Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA säätelee soluvasteita säteilylle (IR) kautta translaatiota ohjaavia kohdegeenien. Analysoimme aikasarjat muutoksia microRNA ilmaisu seuraavissa γ-säteilytys H1299 keuhkosyövän soluihin käyttäen mikrosiruanalyysillä. Muuttuneet merkittävästi IR-reagoiva MikroRNA valittiin analyysiin perustuvat varianssianalyysi, ja ennakoi maalin mRNA: iden rikastuneet mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) signalointia. Samanaikainen analyysi aikasarjat mRNA ja microRNA profiileja paljastanut, että ilmentyminen miR-26b oli säädeltiin, ja sen tavoite aktivoiva transkriptiotekijä 2 (ATF2) mRNA ylöspäin säädellään γ-säteilytettyjä H1299 soluissa. IR miR-26b yli-ilmennetään H1299 soluja ei indusoi ATF2. Kun c-Jun N-terminaalisen kinaasin aktiivisuus estyi käyttämällä SP600125 ilmentyminen miR-26b indusoitiin seuraavan γ-säteilytyksen H1299-soluissa. Näistä tuloksista päättelimme, että IR aiheuttama säätely ylöspäin ATF2 oli coordinately parantaa tukahduttaminen miR-26b keuhkojen syöpäsoluja, jotka voivat voimistaa IR MAPK signalointireitin.

Citation: Arora H, Qureshi R, Park AK, Park WY (2011) koordinoitu asetukseen ATF2 by miR-26b γ-Irradiated Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (8): e23802. doi: 10,1371 /journal.pone.0023802

Editor: Sangdun Choi, Ajou University, Korea

vastaanotettu: 16 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 26 heinäkuu 2011; Julkaistu: 25 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Arora et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä paperi tukee Korean Science and Engineering Foundationin (KOSEF) avustus (M20706000020-07M0600-02010), ja jonka Basic Research Laboratory (BRL) ohjelma kautta National Research Foundation Korean rahoittama opetus-, Science and Technology (2009 -0087452) ja jonka Korea Healthcare Technology R 0,05, kuvio 1 ja taulukko S1). Näkyvä muutoksia havaittiin 8 tuntia sen jälkeen, kun y-säteilytyksen useimmissa IR-reagoiva MikroRNA.

käänteistranskriptio pieniä RNA: ita Kustakin ajankohdasta leimattiin Cy5: llä. Väri koodi edustaa suhteellista ilmentymistä ilmoitettu MikroRNA kunakin ajankohtana. Luettelo kaikista MikroRNA on saatavana taulukossa S1.

tutkia fysiologisen merkityksen IR-reagoiva microRNA, me listattu ennakoi maalin mRNA IR-reagoiva MikroRNA ja rikastetun signalointireittejä valittiin perustuen rikastamiseen ja tilastollinen analyysi ennakoi maalin mRNA Diana-microT-3.0. Niistä listattu signalointireittien keskityimme top 10 polkuja perustuu tilastollisen merkittävyyden (taulukko 1). Olemme erityisen Valitsimme MAPK -signalointireitistä tarkempaa analysointia, koska tämä signalointireitille on välttämätöntä selviytymisen vastauksena DNA vaurioita [13].

vahvistaa sääntelyn MAPK -signalointireitistä IR-reagoiva MikroRNA, me meta-analysoitu mRNA ilmentymisen profiilit saman γ-säteilytettyjä H1299 soluja meidän julkaistu aineistot [14]. Vuonna samanaikainen analyysi kohde-mRNA ja IR-reagoiva microRNA, haimme kaksi kriteeriä: 1) tilastollisesti merkittäviä muutoksia (p 0,05) mRNA: n ilmentymisen upon γ-säteily ANOVA ja 2) korkea käänteinen korrelaatio arvo (r -0.4 ) välillä mRNA ja microRNA ilme. Kuten esitetty kuvassa 2 ja taulukossa S2 tunnistimme 35 paria IR-reagoiva MikroRNA ja kohde-mRNA: iden, mukaan lukien 19 MikroRNA ja 23 ei-päällekkäisiä mRNA: t MAPK -signalointireitistä geenejä H1299 soluissa.

validoitu ilmentymiskuviot IR-reagoiva MikroRNA ja kohde-mRNA: iden että MAPK signalointireitille. Niistä 35 paria, me valittiin ja analysoitiin neljä (miR-26b: ATF2, miR-7: FOS, miR-20a: MAP3K5, ja miR-128: PPARg) pareittain käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR, kuvio 3A , B, C ja D). Kuten havaitaan microarray aineistot (kuva 2), huomasimme, että ATF2, FOS, ja MAP3K5 olivat ylös säännelty ja PPARg sen alas säädellään IR altistumista. MikroRNA kuten miR-26b, miR-7, ja miR-20a säädeltiin, ja miR-128 oli up säädellään IR altistumista. Reaaliaikaisella RT-PCR: llä, olemme osoittaneet, että ekspressiokuvioita valittujen IR-reagoiva MikroRNA ja kohde-mRNA: t olivat hyvin sovitettu kuin mikrosirun ilmaisun tiedot.

ilmentymisen neljä paria mikroRNA ja kohde- mRNA- kuten (A) miR-26b: ATF2, (B) miR-7: FOS, (C) miR-20a: MAP3K5, ja (D) miR-128: PPARg) kvantifioitiin käyttäen reaaliaikaista käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio reaktio (RT-PCR) ilmoitettuina ajankohtina. Arvot normalisoitiin kanssa glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) mRNA: ta kohde-mRNA: iden ja U6B pieniä RNA MikroRNA. Kaikki arvot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (SD) kolminkertaisista kokeista.

alassäädetty IR-reagoiva MikroRNA voi lisätä toimintaa kohde mRNA: iden. Testata suhde alassäädetty IR-reagoiva MikroRNA ja kohde-mRNA: iden, valitsimme parin ATF2 ja miR-26b joukossa 35 paria osoittamaan koordinoidun sääntelyn välillä MikroRNA ja kohde-mRNA: iden päälle IR altistumista. Yksi ennustettu tavoite tunnistettu miR-26b asemassa 112-118 on ATF2 3 ’UTR: n, kuten on esitetty kuviossa 3A. Yli-ilmentymisen miR-26b H1299 solut voitaisiin tukahduttaa ilmentymistason ATF2 mRNA. Lisäksi, proteiini taso ATF2 vähennettiin miR-26b-yli-ilmennetään soluissa (kuvio 4A). Vuonna Lusiferaasimäärityksiä miR-26b tukahdutti käännös lusiferaasin konstruktien kanssa 3 ’UTR: ATF2, mutta eivät ilman 3’-UTR (kuvio 4B). Ehkäisevän vaikutuksen miR-26b on ATF2 havaittiin myös γ-säteilytettyjä H1299 soluissa (kuvio 4C), joka ylläpiti vasta 12 tunnin kuluttua IR altistuksen.

(A) In miR-26b transfektoidut H1299-solut, ilmentyminen mikroRNA vahvistettiin reaaliaikainen RT-PCR: llä. Ekspression ATF2-mRNA miR-26b transfektoiduissa soluissa mitattiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Suhteellinen ATF2 ekspressiotasoja normalisoitiin vastaan ​​GAPDH ja esitetään keskiarvona ± SD kolmesta rinnakkaisesta kokeiluja. Proteiini taso ATF2 tutkittiin myös Western blot in microRNA-transfektoiduissa soluissa. (B) Soluja transfektoitiin tyhjällä Renilla lusiferaasireportterigeenin (psiCHECK2) tai reportterigeeni fuusioituna ATF2 3 ’UTR. Lisäksi, solut kotransfektoitiin miR-26b tai ilman miR-26b; Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisina valoyksikköinä (RLU) ja normalisoitiin kanssa lusiferaasiaktiivisuutta ilmaistu konstitutiivisesti jonka psiCHECK2 vektori. (C) Suhteellinen ilmentyminen ATF2 in miR-26b transfektoitujen ja IR altistuneet solut 4 (valkoinen), 8 (harmaa) ja 12 (musta) tuntia.

Seuraavaksi halusimme vahvistaa vaikutusta MAPK signalointi alas-säätely miR-26b γ-säteilytettyjä soluja. Olemme esti MAPK-signalointireitin käyttäen SP600125, joka on c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) estäjän in γ-säteilytettyjä H1299-soluissa. Hoito SP600125 ei muuttanut perusekspression tason ATF2; kuitenkin, induktio ATF2 upon γ-säteilytys oli merkittävästi estetty SP600125 saaneilla H1299 solujen vasta 12 tunnin kuluttua IR altistuksen (kuvio 5A). Expression of ATF2 edellyttää MAPK signalointia, joka estyi klo JNK kemiallisen estäjä. Toisaalta, ilmentyminen miR-26b indusoitiin käsittelemällä SP600125 in H1299 keuhkosyövän solut (kuvio 5B). Vaikutukset SP600125 ekspressioon ATF2 mRNA ja miR-26b vahvistettiin myös A549 keuhkosyövän solulinjassa (kuvio 5).

H1299 ja A549-soluja käsiteltiin 10 uM SP600125 30 minuuttia, ja sitten altistuvat IR. Suhteellinen ilmaisuja ATF2 mRNA: ta (A) ja miR-26b (B) normalisoitiin ilmentymistason valvonnan 0 h sekä valvonta- ja SP600125 käsiteltyjä soluja 4 (valkoinen), 8 (harmaa) ja 12 (musta ) tuntia. (C) ionisoivan säteilyn aiheuttama ilmaus ATF2, joka alassäädetty ilmentymistä miR-26b γ-säteilytettyjä keuhko- syöpäsoluja.

Keskustelu

Cellular vastauksia eksogeenisen stimulaation voidaan seurata muutoksia geenien ilmentymisessä, kuten ilmaus MikroRNA. IR voi aiheuttaa progressiivista muutoksia solujen eloonjäännin, kasvun ja leviämisen vaikuttamalla geenin ilmentymistä. Edellinen raportit ovat viitanneet siihen, että säteily voi muuttaa ekspressiokuviota geenien [15], [16]. Analysoimme microRNA profiilien ymmärtää mekanismia mikroRNA-välitteisiä soluvasteita IR, ja tunnistaa sääntelyn MAPK signalointireitin IR-reagoiva MikroRNA. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme selvitetty JNK-välitteisen transkription suppressio miR-26b γ-säteilytettyjä soluja, joita varten microRNA voi estää käännös kohde-ATF2-mRNA: n, joka on jäsen MAPK signalointireitin. Näiden havaintojen ehdotamme, että soluvasteen IR on koordinoidusti säätelee vuorovaikutusta MAPK signalointireitille ja microRNA.

ATF2 on cAMP-vaste-elementti sitova (CREB) proteiini perus leusiinivetoketju- (bZIP) domain, jonka kautta ATF2 vuorovaikutuksessa muiden bZIP proteiineja, kuten kesäkuu, FOS, CREB, ja ATF1 [17], [18]. DNA-vaurioita ja proinflammatoristen sytokiinien voi aiheuttaa aktivoitumista ATF2 transkription aktiivisuutta JNK [19]. Rooli monipuolinen signaloinnin aktivointi ATF2 kuvaa myös heterodimeerisiä kumppanien ATF2, jotka myös aktivoidaan ärsyke-spesifisellä tavalla. Siten tietty ärsyke voi johtaa erilaisiin ATF2 komplekseja, aktivoiden tai tukahduttaa erillisiä osa-sarjaa kohdegeenien [20].

miR-26b on introni- microRNA asuvat introni IV CTDSP1, C-terminaali verkkotunnuksen pieni fosfataasi 1. transkriptionaalisen säätelyn vastaanottavan CTDSP1 mRNA ei täysin ymmärretä, mutta monet oletetun sitoutumiskohtia olemassa transkriptiotekijöitä, kuten CREB on KOODAAMISEEN Transcription Factor Binding Analysis [21]. ATF2 voisi tukahduttaa kohdegeenien transkription kautta dimerisaatio muiden bZIP transkriptiotekijöiden. Yliekspressio bZIP proteiineja, kuten ATF2 ja CREB muuttanut geenien ilmentymiseen ihmisen myometrisia soluissa [22]. Meta-analyysi tästä microarray aineistot GEO (GSE1059) paljasti alas-säätely CTDSP1 in ATF2-yliekspressoitu soluissa. Tarvitaan lisätutkimuksia koskien transkriptionaalisen säätelyn miR-26b by ATF2 keuhkojen syöpäsoluja; kuitenkin, JNK aktiivisuus ja ilmaus ATF2 tukahdutettu ilmentymisen miR-26b suoritetaan nykyisessä tutkimuksessa.

sääntelyn purkaminen MAPK -signalointireitistä voidaan saada aikaan IR aiheuttama DNA-vaurioita [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa havaittiin, että MAPK: n signalointi indusoidaan γ-säteilytettyjä H1299-soluja, jotka saattaisivat välittää selviytymisen H1299 keuhkosyövän soluja, kun IR-altistuksen. Lisäksi MAPK signaloinnin johti alas-säätely miR-26b, joka tuki ylläpito ATF2 aktiivisuuden puolestaan. Näistä tuloksista, voisimme osoittaa, että altistuminen H1299 keuhkosyöpään solujen IR aiheuttama MAPK signalointi seuraa tukahduttaminen miR-26b ilmaisu, joka johti karkaamisen ATF2 mRNA posttranslational tukahduttaminen miR-26b. Ehdotamme, että miR-26b välittää koordinoida sääntely ATF2 ja MAPK signalointireitin vastauksena IR.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

H1299 ihmisen keuhkosyövän soluja ylläpidettiin RPMI 1640 ja A549-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja 2 mM L-glutamiini [molemmissa solulinjoissa ostettiin ATCC]. Viljellyt solut joko altistetaan 2 Gy säteilyn käyttäen 4-MV lineaarikiihdytin (Clinac 4/100, Varian, Palo Alto, CA, USA) tai vasemmalle säteilyttämätön negatiivisena kontrollina. Erityinen JNK estäjä SP600125 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). H1299-soluja inkuboitiin 10 uM SP600125 30 min, ja sitten altistettiin IR (2 Gy), minkä jälkeen kokonais-RNA: n eristys osoitettuina aikoina.

MicroRNA microarray

MicroRNA kunkin solulinjan oli eristettiin käyttäen Mirvana microRNA eristyspakkausta (Ambion, Austin, TX, USA) valmistajan protokollien. Puhdistetut MikroRNA leimattiin käyttäen Mirvana microRNA Array Labeling Kit ja kytketty Cy5 Post-Labeling Reactive Dye (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, USA). Leimatut näytteet pestiin ja hybridisoitiin kahtena kappaleena Mirvana microRNA Bioarrays (Ambion) käyttäen Mirvana microRNA Bioarray Essentials Kit. Fluoresenssivoimakkuudet käsiteltiin ja mitattiin käyttäen GeneChip- skannerin 3000 7G (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Tasot mikroRNA hybridisaation määritettiin käyttäen GenePix Pro 6.0 ohjelmiston valmistajan suosittelemia. Taustalla-oikaistu intensiteetin kullekin microRNA saatettiin maailmanlaajuinen varianssi vakauttaminen normalisoinnin menettely [24]. Kaikki tiedot on MIAME yhteensopiva ja raakadataa on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta (GEO) (tulonumero – GSE30075).

Tilastollinen ja bioinformatiikan analyysi

Tunnistaa MikroRNA jolle ekspressiotasoja muuttunut merkittävästi koko ajan tietysti käytimme yksisuuntainen ANOVA. Ottaen huomioon korrelaatio rakenne sisäinen array rinnakkaista [25] vuonna Mirvana microRNA Bioarrays, suoritimme yksisuuntainen ANOVA 328 ihmisen MikroRNA. DIANA (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), joka integroi ihmisen ja hiiren MikroRNA osaksi väyliä ennustaa microRNA tavoitteet [26], suoritettiin aluksi tunnistaa polkuja.

RNA: n valmistaminen ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA uutettiin solulinjoista käyttämällä TRIzol menetelmällä, ja sitten käänteiskopioitua komplementaarinen DNA käyttäen Superscript II käänteiskopioijaentsyymiä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja oligo- (dT) 12-18 alukkeita mukaan valmistajan protokollaa. Määrälliset RT-PCR osoitti geenien suoritettiin reaktioseoksessa, joka sisältää SYBR Esiseos Ex Taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japani). Kvantitointi MikroRNA suoritettiin käyttäen TaqMan microRNA määritykset (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan protokollan. Näytteet analysoitiin käyttäen ABI PRISM 7000 Sequence Detection järjestelmän (Applied Biosystems). Kaikki PCR: t suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja reaktion spesifisyys määritettiin sulamiskäyräanalyysillä klo dissosiaatio vaiheessa. Syntetisoimme spesifisiä alukkeita ATF2 (eteenpäin: 5′-AGATTTATTAATTTTTCTGTGCTCAA-3 ’; taaksepäin: 5’ ACACCCCCATTTATTAAAACACC-3 ’), FOS1 (eteenpäin: 5′-TGTGTTCCTGGCAATAGTGTG-3′; taaksepäin: 5’-CAATGAACATTGATGTTGAAGAAA-3 ’), MAP3K5 (eteenpäin: 5’-GCAGCAGCTATTGCACTTCA-3 ’; taaksepäin: 5′-TGGTCACATTTTGGTTTTGTTC-3′) ja PPARg (eteenpäin: 5’-CCTGCAGGAGATCTACAAGGA-3 ’; taaksepäin: 5′-GGTGTCAGATTTTCCCTCAGA-3’). Suhteellinen kvantitatiivinen menetelmä käytettiin kvantitatiivista analyysiä. Kalibraattori oli keskimäärin ACt käsittelemättömästä soluista. Endogeeninen kontrolli oli glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) geenejä ja U6B varten MikroRNA.

Western blotting

Solut kerättiin ja lyysattiin NP-40, joka sisälsi fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja Protease Inhibitor Cocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA). Proteiini uutteet erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja sen jälkeen siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kalvoja inkuboitiin ATF2-vasta-aineen (1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa Tween 20 -puskurilla rasvatonta maitojauhetta, ja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennus 1:5000; Bio -Rad). Immunoreaktiivisia kaistoja visualisoitiin käyttäen Länsi-Q-kemiluminesenssisubstraatilla Kit Plus (BIOTANG, Waltham, MA, USA).

Constructs, transfektio, ja lusiferaasianalyysissä

esiaste miR-26b oli kloonattiin pcDNA3 (Invitrogen) genomista DNA: ta PCR: llä alukkeilla (eteenpäin: 5′-CCGGAATTCCGGATGGGAATTGGATACAT-3 ’; taaksepäin: 5′-ATTGCGGCCGCAGCTACCCTGACCACTGCTGC-3’). 3 ’UTR: t on ATF2 kloonattiin alavirtaan Renilla lusiferaasin geenin psiCHECK2vector (Promega, Fitchburg, WI, USA). Konstrukti transfektoitiin käyttäen FuGENE HD-reagenssia (Roche, Basel, Sveitsi) reaaliaikainen RT-PCR: llä, Western-blottaus, ja Lusiferaasimäärityksiä. Lusiferaasimäärityksiä suoritettiin käyttäen Dual-Luciferase Assay Kit (Promega). Normalisoituminen Renilla ilmaisun suoritettiin käyttämällä tulikärpäsen lusiferaasin läsnä psiCHECK2 vektorin.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Luettelo valittu MikroRNA peräisin H1299 soluista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023802.s001

(XLSX) B Taulukko S2.

Valitut mRNA: microRNA paria MAPK signalointireitin perustuu rikastamista analyysiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023802.s002

(XLSX) B

Kiitokset

Tekijät Kiitokset jäseniä Park laboratorion keskustelulle sekä H.-S . Shin ja H.-J. Jeon varten microRNA mikrosiruja.