuoppaisille levyille kasvavien pitoisuuksien kanssa, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa korkeintaan 96 tuntia (yhdistelmä kokeissa kuitenkin jopa 72 h). Kun oli lisätty 20 ui MTS-reagenssia kuhunkin kuoppaan, levyjä inkuboitiin 2 h ajan 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa ja absorbanssi 490 nm: ssä rekisteröitiin käyttämällä 96-kuoppalevyn lukijaa (Scientific Multiskan MK3, Thermo Suomi). Tulokset olivat keskimäärin kuusi kuoppaa ja ilmaistiin suhteena absorbanssi jaettuna absorbanssilla mock-ohjaus x 100.

elinkelpoisuus

Solujen elinkelpoisuus määritettiin fluoresenssidetektoria ja resorufiini (CellTiter -blue solunelinkykyisyysmääritys, G8080, Promega, Madison, USA). Menettely oli valmistajan mukaan. Käsittelyt ja hallintalaitteet olivat edellä mainittu. Fluorimetriaa (ex: 560 nm /em: 590 nm) käyttäen FL600 fluoresenssilevylukijaa (Bio-Tek, USA). Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja joka kerta kuusi yksittäistä kaivoja käytettiin. Fluoresenssi tiedot ilmaistaan ​​fluoresenssi käsiteltyjen näytteiden jaettuna fluoresenssin mock ohjaus x 100.

kaspaasi-3/7 activity detection

kaspaasi-3/7 aktiivisuus mitattiin käyttäen synteettistä rodamiini leimattua kaspaasi-3/7 alustan (Apo-ONE® homogeeninen kaspaasi-3/7 Pitoisuus, G7790, Promega, Madison, USA) heti fluoresenssidetektoria solun elinkykyisyyden samalla kuoppiin, mukaan valmistajan ohjeiden. Kun oli inkuboitu huoneenlämpötilassa 60 minuutin ajan, fluoresenssi kunkin kuopan mitattiin (ex: 499 nm /em: 512 nm), käyttäen FL600 fluoresenssilevylukijaa (Bio-Tek, USA). Kaspaasi 3/7 aktiivisuus ilmaistaan ​​fluoresenssi käsitellyn näytteen /mock ohjaus x 100.

fluoresenssimikroskopialla arviointi solujen apoptoosin ja morfologia

vaikutukset eri hoitoja apoptoosin ja ydinvoiman morfologia soluissa arvioitiin Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgia) ja propidiumjodidilla (PI, Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgia) kaksinkertainen loisteputki chromatin värjäystä. Lyhyesti, sen jälkeen, kun yhden tai kahden hoidon siRNA: iden tai aineita, solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja värjättiin 15 min Hoechst (1 mg /ml) ja propidiumjodidia (PI, mg /ml), ja niitä tarkkailtiin kehittynyt fluoresenssi (Zeiss Axiovert 25, Zaventem, Belgia). Apoptoosi ja ydin- morfologia tunnistettiin kondensoimalla ydin- chromatin ja sen pirstoutuminen. Tämä järjestelmä määrittää absoluuttinen määrä elinkelpoisia soluja (Hoechst positiivinen /PI negatiivinen), varhainen apoptoottiset solut (Hoechst positiivinen /PI-negatiivinen sinisellä fragmentoitumat soluissa), myöhäinen apoptoottiset solut (Hoechst positiivinen /PI positiivinen, punaisella fragmentoitumat soluissa ), nekroottinen soluja (Hoechst negatiivinen /PI positiivinen) ja roskia signaaleja. Elinkelpoisia ja apoptoottisia soluja laskettiin 10 eri alojen alle 200-kertainen suurennus, ja kunkin kuopan kolmesta itsenäisestä kokeesta. Counting oli kaksi henkilöä ja keskimääräinen tulos ilmoitettiin suhteessa mock valvontaa. Apoptotic solujen määrä eri hoitoja verrattiin olemalla normalisoida niiden elinkelpoisten solujen määrä.

Tilastollinen

SPSS19.0 käytettiin tilastolliseen analyysiin. Tulokset olivat edustavat kolmen erillisen kokeen, ellei toisin mainita. Arvot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) testiä käytettiin analysoitaessa merkitystä ryhmien välillä. Pienin merkitsevä ero (LSD) menetelmää useiden vertailujen eri hoitoja ja kontrolliryhmässä käytettiin, kun todennäköisyys ANOVA oli tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen merkittävyys määritettiin

P

0,05 tasolla. Analyysi additiivisuuteen ja synergian arvionsa Biosoft CalcuSyn- ohjelman (Ferguson, MO, USA). Yhdistymissopimus Index (CI) käytettiin ilmaisemaan synergiasta (CI 1) additiivinen vaikutus (CI = 1), tai antagonismia (CI 1) [57].

Tulokset

Vaikutus EGFR villityypin ja T790M-erityinen-siRNA kohde ilmaisun ja pahanlaatuisen fenotyypin

siRNA kohdistaminen villityypin sekvenssit pystyi kaataa EGFR transkriptio, alentaa EGFR-proteiinin taso, estävät solujen kasvua ja indusoivat apoptoosia kaikissa NSCLC testatuissa solulinjoissa on kuitenkin eri suuruusluokkaa riippumaton erityinen kuljettaja geenimutaatioita (kuvio 1). Samoin T790M-specific-siRNA voi kaataa T790M mRNA, ja myös tukahduttaa soluproliferaatiota ja parantaa solujen kaspaasiaktiivisuus in H1975 jotka sisältävät T790M mutaation. Kuitenkin vaikutus oli vähemmän tehokas verrattuna EGFR-spesifisen-siRNA (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki negatiiviset ja sekoitetun ohjaus siRNA ei ollut mitään vaikutusta.

Keuhkosyöpä solulinjoja käsiteltiin EGFR-spesifisiä-siRNA 1247. Elävät solut ja apoptoottisia soluja havaittiin Hoechst 33342 ja PI kaksinkertainen fluoresenssivärjäys. Määrä apoptoottisten solujen normalisoida elävien solujen lukumäärä samalla hyvin. Hoechst 33342 ja PI kaksinkertainen fluoresenssivärjäys × 200.

Dual kohdentaminen EGFR ja c-MET siRNA: illa

Solulinjat eri mutaatioita (KRAS: H358, PTEN: H1650; T790M : H1975), jotka tekevät ne kestävät EGFR TKI oli edelleen valittiin kaksi kohdentamiseen. Vastus H1975-solujen kohti EGFR TKI on katsottu johtuvan läsnäolo T790M mutaation, mutta myös aktivointi c-MET-reseptorin [30], [31]. Synergy c-MET esto EGFR esto on esitetty malleja, joissa on aktivoitu tai yli-ilmentyy c-MET-reitin [58]. Meidän kokeessa olemme tutkineet vuorovaikutusta EGFR inhibition ja c-MET inhibitio soluissa, joissa esimerkiksi c-MET aktivointi ei ole läsnä. Pooli c-MET siRNA oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta solujen kasvuun (MTS-määritys) solulinjoissa H358 ja H1650. Vuonna H1975-soluissa, erittäin vaatimaton lisäkasvun aleneminen oli havaittu (87%, kuvio 2A). Oli samanlainen puute kaspaasi 3/7 induktio c-MET inhibition ainoa hoito kaikissa solulinjoissa (kuvio 2B). Vaikka immunoblottaus paljasti, että c-MET reseptorin tehokkaasti pudotettiin, ja että c-MET fosforylaation estyi, myös H1975 soluissa (kuvio 3), oli vähäinen vaikutus alavirran signalointia (AKT, ERK ja STAT polkuja). c-MET siRNA hoito yksinään ei näin ollen ole merkittävää vaikutusta johonkin NSCLC testatuista solulinjoista

in vitro

.

Paneeli A: Solulisääntyminen transfektion jälkeen eri siRNA. Solulinjat H358 (valkoinen), H1650 (harmaa) ja H1975 (musta) transfektoitiin EGFR-specific-siRNA 1247, T790M erityisiä siRNA, c-MET siRNA allas, tai näiden yhdistelmät, ja lisäkasvua tutkittiin 72 tunnin kuluttua transfektio kolorimetristä MTS-määritys. Paneeli B: Kaspaasi 3/7 aktiivisuutta. *

P

0,05 ja **

P

0,01 verrattuna sekä yksi hoitokerta.

Paneeli A: immunoblottianalyysi H358 ja H1650 transfektoitu villin tyypin EGFR siRNA, c-MET siRNA allas tai näiden yhdistelmä. Paneeli B: immunoblottianalyysi H1975 soluja, kuten paneelissa C. Tässä T790M-erityinen-siRNA oli myös mukana. Vasta-aineet sisältyvät fosforyloidun (p-) EGFR, EGFR, pc-MET, c-MET, p-AKT, p-ERK1 /2, s-Stat5: n, p-STAT3, ja β-aktiini.

lisäys EGFR siRNA (joko villityypin tai T790M-spesifinen) c-MET siRNA parannettu kasvun eston H358 ja H1650-soluissa verrattuna EGFR siRNA yksin, mutta paljon vähemmän niin H1975-soluissa (kuvio 2A). Yhdistetty hoito lisäsi myös kaspaasi-3/7-aktiivisuus. Vuonna H1650 soluissa apoptoosisignaalin jopa nousi 8,94-kertainen ohjaus verrattuna yhden EGFR siRNA (4,16-kertainen. In H1975 soluissa oli vaatimattomampi kasvu 3,29-kertaiseksi, mikä on hieman korkeampi kuin EGFR siRNA yksinään (2,26 kertainen). Western blot, kuitenkin osoittanut, että yhdistelmä EGFR /c-MET siRNA pystyi vaikuttamaan ERK-reitin ja (lisäksi AKT, kuvio 3), joka on toisin kuin EGFR inhibition yksin. ERK-reitin säädeltiin vähentävästi eniten H1975 soluissa, kun taas suurin vähennys p-AKT havaittiin H1650 soluissa.

vaikutus elinkelpoisuus arvioitiin myös käyttämällä Fluorimetristä resorufiini elinkelpoisuuden määritys ja mikroskoopilla laskenta elinvoimaisten (Hoechst 33342 positiivinen /PI-negatiivinen) soluja. molemmissa määrityksissä tulokset peilattu MTS tetratsolium määrityksessä (tuloksia ei ole esitetty). Samoin, kaspaasi-3/7-aktiivisuus vahvistettiin myös Hoechst ja PI kaksinkertainen fluoresenssivärjäys määrityksessä (tuloksia ei ole esitetty).

Dual kohdentaminen EGFR kanssa TKI tai setuksimabin ja c-MET kanssa su11274

edelleen selvittämättä, onko saadut tulokset yhdistettiin siRNA hoitoa voitaisiin matkia käyttämällä dual EGFR ja c-MET-specific estäjät, jotka voivat voidaan soveltaa helpommin

in vivo

. Keuhkosyöpä solut käsiteltiin yhden EGFR TKI gefitinibi, erlotinibi tai afatinib, ja yhdessä c-MET estäjä su11274. Yhdistelmä monoklonaalinen EGFR-vasta-aine setuksimabi kanssa su11274 tutkittiin myös.

vaikutus su11274 yksin solujen kasvuun ja apoptoosin oli erittäin heikko kaikissa kolmessa solulinjoissa, vaikkakin, oli hieman voimakkaampi vaikutus H1975-soluissa , joka on suurempi c-MET ilmaisu kuin kaksi muuta solulinjoissa (kuvio 4). Pitoisuudella 1 uM su11274 esimerkiksi vähennys 20-30% proliferaationopeus ja vaatimaton kasvu 40-50% vuonna kaspaasi 3/7 signaaleja verrattu aiemmin ei ole ollut vaikutusta kahdessa muita solulinjoja (kuvio 4, kuvio 5). Nämä tulokset ovat yhteneväisiä c-MET siRNA kokeissa.

H358, H1650 ja H1975-soluja inkuboitiin konsentraatioalueella su11274, ja soluja inkuboitiin 72 tuntia. Paneeli A: leviämisen. Paneeli B: kaspaasi-3/7 toimintaa. Paneeli C: apoptoosin. Paneeli D: annosvaikutuskuvaajia.

Paneeli A: solujen lisääntymisen kerta-annoksella tai yhdistetyn TKI hoitoon. Solulinjat H358 (valkoinen), H1650 (harmaa) ja H1975 (musta) viljeltiin RPMI, joka sisälsi 10% FBS ja 1 uM su11274, gefitinibi, erlotinibi, afatinib tai setuksimabi, ja niiden yhdistelmät. Lisääntyminen määritettiin 72 tunnin kuluttua hoidon kolorimetristä MTS-määritys. Paneeli B: kaspaasi -3/7 induktio yksin tai yhdistettynä TKI hoitoon. *

P

0,05 ja **

P

0,01 verrattuna sekä yksi hoitokerta.

yhdessä EGFR TKI pitoisuudet säilyivät 1 uM kaikille tekijöille. Vuonna H358 ja H1650 soluja (kuvio 5A), The TKI yksin indusoi pientä laskua solujen kasvua (maksimissaan 41% H1975 kanssa afatinib, kuvio 5A), ja vaatimaton lisäys kaspaasi 3/7 signaaleja (1,6-kertaiseksi -at maksimi myös H1975 kanssa afatinib, kuva 5B) verrattuna ajoneuvon hallintalaitteita. Yhdistelmät, joissa su11274 pystyivät vähentää solujen kasvua edelleen hieman H358 ja H1650, ja yhdistelmä vaikutus oli voimakkaampi H1975 (erityisesti su11274 + afatinib, kuvio 5A). Samaan aikaan, lisäksi su11274 tarjosi vahvistuksen kaspaasi-3/7 signaalien mukaisesti, solun kasvun esto tiedot (kuvio 5B). Vahvin vaikutus nähtiin H1975 soluissa, joiden tiedetään olevan EGFR-TKI kestävä. Näissä soluissa, single-aineella hoidon gefitinibi ja erlotinibi on tehoton, kun taas afatinib voi vähentää kasvua ja aiheuttaa apoptoosin. Kaikki yhdistelmät kanssa su11274 saavutti parannettu vaikutus solujen kasvuun ja apoptoosin. Yhdistelmä su11274 + afatinib pystyi vähentämään solujen elinkelpoisuuden 49% 1 uM (kuvio 5A), ja lisääntynyt apoptoottiset signaalit 2,64-kertaiseksi (kuvio 5B).

Jotta voidaan arvioida lisäaineen tai synergistinen luonne dual hoitoja, eri pitoisuuksia jopa 1 uM perustettiin kullekin yhdisteen ja yhdistelmät. Vaikutuksia pisteytetty kolorimetristä MTS formatsaanisakka proliferaatioanalyysi ja CI, joka erottelee lisäaine ja synergiavaikutukset laskettiin (Biosoft CalcuSyn- ohjelmisto). Tulokset osoittavat yksiselitteisesti, että yhdistetty vaikutus kaikkien agentit proliferaatiota H358 ja H1650 oli lisäainetta. Vuonna H1975 soluissa, lisäaine päivästä gefitinibi tai erlotinibi tai setuksimabi + su11274 havaittiin myös (kuva 6). Kuitenkin yhdistelmä afatinib + su11274 tekee synergistisesti (CI 1) solussa kasvun esto ja apoptoosin induktio (kuvio 7). Tämä synergistinen vaikutus voi selittyä sillä osuuskunta estämällä proliferatiivisen /selviytyminen ja antiapoptooppinen signaalien kulkureiteillä AKT, ERK ja STAT (kuvio 8). Western blot ehdotti, että inhibitio näistä kolmesta reittejä on erityisen tehokas H1975-soluissa yhdistetyn hoidon su11274 + afatinib (kuvio 8).

yhdistelmä-indeksi (CI) laskettiin H1975. CI 1, mikä osoittaa additiivinen vaikutus (Ruutu A: gefinib + su11274; Paneeli B: erlotinibi + su11274; Paneeli C: setuksimabista + su11274).

Combination Index (CI) ja afatinib ja su11274. Täällä, CI afatinib + su11274 1, mikä osoittaa synergistisen vaikutuksen.

Immuno blottaus solulysaatteja H358, H1650 ja H1975 soluja käsitellään yhdellä tai yhdistetyn TKI /setuksimabi. Vasta-aineet sisältyvät fosforyloidun (p-) EGFR, EGFR, pc-MET, c-MET, p-AKT, p-ERK1 /2, s-Stat5: n, p-STAT3, ja β-aktiini.

keskustelu

EGFR on terapeuttinen tavoite NSCLC. Aikaisemmassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että yksittäinen aine lääke kohdistaminen EGFR-TKI ei saavutetaan suurin biologinen vaikutus, jopa herkillä solulinjoissa, ja että lisäys EGFR-specific-siRNA EGFR TKI tai setuksimabia lisää terapeuttisia vaikutuksia [45 ]. Kuitenkin vain kohdistaminen EGFR koulutusjakson ei tehoa soluissa, jotka satama resistenssimekanismeja ja on vielä riitä kumoamaan koko pahanlaatuinen fenotyyppi herkkien solujen. Niinpä seuraava kysymys oli, samanaikainen EGFR ja c-MET, RNAi, lisäisi biologisia vaikutuksia, ja siksi olla käyttökelpoinen voittamiseksi TKI resistenssin H1975 soluissa. Tang et al [28] osoittivat, että yhdistelmä EGFR siRNA ja c-MET siRNA H1975-soluissa johti parantuneeseen esto alavirran EGFR signaloinnin, mukaan lukien pro-selviytymisen AKT ja STAT3 polkuja. Täällä, selvitimme vaikutus solujen kasvuun ja apoptoosin. Lisäämällä c-MET siRNA joko EGFR villityypin tai T790M-erityisiä siRNA: t, johti lisääntynyt vaikutus solujen kasvun esto ja kaspaasi-3/7-aktiivisuus induktio. EGFR Villityypin siRNA oli voimakkaampi kuin T790M siRNA, kanssa yhdellä siRNA Edellä kuvattujen tulosten ja yhdenmukaisia ​​aste reitin inhibition (katso alla). Yhdistelmä c-MET siRNA kasvoivat kasvun esto ja apoptoosin induktio lisää merkittävästi H358 ja H1650 soluja. Immunoblottaus esittää johdonmukainen säätely alaspäin fosfo-AKT, sopusoinnussa Tang et al. [28], mutta alas-säätely fosfo-STAT3 oli heikompi. Olemme myös havainneet, että kaksi alavirran signaalit estivät: fosfo-Stat5: n ja erityisesti fosfo-ERK1 /2. Kun T790M ja c-MET siRNA: t yhdistettiin, osuuskunnan vaikutus oli vähemmän voimakas.

Dual kohdentaminen EGFR ja c-MET sitten todeta käyttäen TKI (gefitinibi, erlotinibi ja afatinib plus su11274). Yhden aineella joko estäjä, kolmen EGFR TKI resistenttejä solulinjoja oli suhteellisen heikko vaikutus kasvun esto ja apoptoosin induktio ja oli jopa vähän tai poissa c-MET estäjä. Kuitenkin suurempia annoksia erlotinibin voivat aiheuttaa apoptoosin KRAS mutantti solulinjassa H358 [45]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme havainneet, että yhdistelmä su11274 ja erlotinibin oli myös korkeampi vaikutus solujen kasvun inhibitiota in H1975-soluissa. Inhibiitioastetta (35%) oli samaa luokkaa kuin on raportoitu muiden (42%) [28]. Sen varmistamiseksi lisäaine tai synergistinen luonne kahden hoidon sarja kasvaa TKI pitoisuuksien perustettiin. Vaikutuksia arvioitiin käyttäen kolorimetristä MTS formatsaanisakka proliferaatioanalyysi ja CI laskettiin. Vaikutus dual erlotinibin plus su11274 kohtelu H1975 soluissa oli lisäainetta. Samanlainen additiivinen vaikutus löydettiin gefitinibin tai setuksimabin plus su11274 sisään H1975 solussa. Kuitenkin yhdistelmä afatinib ja su11274 oli selvästi synergistinen vaikutus solujen kasvun inhibitiota in H1975-soluissa.