Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Etäpesäke on yleisin kuolinsyy eturauhassyövän potilailla. Kartoittaa erityisiä etäpesäkkeiden biomarkkereita ja uudet terapeuttiset tavoitteet pidetään olennaisena parantaa ennustetta ja hallinta taudin. MikroRNA (miRNA) muodostavat luokan koodaamattomasta pieni RNA-molekyylien katsotaan keskeisiksi sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen. Heidän säätelyhäiriötä on osoitettu rooli syövän puhkeamista, etenemisen ja etäpesäkkeiden ja miRNA tarjoavat lupaavan uuden luokan syöpä biomarkkereita. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää alas- ja ylöspäin säädelty miRNA eturauhassyövässä, joka voisi tarjota mahdollisia biomarkkereita ja /tai terapeuttisia kohteita eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

Methods

Seuraava sukupolvi sekvensointitekniikan levitettiin tunnistaa ilmennetty eri miRNA on transplantable metastaattinen vs. ei-metastaattinen eturauhassyöpäksenograftista linja, molemmat peräisin yhdestä potilaan ensisijainen syöpä. Ksenografteja kehitettiin kautta sisälsivät kapselin alle kapseli varttaminen syövän

kudos

osaksi NOD /SCID-hiiriin, menetelmän, joka pyrkii säilyttämään ominaisuudet alkuperäisen syöpien (esim kasvain heterogeenisyys, geneettiset profiilit).

tulokset

ilmentyvät eri tunnettu miRNA, isomiRs ja 36 novel miRNA tunnistettiin. Monet näistä miRNA (21/104) on aiemmin raportoitu osoittamaan samanlaisia ​​alas- tai ylössäätöä eturauhassyövissä suhteessa normaaliin eturauhasen kudosta, ja jotkut heistä (esim miR-16, miR-34a, miR-126 *, miR-145, miR-205) on liitetty eturauhassyövän etäpesäkkeiden tukemalla voimassaolon analyyttistä lähestymistapaa.

Johtopäätökset

käyttö metastaattisen ja ei-metastasoitunut eturauhassyöpä sisälsivät kapselin alle kapseli ksenografteissa peräisin yhdestä potilaan syöpä vuoksi on todennäköistä, että ilmennetty eri miRNA tunnistettu tässä tutkimuksessa sisällä mahdollisia biomarkkereita ja /tai terapeuttisina kohteina ihmisen eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

Citation: Watahiki A, Wang Y, Morris J, Dennis K, O’Dwyer HM, Gleave M, et al. (2011) MikroRNA Associated metastaattista eturauhassyöpää. PLoS ONE 6 (9): e24950. doi: 10,1371 /journal.pone.0024950

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 helmikuu 2011; Hyväksytty: 24 elokuu 2011; Julkaistu: 30 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Watahiki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Kanadan Institutes of Health Research (YZW /MG). YZW on saaja Overseas kiinalainen tutkija palkinnon National Natural Science Foundation of China (nro 30928027), ja vastaanottaja innovatiivisen Scholaria palkinnon International Cancer Alliance for Cancer Research ja koulutus sekä Fibrolamellar Syöpäsäätiön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miehillä ja toiseksi yleisin syy syöpäkuolemista Yhdysvalloissa [1]. Vaikka huomattavaa edistystä on tapahtunut hoidossa lokalisoitu, elimeen rajoittunut kasvaimet, eturauhassyöpä on tällä hetkellä parantumaton, kun se on edennyt etäpesäkkeitä, ja eniten kuolemantapauksia tästä taudista johtuvat etäpesäkkeitä jotka kestävät hyvin perinteisiin hoitoihin. Tällä hetkellä, eturauhasen antigeenin (PSA) on merkittävä seerumin biomarkkereiden osoittamiseen käytettävää ja seuranta eturauhassyövän etenemistä. Kuitenkin ennusteen arvioinnissa on lisääntynyt PSA-arvot on rajoitettu, koska edenneen eturauhassyövän voi liittyä hyvin alhainen tai normaali PSA-arvoja. Siksi tarvitaan pikaisesti uusia, tarkempia biomarkkereita, joita voidaan käyttää ennustamaan syövän etenemiseen omaan tai yhteistyössä nykyisen biomarkkereiden kuten PSA [2]. Lisäksi uusia terapeuttisia kohteita, jotka liittyvät eturauhasen syöpään etäpesäkkeitä tarvitaan kiireellisesti.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t (17-27 nukleotidin) negatiivisesti säätelemään kohdegeenien sitoutumalla 3′ alueet (UTR) mRNA ja estämällä käännöksen tai edistävät mRNA: n hajoamisen [3]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet häiriöstä miRNA ihmisen kasvaimissa osoittaa tehtäviä tällaisille molekyylien syövän synnyssä, kuten syövän puhkeamista, etenemisen ja etäpesäkkeiden [4], [5]. Tähän mennessä vain pieni osa on tutkittu miRNA ilmentyminen eturauhassyövässä, ja vain harvat ovat käsitelleet etäpesäke tämän taudin. Erot ilmaus profiilit miRNA toistaiseksi tunnistettu voi olla ennusteen arvioinnissa eri näkökohtia taudin ja ymmärtämään paremmin roolin miRNA kehittämisessä ja etenemisen eturauhassyöpä tarvitaan [6]. Lisätutkimuksia voi myös johtaa tunnistamiseen uusia miRNA jotka liittyvät nimenomaan eturauhassyövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Tällaiset etäpesäke liittyvä miRNA voivat toimia metastasoitunut biomarkkereita ja /tai uusia tavoitteita terapiassa etäpesäkkeitä.

tutkimuksen tarkoituksena on tunnistaa geneettiset tekijät keskeisten roolien eturauhassyövän etäpesäkkeiden ovat haittaa puute optimaalinen koemalleissa . Vaikka ksenograftimalleissa perustuu perustettu syöpäsolulinjoissa, jotka edustavat eri vaiheissa syövän etenemistä voi olla hyödyllistä tunnistaa mekanismit etäpesäkkeitä, ne eivät riittävästi jäljitellä sairauden kliinisen [7]. Ponnistelut ovat siksi keskittyneet käytöstä potilaiden eturauhassyövän

kudoksiin

. Kuitenkin tyypillinen heterogeenisyys näiden kudosten, johon sisältyy sekä ei-metastasoitunut ja mahdollisesti metastaattinen -alapopulaatioiksi, tekee vaikea tunnistaa tekijät, kuten geenit, jotka ovat Euroopan kehittäminen etäpesäkkeiden [8]. Lisäksi on vaikea saada metastaattisen eturauhassyövän kudoksia potilailta kokeellisiin tarkoituksiin, koska ne eivät rutiininomaisesti tai järkevästi koepala tai resektoitiin potilaista, ja nopea ruumiinavaus ohjelmat ovat erittäin kalliita ja vaikeita hallita. Poistaa edellä esteitä, olemme kehittäneet uuden sukupolven potilaasta peräisin eturauhassyöpäksenograftista malleja, jotka lähemmin muistuttavat kliinisestä tilanteesta, käyttämällä sisälsivät kapselin alle kapseli oksastus potilaiden syövän kudoksen immuunivajavaisissa hiirissä. Tämän menetelmän suosii säilyttäminen ominaisuuksien alkuperäisen syöpiä [9] – [11]. Lisäksi se on ollut mahdollista perustaa transplantable, metastaattinen ja ei-metastaattinen eturauhassyöpä alalinjoja epäyhtenäisestä ksenografteista [12], [13]. Käyttö metastaattisen ja ei-metastasoitunut ksenografteissa on jo ollut tehokas tunnistaminen eturauhassyövän etäpesäkkeiden liittyvien geenien [13].

Illumina n massiivisesti rinnakkaisen DNA sekvensointi synteesi tekniikka on laajalti hyväksytty seuraavan sukupolven sekvensointialustamme . Se tukee rinnakkaissekvensointijärjestelmät käytetään patentoitua palautuva terminaattori perustuva menetelmä, joka mahdollistaa havaitsemisen yhden emäkset koska ne sisällytetään kasvavaan DNA säikeitä. Fluoresoivasti leimattu terminaattori on kuvata, koska kutakin dNTP: tä lisätään, ja sen jälkeen lohkaistiin jotta sisällyttäminen seuraavan emäksen. Koska kaikki neljä palautuvia terminaattori-sidottu dNTP ovat läsnä jokaisessa sekvensointi syklin, luonnollinen kilpailu minimoi sisällyttäminen bias, mikä tosi base-by-base sekvensointi [14].

Tässä tutkimuksessa, Illumina seuraavan sukupolven sekvensointitekniikan käytettiin vertaamaan miRNA profiilit on transplantable metastaattinen vs. ei-metastaattinen eturauhassyöpäksenograftista linja, molemmat peräisin kautta sisälsivät kapselin alle kapseli varttaminen [10] – [12] yhden potilaan ensisijainen syöpä kudosta. Ilmentyvät eri tunnettuja ja uusia miRNA todettiin, että voi olla erityisiä rooleja etäpesäkkeitä eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Patient johdettuja eturauhassyöpä ksenograftimalleja

NOD /SCID-hiiriin käytettiin ksenografti kasvatettiin ja ylläpidettiin British Columbia Cancer Research Centre Animal Facility (Vancouver, Kanada). Kaikki koemenettelyn hyväksyttiin University of British Columbia Animal Care Committee (A10-0100). Eturauhassyöpätutkimuksessa Ohutsuolikoepala saatiin tällä BC Cancer Agency potilaan kirjallinen lupa. Eettinen hyväksyntä saatiin University of British Columbia – British Columbia Cancer Agency tutkimuseettiseltä (UBC BCCA REB # H04-60131).

perustaminen transplantable eturauhassyöpäkudoksen ksenografti- linjat kautta sisälsivät kapselin alle kapseli varttaminen on kuvattu aikaisemmin [9]. Esillä olevassa tutkimuksessa, Äskettäin valmistetusta metastaattinen eturauhassyöpäksenograftista linja, LTL-313H [15], ja ei-metastasoitunut vastine, LTL-313B (julkaisematon), käytettiin, joka oli peräisin eri lokusten yhden potilaan eturauhassyövän koepalan näyte (www.livingtumorlab.com). Molemmat linjat olivat PSA- ja AR-positiivisia esitetyllä kautta immunohistokemiallinen ([15]; julkaisematon data). Ne rutiininomaisesti ylläpidettiin munuaiskotelo miespuolisten NOD /SCID täydennetty testosteroni, kuten aiemmin on kuvattu [9]. LTL-313H ksenografteissa osoitti hyökkäyksen hiiren isännän munuainen ja syöpäsolujen havaittiin keuhkoissa isännät 3 kuukauden varttaminen. Sen sijaan LTL-313B ksenografteissa ei osoittanut selvää hyökkäys hiiren munuaisten ja eivät osoittaneet etäispesäkkeitä (tuloksia ei ole esitetty).

Small RNA kirjasto rakentamisen ja cDNA sekvensoinnin

LTL- 313H ja LTL-313B Ksenograftikudoksista kerättiin ja RNA uutettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Mississauga, oN, Kanada) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA toimitettiin Genome Sciences keskuksen British Columbia Cancer Agency (www.bcgsc.bc.ca) pienten RNA cDNA-kirjaston rakentaminen ja sekvensointi kuten aikaisemmin on kuvattu [16] pienin muutoksin. Jokainen kirjasto oli erityinen indeksi sekvenssin 5’adapteri, eli ”ACATCGA” varten LTL-313H kirjasto ja ”CGTGATA” varten LTL-313B kirjasto; molemmat kirjastot sekoitettiin ja järjestys ajettiin yhdessä virtauksen solun Illumina foorumi.

Pienet RNA kartoitus ja differentiaalikaavojen havaitseminen

5 ’indeksoitu cDNA-sekvenssejä käytettiin erottamaan alkuperä RNA: t. 3 sovitinmutteri sekvenssit poistettiin kaikista lukee ja ne Loput tunnisteet, jotka olivat 16-27 nukleotidin pituisia ja ilmaistu tag lasken 2 tai useamman kussakin kirjastossa käytettiin lisäanalyysiä. Leikattu sekvenssit kartoitetaan miRBase 15 ihmisen kantasolujen silmukan sekvenssit (https://www.mirbase.org/) käyttäen Novoalign (www.novocraft.com) ohjelma mahdollistavat jopa 3 epäsuhta. Ne, jotka täsmäsi miRBase järjestyksessä sitten ryhmitelty: 1) tiedossa kypsä miRNA ja miRNA *, 2) otaksuttu miRNA *, ei ole aiemmin raportoitu miRBase, 3) silmukka sekvenssit ja 4) sekvenssit, jotka vastasivat silmukka-sekvenssin kanssa, mutta ei ovat tiedossa kypsä sekvenssit. Sekvenssit vastaavat tunnetut miRNA olivat edelleen ryhmittyneet, joka perustuu niiden lähtökohdat, ja laskettiin. Runsain vaihtelu /alkuasentoon tunnisteita käytettiin vertailussa kirjastoja. Tag määrä normalisoitiin kokonaismäärä laskee ne sekvenssit, jotka vastasivat miRBase 15 varsi-silmukka-sekvenssit ja kahden kirjastot verrattiin ero sekvenssien ilmentämiseksi käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä, jossa Bonferronin korjausta. Sekvenssit katsotaan merkittävästi ilmentyvät eri kahden kirjastot, jos p-arvo oli 0,001 ja siellä oli ainakin 2-kertainen muutos sekvenssit ”normalisoitu määrä.

Novel miRNA tunnistaminen

sekvenssit, jotka eivät täsmänneet tiedetä miRNA kantasilmukan sekvenssit suodatettu pois tunnettujen selostukset sekvenssit ladata UCSC [17]. Tunnistaa uusia miRNA ehdokkaiden joukossa loput verraton sekvenssien miRanalyzer ohjelma [18] on käytetty (https://web.bioinformatics.cicbiogune.es/microRNA/miRanalyser.php). Tuotos ehdokkaat tarkastettiin yksitellen homologiaa tunnettuihin ei-koodaava RNA, ja ei-homologiset sekvenssit otettiin uusina miRNA ehdokkaita.

miRNA tavoite ennustus ja koulutusjakson analyysi

kohdegeenien kunkin ilmentyvät eri miRNA ennustettiin käyttämällä mikrokosmos versio 5 [19], [20], jonka kynnys on

p

= 0,001. Koska jotkut geenit mahdollisesti säätelevät sekä säädelty ja alassäädetty miRNA keskityimme analysoitava edelleen geenejä, jotka olivat mahdollisesti säätelee ainoastaan ​​säädellään ylöspäin tai alassäädetty miRNA. Tunnistaminen Kegg polkuja liittyvät mahdollisiin kohdegeenien suoritettiin käyttäen DAVID 6,7 (Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Lisäksi vertasimme kohdegeenin luettelot geenien ilmentyminen tietojen mikrosirulla määrityksessä käytetään samaa Ksenograftikudoksista tunnistaa ne otaksuttu tavoitteita, joita voidaan säädellä mRNA-tasolla.

Microarray geeniekspressioanalyysissä

RNA että käytettiin miRNA sekvensointia kirjastoa käytettiin myös mRNA-pohjainen geeniekspressioanalyysissä käyttäen Agilent Human GE 44K alustan Vancouverin Eturauhasen Centre Microarray Facility (www.mafpc.ca). Kaikki tiedot ovat MIAME yhteensopiva ja raakadataa on talletettu GEO (hakunumero GSE28029). Ilmaisu signaali muunnetaan z-pisteet ja lasketaan z-suhde ja mRNA: t, joissa on yli 1,96 z-suhde käsiteltiin säädelty ja alle -1,96 kuin alassäädetty [21]. Tiedot myös suodatetaan Flag.

Soluviljely

22Rv1 eturauhassyöpä-solulinjaa viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

miRNA edeltäjä transfektion

esiaste sekvenssi mir-486, esitetään miRBase, ja ei-äänenvaimennusjärjestelmiä negatiivinen kontrolli subkloonattiin pcDNA6.2-GW /EmGFP miR plasmidi (Invitrogen). 22Rv1 solut ympättiin 12 kuoppalevyillä tiheydellä 1,0 x 10

5 solua kuoppaa kohti, 24 tuntia ennen transfektiota. Transfektio suoritettiin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Transfektiotehokkuus oli vahvistanut GFP-signaalin seurantaan käyttämällä käännettyä fluoresenssimikroskooppia järjestelmä (Zeiss). Vahvista kohonneeseen kypsä kohde miRNA, osa transfektoiduista soluista käytettiin validointi kvantitatiivisen (qPCR). Tätä varten uutettiin kokonais-RNA käyttämällä miRNeasy mini -kittiä (Qiagen) ja määrä RNA määritetään nanodrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific). Osat (25 ng) kutakin kokonais-RNA-valmisteet käänteisfaasi-cDNA: ksi käyttämällä Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon) seuraten valmistajan ohjeita. CDNA laimennettiin ja sekoitettiin microRNA LNA PCR-alukkeet ja SYBR Green master mix (Exiqon). qPCR suoritettiin käyttäen ABIPrism 7900HT (Applied Biosystems) seuraten valmistajan ohjeita. ΔΔCT käytettiin laskettaessa kertaiseksi muuttuu suhteessa kontrolliin ja U6 käytettiin endogeenista ohjaus.

MTT-määritystä

Transfektoidut solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 1 x 10

4 solua /kuoppa. MTT-liuosta (20 ui 5 mg /ml) lisättiin viljelmiin (200 ui tilavuutta) ja 4 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa. Poistamisen jälkeen elatusaine, jäljellä olevat kiteet liuotettiin DMSO: hon ja absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin.

Migration /invaasiomääritys

BioCoat Matrigel invaasiota kammioiden (BD Biosciences) käytettiin mittaamaan kudoksen invasiivisuus soluja. Ylemmässä kammiot, 1 x 10

5 solua /kuoppa maljattiin 0,50 ml seerumia. Alakammioissa, 0,75 ml elatusainetta /10% FBS: ää on annettu. Kammiot inkuboitiin 30 tuntia 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Solut, jotka pysyivät ylempään kammioon poistettiin ja transmigrated solut kiinteän metanolissa ja värjättiin kristallivioletilla ja värjätään solut laskettiin mikroskooppisella analyysillä. Kasvainsolun invaasiota ilmaistiin prosentteina soluja, jotka oli läpäissyt Matrigel-päällystetyt kalvot suhteessa solujen määrä, joka oli läpäissyt päällystämättömän kalvoja (invaasio indeksi). Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Tulokset

miRNA sekvensointi ja merkintä

Small RNA: t eristettiin metastaattinen LTL-313H ja ei-metastasoituneen LTL-313B eturauhassyöpäkudoksen ksenografteissa ja käsitelty sallimaan syvän sekvensointi käyttäen Illumina alustan. Lukuoperaatioista adapterilla indeksi sekvenssit ”ACATCGA” ja ”CGTGATA” annettiin LTL-313H alkuperä ja LTL-313B alkuperää, vastaavasti. Yli 10000000 yhteensä lukee saatiin kullekin kirjastojen. Nämä lukee olivat verrattuna sekvenssin tietojen miRBase 15 microRNA Sequence Database. Sillä metastaattinen ja ei-metastaattinen eturauhassyöpä kudoksen kirjastot, 3.445.642 ja 2.272.677 tunnisteet, tässä järjestyksessä, oli kokonaan kartoitettu ihmisen miRNA varsi-silmukka-sekvenssien läsnä miRBase tietokannassa (taulukko 1). Täysin sovitettu lukee oli selityksin, niiden asema varsi-silmukka rakenne. Siirtyminen enintään 2 tukikohdat alkaa ja päättyy asemissa annettiin sekvensseille voidaan selityksin kuin

isomeerien

tunnettujen kypsä miRNA (isomiRs). Kokonaismäärät tiedetään miRNA plus miRNA * s Metastasoituneessa ja ei-metastasoitunut kirjastot olivat 447 ja 509, vastaavasti (taulukko 1). Pisimmälle ilmaisivat miRNA (ja isomiR) oli miR-148a kanssa yhteensä syytettä 270801 ja 763877 lukee per metastasoituneen että ei-metastasoituneen kirjastoja, vastaavasti. Kun isomiRs ryhmiteltiin käyttäen samaa lähtöasentoon, MIR-148a pysyi runsain miRNA ei-metastaattinen kirjasto yhteen laskettu 846468, kun taas metastaattisen kirjastossa miR-21 oli runsain joiden yhteen laskettu 310102 .

miRNA ja miRNA * ilmaisuja

miRBase, miRNA johdettu edeltäjä on nimetty miRNA, valtaosaltaan ilmaisi käsivarteen, ja miRNA * vähemmän ilmaisi, vastapäätä käsivarteen. Jos molemmat kädet ovat samalla ilmaistaan, niitä kutsutaan 5p ja 3p aseita. Ilmaus tunnetaan miRNA on eturauhassyöpäksenografteissa oli yleensä korkeampi kuin miRNA * s. Useissa tapauksissa miRNA * s (joka tunnistetaan miRBase) olivat ilmaisseet kuin vastaavat miRNA (taulukko 2). Näin miR-144 * oleellisesti enemmän ilmaistiin kuin miR-144 sekä metastasoituneen että ei-metastasoituneen kirjastot; Samoin miR-126 * oli enemmän ilmaistiin kuin miR-126, mutta vain ei-metastasoitunut kirjasto. Eroja havaittiin myös ilmaisua malleja 3p ja 5p varsi miRNA (taulukko 2). 3P käsivarret miR-28 ja miR-339 osoitti korkeampi ilmaisuja kuin vastaava 5p aseiden metastaattisen linjan, kun taas ne osoittivat pienempi ilmaisuja kuin vastaava 5p aseiden ei-metastasoitunut linja. Vuonna metastaattinen linja, miR-542 osoitti ajan sääntelyn 3p varren mutta alas-sääntely 5p käsivarteen. Fragmentit, jotka olivat vastineita tunnettujen kypsä miRNA, mutta se ei ollut aiemmin ilmoitettu miRBase tietokantaan, nimettiin ”otaksuttu novel miRNA *” lajit (taulukko 3). Yhteensä 32 tällaisen oletetun miRNA * s havaittiin esittää vähintään kaksi lukee toinen kirjastot. Jotkut näistä miRNA * s osoitti myös korkeampia ilmaus kuin niiden vastaavia miRNA, esim miR-1277 * ja miR-1307 *.

Novel miRNA ehdokkaita

Yksi etu hyödyntää sekvensseriohjelmasta lähestymistapa miRNA profilointi on mahdollisuus tunnistaa uusia miRNA tai miRNA * s. Tätä varten käytimme miRanalyzer, joka on microRNA havaitseminen ja analysointi työkalu [18], yhdistettynä homologiahakujen tunnistaa tunnettuja selostukset, mukaan lukien ei-koodaavat RNA: t (esim, rRNA, tRNA, jne.). Käyttämällä miPred ohjelmisto erottaa todelliset ennalta miRNA muista hiusneula sekvenssit vastaavia varsi-silmukkaa [22], tunnistimme 36 novel miRNA ehdokkaita. Niiden sekvenssit, kromosomi sijainnit ja lukumäärä lukee metastaattisen ja ei-metastaattinen kirjastoja on esitetty taulukossa 4 ja taulukossa S1. Vertaileva analyysi kahdesta kirjastojen osoitti merkittäviä ero kuvaamaan joitakin näistä uusia miRNA, kuten alassäädetty miR-5680-3p ja miR-5681a-3p.

Mahdolliset etäpesäke liittyvä miRNA

Vertaileva metastaattisen ja ei-metastasoitunut vierassiirrettä miRNA kirjastot paljasti yhteensä 104 differentiaalisesti ilmaisi miRNA tai miRNA * s 55 alassäädetty ja 49 säädellään ylöspäin etäpesäkkeisessä linjan (taulukko 5,6,7). Niistä alassäädetty miRNA, 24 miRNA osoitti 5-kertainen pieneneminen, joista neljä miRNA eli miR-205, miR-503, miR-708 ja miR-2115 *, jotka olivat havaittavissa Metastasoituneessa linjaa. Kaksi miRNA, eli miR-24-2 * ja miR-101 *, osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä yhden pohja-shift muodossa. Yhden base-shift muoto miR-203 osoitti jonkin verran lisääntynyt ilmentyminen Metastasoituneessa linjan suhteessa viite miR-203, kun taas ei-metastasoitunut line se osoitti alempaa ilme. Niistä säädellään ylöspäin miRNA, 23 miRNA osoitti 5-kertainen muutos normalisoitu laskee. Yhden base-shift muotoja miR-9 *, miR-148B * ja miR-1246 osoitti suurempi ilmaisua kuin lomakkeet sekä metastasoituneen että ei-metastasoituneen linjat.

Jotkut differentiaalisesti ilmaisi miRNA on aiemmin liittynyt eturauhassyövän, eturauhassyövän etäpesäkkeiden tai etäpesäke muiden syöpien (taulukko 5,6,7). Niistä alassäädetty miRNA useita on raportoitu alassäädetty eturauhassyövässä suhteessa hyvänlaatuinen eturauhasen kudosten eli miR-16 [23] – [25], miR-24 [26] – [28], asennuspalveli- 29a [26], miR-145 [23], [24], [27], [29], [30], ja miR-205 [24], [31], [32]. Alas-säätely miR-16 [25], miR-34a [33], miR-126 * [34], miR-145 [35] ja miR-205 [36] korreloi kehittämiseen eturauhassyövän etäpesäkkeiden. Niistä säädelty miRNA (Metastasoituneessa kirjasto), miR-210 on raportoitu olevan säädellään ylöspäin eturauhaskarsinoomien suhteessa BPH näytteitä [23] ja miR-301 on yhdistetty eturauhassyövän etäpesäkkeiden [37]. Joissakin tapauksissa miRNA jotka havaittiin olevan säädelty esillä olevassa tutkimuksessa on raportoitu olevan joko säädellään ylöspäin eturauhaskarsinoomien verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta [38] – [40], tai alassäädetty [23], [24], [27] – [29]. Lisäksi jotkut ilmentyvät eri miRNA on raportoitu olevan rooli etäpesäkkeiden muiden syöpien, esimerkiksi säädelty miRNA, anna-7i, miR-9, miR-30a, miR-125b, miR -142-5p, miR-151-3p, miR-450a ja alassäädetty miRNA, miR-24, mir-145, miR-146b-5p, miR-185, miR-186, miR-203 ja miR-335 .

Oletetut kohdegeenien differentiaalisesti ilmaisi miRNA

ensimmäisessä vaiheessa tunnistamisessa miRNA mahdollisten merkitys metastaattisen prosessin tunnistimme otaksuttu kohdegeenien jokaiselle differentiaalisesti ilmaisi miRNA käyttämällä mikrokosmos analyysi, tavoite ennustus ohjelma tietyn algoritmin ja kattavuus miRNA, mukaan lukien lajikkeet tähden aseita; kynnys

p

-arvo = 0,001 pidettiin saada luotettavampia kohde tunnistaminen (Microcosm) [41]. Putatiiviset kohdegeenien tunnistettiin 49 pois 55 alassäädetty miRNA ja 47 ulos 49 sääteli miRNA (taulukko S2); ne selityksin käyttäen DAVID ohjelmaa. Oletetun kohdegeenien alassäädetty miRNA liittyi erilaisia ​​Kegg reittejä, mukaan lukien ”Fc-gamma R-välitteistä fagosytoosia” ja ”ECM-reseptorin vuorovaikutusta (taulukko S3). Sillä otaksuttu kohdegeenien sääteli miRNA, väyliä kuten ”Pathways syövän”, ”Focal tarttuvuus” ja ”puriinimetabolia” havaittiin.

vertailu oletettujen miRNA kohdegeenien geeneillä differentiaalisesti ilmaistut metastaattista ja ei-metastasoitunut vierassiirrettä linjat

Vaikka miRNA arvellaan muuttaa proteiinin tasoja, ne ovat joissakin tapauksissa osoitettu myös vaikuttaa mRNA tasolla [3]. Ottaen huomioon tämän, kaksi ksenografti linjat tutkittiin ero mRNA: n ilmentymisen. Kuten alla olevasta taulukosta S4, 622 mRNA: t olivat alassäädetty ja 348 mRNA: t olivat säädelty Metastasoituneessa linjaa. Jotkin geenit tunnistaa ero mRNA ilmaisu oli potentiaalisesti kohdistettu sekä ylä- ja alassäädetty miRNA. Ottaen huomioon tämän, lisäanalyysi rajoitettiin geenejä, jotka mahdollisesti kohdistetaan joko säädelty tai alassäädetty miRNA. Ryhmä, joka näkyi säädelty mRNA: t liittyvät vain alassäädetty miRNA koostui 85 mRNA: iden; ryhmä, joka osoitti alassäädetty mRNA: t liittyvät vain säädelty miRNA koostui 58 mRNA: iden. Niistä mRNA: t säädellään ylöspäin etäpesäkkeisessä linja, jotkut on raportoitu olevan rooli kudosinvaasio ja /tai etäpesäkkeiden erilaisia ​​syöpäsoluja, kuten mRNA: n suhteellinen

FSCN1

[42],

VEGFA

[43]

FGFR1

[44],

ADAMTS1

[45],

CCL2

[46] ja

VIM

[47 ] geenejä. Samoin mRNA: t alassäädetty Metastasoituneessa linjan, kuten mRNA: t ilmaistaan ​​

CTGF

[48] ja

SERPINB5

[49] geenejä, on todettu olevan alassäädetty eri metastaattisen syöpien, todistetaan luotettavuutta analyysit (taulukko S5).

Lisääntyvät kypsän miR-486 transfektoiduissa soluissa

24 tunnin kuluttua transfektion 22Rv1 solujen pcDNA6.2-GW /EmGFP-mir486 tai pcDNA6.2-GW /EmGFP-säätelysekvenssi, yli 90% soluista havaittiin olevan GFP-positiivisten. MIR-486 edeltäjä oli asianmukaisesti käsitelty kypsän miR-486 muodossa kuten on osoitettu qPCR. Suhteessa kontrolliin, ekspressiotasot sekä miR-486-5p ja -3p varret olivat 11,6 kertaa suurempi, mikä osoittaa, että suurin osa soluista ilmaistuna kohonnut miR-486 tasolla.

invasiivisuuden miR-486- transfektoidut 22Rv1 solut

leviämisen määrä miR-486-transfektoidut ja kontrollisekvenssin-transfektoiduissa soluissa oli samanlainen kuten on esitetty MTT-määritystä (Fig. 1A). Kuitenkin miR-486-transfektoiduissa soluissa osoitti kasvua noin 85%: kudoksessa invasiivisuuden suhteessa kontrolliin solut (Fig. 1 B). Vaikka tämä tulos on rajatapaus merkitys (

p

= 0,08), se osoittaa, että lisääntynyt ilmentyminen miR-486 parantaa kudoksen invasiivisuus.

A) Kuten MTT: llä, ei ollut merkittävää eroa välillä kasvu miR-486-transfektoitujen solujen ja kontrollisolujen yli 72 tunnin ajan. B) Tissue invasiivisuus, mitattuna Matrigel invaasio, Mir-486 transfektoiduissa soluissa ja ohjaus soluja. Tiedot on ilmaistu prosentteina invasiivisuus ± S.D. ja osoittavat lisääntynyt invasiivisuus Mir-486-transfektoiduissa soluissa (85%;

p

= 0,08).

Keskustelu

MikroRNA ovat sekaantuneet säätelyyn geenin ilmentymistä at transkription jälkeisellä tasolla lähes kaikissa biologisen tapahtuman, ja on yhä enemmän näyttöä siitä, että muuttuneen ilmauksia tiettyjen miRNA ovat mukana kehittämässä ja etenemisen syöpien [4], [5]. Käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi pienten RNA tunnistamiseen, tässä tutkimuksessa tarkoituksena oli selvittää ilmentyvät eri tunnettuja ja uusia miRNA metastaattisessa vs. ei-metastasoituneen eturauhassyöpävieraslajisiirteissä että voisi olla rooli etenemisen eturauhasen syövän metastaattisen muotoon. Transplantoitavissa syöpä linjat, joita käytettiin näyttävät olevan erittäin sopiva tarkoitukseen, koska ne olivat peräisin yhdestä potilaan syöpä ja siten hallussaan yhteistä geneettistä taustaa. Lisäksi ne oli kehitetty kautta sisälsivät kapselin alle kapseli varttaminen syövän

kudos

osaksi NOD /SCID-hiiriin, menetelmän, joka pyrkii säilyttämään tärkeitä ominaisuuksia alkuperäisen syöpien (esim kasvain heterogeenisyys, geneettiset profiilit) [9] – [11], [50]. Kuten hyvin, ylläpito kasvainlinjojen samantyyppistä siirteen päällä (munuaiskapseleiden alla) varmisti, että niiden kasvu ei merkittävästi vaikuta mikro-ympäristön eroja, jotka voivat olla merkittävä vaikutus syövän kehitykseen [51]. Samoin samantyyppistä siirrännäisen päällä minimoisi eroja miRNA tuotannon isäntäsolujen läsnä ksenografteissa. Vaikka on osoitettu, että ksenografti voi muuttaa ilmaus miRNA [52], meidän tutkimus keskittyi pääasiassa eroista miRNA välillä Hyväksytty näytteiden ja nämä erot saattavat siis olla todellisia. Yhdessä saadut tiedot tässä tutkimuksessa olisi hyödyllistä rajaaminen miRNA onkogeenisella ominaisuuksia, jotka ovat mukana kehittämässä eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

ylin lukee kaksi RNA kirjastot havaittiin asennuspalveli- 148a. Ilmaisu Tämän miRNA on androgeeni-indusoituva LNCaP-soluissa [53]. Tämä viittaa siihen, että suhteellisen korkea ilmentyminen miR-148a löytyy kaksi kirjastoissa on seurausta testosteronin täydentämistä eläimiä.

104 miRNA, joiden todettiin olevan alas- tai ylöspäin-säännelty metastaattinen eturauhassyöpäksenografteista suhteessa niiden ei-metastasoituneen kollegansa, 39 oli aiemmin raportoitu olevan osallisena eturauhassyövän (taulukko 5,6,7). Nämä raportit perustuvat enimmäkseen vertailujen miRNA ilmaisujen eturauhassyöpäkudoksille ja normaalissa eturauhaskudoksiin määrittelemättä metastaattista kykyä pahanlaatuinen näytteitä. On etua, että 21 39 miRNA osoitti alas- tai ylöspäin-asetusten metastaattisen ksenografteissa, jotka vastasivat, joita on raportoitu eturauhasen syövän kudoksissa (suhteessa hyvänlaatuinen kudokset), mikä viittaa siihen, että nämä eturauhassyöpäkudoksille on voinut olla metastaattinen kyky. Niistä miRNA todettu alassäädetty Metastasoituneessa ksenografteissa, miR-16, joka esittää 17-kertaisesti alentunut ilmentyminen, on raportoitu olevan alassäädetty eturauhassyövässä [23], [24] ja on etäpesäke alentava toiminto. Lisäksi metastaattisen eturauhassyövän kasvua

in vivo

voitiin estää systeemisesti synteettistä miRNA-16 [25]. Pelkistetty ilmaus miR-34a Metastasoituneessa ksenograftissa linja on yhdenmukainen sen ilmoitetaan eston eturauhassyövän etäpesäkkeiden [33]. Alempi ilmentyminen miR-126 * hyväksyy raporttien mukaan miRNA säätyy alas eturauhassyövässä etäpesäkkeiden [34] ja että ektooppinen ilmentyminen miR-126 * esti muuttoliike ja invasiivisuus eturauhassyöpäsolujen [34]. Jälkimmäinen esimerkki miRNA * pelissä rooli tuumorisuppressorina. Mielenkiintoista, miR-126, joka on miRNA raportoitu alassäädetty eturauhassyövässä suhteessa normaaliin eturauhasen kudosta [54], oli säädelty Metastasoituneessa ksenograftin linja.