Krooninen sairaus

tiivistelmä

Orthotopic malleja eri tyyppisten kasvainten käytetään laajasti kasvaimia vastustavaa hoidollista kokeiluja prekliinisissä tutkimuksissa. On kuitenkin olemassa muutamia tapoja asianmukaisesti seurata terapeuttisen vaikutuksen potilaalle tehdä kasvainmuodosta, erityisesti kasvainten näkymätön ulkopuolelta. Tässä tutkimuksessa tavoitteena oli luoda ei-invasiivisia puolikvantitatiivinen bioluminesoiviin kuvantaminen menetelmä tarkkailemiseksi potilaalle tehdä ruokatorven syöpään hiirimallissa. Olemme vahvistaneet, että TE8 ruokatorven syöpä solulinjaa istutettiin ortotooppisesti vatsan ruokatorvi on

nu /nu

hiiriä (n = 5) kehitetään paitsi tärkein kasvain on istutettu sivusto, mutta myös paikallisia imusolmukemetastaaseja ja vatsakalvon disseminations sisällä 6 viikkoa ymppäyksen jälkeen. Olemme perustaneet TE8 solulinja, joka pysyvästi ilmensivät tulikärpäsen lusiferaasi-geeni (TE8-Luc). Olemme osoittaneet, että TE8-Luc-soluja istutettiin ihonalaisesti

nu /nu

-hiiriä (n = 5) kasvoi ajan mittaan, kunnes 5 viikkoa ymppäyksen jälkeen. Kasvaimen tilavuus korreloi voimakkaasti luminescent intensiteetti pääsee kasvain, joka oli mittaamaan IVIS kuvantamisjärjestelmä. Sitten osoitti, että TE8-Luc-soluja istutettiin ortotooppisesti hiiren vatsan ruokatorven (n = 8), muodostuu myös kasvain ja että luminoiva intensiteetti tällaisen kasvaimen, kuten havaitaan IVIS, kasvoi kunnes 7 viikkoa siirrostuksen jälkeen ja näin ollen heijastavat todennäköisesti syövän etenemiseen. Siksi ehdotamme, että tämä potilaalle tehdä ruokatorven syöpä malli, seurataan ei-invasiivisia puolikvantitatiivinen IVIS kuvantamisjärjestelmä on hyötyä terapeuttisen in vivo kokeissa vastaan ​​ruokatorven syöpään. Tämä kokeellinen asetus odotetaan edistää uusien hoitoteknologiat ruokatorven syöpään prekliinisissä tutkimuksissa.

Citation: Kuroda S, Kubota T, Aoyama K, Kikuchi S, Tazawa H, Nishizaki M, et al. (2014) perustaminen ei-invasiivisia puolikvantitatiivinen Bioluminescent Imaging Menetelmä seuranta ortotrooppinen ruokatorven syöpään Mouse Model. PLoS ONE 9 (12): e114562. doi: 10,1371 /journal.pone.0114562

Editor: Sunil Singhal, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 elokuu 2014; Hyväksytty: 11 marraskuu 2014; Julkaistu: 10 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Kuroda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Grant-in-tukea opetus-, kulttuuri-, urheilu- ja Technology, Japani (TF) ja avustukset Ministry of Health, Labour and Welfare, Japani (TF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on yksi yleisimmistä syöpien maailmassa. Histologisesti, okasolusyöpä osuus on yli 90% syövistä Japanissa, kun taas adenokarsinooma osuus on yli puolet syövistä Yhdysvalloissa ennustetta ruokatorven syöpä on melko huono keskuudessa syövät ruoansulatuskanavassa, kuten mahasyövän ja paksusuolen syöpä ruokatorven syöpiä ovat alttiita imusolmukemetastaaseja ja suora hyökkäys ympäröiviin elimiin. Huolimatta edistymisestä varhaisen diagnoosin ja kehittämisessä kirurgisten tekniikoiden ja laitteiden, sekä kemoterapia, sädehoito ja niiden yhdistelmä, ruokatorven syöpä ei ole vielä ratkaista tyydyttävällä ja tämä on ala, jolla uusia tehokkaita hoitomuotoja odotetaan kehitetään lähitulevaisuudessa [1] – [3].

alalla lääkekehityksen, potilaalle tehdä kasvain mallit ovat epäilemättä parempia malleja kuin ihonalainen malleja arviointia terapeuttisen tehon uusien lääkkeiden koska ne heijastavat paremmin taudin etenemistä alkuperäinen kasvaimia [4], [5]. Erilaisia ​​ortotooppisten kasvaimen malleja on käytetty eläinkokeissa, mukaan lukien mallit paksusuolen, haiman, maksan, keuhkojen, eturauhasen, munuaisten solun, virtsarakon, rinnan, melanooma ja aivokasvainten [6]. On kuitenkin olemassa vain muutamia raportteja potilaalle tehdä ruokatorven syöpä mallit huolimatta pikaisesti tällaista mallia. Puute potilaalle tehdä ruokatorven syöpä malli näyttää johtuvan ongelmiin anatominen sijainti ja koko ruokatorven lisäksi teknisiä vaikeuksia perustaa potilaalle tehdä malli.

saatavuus menetelmä, jolla arvioidaan terapeuttista tehoa on toinen asia, kun käytetään potilaalle tehdä mallia. Vaikka eloonjäämisaste tai kehon paino on yleisesti käytetty arviointiin, näitä parametreja eivät suoranaisesti heijasta terapeuttinen teho johtuen vaikutuksesta useiden muiden tekijöiden kuten tehosta. Muutama diagnostinen menettelyistä on käytetty ei-invasiivisia menetelmiä tarkkailuun potilaalle tehdä malli, kuten magneettikuvaus (MRI) [7], [8] ja positroniemissiotomografia (PET) /tietokonetomografia (CT) [9 ], [10]. Lisäksi käyttö vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) – [4], [11] ja luciferase- [12], [13] ilmentäviä solulinjoja ovat antaneet mielenkiintoinen lähestymistapa kehittää ei-invasiiviset tekniikkaa.

Kirjoittajat raportoivat sellaisen alkuperäisen potilaalle tehdä ruokatorven syöpä hiirissä, joka kehitti paikallista imusolmukemetastaaseja ja vatsakalvon disseminations lisäksi tärkein kasvain. Mallin olemme vahvistaneet, että IVIS kuvantamisjärjestelmä (Xenogen, Alameda, CA) oli asianmukainen ja hyödyllinen ei-invasiivisia seurannan menetelmä syövän etenemisen tässä mallissa.

Materiaalit ja menetelmät

eläin Koejärjestely hyväksynyt eettinen Review Committee for animal koe Okayama University, ja kaikki hiiret tässä tutkimuksessa käytetyt nukutettiin ketamiini /ksylatsiini tai isofluraani /happea kokeisiin ja eutanasia kaula sijoiltaan nukutuksessa.

Solulinjat ja soluviljelmät

ihmisen ruokatorven okasolusyöpä linja, TE8 (RIKEN BRC Cell Bank, Japani) viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. TE8 transfektoitu tulikärpäsen lusiferaasi plasmidivektorin (pGL-Control-RSVneo) (ystävällisesti Dr. Hiroyuki Mizuguchi, Osakan yliopisto, Osaka, Japani) ja kloonattiin rajoittavalla laimennus (TE8-Luc) viljeltiin kuvatulla TE8 yllä, mutta lisäämällä 0,2 mg /ml Geneticin (G418) (Life Technologies, 10131-027) ja väliaine. Keskimääräinen taso lusiferaasiaktiivisuuden kohti 5,0 x 10

4 TE8-Luc soluissa oli 1462 suhteellisen kevyt yksikköä (RLU).

ihonalainen kasvainmuoto

TE8-Luc soluja (2 x 10

6 solua /hiiri) injektoitiin ihon alle kylkeen viiden 5-6 viikkoa vanhoja naaraspuolisia BALB /c

nu /nu

hiirissä. Kohtisuorassa halkaisija kunkin kasvaimen mitattiin kerran viikossa, kunnes 5 viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: kasvaimen tilavuus (mm

3) =

×

b

2 x 0,5, jossa

on pisin halkaisija

b

on lyhin halkaisija, ja 0,5 on vakio laskea tilavuuden ellipsoidin.

Orthotopic ruokatorven syöpä mallin

Naaraspuoliset BALB /c

nu /nu

hiiriä (5-6 viikkoa) kiinnitettiin selällään. Ihon viilto 7- 10 mm tehtiin keskellä ylävatsan alkaen xiphoid prosessi. Maksa nostettiin ylös ja mahan purettiin pinseteillä niin, että vatsan ruokatorvi näkyi. 1 ml ruisku, jossa on 31-gaugen neula, jossa TE8 tai TE8-Luc solut suspendoitiin Matrigel pitoisuutena 2 x 10

6 solua /20 ui, insertoitiin etuseinämä mahassa ja sitten siirtynyt subserosally kohti vatsan ruokatorvi poikki esophagastric risteyksessä. Sitten solut injektoitiin hitaasti. Lopuksi, vatsa suljettiin ompeleilla (elokuva S1).

Käyttämällä tätä menetelmää, TE8 solut ortotooppisesti istutettiin viisi BALB /c

nu /nu

hiirissä. 4 viikon kuluttua tuumorin istuttamisen, kaikki viisi hiiret leikattiin jälleen tarkistaa kasvainten kehittymiseen, ja sitten yksi viidestä hiiret tapettiin ja sen tärkeimmät kasvain ja paikallinen imusolmuke kerättiin histologista tutkimusta. Tällä 6 viikkoa ymppäyksen jälkeen, muut neljä hiiret olivat kaikki lopetettiin uudelleen laparotomian ja tarkkailu.

TE8-Luc-soluja istutettiin vatsaontelon ruokatorvi kahdeksan BALB /c

nu /nu

hiirillä käyttämällä samaa menetelmää. At 3 viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen, kaikki hiiret toimineet tarkistaa kasvainten kehittymiseen, ja sitten viisi kahdeksan hiiret, joissa kasvain muodostumisen ruokatorven havaittiin, seurattiin kerran viikossa käyttäen IVIS kuvantamisjärjestelmä kuvattu alla, kunnes 7 viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen.

IVIS kuvantamisen

lusiferiini, alustan lusiferaasin, injektoitiin intraperitoneaalisesti hiiriin annoksella 150 mg /kg kehon paino. Sitten hiiret nukutettiin ja saatettu kuvantamisen vaiheessa IVIS laitteen vatsan (ihonalainen malli) tai makuuasennossa (potilaalle tehdä malli) asentoon. Kuvat kerättiin muutaman minuutin välein 10-30 minuutin kuluttua lusiferiini injektion avulla IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA), ja fotonit pääsee kasvain ja sen ympäristö kvantitoitiin käyttäen Living Image Software (Xenogen).

tilastollinen analyysi

Yksinkertainen lineaarinen regressioanalyysi suoritettiin käyttämällä Microsoft Excel tutkia korrelaatio kasvaimen tilavuuden ja luminescent intensiteetti, ja determinaatiokerroin, R

2, laskettiin arvioida vahvuus -alueella.

tulokset

TE8 solut injektoidaan subserosal tilaan vatsan ruokatorven BALB /c-

nu /nu

hiiret muodostivat kasvain (Fig. 1A) neljässä viiden hiirillä ja kehitetään paikallisia imusolmukemetastaaseja (Fig. 1 C) kahdessa viidestä hiirestä on 4 viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen. 6 viikon kuluttua inokulaation toinen hiiri oli havaintoja vatsakalvon disseminations (Fig. 1 E). Muodostuminen tärkein kasvaimen (Fig. 1 B) ja etäpesäkkeitä imusolmukkeissa (Fig. 1 D) vahvistettiin myös histologisilla havainnot. Pääasiallinen kasvain kasvoi submukosaalisen tilaan huolimatta siitä, että ruiskutetaan subserosal tilaan, kun se ei hyökätä limakalvokerrokseen.

A) TE8 soluja istutettiin vatsaontelon ruokatorvi muodostivat kasvain on implantoitu päällä (valkoinen nuoli ) on 4 viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen. B) H.E. värjäys parafinoidut kudosta tärkeimmistä kasvain (A) osoitti, että kasvain oli levinnyt osaksi submukosaalisen tilaan vatsan ruokatorvi. (T: Kasvain, L: Lumen, E: epiteelin kerros, M: Lihas kerros) C) TE8 soluja istutettiin vatsaontelon ruokatorvi kehitetty paikallisia imusolmukemetastaaseja (valkoinen nuolenkärki) 4 viikon kuluttua kasvaimen istuttamisen jälkeen. D) H.E. värjäys parafinoidut kudoksen paikallisen imusolmukkeen (C) histologisesti osoitettu imusolmuke etäpesäke. E) TE8 soluja istutettiin ortotooppisesti myös kehittänyt vatsakalvon disseminations (mustat nuolet) 6 viikon kuluttua kasvaimen istuttamisen jälkeen. Mittaviivat; 2 mm: n (A, C, E), 500 um (B, D)

seuraavan syntyy TE8-Luc-solut, jotka ilmentävät stabiilisti tulikärpäsen lusiferaasi-geeni, ja ihon alle istutettiin nämä solut BALB /c

nu /nu

hiirillä. Luminesenssilla näiden solujen seurattiin IVIS kuvantamisjärjestelmä onko tuumorin tilavuus korreloi luminescent intensiteetti. TE8-Luc solut muodostivat kasvaimen kaikki viisi hiirtä. Koska kasvaimet kasvoivat, luminoiva voimakkuus kasvoi ajan myötä arvioitiin visuaalisesti (Fig. 2A) ja kvantitatiivisesti (Fig. 2B) (Fig. 2C). Kasvaimen tilavuus ja luminescent intensiteetti oli korreloivat voimakkaasti keskenään (R

2 = 0,9199) (Fig. 2D), mikä osoittaa, että mittaus luminescent intensiteetti on tarkoituksenmukaista arvioida syövän etenemisen.

A) IVIS kuvia saatiin kerran viikossa, kunnes 5 viikkoa sen jälkeen, kun ihon alle inokulaation TE8-Luc-soluja. B) Luminescent intensiteetti fotonien pääsee kustakin kasvaimesta kuvat (A) kvantifioitiin. Hiiri numerointi vastaa numerointia (A). C) Tuumorin tilavuus laskettiin myös kerran viikossa. D) välinen korrelaatio luminoivan intensiteetti pääsee kunkin kasvaimen ja kasvaimen tilavuus arvioitiin tilastollisesti käyttämällä tietoja (B) ja (C).

Lopuksi määritetään jos TE8-Luc-solut voivat muodostaa ortotooppisten kasvain, joka kasvoi ajan mittaan. Viisi kahdeksan BALB /c

nu /nu

hiiriin, joissa TE8-Luc-soluja istutettiin ortotooppisesti vatsan ruokatorvi kehitetty kasvain on implantoitu sivustosta osoitteessa 3 viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen, jossa vahvistettiin uudelleen laparotomy . Nämä viisi hiiriä seurattiin IVIS kerran viikossa, ja fotoneja emittoituu kasvaimen ja sen ympäristössä kasvoi ajan kuluessa, kun arvioidaan visuaalisesti (Fig. 3A) ja kvantitatiivisesti (Fig. 3B).

A) IVIS kuvia saatiin kerran viikossa 3-7 viikkoa sen jälkeen, kun TE8-Luc potilaalle tehdä tuumorin istuttamisen osaksi vatsan ruokatorvi. B) Luminescent intensiteetti fotonien pääsee kustakin kasvain ja sen ympäristössä kuvat (A) kvantifioitiin. Hiiri numerointi vastaa numerointia (A).

Keskustelu

Furihata et al. [14] oli raportoi ensimmäisenä perustamista potilaalle tehdä ruokatorven inokulaation hiirissä vuonna 2001, jossa ne avataan etuseinämä mahassa ja ruiskutetaan kasvainsoluja osaksi submukosaalisen tilaan vatsan ruokatorven heti laparotomy. Sen sijaan, me ruiskutetaan soluista subserosal tilaan vatsan ruokatorven avaamatta vatsaan. Vaikka niiden menetelmä on teoreettisesti enemmän ihanteellinen tapa kuin meidän, meidän menetelmä on yksinkertaisempi ja on edelleen hyväksyttävä menetelmä sillä kasvainten muodostetaan käyttämällä menetelmää kasvoi ja levisi submukosaalisen tilaan huolimatta ruiskutetaan subserosal avaruuden histologisen havaintoja kuvassa. 1C. Kaksi viidestä mallimme hiirille kehittyi paikallisia imusolmukemetastaaseja ja yksi hiiri näytteillä vatsakalvon disseminations. Ilmeinen etäpesäkkeitä maksan, keuhkojen tai välikarsinan imusolmukkeiden ei löydetty. Jotta saadaan aikaan entistä invasiivisia ortotooppisten ruokatorven syöpä malli, voi olla tarpeen käyttää enemmän invasiivisia soluja [15], tai käyttää kliinisten kasvaimen näytteiden, joilla on suuri invasiivisia potentiaalia [4].

Ohara et al. [16] perustettiin mielenkiintoisen potilaalle tehdä hiirimallissa kaulan ja rintakehän ruokatorven syöpä ruiskuttamalla kasvainsoluja ruokatorven onteloon suun kautta. Vaikka tämä menetelmä olisi yksinkertainen, että ei kirurginen tekniikka on tarpeen, se voi olla vaikea arvioida, jos kasvainsolut tarkasti ruiskutetaan ruokatorveen, koska menettelyä on väistämättä suoritettiin sokeasti. Kuitenkin tämä menetelmä voi olla etulyöntiasema menetelmämme, että se aiheuttaa huono suun kautta, joka kuvastaa paremmin etenemisen alkuperäisestä kasvaimesta. Tutkimuksessamme ruumiinpaino ei laskenut lainkaan vasta juuri ennen kuolemaa, vaikka laaja kasvaimen kasvua ja leviämistä (tietoja ei esitetty).

Quatromoni et al. [17] raportoi äskettäin tehokas adenoviruspohjaiset immunoterapian vastaan ​​ruokatorven syöpä, jossa potilaalle tehdä ruokatorven syöpä hiirimallissa perustettu mahalaukkurajan risteyksessä samaa tekniikkaa käyttäen kuin osoitimme elokuvassa käytettiin. Tässä mallissa kasvaimet kasvoivat ajan rajoitu kasvaimeen pistoskohdan ilman suoraa hyökkäystä ruokatorven limakalvon. Kuitenkin, kasvaimia ei aiheuttanut tukos ruokatorven onteloon eikä hiirillä oli näyttöä nielemisvaikeuksia ja merkittävä laihtuminen. Nämä ominaisuudet ovat kaikki samanlaisia ​​kanssa osoitimme Tutkimuksessamme.

Sen sijaan, Gros et al. [18], [19] muodostettiin potilaalle tehdä ruokatorven syöpä hiirimallissa käyttäen erittäin aggressiivinen ruokatorven syöpä solulinja samalla tavalla kuin meillä, jossa ne havaittiin metastaaseja maksaan ja keuhkoihin sekä imusolmukkeisiin käyttämällä korkean resoluution kuvantaminen GFP ja MRI, kun emme pystyneet havaitsemaan etäpesäkkeitä maksaan tai muihin elimiin lusiferaasin kuvantamisen tutkimuksessamme. Nämä raportit Quatromoni et al. ja Gros et ai., myös meidän tutkimus, viittaavat siihen, että potilaalle tehdä ruokatorven syöpä mallin perustettu mahalaukkurajan risteys ja sen perustamisesta menetelmä on yleinen ja lisääntymiseen, ja että tämä malli voi aiheuttaa syövän etenemiseen, joka on lähellä todellista kliinistä käytäntöä, kuten metastaasit imusolmukkeisiin, vatsakalvon ja maksan tai muiden elimien lisäksi paikallisia kasvaimen kasvua.

Toisin kuin ihonalainen mallit, on vaikeaa analysoida tarkasti kasvaimen eteneminen ortotooppisten kasvainmalleissa. Vaikka eloonjäämisaste ja kehon painoa käytetään yleisesti arviointimenetelmiä potilaalle tehdä tutkimuksia, nämä parametrit eivät suoranaisesti heijasta terapeuttista tehoa, koska monet muut tekijät vaikuttavat myös tuloksiin. Käyttö kasvainsolujen merkitty lusiferaasireportterigeenillä ja bioluminescent kuvantaminen, joka on tällä hetkellä hyvin käytetty menetelmä tutkimusalalla, voimme seurata kasvaimen kasvua ei-invasiivisesti in vivo, varsinkin syvissä kudoksissa [13]. Siksi me alun perin perustettiin TE8-Luc soluja, jotka oli stabiilisti transfektoitu tulikärpäsen lusiferaasi-geeni ja joita käytetään ei-invasiivisia seurantaa.

Tutkimuksessamme käyttäen IVIS kuvantamisjärjestelmä luminoivat intensiteetti fotonien pääsee TE8-Luc ihonalainen kasvaimet korreloivat voimakkaasti kasvaimen kasvua. Tämän perusteella asiassa on siis todennäköistä, että kasvu luminoiva voimakkuus käytettäessä potilaalle tehdä mallin ajan kuvaa tarkasti syövän etenemiseen. Todellakin, aikaisemmassa tutkimuksessa, jossa me määrällisesti seurataan terapeuttista tehoa tässä potilaalle tehdä mallissa käyttäen IVIS kuvantamisjärjestelmä muutos luminoiva intensitetti näyttävät tarkasti terapeuttinen teho [20]. Siksi menetelmä, joka me kuvaamme tässä tutkimuksessa varten perustetaan potilaalle tehdä ruokatorven syöpä hiirissä ja ei-invasiivisia seurannan kanssa IVIS kuvantamisjärjestelmä on erittäin hyödyllinen ja käytännöllinen menetelmä, ja sen odotetaan osaltaan kehittää uusia hoitoteknologiat ruokatorven syöpään.

tukeminen Information

Movie S1.

Miten tehdä potilaalle tehdä ruokatorven syöpään hiirimallissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0114562.s001

(MPG) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Tomoko Sueishi ja Tae Yamanishi erinomaisesta teknistä tukea.