Krooninen sairaus

tiivistelmä

histonimodifikaation on keskeinen rooli geenisäätelyn, niin pitää maailmanlaajuinen epigeneettisiä markkereita, erityisesti kasvaimen liittyviä geenejä. Siksi kemialliset lähestymistavat kohdistaminen histoni-modifioivia entsyymejä ovat nousseet päälle tärkein vaihe syövän huumeiden löytö. Täällä, tutkimme terapeuttinen potentiaalit ja mekanistinen roolit äskettäin kehitetty histonideasetylaasi estäjä, CG200745, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. Hoidon CG200745 kasvanut maailmanlaajuisesti histonien asetylointi, jolloin soluproliferaation inhibointi. Chip-on-chip analyysin kanssa H4K16ac vasta-osoitti muuttunut H4K16 asetylointi geeneihin kriittisiä solujen kasvun estäminen, vaikka väheni transkription aloituskohdasta osajoukko geenien. Altered H4K16ac liittyi muutoksia mRNA: n ilmentymisen vastaavien geenien, jotka edelleen validoitu kvantitatiivinen RT-PCR: llä ja western-blottauksella määrityksissä. Tuloksemme osoittivat, että CG200745 aiheuttaa NSCLC solukasvuneston kautta epigeneettisellä muuttaminen kriittisten geenien syövän solujen eloonjäämistä, joka tarjoaa keskeinen vihjeitä lupaavana kemoterapeuttiset vastaan ​​keuhkosyöpään.

Citation: Chun SM, Lee JY, Choi J, Lee JH, Hwang JJ, Kim CS, et ai. (2015) Epigeneettiset modulaatio HDAC estäjä CG200745 alulle anti-leviämisen in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 10 (3): e0119379. doi: 10,1371 /journal.pone.0119379

Academic Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 22 elokuu 2014; Hyväksytty: 30 tammikuu 2015; Julkaistu 17. maaliskuuta 2015

Copyright: © 2015 Chun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tuettu apurahoja tutkimukseen olivat Korean Health Technology R Welfare, Korean tasavalta (HI06C0868, HI10C2014), johtava ulkomainen tutkimuslaitos rekrytointiohjelma, Basic Research Promotion Fund, ja Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, Science and Technology (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset muutoksia kuten CpG DNA: n metylaatio tai histoni asetylaatio pidetään tärkeänä askeleena syövän kehittymisessä ja siksi on tutkittu löytää syövän biomarkkereita ja terapeuttinen stratege [1-3]. Kun sytosiini metylaatio tapahtuu CpG-dinukleotidien toiminnan välityksellä DNA metyylitransferaasin (DNMT), metyyli- sytosiini ylläpidetään seuraavan sukupolven puuttuessa DNA de-metyyli-transferaasi nisäkkäillä. Peruuttamatonta histonimodifikaation on myös käytetty biomarkkerina varhaistoteamiseen tai prognoosi syövän sekä tehokas tavoite syöpähoitojen [4,5]. Asetylaatio tai metylointi lysiinijäännöksissä H3 ja H4 aminopään hännät ovat hallitsevassa asemassa histonimodifikaation, ja kukin on vastuussa ilmentymisen sidottu geenejä. Esimerkiksi metylaatioita lysiinijäännöksissä 4 H3 ja lysiiniä 27 H3 tunnetaan transkription aktivointi- ja tukahduttaa tapahtumia histoni sidottu geenejä, tässä järjestyksessä. Histoni asetylointi lysiinijäännöksissä 16 H4 liittyy transkription aktivaation ja /tai replikaation aloittamisen vastaavien geenien. Normaaleissa soluissa, histoni asetylaatio kontrolloidaan täsmällisesti histoni asetyyli transferaasin (HAT) ja histonideasetylaasi (HDAC). Hyper-asetylointi onkogeenien tai hypo-asetylointi tuumorisuppressorigeeneille, kuitenkin, on usein havaittu eri syövissä. HDAC-inhibiittorit (HDACi) ovat kehittyneet syöpälääkkeet kohdistaminen epigeneettisiä modulaatio, ja niitä sovelletaan hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä, erityisesti kiinteiden kasvainten, kuten rinta-, paksusuoli-, keuhko- ja munasarjasyövät, sekä hematologiset kasvaimet , kuten lymfooma, leukemia, ja myelooma [6-9]. Lisäksi epigeneettiset säätelyhäiriötä keuhkosyövässä usein liittyy yli-ilmentyminen HDAC1 ja poikkeava metylaatio tiettyjen geenien, jolloin terapeuttinen teho yhdistelmän epigenetic hoidon kohdistaminen DNA: n metylaation ja histonien deasetylaatiolla. HDAC käsittää kolme luokkaa: Luokka I, HDAC 1, 2, 3, ja 8; Luokan II HDAC 4, 5, 6, 7, 9, ja 10; ja luokan III, HDAC 11 (sirtuins 1-7) [10,11]. HDACi, trikostatiini A (TSA) [12,13] tai vorinostat (SAHA) [14-16] estävät luokan I ja II HDAC-entsyymien, jolloin kasvun pysähtymisen, apoptoosin, erilaistumista ja angiogeneesiä syöpäsolujen, kun sitä käytetään itsenäisesti tai yhdessä muiden syöpälääkkeiden kanssa. Mekanistisesti palauttaminen vaiennettu tuumorisuppressorigeeneille tai poistaminen aktivoitua onkogeenien syöpäsoluissa on keskeisessä asemassa syövän lääkkeiden vaikutuksia. Tämä seuraa solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa ilmaisun kautta p21 ja p27-proteiineja, tai G2 /M-siirtymävaiheen viive läpi transkription downregulation sykliini B1, PLK1, ja surviviini.

HDAC estäjä CG200745, (E) -N (1) – (3- (dimetyyliamino) propyyli) -N (8) -hydroksi-2 – ((naftaleeni-1-loxy) metyyli) okt-2-enediamide, on viime aikoina kehitetty ja paraikaa vaiheen I kliinisen tutkimuksen. Sen inhiboiva vaikutus solujen kasvuun on osoitettu useissa syöpäsolujen, mukaan lukien eturauhassyöpä, munuaissolukarsinooma, ja RKO-solujen (koolonkarsinoomasoluja) mono- ja monimuotoiset-hoito muiden syöpälääkkeiden [17-19]. Taustalla oleva mekanismi solujen kasvun inhibition CG200745 in RKO-solujen on osoitettu esiintyvän p53-riippuvaisella tavalla [19]. Tärkeää on, CG200745 lisääntynyt asetylaatio p53 lysiinitähteiden K320, K373 ja K382. CG200745 indusoi myös kertyminen p53, edistää p53-riippuvaisen transaktivaation ja parannettu ekspressio koodaamien proteiinien p53 kohdegeenien,

MDM2

ja

p21

(Waf1 /CIP1) ihmisen eturauhassyövän solut. Nykyisissä tutkimuksessa arvioimme antituumorivaikutuksia ja tutki kohderyhmiä on CG200745 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin tarkistaa ylimääräisiä syövän osoitus. Analysoimme solujen lisääntymisen ja muuttuneen geeniekspressiomalli upon histonien deasetylaatiolla läpi Chip-on-chip määrityksessä, reaaliaikainen PCR kvantifiointi ja western-blottauksella. Tuloksemme viittaavat siihen, että HDAC estäjä CG200745 aiheuttaa epigeneettiset aktivoituminen kriittisten geenien transkriptionaalisesti tukahdutettiin syöpiä, ja siksi voi olla lupaava NSCLC syövän terapeuttista.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja solulinjat

HDAC-inhibiittorit (HDACi), suberoylanilide hydroamic (vorinostat, SAHA) ja CG200745, toimitti Crystal Genomics Co. (Seoul, Rep. Korea). Nämä yhdisteet liuotettiin DMSO: hon ja säilytetään -20 ° C: ssa käyttöön asti. Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat ja kuolemattomaksi normaali keuhkoputken epiteelisolulinja (BEA-2B) hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI 1640-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Western blotting

50 ug koko solu-uutteet ajettiin SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Kalvot blokattiin ja inkuboitiin erityinen ensisijainen vasta-aineita H4K16ac, CCND1, p21, ja kaspaasi 3 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-H4S1 /K5 /K8 /K12Ac Santa Cruz (Santa Cruz, CA) ja β- aktiini Sigmalta (St. Louis, MO). Inkuboinnin jälkeen asianmukaiset piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla toissijainen vasta, vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL-reagenssia (Amersham-GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Yhteensä RNA: n valmistaminen ja cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttäen Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Grand Island, NY) on IQ5 Multicolor Real-Time tunnistusjärjestelmä (Bio-Rad), jossa kunkin eteen- ja taaksepäin primeri

CCNA2

,

CCNB1

,

CCND1

,

CCNE2

,

CDK2

,

Bax-a

,

bcl- 2

,

p16

,

p21

,

P27

, ja

Mxi1

(Bionics, Seoul, Korea) (S1 taulukko).

Sytotoksisuusmääritvs

IC

50 kunkin HDACi keuhkosyöpään solujen määritettiin läpi solulisäkasvumääritykselle käyttäen CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Reagent (Promega, Madison, WI) mukaan valmistajan protokollaa. Sen jälkeen eri ajanjakson inkubaation HDACis, absorbanssi mitattiin sitten 490 nm Wallac 1420 Victor3 harjoituskavereidesi 2 ohjelmisto.

FACS määritys

Vaikutus CG200745 on NSCLC solusyklin analysoitiin on Virtaussytometriaa käyttäen propidiumjodidi (PI) värjäys. Inkubaation jälkeen CG200745 tai DMSO, solut kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli. Genominen DNA värjättiin 30 ug /ml PI ja fluoresenssi mitattiin FACS Calibur kone (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). Punainen fluoresenssi johtuu PI-värjätään DNA kerättiin 560 nm: ssä puoliläpäisevän peilin ja 600 nm: n ylipäästösuodin (kaistanleveys, 35 um). Kaikkiaan 10000 solut kerättiin FACS ja analysoitiin käyttäen Cell Quest 3.1 -ohjelmistoa (Becton Dickinson).

Kromatiini immunosaostuksella (chip)

siru määritykset suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti. Lyhyesti, solut käsiteltiin 3 uM CG200745 tai DMSO: ssa 24 h saostettiin anti-asetyyli-H4K16 vasta-ainetta (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Sen jälkeen silloittamalla 1% formaldehydiä, kromatiini pirstoutuneet 300 ~ 800 bp koko sonikoimalla Bioruptor, UCD-200 (Diagenode, Denville. NJ). Kromatiinin /proteiini-kompleksit saostettiin modifioidun histoni spesifistä vasta-ainetta ja Protein A /G plus immobilisoitu -agaroosihelmiä. Eluoitumisen jälkeen helmiä, saostunut DNA-proteiinit olivat reverse-silloitettu, ja DNA puhdistettiin PCR-puhdistuskittiä (Qiagen, Valencia, CA).

Microarray kokeita ChIP tuotteet: ChIP-on-chip kokeet

chip-on-chip-määritys suoritettiin laitteella Agilent 244k x 2 oligonukleotidia mikrosirun kuin valmistajan ohjeiden (Agilent Mammalian chip-on-chip Protocol v.10). Lyhyesti, tulo-ohjaimen kokosoluekstraktien ja puhdistettu ChIP tuotteet monistettiin ligaatio-välitteisen PCR: llä käyttämällä keinotekoista oligonukleotidilinkkeri, kun tylpistämällä DNA-päät käyttäen T4-DNA-polymeraasia. Sitten monistettu tulo ja siru tuotteet leimattiin fluoresoivalla BioPrime Total Genomic merkintäjärjestelmä (Invitrogen). Sama määrä tulon DNA ja siru tuotetta eri fluoresoivia väriaineita sekoitettiin ihmisen Cot-1 DNA (1 mg /ml), ja hybridisoitiin päälle Agilent 488k promoottori array (kaksi 244k paneelit), joka sisälsi ~ 17000 määritellyistä ihmisen selostukset kattaen -5,5 kb 2,5 kb transkription aloituskohdasta (TSS). Hybridisoituun kuvat tehtiin näkyviksi mikromatriisi skannerin (Revolution 4200; Vidar Systems Cor., Herndon, VA).

Data Analysis ja ontologia analyysi

Histon asetylaatio siru tuotteiden ja syöttää analysoitiin käyttämällä ChIP moduuli DNA Analytics (Agilent, versio 4.0.81) kanssa Tukey biweight normalisoinnin, Whitehead virhe malli, ja Whitehead Per-Array Seudun malli. Lyhyesti, log2 suhde kutakin geeniä CHIP tuotteiden ja tulo laskettiin keskiarvo koettimen 1,000bp, harkitsee geenit, joiden P-arvo on pienempi kuin 0,1 arvokkaina. Jotta kuvata H4K16ac tilan transkription aloituskohdasta (TSS) etäisyys kunkin koetin yksinkertaistettiin seuraavasti: välisellä alueella-1000 ~ -500 päässä TSS oli numeroidaan-2, -500 ~ TSS kuin-1, ja TSS ~ + 500 +1: ksi, koska TSS asema määritellään from-11-10.

Functional merkinnät kautta kvantitatiivinen RT-PCR ja western blotting seurasi analyysi käyttäen DAVID (Tietokanta Annotation, visualisointi ja Integrated Discovery) bioinformatiikan resurssi ja Gene ontologiat (Molecular Function, biologisen prosessin, Cell osat) signalointiin reittejä. Kaikki luokat edustavat alle 4% kokonaismäärästä soveltavan geenejä ulkopuolelle.

Tulokset

CG200745 estää proliferaatiota NSCLC-solujen

määrittämiseksi estäviä vaikutuksia CG200745 soluproliferaatioon, mittasimme IC

50 CG200745 seuraavista keuhkosyövän solulinjat: Calu6, H358, H596, A549, HOP62, HOP92, H226, H460, ja H522, sekä Beas2B soluja. IC

50-arvot CG200745 testatussa keuhkosyövän soluja mikromolaarisina tasolla, ja ne olivat verrattavissa saatu viite lääke, SAHA (taulukko 1), mikä osoittaa merkittävää kasvua vaimentava vaikutus on CG200745 eri NSCLC solulinjoissa. Joukossa, A549, Calu6, HOP92, ja H522-solut olivat herkkiä IC

50 3 uM. Vaikutus CG200745 on Calu6 soluproliferaatioon vahvistettiin solujen määrä ja morfologia optista mikroskopia altistumisen jälkeen 3 uM CG200745 eri aikaväleillä (Fig. 1). Calu6 solut osoittivat säännöllinen solu kasvaa kuvioita ajasta riippuva tavalla, kunnes 8 tunnin kuluttua lääkehoitoa. Kuitenkin 8 tunnin CG200745 hoidon kasvuvauhti Calu6 solujen vähennettiin, ja solukuolemaa kanssa morfologisia muutoksia todettiin. Haitallista vaikutusta CG200745 on Calu6 solujen kasvua analysoitiin suorittamalla MTT-määritys, jossa eri olosuhteissa, mikä vahvistaa, että lääkeaine vähentää solujen lisääntymistä 40% käsittelemättömien solujen (kuvio. 1A).

Calu6 soluja kasvatettu 6-kuoppalevyillä hoidettiin 3 uM CG200745 varten osoitetun ajanjaksojen analysoida anti-leviämisen vaikutusta CG200745, ja niitä tarkasteltiin mikroskoopilla. (B) kasvu Calu6 soluja 96-kuoppalevyillä analysoitiin kautta MTS-määritys käsittelemällä eri pitoisuuksia CG200745 (0 10 uM) aika-rata (0-48 tuntia). Tilastollinen merkitys muutoksia solujen elinkelpoisuus laskettiin t-testiä (*** osoittaa p 0,001).

CG200745 hoito indusoi G2 /M solukierron pysähtymisen ja apoptoosin Calu6 soluissa

HDACi yhdisteiden tiedetään indusoivan solusyklin pysähtymiseen, joka on tärkeä syövän tavoite mekanismi, eri syöpäsoluissa. Sen tutkimiseksi, onko CG200745 indusoi syklin pysähtymisen Calu6 solulinjassa, näitä soluja käsiteltiin tämän HDACi molekyylin eri ajankohtina 0-24 tuntia, minkä jälkeen virtaussytometrianalyysillä (FACS). Kuten on esitetty kuviossa. 2A, kasvuun G2 /M-väestöstä ei havaittu ajasta riippuva tavalla. CG200745 käsiteltyjen Calu6 solut osoittivat merkitsevästi lisääntynyt solujen osuus G2 /M-vaiheessa (69%) verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin (26%) (kuviot. 2B ja 2C). Nämä tulokset osoittavat, että CG200745 aiheuttaa solujen kasvun inhibition kautta G2 /M-vaiheen solusyklin pysähtymisen.

Calu6 soluja käsiteltiin 3 uM CG200745 analysoitiin solun syklit virtaussytometrillä. Jokainen histogrammi koostuu kahdesta mustaa huiput ja yksi naarmuuntuu alueella tarkoittaa G0 /G1 vaiheessa G2 /M vaiheessa, ja S-vaihe, vastaavasti. Vaikutus CG200745 on solusyklin jakautumisen analysoitiin eri ajankohtina (A), tai käsittelemättömiin soluihin verrattuna (B) kuvaa kuin graafinen näkymä (C).

CG200745 aiheuttaa lisääntynyt histoni asetylointi

tutkimiseksi HDAC estäviä vaikutuksia CG200745 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut, käsittelimme Calu6 solujen eri pitoisuuksilla CG200745 ja analysoitiin histoni asetylaatio western-blottauksella, sekä HAT ja HDAC eri ajankohtina. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, alhainen pitoisuus CG200745 käsittely lisäsi merkitsevästi asetylaatio histoni H3 ja H4 eri kohteisiin, kuten K9 H3, ja K16 sekä S1 /K5 /K8 /K12 on H4, on ajasta riippuva tavalla jopa 24 tuntia käsittely Länsi blotting analyysiin. Vahvista estäviä vaikutuksia CG200745 on histonien deasetylaatiolla mittasimme HAT ja HDAC ydin- uutteiden Calu6 solujen ennen ja jälkeen CG200745 hoidon. Toisin kuin muuttumattomana HAT toimintaa sen jälkeen, CG200745 hoidon (Fig. 3B), HDAC aktiivisuus CG200745 käsiteltyjen Calu6 soluissa oli merkittävästi alhaisempi kuin sen käsittelemätön kontrolli-soluissa (kuvio. 3C), mikä osoittaa, että CG200745 lisääntynyt histoni asetylaatio tasolla, koska esto HDAC-aktiivisuuden.

(A) asetylointi tila histonien analysoitiin Western-blottaus Calu6 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla CG200745 (0-10 uM) kanssa anti-H3K9ac, anti-H4K16Ac, anti-H4S1 /K5 /K8 /K12Ac ja /tai anti-asetyyli H4 vasta-aineita. (B, C) HAT ja HDAC toiminnan ohjaus ja CG200745 käsiteltyjä soluja määritettiin käyttämällä 50 ug tumauutetta ilmoitetuilla ajankohtana.

CG200745 indusoi histonimodifikaation muutoksia Calu6 soluissa

H4K16ac on tunnettu aktivaattori globaalin geenin transkription. Sen tutkimiseksi, onko säätelevien geenien solujen eloonjäämistä vaikutti histoni asetylaatio johtuvat CG200745 hoitoon, suoritimme ChIP-on-chip-määritys käyttäen H4K16ac spesifistä vasta-ainetta. Geenit sitoutuneet H4K16ac immunosaostettiin ja analysoitiin oligonukleotidin mikrosirulla keskittynyt promoottorialueen. Tärkein Tämän kokeen tarkoituksena oli selvittää, kuinka monta ja mitkä geenit liittyvät H4K16ac asemaan vaikuttavat CG200745 hoitoa. Kuten on esitetty taulukossa 2, yli 10000 geenejä sitoutuu H4K16ac havaittiin sekä ohjaus- ja CG200745-käsiteltyjä soluja, joiden ekspressiotasoja tuhansien geenien osoittaa muutoksia H4K16ac ChIP-on-chip määrityksen jälkeen CG200745 hoidon.

tutki rakenteessa H4K16ac mukaisesti muuttuvan etäisyyden TSS piirtämällä keskimäärin log arvo siru /panos kaikille koettimia (Kuva. 4), jossa X-akseli merkitään etäisyys TSS alueen kuvattu aiemmassa osassa. H4K16ac oli yllättäen väheni viereisellä alueella TSS, erityisesti-500 nt päässä TSS jälkeen CG200745 hoidon, kun taas H4K16ac kaukaisiin alue TSS ollut mitään eroa sen kanssa käsittelemätön kontrolli soluissa, joka on yhteinen johtuu transkription aktivointi funktio H4K16 (Fig. 4A). Keskimääräinen log suhde siru /lähtötietoja selvästi osoittaa, että vähemmän geenejä kanssa H4K16ac 500 nt päässä TSS nähtiin käsitellyissä soluissa verrattuna hallita soluihin, vaikka merkittävä muutos sivusto H4K16ac oli edelleen havaittavissa ympäri TSS (Fig. 4B) . Nämä tulokset vahvistettiin kokeiden toisto, mikä osoittaa, että CG200745 hoito estää H4K16 asetylointi 500 nt päässä TSS monia geenejä.

H4K16 asetylointi vieressä TSS arvioitiin laskemalla keskimääräinen ChIP /panos log-suhde on saman etäisyyden päässä TSS. Numerot X-akselilla osoittavat etäisyyttä TSS. Y-akseli edustaa keskimääräinen pala /panos log-suhde. (A) H4K16 asetylaatio asema geenien noin TSS erikseen kuvattu CG200745-käsitellyt tai käsittelemättömät Calu6 soluja. (B) taso H4K16 asetylointi verrattiin välillä CG200745 käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen mukaan etäisyys TSS. Kaksi erillistä koetta suoritettiin laskea virhepalkin kullekin paikalle.

korrelaatio muutosten H4K16ac ja geenin ilmentymisen jälkeen, CG200745 hoidon

H4K16ac-indusoidun geeni-ilmentymisen ohjaa löystymistä Kromosomi-DNA: n sitoutuneen histoniproteiineista, jolloin avaaminen DNA sivustoja eri transkriptiotekijöitä. Alle hypo-asetyloitu tila kuitenkin positiivisen varauksen lysiinitähteiden aminopäässä histoni hännän toimii lähteenä korkean affiniteetin sitoutuminen negatiivinen varaus fosfaatti selkäranka kromosomi-DNA. Tämä tiukka sitoutuminen mahdollistaa kromatiinin muodostaa kompakti rakenteita, mikä johtaa inhibitioon transkription liittyviä geenejä. Kuten on esitetty taulukossa 2 H4K16ac tasot tuhansien geenien muutettiin sen jälkeen, kun CG200745 hoidon. Sen tarkistamiseksi korrelaatio H4K16ac aseman ja vastaavan geenin ilmentymisen, mRNA tutkittiin geenien toteutettiin merkittäviä H4K16ac muutoksia ympäri TSS-alueella. Kuten taulukossa 3 on esitetty, mRNA: n ekspressiotasot

p

21,

GSN-b

, ja

Mxi1

, jotka osoittivat lisääntynyttä H4K16ac, olivat kaikki lisääntynyt sen jälkeen, kun CG200745 hoidon , kun taas muista geeneistä, vähentynyt H4K16ac, kuten

HOXD11

,

HOXD9

, ja

PIM1

, osoitti vähentynyt mRNA ilmaisun. Lisäksi mRNA: n ilmentyminen

HAT1

, joka osoitti samanlaista H4K16ac tasojen kanssa ja ilman CG200745 hoitoa, ei ole muutettu.

varmistamiseksi edelleen korrelaation mRNA: n ekspression ja muutokset H4K16ac jälkeen CG200745 hoidon, mRNA ilmaus

CCND1

ja

p21

geenejä arvioitiin. H4K16ac tasot

CCND1

ja

p21

-promoottorin alue analysoitiin hoidettu (kontrolli) ja CG200745 käsiteltyjen (CG5) Calu6 soluihin käyttäen koko geenikoettimena mikrosirun. Kuten on esitetty kuviossa. 5 H4K16ac taso

CCND1

ja

p21

geenien jälkeen CG200745 hoidon, erityisesti lähellä TSS asennossa, todettiin olevan merkittävästi muuttunut (Kuva. 5A) ja korreloivan ilmentymisen mRNA kun määrällisesti mitattuna (kuvio. 5B). Expression of

Mxi1

nostettiin 24 tunnin hoito CG200745 Semi kvantitatiivisen analyysin kanssa kaksi erilaista alukkeiden (Fig. 5C). Proteiinin ekspressiotasot

sykliini D1

ja

p21

geenit dramaattisesti vähentää ja lisätä vastaavasti, paitsi Calu6 soluissa, mutta myös useita muita NSCLC-soluja, mukaan lukien A549, H358, ja H596-soluja (Fig. 6). Lisäksi, CG200745 hoito johti aktivaatioon luontainen apoptoottisten kaspaasi 3, on Calu6 soluissa sekä monissa NSCLC soluihin, kuten A549, H358, ja H596-solut (Fig. 6A ja 6B). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että ekspressiotasot tiettyjen geenien vaikutti CG200745 hoidon kautta H4K16ac tasolla TSS alueella.

(A) tasot H4K16 asetylointi on CCND1 ja

p

21-geenejä merkitty mukaan etäisyys TSS on hoidettu (kontrolli) ja CG200745-käsiteltyjä soluja (CG5). (B) mRNA tasot CCND1 ja

p

21 geenit kvantitoitiin reaaliaikaisen RT-PCR. (C) ilmentyminen Mxi1 geenin määritettiin RT-PCR: llä A549- ja Calu6 soluja.

Solut analysoitiin Western-blottauksella sykliini D1, p21, kaspaasi-3, c-myc, asetyyli-H4, H3, ja β-aktiini-vasta-aineita. Solulysaateista lääkkeellä käsiteltyihin A549, Calu6 (A), H358, ja H596 (B-solut) verrattiin vastaaviin käsittelemättömiin soluihin.

Keskustelu

HDACi molekyylejä on raportoitu indusoivat erilaisia ​​syöpää ehkäisevistä vaikutuksista, mukaan lukien tuumorisolujen apoptoosin, solusyklin pysähtymisen, erilaistumista, vanhenemista, modulaatio immuunivasteita, ja muuntuneesta angiogeneesistä [20]. Lisäksi käyttö HDACi on osoitettu lisäävän herkkyyttä NSCLC solulinjojen gefitinibi tai erlotinibi [21,22]. CG200745, (E) -N (1) – (3- (dimetyyliamino) propyyli) -N (8) -hydroksi-2 – ((naftaleeni-1-loxy) metyyli) okt-2-enediamide, on viime aikoina kehitetty HDACi , paraikaa vaiheen I kliinisen tutkimuksen. Sen inhiboiva vaikutus solujen kasvuun on osoitettu useissa syöpäsolujen, mukaan lukien eturauhassyöpä, munuaissolukarsinooma, ja RKO-solujen (koolonkarsinoomasoluja) mono- ja monimuotoiset-hoito muiden syöpälääkkeiden [17-19]. Tämä lääke yhdessä Doketakselia aiheuttamaa kasvainten pienenemistä DU145 eturauhasen syöpäsolun ksenografti- aktivoimalla apoptoosin. Lisäksi se aiheutti solukuoleman koolonkarsinoomasoluja ilmentävät villityyppistä p53 asetyloimalla p53. Meidän nykyisessä tutkimuksessa tutkimme antituumorivaikutukset HDACi on NSCLC solujen mahdollisesti laajentaa kliinisen käytön laaja kasvain merkkejä. Olemme lisäksi tarkoitus valaista oleva mekanismi romaani HDAC estäjä, joka on nyt kliinisissä kokeissa leukemiaa ja kiinteä kasvain, jonka kliiniset hakemus voitaisiin saavuttaa, kuten co-käsittelyä ja /tai adjuvantti hoito kohdennettuja kemoterapeuttisten. HDACi indusoi inhibitio keuhkosyövän solujen kasvua, solujen kasvun pysähtymisen G2 /M-vaiheessa, ja apoptoosin osoituksena kaspaasi 3 pilkkomalla verrattavissa IC

50 pitoisuuksia kuin SAHA (tunnetaan myös nimellä Vorinostat), ainoa HDACi hetkellä hyväksytty kliiniseen hoitoon ihon T-solulymfooman [23-25]. Vaikka H4K16 asetylointi vielä tapahtunut laajalti promoottorialueille kiinnostavaa, CG200745 nimenomaan laski histoni H4K16 asetylointi-500 nukleotidin TSS kuten on esitetty toista Chip-siru analyysiin. Nämä tulokset osoittavat, että HDAC-inhibiittori-välitteistä solujen kasvun esto liittyy transkription säätelyyn useiden geenien. Perusteellinen analyysi geenien solukierron säätelyssä, kuten

CCND1

,

p21

, ja

Mxi1

, osoitti CG200745 hoitotulokset transkription muutoksia näiden geenien .

Mxi1

, antagonisti

c-Myc

onkogeeni, koodaa proteiinia nimetty Mad2, joka on transkriptiotekijän Myc-Max-Mad-verkkoon. Mad /MXI heterodimeerin ennustetaan antagonisoida Myc toiminto poistamalla käytettävissä Max myc transkriptionaalisen aktiivisuuden. Transkriptiotekijä C-Myc yli-ilmennetään monissa ihmisen kasvaimissa, ja sen aktivointi vaatii hetero- kumppanin Max. C-myc säädellään ubikinaation ja proteasomin hajoaminen [26,27]. Itse asiassa, inhibitio Myc /Max sitoutumisen pieniä molekyylejä, on todettu olevan erittäin lupaava kohde syövän hoidossa [28]. Mxi1 liittyvät leviämisen välittyy IGFBP-3 signaloinnin [18], ja nousi FoxO3a ilmentymistä säätelee lisäävästi ilmentymisen jäsenten Mad /MXI reitin [29]. Voimistunut ilmentyminen Mxi1 mukaan CG200745 hoito voi siis olla rooli säätelyssä soluproliferaation kautta Myc-Max-Mad verkkoon.

SAHA HDACi, on osoitettu vähentävän ekspressiotasoja Erk1 /2 ja MMP-9, lisätä ekspressiotasot p53, joka puolestaan ​​muuttaa solujen lisääntymisen ja apoptoosin, ja edistää asetylointi histonien H3 ja H4 in munasarjakarsinoomasolut [30]. Lisäksi aikaisemmassa tutkimuksessa on raportoitu, että SAHA aktivoi p53, mutta ei vaadi p53 sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista. Sama tutkimus osoitti, että entinostat aiheuttama sytotoksiset vaikutukset ovat osittain riippuvaisia ​​p53, mikä osoittaa, että eri HDACi yhdisteillä on erilaisia ​​vaatimuksia p53 [31]. Taustalla oleva mekanismi solujen kasvun inhibition CG200745 in RKO-solujen on osoitettu esiintyvän p53-riippuvaisella tavalla [19]. Tässä tutkimuksessa CG200745 lisääntynyt asetylaatio p53 at lysiinijäännöksissä K320, K373, ja K382. CG200745 indusoi myös kertyminen p53, edistää p53-riippuvaisen transaktivaation ja parannettu ekspressio koodaamien proteiinien p53 kohdegeenien,

MDM2

ja

p21

(Waf1 /CIP1) ihmisen eturauhassyövän solut. Antituumorivaikutukset of CG200745 on NSCLC-solut kuitenkin havaittiin nykyisen analyysien olevan riippumaton mutaatio aseman koodaavat geenit p53. NSCLC soluja käytimme myös p53 villityypin ja null /mutanttisoluja, osoitti solujen kasvun esto, kun käsittelemällä HDACi, mikä osoittaa, että CG200745 säätelee solujen kasvua eri mekanismeilla mukaan solujen yhteydessä.

Yhteenvetona havainnot meidän Tämän tutkimuksen laajentaa yleistä sovellettavuutta CG200745 hoitoon NSCLC, jota varten se on lupaava uusi HDACi. Lisäksi tuloksemme osoittavat, että tämän vaikutukset HDACi voi tapahtua p53-riippumaton mekanismi. Lisäksi tiedot osoittavat, että HDACi voi estää c-myc-signalointireitin kautta induktion

Mxi1

, mutta tämä havainto vaatii lisätutkimuksia. Lopuksi potentiaalia CG200745 parantaa tehoa syöpälääkkeiden osana yhdistelmähoitoa tulisi tutkia tarkemmin

tukeminen Information

S1 Taulukko. Alukesekvenssit kvantitatiivista RT-PCR-reaktiossa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0119379.s001

(DOCX) B

Kiitokset

Tuettuja apurahoja tutkimukseen olivat Korean Health Technology R Welfare, Korean tasavalta (HI06C0868, HI10C2014), johtava ulkomainen tutkimuslaitos rekrytointiohjelma, Basic Research Promotion Fund, ja Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, Science and Technology (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192).