Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aktivointi Wnt-signalointireitin on sekaantunut poikkeava soluproliferaatiokokeessa erilaisissa syövissä. Vuonna 40% endomet- munasarjojen syöpien, konstitutiivinen aktivaatio koulutusjakson johtuu kasvaimia mutaatioita β-kateniinin tai muut inaktivoivat mutaatiot keskeisten alipaineensäätöventtiileillä. Eritettyä frizzled liittyvä proteiini 4 (SFRP4) on ehdotettu olevan estävää aktiivisuutta sitoutumalla ja metalleja sitovia Wnt ligandeja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Me tehdään RT-qPCR ja Länsi-blotting in ensisijainen kulttuureissa ja munasarjojen solulinjoja SFRP4 ja sen keskeiset loppupään sääntelyviranomaisten aktivoitu β-kateniinin, β-kateniinin ja GSK3p. SFRP4 tutkittiin sitten immunohistokemia kohortin 721 potilailla ja koska sen ehdotetun eritystoiminnan, plasmassa, esittelee ensimmäinen ELISA SFRP4. SFRP4 oli eniten ilmaistu munanjohtimien epiteelin ja väheni pahanlaatuisiksi, sekä RNA ja proteiini tasolla, missä se oli vieläkin selvempi membraanijakeen (p 0,0001). SFRP4 ilmentyi proteiinin tasolla kaikissa histotypes munasarjasyövän mutta laski raja kasvaimia syöpiin ja menetystä solujen erilaistumisen. Menetys kalvo ilmaisun oli itsenäinen ennustaja huono selviytymisen munasarjasyöpää sairastavilla potilailla (p = 0,02 kausitasoittamattomina; p = 0,089 oikaistu), joka lisäsi riskiä potilaan kuolla tähän tautiin kertoimella 1,8.

päätelmät /merkitys

tulokset tukevat rooli

SFRP4

kuin tuumorisuppressorigeenin munasarjojen syöpien

kautta

inhibition Wnt-signalointireitin. Tämä ei ole ainoastaan ​​ennustava vaikutuksia, mutta voisi myös helpottaa hoitavaa roolia käyttäen epigeneettiset tavoitteita.

Citation: Jacob F, Ukegjini K, Nixdorf S Ford CE, Olivier J, Caduff R, et al. (2012) menetys Eritettyjen Frizzled liittyvistä Protein 4 korreloi Aggressiivinen Fenotyyppikuvaus ja ennustaa Huono tulos munasarjasyövässä Potilaat. PLoS ONE 7 (2): e31885. doi: 10,1371 /journal.pone.0031885

Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Tutkimuskeskuksen, Saudi-Arabia

vastaanotettu: 15 elokuu 2011; Hyväksytty: 14 tammikuu 2012; Julkaistu: 21 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Jacob et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cancer League Canton Zurich (VHS); Oncosuisse (02115-08-2007 on V.H.S.); Swiss National Foundation (320000-12543 ja V.H.S .; PBZHP3-133289 ja F.J.); European Science Foundation (ja V.H.S.); Cancer Institute of New South Wales (09 /CRF /2-02 ja V.H.S.); Royal Australian ja Uuden-Seelannin College of Synnytyslääkärit ja Gynekologit (jotta V.H.S.); William Maxwell Trust (jotta V.H.S.) ja Royal Hospital for Women Foundation (ja V.H.S.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on viidenneksi yleisin kuolinsyy kaikista syövistä esiintyy naisilla ja johtava kuolinsyy gynekologisista syöpäsairauksia. Yli 75% naisista esiintyy paikallisesti edennyt tai levittää tautia, tyypillisesti ominaista asteittainen invaasion ympäröivien elinten ja suurina vaiheessa tapauksissa on vatsaonteloon. Survival on muuttunut vain vähän 1980-luvun alusta huolimatta uusi kemoterapeuttiset lääkkeet. Eloonjäämisaste kolme neljäsosaa potilaista esiintyy laajalle levinnyt etäpesäkkeitä on vain noin 20% [1].

Tämä huono yleistä ennuste johtuu puutteesta ensioireita ja varhaisen diagnoosin, tehoton hoito edenneen taudin, resistenssin platinapohjaisen kemoterapian ja rajallinen ymmärrys varhaisen alkutapahtumat ja alkuvaiheessa munasarjasyövän kehitystä. Suurena haasteena on edelleen tunnistamisen onkogeenisten munasarjasyöpä väyliä apuna diagnosoinnissa, koska prognoosi- indikaattorit ja kohteina uusia hoitostrategioita [2]. Monet ryhmät, kuten omat, ovat hyödyntäneet array-pohjainen genominlaajuisten löytö alustojen tunnistaa poikkeava mRNA ilmaisun ja somaattisesti hankittu DNA sekvenssivariantit tai mutaatioita määrittää molekyylimuutoksista taustalla kehitystä munasarjasyöpä, joka on ensimmäinen askel tunnistaa molekyylimarkkereina mahdollisten kliinistä hyötyä [3], [4].

Käyttämällä tätä tekniikkaa, jäsenet Wnt-signalointireitin ovat sekaantuneet munasarjojen karsinogeneesin olevan mahdollisuudet diagnostisia, ennustetekijöitä ja terapeuttisten kohteiden [5], [6]. Wnt-signalointireitin on erittäin hyvin säilynyt koko eläinten ja välittää erilaisia ​​solun toimintoja, kuten solun polariteetti, kudoksen kuviointi, ohjaus solujen lisääntymisen ja kehittäminen neoplasian [7], [8]. Wnt proteiineista erittyy, kysteiiniä runsaasti molekyylejä kanssa konservoituneiden rakenteisiin. Yhdeksäntoista Wnt proteiineja on tunnistettu ja liitetty eri vaiheissa inhimillisen kehityksen ja Karsinogeneesin lukien rinta-, keuhko-, paksusuoli-, munasarjat ja iho [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Wnt-proteiinien signaali

kautta

Frizzled-reseptorien kautta useita erilaisia, mutta toisiinsa signalointireittien, mukaan lukien Wnt /Ca

2+, β-kateniinin ja tasomainen-solujen polaarisuutta reittejä [15], [16] , [17]. Yleensä Wnt perhe on luokiteltu perustuen ligandi ja reseptori osallistu sen kanoninen /β-kateniinin reitti ja β-kateniinin riippumaton /muiden kuin ensisijaisen reitin. Mielenkiintoista, ei-kanoninen Wnt signalointi voi antagonisoida kanoninen Wnt signalointi, ja se voi edustaa uutta koulutusjakson kohdistaa syöpiin vetämänä kanoninen Wnt signalointia [18]. Alavirtaan kohdegeenien Wnt /β-kateniinin /TCF signalointireitille on todettu olevan ratkaiseva munasarjojen epiteelisolujen transformaatio, ja olivat upregulated kaikissa endomet- munasarjasyöpiä Wnt-reitin puutteita [19], [20]. Useat muut tutkimukset tukevat tämän havainnon, raportointi yliekspressio sykliini D1 munasarjasyöpiä kuljettavat β-kateniinin mutaatioita [21], [22], [23], [24].

Eritettyä frizzled-sukuiset proteiinit (SFRP: t) ovat solunulkoinen estäjiä Wnt signaloinnin, jotka toimivat sitoutumalla suoraan Wnt-ligandien [25] tai Frizzled-reseptoreihin [26]. Frizzled-reseptoreita löytyy yksinomaan solukalvon, joka sijaitsee pinnalla Wnt-responsiivisten solujen. Viime vuosina lukuisia raportteja on kuvattu epigeneettisellä hiljentäminen kanoniset Wnt signaloinnin antagonistien eri ihmisen syövissä, mikä viittaa siihen, ne voivat toimia tuumorisuppressoreilla [27]. Munasarjasyövän,

SFRP1

oli ensimmäinen perheenjäsen raportoitu hypermetyloitunut ja vaientaa munasarjasyövän solulinjoissa ja potilaan näytteet, mutta ei normaalissa valvontaa, mikä viittaa mahdolliseen rooliin tuumorisuppressorina [28]. Promoottori hypermetylaatiota

SFRP2

ja

SFRP5

myöhemmin löydettiin myös munasarjasyövän [29]. Tuoreessa tutkimuksessa raportoitu menetys

SFRP5

lauseke liittyvät sekä etenemiseen munasarjojen syövän synnyn ja kemoterapian resistenssin [29].

Kuten aiemmin tunnistettu

SFRP4

olla poikkeavasti ilmaisi RNA-tasolla suuressa transkription profilointiin kokeilu munasarjasyöpä potilaiden (julkaisematon data), tässä me tutkimme ensimmäistä kertaa SFRP4 RNA: n ja proteiinin ilmentymistä 725 käyttävillä potilailla käänteistranskriptio kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR), Western -blot, immunohistokemia (IHC) ja kaapata entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) primaariviljelmissä, munasarjojen solulinjoissa, askites, kudosten ja plasma.

Methods

kliinis potilaan kohortin

Eettinen hyväksyntä ja kirjallinen lupa myönnettiin kolmessa eri sivustoja Sveitsissä, Saksassa ja Australiassa: 1. laitos Naistenklinikka, yliopistollisen sairaalan Zürichin osasto Naisten- ja synnytysten, Spital Limmattal, Zurich (SPUK, StV06 /2006, jotta VHS); 2. laitos Naisten- ja synnytysten, University of Schleswig-Holstein (eettisen komitean yliopiston Schleswig-Holstein, Campus Lyypekki, jotta D. H.); ja 3. gynekologinen syöpä keskus, Royal Hospital for Women, Sydney (HREC 08/09/17 /3,02, jotta V.H.S.). Arkistointia kudos 721 potilaalla sisällä Sveitsin Kohortti normaali, hyvänlaatuinen ja munasarjojen /tubal /vatsakalvon tai kohdun limakalvon syöpiä sisältyivät kudossiruina (281 hyvänlaatuinen diagnoosit, 440 syövät), jossa suurin osa syövistä on munasarjojen alkuperää (69,8%; Taulukko 1). Hematoksyliiniä Eosiini (H Microsoft , Seattle, USA). Potilaat, joilla on aiemmin ollut syövän tai tulehduksellisten /autoimmuunisairauksien jätettiin pois tästä tutkimuksesta.

plasma kohortin pidennettiin 52 potilasta (saksalainen kohortti) varten helpottaa suurempaa endometrioosi potilasryhmälle. Verinäytteet kerättiin EDTA-verta putkiin (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA) ennen leikkausta ja säilytettiin jäissä, kunnes se jatkokäsiteltiin. Näytteet käsiteltyinä 3 h sentrifugoimalla 3’000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja plasma säilytettiin -80 ° C: ssa.

Soluviljely

Cell linja SKOV3 (serous munasarjasyöpä ) viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, joka sisälsi penisilliiniä /streptomysiiniä (Pen /Strep), 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja L-glutamiinia (L-Glut). TOV112D (endomet- munasarjasyöpä) ja TOV21G (kirkas cell munasarjasyöpä) viljeltiin DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. Normaali ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen (HOSE6-3) viljeltiin Medium 199 /MCDB 105 (01:02), joka sisälsi Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. Kaikki syöpäsolun linjat olivat peräisin ATCC (www.atcc.org), HOSE6-3 oli lahja Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australia.

Primääriviljelmät

Primääriviljelmät kerättiin leikkauksen aikana tai toistuvasti paracentesis tarvitaan solunsalpaajaresistentti etenevä sairaus (Australian kohortti). Munasarjasyöpä johdetut viljelmät aikana paracentesis otettiin solupelletistä syntyy sentrifugoinnin jälkeen askites 4 ° C: ssa 3’000 g. Tuubal soluja kulttuuri kerättiin käyttämällä cytobrush at Fimbriaproteiinia putken heti ennalta ehkäisevää kahdenvälistä salpingo munasarjan poisto. Kaksi munanjohtimien solulinjoja käytetään tässä julkaisussa olivat peräisin kahdelta potilailla, joille tehdään riskin vähentäminen leikkaus

BRCA1

mutaatiostatus (Tube 1) ja suvussa munasarjasyövän /rintasyövän (Tube 2), jossa Kirjallinen eettinen lupa on myönnetty (HREC 08/09/17 /3,02, VHS). Talteen viljelmiä heti tallennettu DMEM ja siirretään laboratorioon viljelyyn. Primääriviljelmiä joko kasvatettiin DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (munasarjasyövän solulinjoissa) tai Medium 199 /MCDB 105 (01:02), joka sisälsi Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (normaali munanjohtimien solulinjat), kunnes konfluentteja. Toisen kanavan kutakin viljelmää käytettiin kokeissa.

RT-qPCR

RT-qPCR suoritettiin MIQE ohjeiden Soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä (NUNC, Thermo Fisher Scientific , Roskilde, Tanska) konfluenssiin 60%, pestiin 1 x DPBS: llä (Gibco, Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgravessa) ja kokonais-RNA (NucleoSpin RNAII kit, Macherey Nagel, Duren, Saksa). RNA-pitoisuus mitattiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Tanska), eheys varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla (1,7% agaroosigeelillä) ja suhde optinen tiheys 260/230 nm≈2.1 (2,0 2.2) ja 260 /280≈2.0 (1,8-2,2) valittu kriteerit. QPCR suoritettiin kolme viite-geenit sekä kohdegeenin,

SFRP4

käyttäen 500 ng käänteistranskriptio-RNA: n kokonaistilavuudessa 20 ui (iScript Reverse Transcription Supermix, Bio-Rad Laboratories Pty Ltd, Gladesville, Australia ). Alukkeet viite geenien valittiin, koska niiden stabiilin ekspression: TATA box sitova proteiini [30] eteenpäin 5′-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3 ’ja reverse 5′-CACATCACAGCTCCCCACCA-3′; beetaglukuronidaasi [31] eteenpäin 5’-AGCCAGTTCCTCATCAATGG-3 ’ja reverse 5′-GGTAGTGGCTGGTACGGAAA-3′; sukkinaattidehydrogenaasi monimutkainen, aliyksikössä [32] eteenpäin 5’-TGGGAACAAGAGGGCATCTG-3 ’ja reverse 5′-CCACCACTGCATCAAATTCATG-3’; ja

SFRP4

eteenpäin 5′- ACACCCTCTTAAGCAGCACCAG-3 ’ja reverse 5′- AGGGTGGATGTCCTGGGAAGTAAG-3’ [33] (Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, Australia). QPCR suoritetaan Stratagene Mx3005® (Integrated Sciences Pty Ltd, Chatswood, Australia) käyttämällä 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australia) ja SensiFAST ™ SYBR lo-ROX Kit (Bioline ( Aust) Pty Ltd, Alexandria, Australia) vähäisin ROX kuin fluoresenssi viittaus väriaine. Optimaalinen reaktio-olosuhteissa saatiin 2 x SensiFAST ™ SYBR mix, 400 nM erityisiä sense-aluketta, 400 nM erityisiä antisense-aluketta, RNaasi /DNaasi-vapaaseen veteen ja 25 ng cDNA-templaattia jopa lopulliseen tilavuuteen 20 ui. Monistukset suoritettiin alkaen 30 sekuntia entsyymin aktivointi 95 ° C: ssa, jota seuraa 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 5 s ja pariutumis /pidennys 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Sulamiskäyrä sen jälkeen tuotettiin 65-95 ° C: ssa. Kaikki näytteet ja negatiivisia kontrolleja monistettiin kolmena kappaleena ja keskimääräinen perustason korjatun normalisoitu fluoresenssisignaalien (DRN) saatu lisälaskuihin. Kvantifiointi sykli (Cq) arvoille viitataan geenien yhdistettiin geometrisen keskiarvon jokaisesta näytteestä [32] ja vähennetään

SFRP4

ilmaus: ΔCq = Cq

SFRP4

-Cq

Ref. Suhteellisen määrällisesti

SFRP4

lauseke (R) kaikissa tutkittu solulinjoissa, HOSE6-3 valittiin hallinnassamme ja ilmaisujen muiden linjojen laskettiin suhteena verrattuna HOSE6-3 seuraavasti: R = 2

– [ΔCqSFRP4- ΔCqHOSE6-3].

Western-blot-analyysi

Askites kerättiin paracentesis kahdelta munasarjasyöpä potilasta kahdessa peräkkäisessä ajankohtina, kolmen kuukauden välein. Tubuliinia käytettiin lastaus ohjaus solulinjojen ja anti-beeta-2-mikroglobuliinin potilaan askites-proteiinin uutteita. Alikvootit 30 ug yhdistettiin NuPAGE® LDS näytteen ja vähentää puskureita (Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgravessa) ja keitettiin ennen lataamista natriumdodekyylisulfaattia (SDS) -polyacrylamide geelejä. Kaikki geelit sähköisesti siirrettiin PVDF-kalvoille ennen blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 0,01% TBS /Tween joka sisälsi 3% rasvatonta maitojauhetta (TBS /Tween rasvatonta maitoa). Membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa TBS /Tween rasvatonta maitoa ja pestiin sitten kolme kertaa 5 minuuttia TBS: ssä /Tween. Visualisointi proteiinien suoritettiin

kautta

lisäämällä sekundäärinen vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (HRP), jota inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: TBS /Tween rasvatonta maitoa. Membraanit pestiin kolme kertaa 10 minuutin ajan TBS-Tweenillä, inkuboitiin ECL ja kehitettiin Hyperfilm. Skannaus ja kvantifiointi signaalin intensiteetin suoritettiin käyttämällä Bio-Rad GS-800 tiheysmittari kanssa Määrä Yksi ohjelmisto (Hercules, CA, USA). Vasta-aineita käytettiin jäljempänä mainittujen pitoisuuksien: SFRP4 (Abnova, # 6424-A01): 1:1’000, aktivoitu β-kateniinin (Millipore, # 05-665) 1:1’000, β-kateniinin (Santa Cruz Biotechnology, # SC-7963), GSK3p (Sigma, # G7914) 1:1’000, anti-beeta-2-mikroglobuliinin (Sigma, # WH0000567M1, 1:1’000). Kaikki toissijainen vasta-aineet olivat peräisin DAKO (Dako Australia Pty Ltd, Botany, Australia) ja käytettiin jäljempänä mainittujen pitoisuuksien: vuohen anti-kani, 1:5’000 ja vuohen anti-hiiri, 1:5’000.

immunohistokemia

havaitsemiseen SFRP4 ilmentyminen monenlaisissa kudoksissa, kudos microarray dioja analysoitiin käyttämällä Ventana Benchmark automatisoitu värjäys järjestelmä (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). Sillä antigeeni haku, Levyjä lämmitettiin solujen ilmastointi ratkaisu 1 h (CC1, Tris-pohjainen puskurin hieman emäksinen pH) käyttäen standardia protokollaa. Laseja inkuboitiin 1 tunnin ajan hiiren ensisijaista polyklonaalista anti-ihmisen SFRP4 vasta-ainetta (1:30; Abnova, Taipeh, Taiwan). Detection suoritettiin käyttäen UView HRP-järjestelmän (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). Negatiiviset kontrollit pois ensisijainen vasta-aine, ja positiivinen ja negatiivinen kontrolli kudoksen kunkin vasta-aine tunnistettiin sähköisen Northern blot tietoja tai julkaistusta kirjallisuudesta. Counterstaining tehtiin hematoksyliinillä ja 1% happoa alkoholia. Immunovärjäys pisteytettiin prosenttiosuutena ja intensiteetti SFRP4 ilmentymisen solujen eri osastoissa (kalvo, solulimassa, tumassa). Pisteytys itsenäisesti arvioineet kaksi tutkijaa ja poikkeamia ratkaista yhteisymmärryksessä. SFRP4 ilme porausnäytteiden yhdestä potilaasta oli keskimäärin.

ELISA

Seerumin SFRP4 pitoisuudet määritettiin itse kehitettyä Sandwich-ELISA. Immunolevyt (96-NUNC MaxiSorp; Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Tanska) päällystettiin syömällä hiiren polyklonaalisella vasta-aineella osittainen rekombinantti ihmisen SFRP4 proteiinia (# H00006424-A01, Abnova, Taipei, Taiwan) ja laimennettu 1:250 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,2. Pinnoite ja inkubaatio suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa. Rekombinanttiproteiini, ensimmäisen ja toisen vasta-aineet laimennettiin PBS: ään, ja levyt pestiin kolme kertaa 0,05% (v /v) Tween 20: tä (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Sveitsi). Levyt blokattiin PBS: llä, joka sisälsi 5% (w /v) kaupallisesti saatavilla maitojauheen 40 minuuttia 37 ° C: ssa ja pestiin kolme kertaa. Blokkaamisen jälkeen epäspesifinen sitoutuminen sivustoja standardikäyrää kehitettiin käyttäen rekombinanttia SFRP4 proteiinia (# H00006424-Q01, Abnova, Taipei, Taiwan) välillä 3’200 ng /ml 12,5 ng /ml. Laimentamaton plasma näytteitä inkuboitiin kahtena 1 tunnin ajan RT: ssä. Sitoutunut SFRP4 havaittiin käyttäen kanin polyklonaalista primääristä vasta-ainetta ihmisen SFRP4 huoneenlämpötilassa 60 min (Dr. R. Friis, University of Berne, Sveitsi). Levyt pestiin kolme kertaa jälkeen inkuboitiin toissijaisen polyklonaalista anti-hiiri-vasta-aine oli konjugoitu kanin piparjuuriperoksidaasiin (1:1’000, Abcam, Cambridge, UK) 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Viiden pesuvaiheet, kromogeenilla TMB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Sveitsi) käytettiin substraattina ja peroksidaasin reaktio pysäytettiin 30 min yhtä suuri tilavuus 2 M rikkihappoa. Optinen tiheys mitattiin käyttäen 450 nm: ssä ELISA-lukijaa (Tecan Spectrafluor Plus, Tecan, Mannedorf, Sveitsi).

Tilastollinen analyysi

Vaikka SFRP4 proteiinin ilmentymistä kudoksissa oli alun perin määrällisesti sytoplasman, kalvo ja tumavärjäystä, numerot olivat usein liian alhainen edelleen tilastolliset analyysit yksittäisten histologisia alaryhmiä. Siksi SFRP4 ilme yhdistettiin, riippumatta sijainti värjäys, ja kutsuttiin yleistä ”SFRP4 ilmaisu” (mielivaltainen yksikköä). SFRP4 ilmentymistä sekä kudoksen ja plasman alunperin kuvataan boxplots eri diagnoosia ryhmittymien. Normaali quantile tontin SFRP4 ilmaisun plasmassa oli osoitus positiivinen skewness tehdä myöhemmät analyysit vaativat normaalijakaumaa olettamus kyseenalainen. Kuitenkin varianssi vakauttava logaritminen muunnos korjaantua asiaa. Erot SFRP4 ilmaisun kesken diagnoosi ryhmissä arvioitiin käyttämällä sarjaa yleistä lineaarista mallia yhdessä Bonferronin säätö pareittain vertailuissa. Mahdolliset assosiaatiot SFRP4 ilmaisun ja kliinisiä parametrejä arvioitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa. Tautikohtaisten selviytymisen ja uusiutumisen elinaika n ilmentämiseen SFRP4 kuvattiin käyttäen Kaplan-Meier käyrät ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen Coxin regressiota laskemalla korjaamattomissakin oikaistun riskisuhteita. Oikaistu Cox malleja olivat ikäryhmissä (≤60, 60), kasvaimen (1-2, 3), syöpä FIGO vaiheessa (I-II, III-IV) ja jäljellä tauti ( 10 mm, ≥10 mm) . P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Tiedot analyysit luotiin käyttäen SAS-ohjelmiston (v9.2, Cary, NC, USA).

Tulokset

Menetys SFRP4 ilmaisun korreloi aggressiivinen fenotyyppiin

SFRP4

oli hyvin ilmaistu ensisijainen tubal kulttuureissa verrattuna normaaliin munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja HOSE6-3 ja oli erityisen korkea potilaan kanssa BRCA mutaatio (putki 1) verrattuna potilaaseen positiivinen suvussa rintojen /munasarjasyöpä (Tube 2; kuvio 1 A). Vaikka selkeä solu ja endomet- munasarjasyövän solulinja (TOV21D, TOV 112D, vastaavasti) ilmaisi

SFRP4

samalla tasolla yhteen munanjohtimien valvonnan erotukseton serous munasarjasyövän solulinja (SKOV3) näkyy hyvin alhaiselle tasolle ja

SFRP4

(kuvio 1 A). SFRP4 ilmentyminen mitattiin sitten proteiinitasolla eri terveen ja munasarjasyövän solulinjoissa Western-blot. SFRP4 ilmentymistä verrattuna sen keskeiset alas-virtauksen säätimet aktivoitu ja koko β-kateniinin. HOSE6-3 verrattiin eri munasarjasyövän solulinjoissa eri histotypes ja solujen erilaistumisen. SFRP4 ekspressio hävisi kaikki syöpäsolulinjoissa verrattuna HOSE6-3 (kuvio 1 B). Mielenkiintoista, TOV112D, The endomet- munasarjasyövän solulinja ilmaistuna korkeimmat molempien päälle ja koko β-kateniinin, johdonmukainen tunnetut Wnt signalointia häiriöitä endomet- syövissä (kuvio 1 B) [19]. Askitesneste aikana kerätyt progressiivisen kemoterapian resistenssin analysoitiin sitten sen ilmentymisen SFRP4 ja loppupään tavoitteita mittana muutos ajan mukaan. Käyttämällä askites kahdessa peräkkäisessä ajankohtina kahdesta syöpäpotilaat muka eri aggressiivisuus (Pt 1 mixed munasarjasyöpä G1, Pt 2 serous vatsakalvon syöpää G3), nämä kokeet osoittivat väheneminen SFRP4 proteiinin ilmentymisen aikana etenevä solunsalpaajaresistentti sairaus (kuvio 1 C, D ). Samanaikaisesti SFRP4 lasku, tasot loppupään Wnt signalointia säädin GSK3p vähensi myös, kun taas aktivoitu β-kateniinin kasvanut, mikä viittaa siihen, että Wnt signalointia todellakin aktivoitu näillä potilailla.

Menetys

SFRP4

ilmentyminen ensisijainen tubal epiteelisolujen linjojen kohti munasarjasyövän solulinjoissa on esitetty eri koeasetelmia. (A) Olemme hakeneet fluoresenssipohjaista RT-qPCR tutkimaan

SFRP4

geeniekspression ensisijainen munanjohtimien (terve potilasta) ja kuolemattomia solulinjoja. HOSE6-3 valittiin ohjaus ja ilmaisuja muut solulinjat laskettiin suhteena verrattuna HOSE6-3: R = 2

– [ΔCq

SFRP4

– ΔCqHOSE6-3]. (B) SFRP4 ja sen loppupään tavoitteet aktivoitu β-kateniinin (ABC), β-kateniinin ja GSK3 β mitattiin Western-blot erilaisissa solulinjoissa (HOSE6-3, TOV21G (kirkas solu, tyypin I munasarjasyöpä), TOV112D ( endomet-) ja SKOV3 (serous) tyypin II munasarjasyöpiä) sekä (C) askites näytteitä korkealuokkaisesta serous munasarjasyöpää sairastavien potilaiden chemoresistance, kerättiin kahdessa peräkkäisessä ajankohtina aikana sairauden etenemiseen (TP, aika kohta esitetty Western-blot ; B2M, beeta-2-mikroglobuliinin käytettiin latauskontrollina). (D) Tulokset SFRP4, aktivoitu β-kateniinin (ABC), β-kateniinin, GSK3 β esitetään kvantitatiivisesti käyttäen Densitometrinen analyysi yhdessä kokeessa potilaiden askites näytteistä.

Korrelaatio SFRP4 kudosekspressiotutkimuksen kanssa eri kliinis parametrit

SFRP4 lokalisointi mitattiin sitten proteiinitasolla koska sen ehdotetun toiminnon kalvo, solulimaan ja toisinaan myös solujen tumaan (kuvio 2) käyttäen IHC suuressa kohortissa 721 potilaiden kudossiruina liittyy laaja seurantatutkimus (taulukko 1). Kalvomainen värjäystä voitiin tunnistaa solun solun rajan ja apikaalisella kalvo, joka on yhdenmukainen sen ehdotettu eritystoiminnan. Meidän kohortti sisällytetty 281 verrokeilla, jotka olivat terveitä tai heillä oli hyvänlaatuinen ehtoja kuten endometrioosi tai cystadenomas /-fibromas. Syöpä ryhmä sisälsi myös 440 potilaalla on rajatapaus kasvaimia tai invasiivisia syöpiä enimmäkseen munasarjan (69,8%), mutta myös kohdun limakalvon (11,3%) ja muuta alkuperää (18,9%). Keskimääräinen ikä diagnoosin oli 57,1 vuotta (19-88 vuotta) koko kohortin, jossa keskimääräinen kontrolliryhmän ollessa viisi vuotta nuorempi kuin syöpä kohortti (53.7

vs.

58,9 vuotta). Kattava tietokanta sisällytetty seurannan tiedot enintään 29 vuodeksi (keskiarvo sekä ikäluokkien 48,4 kuukautta (1-348 kuukautta)).

IHC osoitetaan edustava SFRP4 proteiinin ilmentymistä kahdessa suurennoksilla (x 10 vasemmassa sarakkeessa , × 40 oikea palsta) normaaleissa kudoksissa (munasarjojen pinnan epiteeli (A) ja munanjohtimien epiteelin (B)) ja erilaiset munasarjojen syöpiä (endomet- (C), vakavien (D) ja selkeä solu (E)).

SFRP4 positiivisesti ilmaistu kudoksen 296 721 potilaan kudosten (41,1%) ja 128 142 plasmanäytteistä (90,1%). Sisällä syöpä kohortin 279 potilasta (86,4%) oli korkealaatuista kasvaimet (aste 3) ja 221 potilasta (55,3%) esitti kehittyneitä (FIGO III /IV) vaiheen tauti. Viiden vuoden kuolleisuus koko syöpä /Tyyppi I /Type II kohortissa oli 29,5 /20,6 /41,3%, tässä järjestyksessä. Viisivuotinen relapsimäärä samassa kohortin alaryhmien oli 20,5 /15,3 /27,5%, vastaavasti, mikä osoittaa edustavan syöpä kohortti.

Mahdolliset assosiaatioita SFRP4 ilmentyminen määritettiin sekä kudoksen ja plasman kanssa kliinis parametrien johdettu meidän talon kliinis tietokanta (PEROLW tietokanta, Access (Microsoft, Seattle USA)) arvioitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa, r. Kliinis parametrit oli saatavilla meidän ryhmä koostui keskenmenoja, ikä diagnoosin, BMI, CA125 tasot, CA72-4 tasot, HE4 tasoja, laatu ja vaihe syöpien, jäljellä tauti, askites diagnoosin, koko ja bilaterality munasarjojen kasvaimia, suorituskyky tila diagnoosi, pituus seurannan, tautikohtaisia ​​ja uusiutumisen elinaika, platina kemoterapiaa, ehkäisytablettien tai hormonikorvaushoitojen, raskauksia /toimitukset, ikä kuukautisten alkaessa ja vaihdevuodet, läsnäolo akne, munasarjojen monirakkulatauti, leikatut hiukset, hedelmättömyys , infektiot, diabetes, kohonnut verenpaine, alkoholi /huumeiden saanti, tupakointi, saanti steroideihin kuulumattomien lääkkeiden, aikaisempi sairaalahoitoon, rintojen tauti, endometrioosi, kohdun, munasarjojen kystat ja aikaisempi syöpää tai familiaalinen syöpiä.

vain kohtalaisen vahva korrelaatio löytynyt SFRP4 ilmentymistä sekä kudoksen ja plasman havaittiin tapauksessa askites, joka on läsnä ensimmäisessä diagnoosin (SFRP4 IHC: r = 0,55, p = 0,01; SFRP4 ELISA: r = -0,60, p = 0,03 ). Toinen kohtalaisen voimakas korrelaatio oli läsnä imetyksen kun korreloi SFRP4 plasman lauseke (r = -0,79, p = 0,06). Kuitenkin tämä on rajatapaus merkitys otos imetyksen oli melko pieni. Heikko korrelaatioita havaittiin BMI (SFRP4 IHC: r = 0,19, p = 0,003), ja uusi tuumorimarkkeri HE4 (SFRP4 ELISA: r = -0,25, p = 0,02) [34]. Marginaalisesti merkittävää suhdetta voitiin havaita aiemmin ollut naistentautien toiminnot (IHC: p = 0,038, ELISA: p = 0,099), hormonikorvaushoito (ELISA: p = 0,097) ja alkoholin nauttiminen (IHC: p = 0,098).

SFRP4 ilmaisua yhä menetetty pahanlaatuisiksi

kuten olisi voitu ajatella sen oletettu toiminta, SFRP4 ilmaus esitetään erityisesti ja sytoplasman värjäytymistä. Kaikki kudokset tutkitaan vain fimbrial loppuun munanjohtimen ilmaistuna ydin- SFRP4 värjäytymistä, mikä oli melko odottamaton havainto (kuva 2 B). Munasarjojen pintaepiteelissä, joka viime aikoihin asti ehdotetaan olevan yhdenmukainen kotipaikkaan useimmille munasarjasyöpiä, näytetään vain minimaalinen soluliman eikä solukalvojen värjäytymistä, kuten tapahtui sisällyttämistä kystat, sijainti metaplastiset muutoksia munasarjoissa. Korkeimmat SFRP4 ilme sisällä kaikissa tutkituissa kudoksissa havaittiin tubal epiteelin, joka on johdonmukainen havaintojen RNA-tasolla primaarisissa tubal kulttuureissa (kuva 1 A). Hiljattain ehdotettu tyypin II syöpiä yhä uskotaan olevan niiden alkuperän Fimbriaproteiinia päähän munanjohdin, jonka pitäisi pikemminkin olla normaali valvonta useimmat syövät (38). Todellakin, löysimme lasku kumulatiivinen SFRP4 ilmentymisen tubal epiteelin hyvänlaatuinen kudokset (mukaan lukien munasarjojen pinnan epiteeli ja osallisuuden kystat), endometrioosi ja Borderline kasvaimia ja syöpiä (kuva 3.1 A, B), jälleen johdonmukaisuus suuntaus löysimme RT -qPCR solulinjoissa (kuvio 1 A). Menetys SFRP4 lausekkeen hyvänlaatuinen syöpään oli tilastollisesti merkitsevä sekä silloin, kun mitataan kalvo ilmaisu yksinään (p 0,0001 kaiken Kuva 3.2; hyvänlaatuinen

vs.

Cancer, p = 0,07; Borderline

vs.

Syöpä, p 0,0001) ja kun kalvo, solulimaan ja ydin- ilmentyminen mitattiin yhdistelmänä (p = 0,0004 yleistä, kuva 3.1 A; hyvänlaatuinen

vs.

Cancer, p = 0,039; Borderline

vs.

Cancer, p = 0,002). Vaikka alaluokitus solukalvojen värjäytyminen oli vaikea mitata, koska pienet otoskoot kalvo ilmentävien kudosten, korkein ilmentyminen hyvänlaatuinen ryhmän koko SFRP4 ilmaus oli tubal epiteelin, jonka jälkeen endometrioosi ja alhaisin munasarjojen pinnan epiteeli osallisuutta kystat (Kuva 3.1 B; Tube vs. OSE, p 0,0001; Tube vs. endometrioosi, p = 0,014).

Boxplots edustavat kumulatiivinen SFRP4 lauseke (mielivaltaisina yksikköinä) sytoplasmassa, kalvo ja nucleus (SFRP4 ilmentäminen