Krooninen sairaus

tiivistelmä

15-LOX, ehdotetaan, estää kasvun eturauhassyövän osittain muuntamalla arakidonihapon, eikosatrieenihappoetyyliesteriä, ja /tai eikosapentaeenihapon happojen n-6 hydroksimetaboliittien. Nämä metaboliitit inhiboimaan PC3, LNCaP ja DU145 eturauhassyövän soluissa, mutta ainoastaan ​​≥1-10 uM. Osoitamme tässä, että 15-LOX metaboliitteja dokosaheksaeenihappoa (DHA), 17-hydroperoksi-, 17-hydroksi-, 10,17-dihydroksi- ja 7,17-dihydroksi-DHA inhiboida näiden solujen ≥0.001 , 0,01, 1, ja 1 uM. Vertailun vuoksi vastaava 15-hydroperoksi, 15-hydroksi, 8,15-dihydroksi, ja 5,15-dihydroksi arakidonihapon aineenvaihduntatuotteet sekä DHA sinänsä vaadi ≥10-100 uM tehdä tätä. Kuten DHA, DHA metaboliitit a) aiheuttaa PC3-solujen aktivoimiseksi peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorin-γ (PPARy) toimittaja, ilmaista syndekaani-1, ja tulla apoptoottisten ja b) on estetty hidastaa solujen lisääntymistä farmakologisin estoa tai knockdovvn PPAR tai syndekaani-1. DHA metaboliitit siis hidas eturauhassyövän soluproliferaatiota sitoutumalla PPARy /syndekaani-1-reitin apoptoosin ja siten voidaan edistää eturauhassyövän alentava vaikutus ei ole vain 15-LOX vaan myös ravinnon DHA.

Johdanto-osan: O’Flaherty JT, Hu Y, Wooten RE, Horita DA, Samuel MP, Thomas MJ, et al. (2012) 15-Lipoksigenaasi metaboliitteja Dokosaheksaeenihappo esto Eturauhassyöpä Cell Proliferation ja Survival. PLoS ONE 7 (9): e45480. doi: 10,1371 /journal.pone.0045480

Editor: Clarissa Menezes Maya-Monteiro, Fundação Oswaldo Cruz, Brasilia

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 20 elokuu 2012; Julkaistu: 20 syyskuu 2012

Copyright: © O’Flaherty et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH avustuksia PO1CA106742 (JTO, YH ja IJE), RO1CA115958 (IJE), RO1AI064609 (DAA) ja keskus Grant NIH CA1207 (MJT) ja kaksi Golfers ’syöpää vastaan ​​avustuksia (JTO). National Science Foundation apurahan BIR-9414018 kunhan varoja ostaa massaspektrometriin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

metabolia ravinnon rasvahappojen on erityisen kiinnostava eturauhassyövässä, yleisimmin diagnosoitu syöpä ja johtava kuolinsyy Amerikan miehillä. Epidemiologiset tutkimukset viittaavat siihen, että saanti n-3 meren monityydyttymättömiä rasvahappoja (PUFA), eikosapentaeenihappo (EPA, 20:5, n-3) ja dokosaheksaeenihappo (DHA, 22:6, n-3) vähentää eturauhasen syövän riskiä [ ,,,0],1], [2]. Lisäksi tasot kudoksissa n-3 PUFA oli käänteisesti yhteydessä eturauhassyövän etenemiseen [3], [4], [5]. Lisäksi soluviljelmissä ja eläinmalleissa on osoitettu, että n-3 PUFA ovat suojaavia taas n-6 PUFA edistää tätä syöpä [6], [7], [8]. PUFA sisällytetään solukalvon fosfolipidit ja substraattien oksigenaasia (cyclooxygenase ja lipoksigenaasin) entsyymit voidaan metaboloituu bioaktiivisten lipidien. Yksi ehdotettu mekanismi kasvain-estävä aktiivisuus n-3 PUFA on kilpailukykyinen esto oksygenaasit käyttämän n-6 PUFA muodostaa kasvain edistävää aineenvaihduntatuotteiden (tarkistetaan [9], [10]). Tutkimuksemme [11], [12] ja toisten [6], [13] ovat osoittaneet, että DHA on voimakas estäjä eturauhasen syöpäsolujen kasvua, ominaisuus, joka säätelee 15 lipoksigenaasin (15-LOX) ( julkaisemattomia tutkimuksia).

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kaksi isoformia 15-LOX tunnistettu ihmisillä voi olla vastakkaiset roolit kehittymistä ja etenemistä eturauhassyövän kautta aineenvaihduntaa n-6 PUFA. 15-LOX-1 on korkeammin ilmaistaan ​​pahanlaatuinen kuin normaalissa ihmisen eturauhasessa ja sen tasot korreloivat positiivisesti taudin vakavuuden [14], [15], [16]. Se suosii linolihappo (LA) ja arakidonihapon (AA) ja esittää sen vuoksi lähinnä LA metaboliitti, 13-hydroksi-octadecaenoic happo (HODE) [14], [17], [18]. Eturauhassyöpä on korkeampi 13-HODE ja muuntaa LA 13-HODE suuremmassa määrin kuin normaalissa eturauhasessa [14], [15], [16]. 15-LOX-2 sen sijaan mieluummin AA yli LA, tekee pääasiassa AA metaboliitti, 15-hydroksi-eikosatetraeenihappo (15-HETE), on alle ilmaistu tai poissa eturauhassyövässä, ja sen tasot korreloivat negatiivisesti sairauden vakavuuden [14], [17], [18], [19], [20]. Ihmisen eturauhassyöpä on suhteellisen vähän kyky muuntaa AA 15-HETE [15]. Kokeelliset tutkimukset ovat tukeneet ja laajentunut nämä kliiniset havainnot.

Hiiret tehty ilmaisemaan niiden eturauhanen rauhaset ihmisen 15-LOX-1 kehittää eturauhasen intraepiteliaalisten neoplasia (PIN) [21]; tarkoitetulla tavalla muokattu ilmentämään ihmisen 15-LOX-2, ne kehittävät prostates suurennettu kanssa senescent soluihin [22]. Joka korreloi nämä tulokset, pakko ilmentyminen ihmisen 15-LOX-1 nopeuksilla ja 15-LOX-1 Knockdown hidastaa leviämisen viljellyistä ja kudosviljellyn ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [23]. Pakko ilmentymisen ihmisen 15-LOX-2 aiheuttaa nämä solut pysähtyä lisääntyvissä ja tulla senescent [24], [25]. Vaikutus 15-LOX-1 tulee näkyviin, koska tuotannon 13-HODE, joka parantaa kykyä kasvutekijöitä stimuloimaan eturauhassyövän solujen proliferaatiota [23], [26], [27]. Vaikutus 15-LOX-2 johtuu osittain tuotannon 15-HETE, joka estää eturauhassyövän soluproliferaatiota [24], [25], [26] aktivoimalla peroksisomiproliferaattorilla aktivoiva reseptori (PPAR) -γ [26], [28], [29]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että eteneminen eturauhasen epiteelisolujen pahanlaatuisuuteen liittyy up-säätelevä 15-LOX-1 ja alaspäin säätäminen 15-LOX-2 luoda ympäristö suosii kasvun, eli yksi rikkaampi pro-proliferatiivisia ja huonompi antiproliferatiivisia PUFA aineenvaihduntatuotteita. On ongelmia tämän 15-LOX /n-6 PUFA malli. AA itsessään aiheuttaa syöpäsolujen lisääntyä [30] ja kuten muutkin n-6 PUFA ehdotetaan edistää sijaan tukahduttaa eturauhassyöpä joissakin epidemiologisiin tutkimuksiin [31], [32], [33]. Lisäksi, anti-proliferatiivista vaikutusta 15-HETE viljellyissä eturauhasen syöpäsolujen vaatii ≥10-100 uM [25], [26], [34]. Vastaava päämetaboliitit n-6-PUFA, γ-linoleenihappoa (GLA), ja n-3-PUFA, eikosapentaeenihappo (EPA), ovat myös vähemmän todennäköisesti välittäjiä 15-LOX-2: n syövän vastaisen vaikutuksen, koska sekä 15-hydroksi-eikosatrieenihappoetyyliesteriä ja 15-hydroksi-eikosapentaeenihappo vaativat ≥1-5 uM hidastaa leviämisen eturauhasen syöpäsolujen [35], [36]. Olemassa olevat tiedot siis takaa etsii muita 15-LOX /PUFA aineenvaihduntatuote malleja.

täällä tutkia aktiivisuus, voimakkuus, ja vaikutusmekanismi 15-LOX aineenvaihduntatuotteiden DHA. Nämä metaboliitit ovat erityisen kiinnostavia, koska 1) DHA kuuluu n-3 PUFA perhe ehdotti tukahduttaa eturauhassyövän epidemiologisissa tutkimuksissa [31], [32], [33]; 2) DHA on keskeinen tekijä antiproliferatiivista vaikutusta n-3 PUFA eturauhassyövän soluissa [11], [12] ja 3) aktiivisuus lyhytketjuisemmat n-3 PUFA, kuten EPA, voivat olla merkityksettömiä DHA: n toimintoihin, sillä miehet [37] sekä viljellyt syöpäsolujen [11] voidaan helposti muuntaa lyhytketjuisemmat n-3 PUFA EPA mutta ovat käytännössä kykene muuntaa EPA DHA.

Materiaalit ja menetelmät

DHA ja AA (NuChek Prep); soija 15-LOX tyypin 1a (sLOX), natriumboraatti, ja natriumboorihydridiä (Sigma); HPLC sarakkeet (Waters); HPLC: llä tai optimi luokka orgaanisia liuottimia ja dietyylieetteriä (Fisher); anti-SDC-1 (H-174) vasta-aineen (Santa Cruz Biotechnology, Inc); anti-HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanin vasta-ainetta (Cell Signaling Technology); ja CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay ja Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega) ostettiin. PC3, DU145, ja LNCaP ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (American Type Culture Collection (Manassas, VA) kasvatettiin pitkälle Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaineessa (Invitrogen), joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia (PC3-solut), Eaglen minimum essential Earlen suoloja keskipitkän (Invitrogen), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (DU145-solut) tai RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (LNCaP-solut), kuten on kuvattu [34], [38].

Metabolinen valmisteet

valmistettu 15S-hydroperoksi- eicosatetra-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eeni- (15-HPETE), 15S-hydroksi-eicosatetra-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eeni- (15-HETE), 5S, 15S-dihydroksi-eikosa-tetra-6E, 8Z, 11Z, 13E-eeni- (5,15-diHETE), ja 8S, 15S-dihydroksi- eicosatetra-5Z, 9E, 11Z, 13E-eeni- (5,15- diHETE) hapot saattamalla arakidonihappo (AA), jossa sLOX [39], ja käyttää tätä samaa menetelmää valmistaa DHA aineenvaihduntatuotteita. Lyhyesti, DHA (10

-4 M) saatettiin reagoimaan 0,8 mg: n sLOX 50 ml: ssa hiilihapotettujen natriumia boraatti-puskurissa (50 mM, pH 9, 4 ° C, 30 min). Reaktiot uutettiin dietyylieetterillä; 17S-hydroperoksi-docosa-heksa-4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoaatti (17-HpDHA) tuote puhdistettiin gravimetrisesti piihappoa kromatografialla, isokraattinen C18 u-Bondapak HPLC: llä (1,5 x 300 mm, metanoli: H

2O: jääetikkaa, 750/250 /0,1, v /v, 3 ml /min; eluoitui ~34 min), ja isokraattinen μ-Porasil HPLC: llä (1,5 x 300 mm; heksaani: isopropanoli: jääetikka happo, 950:50: 1, v /v, 5 ml /min; eluoitui ~6 min). Eluointi UV-spektrit seurattiin G1315A diodialueen spektrometri juoksi ChemStation 51 ohjelmisto (Agilent Technologies). 17-HpDHA saatettiin reagoimaan natriumboorihydridin kanssa metanolissa ja uudelleen puhdistettiin μ-Bondapak-HPLC: llä, jolloin saatiin 17S-hydroksi-docosahexa-4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoaatti (17-HDHA). Sillä dihydroksi tuotteet, DHA (10

-4 M) 500 ml: ssa reaktioiden annettiin reagoida 10 mg: n sLOX lisättiin 0, 45, 90, 150, ja 240 min. Sen jälkeen, kun 300 minuutin kuluttua reaktio työstettiin, kuten 17-HpHDA vaikka μ-Bondapak-HPLC-vaihe; huippu eluoimalla tämän järjestelmän -10 min kanssa trieenin absobanssispektrit (maksimit: 280, 270, ja 261 nm) dominoi vasemmalla puolella ja 5,15-diHETE kaltainen absobanssispektrit (maksimi: 243; adiabaattinen kyttyrä: ~223 nm) dominoi sen oikealla puolella kerättiin; pelkistetään natriumboorihydridillä; ja sen jälkeen, Butovich et ai. [40], [41], ratkaistaan ​​isokraattinen 5SW HPLC: lla (3 x 250 mm; heksaani: isopropanoli: jääetikkaa (974:26: 1, v /v; 1 ml /min), otetaan piikit on noin 17 ja 22 min vastaavien UV-spektri 10S, 17S-dihydroksi- docosahexa-4Z, 7Z, 11E, 13Z, 15E, 19Z-enoaatti (10,17-diHDHA myös kutsutaan protektiini DX [42]; maksimit: 280, 270, ja 260 nm) ja 7S, 17S-dihydroksi- docsahexa-4Z, 8E, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoaatti (7,17-diHDHA [tai protektiini D5] maksimi: 222 nm; adiabaattinen kyttyrä: 242 nm) [40], [ ,,,0],41], [43]. sen lisäksi, että niiden HPLC-eluointi kertaa ja UV-spektrit, rakenteiden AA aineenvaihduntatuotteiden vahvistettiin MS [39] ja DHA aineenvaihduntatuotteiden MS ja ydinmagneettisen resonanssin (NMR). 17-HDHA ja 10,17-diHDHA saatiin sähkösumutus spektrit (Quattro II MS, MassLynx 3,5 ohjelmisto, negatiivisten ionien tilassa) kuin julkaistu [40], [41], [43], [44], [45], [46]. molekyyli-ioni 17-HpDHA oli 16 AMU suurempi kuin 17-HDHA. NMR-spektrit (1D ja 2D kaksinkertainen kvantti-suodatettu COSY in d

4-metanolia; 25 ° C; Bruker 699 MHz Avance NMR-spektrometri) varten 17-HDHA ja 10,17-diHDHA oli kemialliset siirtymät ja kytkentäkuviot vastaavat julkaistuissa raporteissa [40], [41], [44]; päätelty konjugoitu kaksoissidos geometriat olivat 17-HDHA, 13Z, 15E; for 10,17-diHDHA, 11E, 13Z, 15E; ja 7,17-diHDHA, 8E, 10Z ja 13Z, 15E. Neljä DHA aineenvaihduntatuotteet puuttui resonanssia 6,1-6,2 ppm osoittaa puuttuminen trans-trans-konjugoidun kaksoissidoksen. PUFA ja metaboliittien säilytettiin metanolia argonatmosfäärissä -80 °; vapautettiin metanolista typpivirrassa; otettu elatusaineissa; ja lisätään soluviljelmiin. Koska niiden epävakauden [40], [41], 15-HPETE ja 17-HpDHA käytettiin 3 viikon kuluessa valmisteen.

leviämisen ja kaspaasi Analyysit

lisäkasvua tutkittiin kanssa Cell Titer96 Aqueous yksi ratkaisu Soluproliferaatiomäärityksiä (Promega) kuvatulla [47]. Mitata apoptoottista aktiivisuutta, solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 1000 solua /kuoppa 24 tunnin ajan, käsiteltiin sitten yhdisteiden kanssa 48 tuntia ennen mittausta kaspaasiaktiivisuus käyttämällä kaspaasi-Glo® 3/7 määritys ( Promega) mukaan valmistajan suuntiin.

PPARy aktivointi Pitoisuus

2 x 10

5 PC3-solut ympättiin 35 mm ruokia 1 ml kehittyneiden DMEM 1% FBS, ja 24 h ja transfektoitiin 1 ug: n lacZ ja 1 ug pPre DNA: ta (PPAR-vaste-elementti ja lusiferaasireportterista) [34], [38] käyttämällä FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche). Joissakin tutkimuksissa solut ko-transfektoitiin vektorilla (1 ug), joka koodaa dominantti negatiivinen (d /n) -PPARγ (L468 /E471) [34] [38] tai tyhjä pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 24 h tai käsiteltiin 30 min PPARy-antagonisti, GW9662. Sitten solut altistettiin DHA metaboliitin tai PPAR-agonistin, troglitatsoni, 24 tuntia. Solut kaavittiin Reporter Lysis Buffer (Promega). Näytteet jäädytettiin 18 tuntia ja sentrifugoitiin (200 g, 4 min, 20-C). Supernatanttinesteet analysoitiin lusiferaasi ja β-galaktosidaasi (Promega Luciferase ja β-galaktosidaasi-entsyymianalyysi Systems). Luciferase korjattiin transfektiotehokkuuden perustuu β-galaktosidaasin kuten [34], [38].

SDC-1-määritys

havaitsemiseksi SDC-1 viesti, yhteensä PC3 solu-RNA valmistettiin ja monistettiin kolmena kappaleena käyttäen Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Alukkeet ihmisen SDC-1 olivat 5′-ggagcaggacttcacctttg (eteenpäin) ja 5′-ctcccagcacctctttcct (käänteinen). Data normalisoitiin housekeeping-ohjaus peptidyyli-prolylisomerase B ja ne on esitetty suhteessa kontrolliin. Havaitsemiseksi SDC-1-proteiinin, PC3-solut homogenoitiin ja lyysattiin jääkylmällä puskurilla (25 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1% Triton X-100, 0,1 mg /ml fenyyli-metaanisulfonyyli fluoridi, 1 x proteinaasi, ja 1 x fosfataasi-inhibiittorit [Roche Applied Science)], dialysoitiin 100 mM Tris ja 30 mM natriumasetaattia, pH 8,0, 24 tunnin ajan 4 ° C: ssa, ja pilkottiin kondroitinaasi ABC (Seikagaku, Ijamsville, MD) ja heparinaasi III (Sigma -Aldrich) 37 ° C: ssa yön yli. Proteiini uutteet valmistettiin Western blot -analyysiä, kuten on kuvattu käyttäen esitettyä vasta-ainetta [12]. Band tiheydet valokuvafilmeissä analysoitiin Image J 1.37v (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Hiljentää SDC-1, 1 x 10

5 PC3-solua per kuoppa maljattiin 96-kuoppalevyillä, jotka oli transfektoitu pieni häiritsevä RNA (siRNA), ihmisen SDC-1-geenin (Ambion, luettelonro. AM16708) tai negatiivisena kontrollina siRNA, jolla ei ole tunnettujen tavoite käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) saavuttaa pudotus tehokkuus 75%, kuten on kuvattu [12]. Viljelmiä inkuboitiin 18 tuntia ja sitten altistettiin DHA metaboliitin varten 3 päivää.

Tilastollinen analysointi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, kun esitetyt tiedot ovat peräisin Eräässä kokeessa, joka oli toistaa samanlaisella tulokset tai SEM, jossa tulokset esitetään keskiarvona riippumattomassa kokeessa. Tulokset analysoitiin ANOVA (tavalla tai kaksisuuntainen kuin syytteeseen) ja Bonferronin Multiple Vertailu kokeen käyttäen GraphPad Prism versio 4.00 Windowsille, GraphPad Software, San Diego CA. Eroja pidettiin merkittävinä osoitteessa

P

0,05.

Tulokset

17-HpDHA, 17-HDHA, 10,17-diHDHA, ja 7,17-HDHA hidastui leviämisen PC3-solujen 25%: noin 0,1, 1, 8, ja 10 uM, vastaavasti (Fig. 1A). Samoissa olosuhteissa, DHA vaaditaan 60 uM saavuttaa tämä vaikutus [12] ja analogisia AA-johdettu 15-LOX aineenvaihduntatuotteita, 15-HPETE, 15-HETE, ja 8-15-diHETE, oli paljon vähemmän tai ei lainkaan aktiivisuutta kun taas 5,15-diHETE hieman-stimuloitu proliferaatio (Fig. 1 B). Vertailukelpoinen 15-hydroksi aineenvaihduntatuotteiden EPA ja GLA kuulemma vaativat ≥5 uM hidasta lisääntymistä 25% [35], [36], kun taas 15-LOX riippuva aineenvaihduntatuotteet LA, 13-HODE ja 9-HODE, puuttui anti- proliferatiivinen aktiivisuus 100 uM ja todella stimuloi proliferaatiota ≥0.1 ja 1 nM (julkaisemattomia havaintoja). 17-HpDHA ja 17-HDHA myös osoittautunut tehokkaampia kuin 15-HPETE tai 15-HETE hidastaa leviämisen LNCaP ja DU145 syöpäsolujen (Fig. 1 C ja 1 D). Samanlaisia ​​tuloksia esiintyi kolmessa solulinjoissa, kun inkuboitiin aineenvaihduntatuotteiden 48 tai 96 h (tuloksia ei esitetty). Identtisissä olosuhteissa, DHA tarvitaan ≥30 uM estää näiden solujen [12].

ilmoitettu solutyyppejä inkuboitiin 3 päivää, jossa on valittu metaboliitin ja niiden leviäminen esitetään keskiarvona ± SEM (≥ 3 itsenäistä koetta) fraktioita joka löytyy soluissa käsitelty ajoneuvon (elatusaineet) metaboliitit.

tutkia mekanismi (t) taustalla aineenvaihduntatuotteiden ”antiproliferatiivisia aktiivisuutta, keskityimme PC3-soluja, ja sen jälkeen aikaisempien tutkimusten jossa todettiin, että DHA estää eturauhassyövän soluproliferaatiota aktivoimalla PPARy indusoida ilmentymisen syndekaani (SDC) -1. Tämä transmembraaninen proteoglykaani on apoptoosia indusoiva aktiivisuus eturauhasen ja muiden syöpäsolujen [12], [38], [48], [49]. 17-HpDHA ja 17-HDHA, on ≥0.01 ja 1 uM, aiheutti PC3-solujen aktivoimiseksi kaspaasi-3, markkeri apoptoosin (Fig. 2A). Tilastollinen analyysi (kaksisuuntainen ANOVA) osoitti, että annos-vaste-muuttujan merkitsevästi (p 0,0001) ja kaksi metaboliitin muuttujan merkittävästi (p 0,001) vaikutti tuloksiin 17-HpDHA on tehokkaampi, että 17-HDHA. Nämä samat kaksi DHA aineenvaihduntatuotteet aiheutti myös solujen aktivoida PPAR reportterigeenin; tämä vaikutus oli samanlainen kuin farmakologisen PPAR-aktivaattori, troglitatsoni (Fig. 2B), samoin kuin DHA: ta [38], [48]. Sekä 10,17-diHDHA ja 7-17-HDHA olivat heikot aktivaattorit PPARy tässä tutkimuksessa asiakkuutta vastaavasti 69% ja 68%: n nousu aktiivisuuden yli-ohjaus, joka tiettyjä kehityssuuntia kohti, mutta ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä (P 0,1) (Fig. 2B). Olemme aiemmin osoittaneet, että sekä 15-HETE ja 5,15-diHETE (1-200 uM) ei aktivoida tämän reportteri [34]. Lopuksi DHA aineenvaihduntatuotteiden stimuloi PC3-solut ilmaista SDC-1 mRNA (Fig. 2C), jotka johtivat lisääntyneeseen SDC-1protein (Fig. 2D); Näiden vaikutusten lisäksi sovitettu kuin troglitatsoni ja DHA [12], [38], [48], [49]. Suhteellinen voimakkuudet Metaboliittien tuottavat näitä vastauksia arviolta niiden suhteelliset voimakkuudet hidastamaan PC3-solujen lisääntymisen. Ristiriita heikko aktivointi PPARy jonka 10,17-diHDHA ja 7-17-HDHA (Fig. 2B), ja niiden vankempi vaikutus kertyminen SDC-1-proteiinin yli 72 h (Fig. 2D) voi ehdottaa hidas käyttöönotto ja /tai aineenvaihduntaan näiden kahden polaarisempaa tuotteiden solut.

. Soluja inkuboitiin ilmoitetun pitoisuuden 17-HDHA tai 17-HpDHA 24 tuntia ja kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin Caspase-Glo® 3/7 määrityksessä. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD (n = 3) verrattuna kontrolliin käsiteltyjen solujen väliaine metaboliitit. Vastaukset annosten ja yli 10

-8 M 17-HpDHA ja tai sen yläpuolella 10

-7 M 17-HDHA olivat merkitsevästi suurempi kuin kontrolli soluja (kaksisuuntainen ANOVA, P 0,05) . B. Solut, jotka on transfektoitu lusiferaasin PPARy reportterigeeni stimuloitiin 24 tuntia 10 uM ilmoitetun metaboliitin (pienin annos, jossa kaikilla oli selvä vaikutus solujen kasvuun) tai 5 uM troglitatsonin ja analysoitiin lusiferaasi. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). Bars merkitty samoilla kirjaimilla eivät eroa merkittävästi toisistaan; baareja merkitty eri kirjaimia poikkeavat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA, P 0,05) C. Soluja käsiteltiin väliaineen (kontrolli) tai 10 pM osoitettua metaboliitin 8 tai 24 h ja niiden SDC-1-mRNA oli mitattu. Arvot edustavat keskiarvoa, ± SD (n = 3). Kussakin kerta ryhmä, baareja merkitty samoilla kirjaimilla eivät eroa merkittävästi toisistaan; baareja merkitty eri kirjaimia poikkeavat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA, P 0,05). D. Soluja käsiteltiin väliaineen (kontrolli) tai 10 uM ilmoitettu metaboliitin 72 h ja niiden lysaatit analysoitiin SDC-1. Western blot edustaa 3 itsenäistä koetta. Arvot kuvaajat edustavat keskiarvoa ± SEM (N = 3 itsenäistä koetta). Bars merkitty eri kirjaimia poikkeavat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA, P 0,05).

PPARy aktivointi ilmestyi kriittinen aktiivisuuden DHA aineenvaihduntatuotteiden: metaboliitit ovat merkittävästi esti antaisi SDC-1 PC3-soluissa, jotka on transfektoitu d /nPPARγ, mutta ei soluissa, jotka on transfektoitu pcDNA3 vektorisäätö, verrattuna soluihin, jotka olivat transfektoimattomia (Fig. 3A). Vielä tärkeämpää on, d /nPPARγ transfektion esti myös kunkin neljän metaboliittien ”anti-proliferatiivinen aktiivisuus taas pcDNA3 ei, jälleen verrattuna soluihin, jotka olivat transfektoimattomia (Fig. 3B). Tämän tueksi viimeisen tuloksen, anti-proliferatiivista aktiivisuutta metaboliittien estyi PC3-soluissa, jotka on esikäsitelty PPARy-antagonisti, GW6992, verrattuna solut, joita käsiteltiin lääkkeen ajoneuvon (Fig. 3C). Lopuksi, SDC-1 induktio esiintyi myös tärkeää, että aineenvaihduntatuotteiden ”antiproliferatiivista aktiivisuutta. Solut, jotka olivat heidän SDC-1 pudotti transfektiolla SDC-1-spesifisiä siRNA olivat välinpitämättömiä (eli ei onnistunut pysäyttämään proliferoitumalla vastaus) metaboliiteiksi verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA tai transfektoitu (Fig. 3d). Vaikka 10,17-diHDHA ja 7-17-HDHA olivat suhteellisen heikkoja aktivaattorien PPARy (Fig. 2B), näiden vaikutukset aineenvaihduntatuotteiden SDC-1 ilmentymisen ja leviämisen olivat myös herkkiä PPARy esto (Fig. 3A-D). Tämä viittaa siihen, että matalan kynnyksen reseptorin aktivaatio voi olla riittävä PPARy säätelyä

sdc-1

geenin, joka on yhdenmukainen vaikutuksia DHA tämän reitin aikaisempien tutkimusten [38].

. Solut eivät transfektoitu tai transfektoitu pcDNA3 tai d /nPPARγ altistettiin 10 uM osoitettua metaboliitin 24 tuntia ennen määrittämällä syndekaani-1-mRNA. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). Sisällä transfektio ryhmä, baareja merkitty samoilla kirjaimilla eivät eroa merkittävästi toisistaan; baareja merkitty eri kirjaimia poikkeavat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA, P 0,05). B. Solut transfektoimattomissa tai transfektoitu pcDNA3 tai d /nPPARγ altistettiin 10 uM osoitettua metaboliitin 3 päivää ennen määrityksiin lisääntymistä. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). Sisällä aineenvaihduntatuote ryhmä, baareja merkitty samoilla kirjaimilla eivät eroa merkittävästi toisistaan; baareja merkitty eri kirjaimia poikkeavat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA, P 0,05). C. Soluja inkuboitiin 0-1 uM PPARy-antagonisti, GW6692, 30 min ja 10 uM osoitetun metaboliitin ja 3 päivää ennen määrityksiin leviämisen. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM (N = 3 itsenäistä koetta). Sisällä aineenvaihduntatuote ryhmä, baareja merkitty samoilla kirjaimilla eivät eroa merkittävästi toisistaan; baareja merkitty eri kirjaimia poikkeavat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA, P 0,05). D. Solut transfektoimattomilla, transfektoitu ohjaus siRNA, tai transfektoitu SDC-1 siRNA altistettiin 10 uM osoitettua metaboliitin 3 päivää ennen määrityksiin lisääntymistä. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD (n = 4). Sisällä transfektio ryhmä, baareja merkitty samoilla kirjaimilla eivät eroa merkittävästi toisistaan; baareja merkitty eri kirjaimilla poikkeavat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA, P 0,05).

Keskustelu

Suurin osa PUFA oksygenaasit ja aineenvaihduntatuotteiden että ne tekevät näyttävät sidoksissa sen etenemisen eturauhasen syöpä, koska näiden metaboliittien edistää solujen tämän syövän proliferaatiota [15], [16], [21], [23], [24], [26], [27], [28], [ ,,,0],30], [34], [50], [51], [52], [53]. 15-LOX-2 ja sen aineenvaihduntatuotteet ovat erinomaisia ​​poikkeuksia tähän sääntöön: ne näyttävät liittyy tukahduttaminen eturauhassyövän osittain koska nämä metaboliitit estävät lisääntymistä [15], [19], [20], [22], [24] , [25], [26]. Perustuen niiden in vitro ja määräävän aseman 15-LOX-2 aineenvaihduntatuotteita, 15-HETE [24], [25], [26], [34], 15-hydroksi-eicostrienoic happo, ja 15-hydroksi-eikosapentaeenihappo [ ,,,0],35], [36] ovat ehdokas välittäjiä 15-LOX-2: n antiproliferatiivinen vaikutus. Kuitenkin alhainen teho näiden aineenvaihduntatuotteiden avulla, että tuotteet ovat peräisin muista PUFA saattaa olla voimakkaampi ja siksi tärkeämpi välittämisessä 15-LOX-2 vaikutus. Huomaamme, että jäsenet 17-sarjan DHA metaboliittien, 17-HpDHA, 17-HDHA, 7,17-diHDHA, ja 10,17-diHDHA, inhiboimaan androgeenista riippumaton (PC3 ja DU145) ja androgeeniriippuvaisissa (LNCaP) eturauhasen syöpäsoluja. Voimakkaimmat näistä, 17-HpDHA ja 17-HDHA, hidastuu merkittävästi proliferaatiota konsentraatioissa ≥1 ja 100 nM, vastaavasti, ja näin ollen ovat 1000-kertaa tehokkaampi kuin vastaava metaboliitit AA; ne näyttävät myös huomattavasti tehokkaampi kuin 15-LOX aineenvaihduntatuotteiden EPA ja GLA raportoitu [35], [36]. DHA metaboliitit selvästi toiminut rakenteellinen erityisellä tavalla osoituksena niiden ratkaisevasti erilainen yksittäisten tehot ja niiden suurempi tehojen kuin heidän kollegansa 15-sarjan AA aineenvaihduntatuotteiden. Toteamme, että toiminta 17-sarjan DHA aineenvaihduntatuotteiden täältä eivät sulje pois mahdollisuutta, että niiden vaikutukset mukaan niitä edelleen solun aineenvaihduntaan vieläkin voimakkaampi antiproliferatiivisia tuotteita. Olemme juuri alkaneet tutkia tätä asiaa.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että DHA estää leviämisen eturauhasen syöpäsolujen lukien PC3-soluissa polku, joka käsittää aktivoinnin PPARy, sitoutuminen PPAR SDC-1 promoottori induktio SDC-1, ja SDC-1: n indusoiman apoptoosin [12], [38]:

DHA aineenvaihduntatuotteet tutkittu tässä stimuloi PC3-solujen aktivoimiseksi PPARy reportteri, ilmaista SDC-1, ja aktivoi kaspaasi-3, mikä viittaa siihen ylimääräinen tärkeä askel tämän reitin eli aineenvaihduntaa DHA voimakkaampi välituotteita. Lisäksi PPARy-antagonisti, GW6992, d /nPPARγ ja SDC-1 hiljentäminen esti DHA aineenvaihduntatuotteiden ”antiproliferatiivinen toiminta; d /nPPARγ myös estänyt niiden induktio SDC-1. Metaboliitit käytetään siis samaa signalointireitin kuin DHA hidastaa leviämisen PC3-solujen. Tämä joukko havaintoja avautuu mahdollisuus, että antiproliferatiivista vaikutusta DHA välittyy ainakin osittain kautta metabolia 15-LOX-2 on 17-sarjan metaboliittien, erityisesti 17-HpDHA ja 17-HDHA. On kuitenkin useita ongelmia tämän järjestelmän.

Tutkimukset ovat eri mieltä siitä, pystyvätkö PC3-solujen aineenvaihdunta PUFA joidenkin löytää solut tee [26] tai hyvin vähän [23], [24] 13- HODE ja 15-HETE ja muut löytää ne tekevät huomattavia määriä 13-HODE [15], [16], mutta hieman 15-HETE [15], vaikka altistus suurille LA tai AA. Koska 15-LOX-1 haluaa LA AA, kun taas 15-LOX-2 mieluummin AA LA [14], [17], [18], [19], [20], nämä tulokset osoittavat, että PC3-soluja, ei ole lainkaan tai vain vähän 15-LOX-2 metaboloivien toiminnan tuloksena täysin yhteensopiva näkemyksen, että nämä solut ovat 15-LOX-1, mutta vähän tai ei lainkaan 15-LOX-2 viestiä ja proteiini [15], [24], [54]. Lisäksi suhteellinen kyky ja spesifisyys kahden ihmisen entsyymit käyttää DHA substraattina ei ole määritelty, vaikka 15-LOX-1 knock-down tutkimuksessa verkkokalvon pigmentti epiteelisolujen viittaa siihen, että 15-LOX-1, mutta ei 15- LOX-2 on vastuussa metaboloivien DHA 17-sarjan aineenvaihduntatuotteiden [55]. On selvää, että 17-sarjan DHA metaboliitit ovat erilaiset solutyypit, in vitro ja lukuisia kudostyypeissä in vivo [45], [55], [56], [57], [58]. Kuitenkin kyky pahanlaatuisia sekä normaalissa eturauhasessa solujen ja kudosten tehdä näitä aineenvaihduntatuotteiden ja osuus 15-LOX-1 versus 15-LOX-2 tähän ei tiedetä. Huomasimme, että PC3-solut altistettiin antiproliferatiivinen pitoisuus (eli 100 uM) DHA 0,5-96 h muuttaa vain hyvin pieniä määriä (alle 0,003%) ja sen 17-HDHA, 7,17-diHDHA, plus 10 , 17-diHDHA, kuten havaitaan selektiivinen ioni-seuranta-MS (julkaisemattomia tutkimuksia). Nämä määrät näyttivät riittämätön hidastaa leviämistä. Kohdatessaan nämä havainnot, voisi olla kannattavaa harkita muita keinoja, joilla eturauhasen syöpä saattaa joutua näiden aineenvaihduntatuotteita. Ihmisen eturauhassyöpä rinnastaa normaalin kudoksen. Tämä normaali kudos voisi tarjota 17-sarjan DHA aineenvaihduntatuotteiden toiminnan kautta 15-LOX-1, 15-LOX-2, tai P450 [59], [60]. 17-sarjan DHA aineenvaihduntatuotteet ovat myös läpi itsehapettumiselle [61]; viljellyt neuroblastoomasoluja, esimerkiksi aineenvaihdunta DHA 17-HDHA ja muiden sytotoksisten DHA johdannaiset kautta auto-oksidaation sekä 15-LOX-riippuvaisten reittien [56]. Yksi tai useampi näistä vaihtoehtoisista polkuja voi olla keino, jolla ravinnon n-3 PUFA lopulta toimimaan vähentää kuolleisuutta eturauhassyövän [31].

Yhteenvetona, olemme huomanneet, että sarjan 15-LOX- johdettu metaboliitit DHA, erityisesti 17-HpDHA ja 17-HDHA, ovat paljon tehokkaampia kuin vanhemman molekyyliä tai 15-LOX metaboliitit muiden PUFA inhiboimaan androgen positiivisia ja androgeenin negatiivisia ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. Samanlaisia ​​niiden emämolekyyliin, DHA aineenvaihduntatuotteiden ”toimintatapa perustuu PPARy /SDC-1 apoptoosia signalointireitin. Ehdotamme, että eturauhassyövän alentava vaikutus ravinnon DHA välittyy osittain muuntaminen DHA yhteen tai useampaan näistä metaboliiteista.

Kiitokset

sisältö käsikirjoituksen on yksinomaan vastuu kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Cancer Institute tai National Institutes of Health.