PLoS ONE: DNA Metylointi-ohjattu ennustaminen Clinical Epäonnistuminen riskialttiista Eturauhasen Cancer
tiivistelmä
Background
Eturauhassyöpä (PCA) on hyvin heterogeeninen sairaus suhteessa kliiniseen tulokseen. Tässä tutkimuksessa selvitettiin ero DNA-metylaation a priori valitun geenin diagnosoida PCa ja ennustaa kliininen vajaatoiminta (CF) korkean riskin potilailla.
Methods
kvantitatiivinen multiplex, metylaatiospesifistä PCR-määritys kehitetty arvioimaan promoottori metylaatio
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2
ja
WR
geenien for- maliini- kiinteä, parafinoidut kudosnäytteitä 42, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu ja eturauhasen näytteitä potilaista, joilla korkean riskin PCa, joka kattaa koulutuksen ja validointi kohortteja 147 ja 71 potilasta, vastaavasti. Log-rank testejä, yhden ja usean Cox malleja käytettiin tutkimaan ennusteen arvioinnissa DNA metylaatio.
Tulokset
hypermetylaatiota
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2
ja
WR
oli erittäin syöpää erityisiä. Kuitenkin vain
GSTP1
metylaatio merkitsevästi yhteydessä CF sekä riippumaton korkean riskin PCa ikäryhmät. Tärkeää on, trichotomization osaksi matala, kohtalainen ja korkea
GSTP1
metylaatio taso alaryhmiä oli erittäin ennustavan CF. Potilaat, joilla on joko alhainen tai korkea
GSTP1
metylaatio tasolla verrattuna kohtalainen metylaatio ryhmiä, oli suurempi riski CF sekä koulutukseen (Riskisuhde [HR], 3,65; 95% CI, 1,65 8,07) ja validointi sarjaa (HR 4,27; 95% CI, 1,03-17,72) sekä yhdistetyn kohortissa (HR, 2,74; 95% CI, 1,42-5,27) in monimuuttujamenetelmin.
Johtopäätökset
luokittelu ensisijaisen korkean riskin kasvainten kolmeen alatyyppiä perustuen DNA: n metylaatio voidaan yhdistää kliinis-patologinen parametrit informatiivisempi riski-kerrostuminen näistä PCa potilaista.
Citation: Litovkin K , Van Eynde A, Joniau S, Lerut E, Laenen A, Gevaert T, et ai. (2015) DNA Metylointi-ohjattu ennustaminen Clinical Epäonnistuminen riskialttiista Eturauhassyöpä. PLoS ONE 10 (6): e0130651. doi: 10,1371 /journal.pone.0130651
Academic Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta
vastaanotettu: 29., 2014; Hyväksytty: 25 toukokuu 2015; Julkaistu: 18 kesäkuu 2015
Tämä on avoin pääsy artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 julkisuuteen omistautumista
Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.
Rahoitus: Tätä työtä tukivat Säätiö Fournier-Majoie (FFM ), Industrial Research Fund of KU Leuven (IOF-HB 07/04 ja IOF-HB /12/011), ja Belgian National Cancer Plan (Action 29_023). DNAlytics SA tuettiin muodossa palkkojen tekijöille [PG ja TH], mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.
Kilpailevat intressit A GB patentti, jonka otsikkona on” markkerigeeni perustuu ennusteeseen eturauhassyövän ”, on jätetty kuningaskunnassa etuoikeuspäivä 27 tammikuu 2014 (GB1401371.8), ja AVE, KL ja MB kuin keksijät. TH on toimitusjohtaja ja Pierre Gramme pääasiallinen analyytikko DNAlytics, SA (Chemin du syklotronia 6, 1348 Louvain-la-Neuve, Belgia). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.
Johdanto
Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, laajamittaisessa täytäntöönpanossa seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) testaus on johtanut dramaattinen kasvu eturauhassyövän diagnoosia (PCA) [1]. Kuitenkin monet PSA-diagnosoitu kasvaimet ovat kliinisesti merkityksettömiä. Vain noin neljännes, joilla on vasta diagnosoitu PCa katsotaan olevan suuri riski sairastua kuolemaan johtava sairaus, joka ilmenee Clinical Failure (CF) ja syöpään liittyvä kuolema (CRD) [2-4]. Mukaan European Association of Urology (EAU) ja National Kattava Cancer Network (NCCN) suuntaviivat, nämä korkean riskin PCa potilaita määritellään kliiniseen vaiheeseen ≥T3a, biopsia Gleason pisteet 8-10 ja /tai seerumin PSA 20 ng /ml [5,6]. Kuitenkin 62-84% korkean riskin PCa potilaat kokevat syöpää erityisiä säilymisen vähintään 15 vuoden kuluttua eturauhasen (HE), jotka osoittavat, että kaikki potilaat eivät tässä ryhmässä on huono ennuste [7]. Tämä heterogeeninen kliininen tulos sisällä korkean riskin ryhmä on mahdollisesti selittyy käyttää riskien kerrostuminen mallit eivät ota huomioon taustalla (epi) geneettiset ja molekulaariset ominaisuudet kasvaimen jotka määräävät läsnäolo micrometastases. Siksi yksi tärkeimmistä haasteista nykyajan PCa tutkimus on tunnistaa biomarkkereita, jotka parantavat ennustamista CF ja CRD. Parempi luonnehdinta potilaille, joilla on korkean riskin PCa molekyylitasolla pitäisi mahdollistaa entistä henkilökohtainen lääketiede, yhteensovitus hoito intensiteetti taudin aggressiivisuutta ja odotettavissa ennustetta. Tähän mennessä ei ole olemassa vakiintunutta lääketieteellistä syytä käyttää molekyyli- ennustelaitteet.
Nyt on hyvin tunnettua, että molemmat mutaatiot ja epigeneettiset muutokset, erityisesti ero DNA: n metylaatio, osansa karsinogeneesis- [8]. DNA: n metylaatio, joka esiintyy pääasiassa sytosiinijäännöksiä sekvenssin yhteydessä CpG dinukleotideille tapahtuu eri alueilla genomissa, eli promoottori CpG-saarekkeiden (promoottori liittyvä CpG-tiheä alueet), promoottori CpG Island rannoilla (alue alemman CpG tiheys lähellä CpG island), geeni elimet ja toistuvat sekvenssit [9]. Aikuisen ihmisen genomin useimmat CpG: t ovat metyloidut, lukuun ottamatta promoottorin CpG rannoilla ja saarilla. On yleisesti hyväksyttyä, että PCA liittyy muutos näistä kuvioista, kattaa genominlaajuisten hypometylaatio sekä promoottori-specific hypermetylaation [8-12]. Globaali hypometylaatio havaitaan monissa genomista loci, kuten toistuvia elementtejä ja geeni elimiä, edistää genomiin epävakautta ja väärä transkription vihkimyksiä, vastaavasti. Promoottori liittyvä hypermetylaation liittyy geenien ja edistää PCa etenemisen vaiennettaisi kasvaimeen synnyssä [8,13]. PCA, eri hypermetyloitunut geenit on tunnistettu, jossa
GSTP1
ollessa useimmin muuttunut ja tutkittu [13].
Tässä tutkimuksessa pyrittiin kehittämään luotettava kvantitatiivinen määritys samanaikaisesti määritetään promoottori metylaatiotasoilla a priori valitun PCa-kytkettyjen geenien
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
WR
ja
PTGS2
, ja arvioida niiden diagnostisia ja ennusteen arvioinnissa suuririskisille PCa potilaista [13].
Materiaalit ja menetelmät
potilaille ja näytteiden keräämistä
potilaat, joilla on korkea -risk PCa valittiin perusteiden mukaisesti hyväksymien EAU ja NCCN eli kliiniseen vaiheeseen ≥T3a, biopsia Gleason pisteet 8-10 ja /tai PSA-arvot 20 ng /ml [5,6]. Formaliinifiksoidusta, parafinoidut (FFPE) normaalissa eturauhasessa ja PCa kudokset saatiin yliopistollisen sairaalan Leuven (UHL, Leuven, Belgia) ja University Hospital Würzburgin (UHW, Würzburg, Saksa). Tällä UHL näytteet on saatu, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH, n = 42) tai korkean riskin PCa (pCA2, n = 71). Näytteitä korkean riskin PCa potilaat saatiin myös UHW (PCa1, n = 147). Preoperatiivinen lavastus molemmissa kohorteissa sisältyi eturauhasen, joka on abdominopelvic-tietokonetomografia (CT) skannaa ja luukuvaus. Neoadjuvant hormonaalista, säteilyä tai kemoterapiaa olivat poissulkuun. Staging ja luokittelu eturauhassyöpänäytteissä (koko vuori kohdat, 4 mm: n välein) suoritettiin mukaan vuoden 2002 TNM luokittelu ja Gleason pisteytysjärjestelmä, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Seuranta suoritettiin 3 kuukauden välein 2 ensimmäisen vuoden ajan leikkauksen, 6 kuukauden välein seuraavien 3 vuotta, ja sen jälkeen vuosittain. CF julistettiin kun joko paikallisen uusiutumisen tai kaukaisia etäpesäkkeitä oli histologisesti todettu tai vahvistanut CT tai luukuvaus. Kliinis-patologinen ominaisuudet kaikkien kohortteja on kuvattu taulukossa 1. Niistä potilaista PCa1 ja pCA2 ikäluokat, 84% ja 21%: lla, sai adjuvanttia hoidot (sädehoidon ja /tai hormonihoito). Tutkimuksen hyväksyi Medical Ethics komission yliopistollisen sairaalan Leuven. Jälkimmäinen luvan suorittaa tätä retrospektiivinen tutkimus ilman tietoista suostumusta, koska vain arkistoidaan PCa näytettä (jääneeseen FFPE lohkoa) käytettiin. Kaikki näytteet analysoitiin anonyymisti.
Soluviljely
Ihmisen eturauhasen PC-3 (CRL-1435, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA), LNCaP ( ATCC, CRL-1740) ja DU 145 (ATCC HTB-81) soluja viljeltiin yksikerrosviljelminä 50% Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) ja 50% Hamin F12, RPMI1640 ja DMEM, vastaavasti, johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia . PZ-HPV-7-solut (ATCC, CRL-2221), joka on kuolemattomaksi solulinja on johdettu normaalista ihmisen eturauhasen soluja, viljeltiin keratinosyyttien-seerumittomassa väliaineessa, johon oli lisätty 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää ja 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutteella. Hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu BPH-1-solut ystävällisesti professori J. Swinnen (KU Leuven, Belgia) ja pidettiin RPMI 1640 + 10% vasikan sikiön seerumia [15].
DNA: n eristämiseksi ja bisulfiitti muuntaminen
Kokoveri ihmisen genomista DNA ostettiin Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA. Solulinjoista genominen DNA uutettiin käyttäen GenElute Mammalian Genominen DNA Purification Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). BPH kohortin, genominen DNA uutettiin kokonaisuudessaan parafiini osassa, käyttäen WaxFreeTM DNA Kit (TrimGen, Sparks, MD, USA). Sekä PCa ikäluokat, FFPE lohko suurin kasvaimen alueelle haettiin, ja alueet 90% syöpäkudoksen, joka sisältää sekä kasvain epiteelin ja kasvaimeen liittyvien stroomasolujen, leimasi samalla uro-patologi ja myöhemmin macrodissected. Eristäminen genomisesta DNA: sta suoritettiin seuraavasti standardi fenoli-kloroformi- menettelyä. Seuraavaksi genominen DNA (~ 500 ng) kustakin näytteestä oli bisulfiitti-muunnettava EZ DNA metylaatio Kit (Zymo Research Corp., Orange, CA, USA) valmistajan protokollan, ja eluoitiin 25 ul: H
2O .
metylointi-riippumaton (MI) PCR ja kloonaus
MI aluketta, jotka sisältävät korkeintaan yhden CpG lähellä 5′-päätä oli suunniteltu monistamaan 100-200 emäsparin (bp) fragmenttien ympärille transkription aloituskohdasta on
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2
ja
WR
(taulukko A S1 File , kuvassa A S1 File). MI-PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Sen jälkeen monistetut fragmentit kloonattiin kompetentteihin DH5a-soluihin (Invitrogen Ltd, Paisley, UK), käyttäen pGEM-T Easy Vector System (Promega Corporation, Madison, WI, USA) ja noin 4 pesäkettä valittiin satunnaisesti ja analysoitiin dideoksinukleotidisekvensoinnilla. Plasmidit, jotka sisältävät DNA-inserttejä, jotka vastaavat täysin metyloitu (johdettu LNCaP tai PC-3-soluja) tai metyloimattomia (johdettu ihmisen kokoveri) promoottorialueet jälkeen bisulfiittikonversion, merkitään plasmidit pM ja pU, vastaavasti, valittiin jatkokäyttöä varten on toisen vaiheen määrällisten multiplex metylaatiospesifinen PCR (QM-MSP) määritys [16].
QM-MSP-määritys
QM-MSP-määritys kehitettiin määrittää promoottorin metylaatiotilaa
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2
ja
WR
(kuvassa A S1 File). Yksityiskohtainen protokolla on kuvattu [15], ja kaikki alukesarjoista määritellään taulukon A S1 File. Lyhyesti, ensimmäisessä PCR-reaktiossa seos validoitu geenin alukkeita käytettiin yhteistyössä monistamiseen promoottorit
GSTP1
,
CCND2
,
WR
,
PTGS2
ja
APC
geenejä riippumattomia metylaatiostatuksen (MI alukesarjoista taulukossa A S1 File). Sen varmistamiseksi, että QM-MSP voidaan käyttää hyvin hajanainen DNA: ta, joka on usein ongelmallista eristetty DNA FFPE kudoksesta, multiplex-alukkeita suunniteltiin monistamaan PCR-fragmenttien ≈ 100-200 bp. Toisessa PCR-reaktiossa, absoluuttinen määrällisesti metyloitua ja metyloimattomien DNA-fragmenttien erikseen suoritettu kullekin geenin kanssa validoitu kvantitatiivinen metyloitu ja metyloitumaton spesifisiä alukkeita (MSP ja USP alukkeita sarjaa vastaavasti taulukossa A S1 File, kuva B S1 File). Lopuksi, laskea% ja DNA: n metylaation määrä kokonais-DNA oli peräisin summa metyloidun ja metyloitumattoman DNA: n (U + M). Vain näytteet, jotka sisältävät 3000 geenin kopioita jälkeen esivahvistusta hyväksyttiin kvantifiointiin kuvatulla [16]. Metylaatio
GSTP1
,
APC
ja
CCND2
kvantifioitiin vuonna 147 ja 70 näytteitä PCa1 ja pCA2 kohortteja, vastaavasti.
PTGS2
kvantifioitiin vuonna 147 ja 66 näytteitä ja
WR
146 ja 66 näytteitä PCa1 ja pCA2 kohortteja vastaavasti.
immunohistokemia
FFPE kohdat kohortti pCA2 värjättiin on BOND MAX Autostaineriin (Leica). Lyhyesti, parafinoidut leikkeitä ensin vaha, ja antigeeni haku suoritettiin BOND epitooppi-haku ratkaisua 1 (Leica). Hiiren monoklonaalinen 3F2 anti-GSTP1 (1: 2000, 3369) ja kanin monoklonaalinen anti-ERG (1: 100, ab92513) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA) ja Abcam (Cambridge, UK), tässä järjestyksessä. Objektilasit analysoitiin valomikroskoopilla, tarkistetaan ja sai jota uropathologist, Mukaan Allred menetelmällä [17]. Allred pisteet on puolikvantitatiivinen järjestelmä, jossa otetaan huomioon osuus positiivisten solujen (0-5) ja värjäyksen voimakkuuden (asteikolla 0-3). Osuus ja intensiteetti pisteet laskettiin yhteen, jolloin saadaan yhteensä tulokset 0, 2-8. Pistemäärä 0-2 katsottiin negatiiviseksi, kun taas 3-8 otettiin myönteinen [17].
Tilastollinen
BPH kohortti käytettiin määrittämään perustason metylaatiotasoilla kaikille DNA metylaatio markkereita. Vastaanotin-käyttöjärjestelmän-ominaisuudet (ROC) analyysi, herkkyys, spesifisyys, ja positiivinen /negatiivinen ennustearvo määritettiin MedCalc for Windows, versio 12.5 (MedCalc Software, Ostend, Belgia). Yhdistyksen välinen metylaatio (jatkuva muuttuja) ja kliinis-patologinen parametrit (Gleason pisteet ja patologinen vaihe), ERG ja GSTP1 immunovärjäyksin ja strooman sisältöä tutkittiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä (kaksi luokat) tai Kruskal-Wallisin testi ( yli kahteen ryhmään). Fisherin tarkkaa testiä käytetään yhdistyksen kahden kategorinen muuttujaa. Korrelaatioita metylaatio erilaisten geenien arvioitiin Pearsonin korrelaatiokerroin (
r
).
luokittelu DNA: n metylaatio riskien-luokitus perustui Coxin malleihin. Toiminnallinen suhde laajuus DNA: n metylaation ja time-to-tapahtuman tulokset (CF) selvitettiin vertaamalla lineaarinen suuntaus toisen asteen ja kuutio-kiilat suoritettavien toimintojen avulla uskottavuusosamäärä [18]. Yksi tai kaksi cut-off-arvot määritettiin tapauksessa epälineaarisuus. Ensimmäinen raja-arvo on määritetty ottamalla huomioon kaikki mahdolliset dichotomizations, kun taas toinen määritettiin vahvistamalla ensimmäinen jaksotuksen ja otetaan huomioon kaikki mahdolliset trichotomizations. Sekä malli fit (todennäköisyys) ja kliinistä tulosta per datajoukon pidettiin lopullisessa valinnassa näiden raja-arvot.
riskin eroavaisuuksiin metylaatio ryhmien analysoitiin yhden muuttujan Coxin malleja ja log-rank-testi . Tulokset on esitetty avulla riskisuhde (HR) ja niiden 95% luottamusväli (CI), ja graafinen esitys, jonka piirtämällä Kaplan-Meier. Coxin monimuuttuja analyysit käytettiin suunnittelemaan kliinis-patologisten mallien kanssa ja ilman metylointi markkereita. Ennustavan tarkkuus Molempien mallien arvioitiin avulla Concordance todennäköisyysarvio (CPE), AUC-kuin indeksi aika-tapahtumatiedot, jossa arvot ovat välillä 0,5 (no ennustearvo) ja 1 (täydellinen ennustearvo) [19 ]. Sen varmistamiseksi, että mitatut CPE on toistettavissa out-of-näytteen potilaista, toistuva satunnainen alinäytteenotto ristivalidointi käytettiin. Kategorisointi DNA: n metylaation edellä kuvatun ja painojen Coxin malli viritettiin koulutusta sarjaa ja arvioidaan vastaavan testin sarjaa. Suoritimme 200 satunnaisesti jakaa kohortin osaksi 80% opetusjoukolla ja 20% Koepakettia. Analyysit suoritettiin käyttäen SAS-ohjelmiston, versio 9.2 for Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).
P
-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
metylointi viiden markkerigeeneihin ihmisen eturauhasen solulinjoissa ja kokoveren
geenispesifistä alukepareja suunniteltiin monistamaan CpG saarilla promoottorialueen
GSTP1
,
APC
,
WR
,
CCND2
, ja
PTGS2
, riippumatta niiden metylaatiostatuksen (taulukko A S1 File). Amplification näiden lokusten suoritettiin natrium-bisulfiitin muunnettu eristetyn genomisen DNA: 5 ihmisen eturauhasen solulinjoissa, mukaan lukien kolme PCa (LNCaP, PC-3 ja DU 145) ja kaksi hyvänlaatuinen (PZ-HPV-7 ja BPH-1) solulinjat ja genomista DNA: ta eristettiin ihmisen kokoveren syöpää vapaa henkilö. DNA bisulfiitti sekvensointi Näiden kloonattujen fragmenttien mukaan lähes kaikki CpG dinukleotideissä metyloitiin LNCaP ja /tai PC-3 syöpäsolujen linjat, mutta ei hyvänlaatuinen solulinjoissa ja verta (kuvassa A S1-tiedosto
APC
). Seuraavaksi QM-MSP viiden valitun geenin kehitettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät jaksossa, ja suoritetaan näiden kuuden genotyypit (taulukko 2). Kaikki geenit olivat täysin metyloitu (≥99% metylaatio) hormoneja herkkiä LNCaP mukaisesti meidän bisulfiitin sekvenointitulosten ja aiemmat tutkimukset [20]. Hormoneja tulenkestävän solulinjoissa PC-3 ja DU 145, DNA: n metylaatio tasot olivat vähemmän näkyvästi, koska vain kaksi geeniä (
APC
ja
PTGS2
) oli 100% metyloitu PC- 3 linja, kun taas yksikään geenien oli täysin metyloitu DU 145 soluja. DNA: n metylaatio ei-pahanlaatuisia genotyyppejä mukaan lukien BPH-1, PZ-HPV7 ja kokoveren, ei havaittu
GSTP1
,
WR
,
PTGS2
,
CCND2
, ja
APC
geenilokukset, paitsi
CCND2
BPH-1, joka oli 13% metyloituja.
Cancer erityiset DNA: n metylaatio korkean riskin PCa
Seuraavaksi promoottori metyloinnin
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2
ja
WR
oli määrällisesti FFPE eturauhasen kudosnäytteitä käyttäen QM-MSP menettely. Näytteet olivat peräisin höyläysleikkaus tai adenomectomy yksilöitä 42 BPH-potilaille ja eturauhasen yksilöitä 218 potilasta, joilla on suuri riski PCa. PCA potilaat kuuluivat kahteen ryhmään, lisäksi merkitty sillä PCa1 tai koulutuksen kohortti (
n
= 147) ja pCA2 tai validointi (
n
= 71) kohortti. Vuonna BPH kohortin keskimääräinen metylointi taso näistä markkerigeeni ei ylittänyt 2% (kuvio 1, taulukko B S1 File). Kuitenkin paljon suurempi CpG metylaation havaittiin kaikkien geenien sekä korkean riskin PCa ikäluokat, mikä viittaa syöpään erityinen metylaation valitun markkereita (kuvio 1, taulukko C ja D S1 File). Metylointi sulku arvo 1 tai 2%,
GSTP1
osoitti korkeinta herkkyyttä PCa1 (0,99) ja pCA2 (0,97) ikäluokat kello spesifisyys 1,00 viiden yksittäisen markkereita (taulukko E S1 File ). Muut yhdistelmät markkerimuotoja ei entisestään parantaa herkkyyttä heikentämättä spesifisyyttä (taulukko E S1 File). Arvioidaan tarkemmin tarkkuutta erotteleva korkean riskin PCa BPH, vastaanotin-käyttöjärjestelmän ominaisuudet (ROC) analyysi kunkin yksittäisen merkkiaineiden suoritettiin ja käyrän alapuolinen alue (AUC) laskettiin (kuvio 1). AUC: t vaihtelivat 0,85 (
PTGS2
) 0,99 (
GSTP1
), vahvistaa syöpää erityisiä metylaation, jossa
GSTP1
Metylointia paras luokittelija.
metylaatio
WR
,
GSTP1
,
APC
,
CCND2
ja
PTGS2
määritettiin QM-MSP in eturauhasen näytteissä 42 potilaalla on BPH ja 147 (PCa1) ja 71 (pCA2) potilailla, joilla on korkean riskin PCa. Tiedot näkyvät dot käyriä osoitti geenien (A-E, vasen kaavioita). Metylaatiotasoilla jokaisen geenin kussakin PCa kohortin olivat huomattavasti korkeammat kuin BPH ryhmässä, määritettynä Mann-Whitneyn U-testi (*, P 0,001). Vastaanotin-toiminta-(ROC) analyysi Metylointilaitteistoon markkereita erottaa BHP riskialttiisiin eturauhassyöpänäytteissä (A-E, keski, PCa1 ja oikea, pCA2), käyttäen tiedot näkyvät pistekuvioita suoritettiin. Harmaa viiva, mediaani; AUC, käyrän alla.
Metylointi heterogeenisyys korkean riskin PCa
Metylointi taso kaikkien yksittäisten geenien vaihteli 0%: sta ~ 80%, mikä viittaa valtava muun ja kasvaimensisäisellä molekyyli epäyhtenäisyys korkean riskin eturauhasen kasvaimia (kuvio 1). Koska DNA uutettiin alueilla 90% syöpäkudoksen, joka käsittää sekä kasvain-epiteeli- ja kasvaimeen liittyvien stroomasolujen, meillä on semi-määrällisesti stroomaan sisällön kudokset pCA2 kohortin ja analysoitiin korrelaatio
GSTP1
DNA: n metylaatio. Strooman pitoisuus vaihteli 10%: sta 35% kahden harha 40 ja 60% (taulukko F S1 File). Mikä tärkeintä, ei korrelaatio löytyi
GSTP1
DNA: n metylaation ja strooman sisältöä, analysoituna Spearman (
P
-arvo, 0,1550), Kruskal-Wallisin ja Fisherin tarkka testit (taulukko G S1 File), mikä osoittaa, että ero strooman sisältö ei ole perimmäinen syy väliselle ja kasvaimensisäisellä heterogeenisuus DNA metylaatio. Siksi meidän tiedot ovat sopusoinnussa ajatus, että on olemassa suuri välinen ja kasvaimensisäisellä heterogeenisuus korkean riskin PCa DNA-metylaatio tasolla.
Mielenkiintoista, ranking potilaiden koulutuksen ja validointi ikäryhmien mukaan metylaatio taso
GSTP1
, useimmin metyloitu markkerigeeni, huomasimme, että metylaatio taso muut 4 markkereita yleensä noudattivat samaa kaavaa molemmissa kohorteissa (kuvio 2A). Lisäksi parvikuvio analyysit välillä metyloinnin
GSTP1
ja muiden geenien (kuvio 2B ja kuvio C S1 File) paljasti, että kasvaimia, joita ei metyloitu
APC
,
CCND2
,
PTGS2
tai
WR
, olivat usein metyloitu
GSTP1
, jossa tasot vaihtelevat -5 70%. Kuitenkin, jos kasvaimia hypermetyloitunut osoitteessa
APC
,
CCND2
,
PTGS2
tai
WR
, niiden metylaatio aste oli yleisesti ottaen verrannollinen
GSTP1
metylaatiotasoilla. Nämä löydökset tukevat erittäin merkittävä positiivinen Pearsonin korrelaatiokertoimet metylaatiotasot näistä merkeistä (
r
= ,45-0,82;
P
0,001; taulukko H S1 File). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että metylaatio viidestä geenien on kohtalaisen korreloi voimakkaasti ja todennäköisesti tapahtuu samoissa soluissa.
Väri-skaalattu esitys DNA: n metylaation kasvaimissa päässä PCa1 ja pCA2 ikäryhmät. (EN) potilaat määrättiin niiden
GSTP1
metylaatio arvo. Että% metylaation muut 4 markkerigeenin on myös esitetty. Harmaa laatikot osoittavat puuttuvat arvot. (B) sirontakaavioissa korrelaatio
GSTP1
metylaatio ja
WR
metylaation PCa1 (vasen paneeli) ja pCA2 (oikea paneeli) ikäryhmät.
Promoottori hypermetylaation versus kliinis-patologisten parametrien
väliset korrelaatiot metyloinnin geenilokuksissa, patologinen vaiheessa (pT), ja Gleason (GS) arvioitiin kummassakin PCa ikäryhmät. Mikään markkereita osoitti merkittävää yhteyttä pT, joka luokiteltiin neljään ryhmään (pT2, PT3A, pT3b ja pT4). GS, data jaettiin ryhmiin alhainen (GS2-6), keskitason (GS7) ja korkea laatu (GS8-10). Mediaani metylaatiotasoilla näiden ryhmien on annettu taulukossa 3. Perustuen Kruskal-Wallisin ja Mann-Whitney U-testejä, yksikään markkereita liittyi merkittävästi GS sekä ryhminä (taulukko 3 ja Taulukko I S1 File). Pairwise vertailu GS ryhmien kävi ilmi, että vain
PTGS2
metylaatio oli lisääntynyt GS8-10 ja GS7 verrattuna GS2-6, vuonna PCa1 (taulukko I S1 File).
APC
ja
WR
metylaatioita olivat vain huomattavasti suurempi GS7 verrattuna GS2-6, vuonna pCA2 (taulukko I S1 File).
GSTP1
metylaatio ennustaa kliinistä epäonnistuminen korkean riskin PCa potilaat
Seuraavaksi olemme tutkineet suhde laajuus merkki metylaation ja kliinisten vika, käyttäen Cox malleja [21]. Kliiniset vika julistettiin kun joko paikallisen uusiutumisen tai kaukaisia etäpesäkkeitä oli histologisesti todettu tai vahvistanut CT tai luukuvaus. Mitään merkittävää lineaarinen suhde välillä havaittiin kunkin viiden geenien ja CF. Koska se on vakiintunut, että biomarkkereita, kun sitä sovelletaan kliinisesti, usein kaksijakoinen, käytimme cox malleja valitsemiseksi optimaalisen cutoffs kunkin yksittäisen merkkiaineiden [22]. Yhden ja usean Cox regressioanalyysi osoitti, että dichotomization perustuva
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2
tai
WR
metylaatio oli vain korreloi merkitsevästi CF yhdessä kohortin, mikä osoittaa, että se on kliinisesti merkityksetön (taulukko J S1 File). Olemme kuitenkin huomanneet, että
GSTP1
metylaatio oli merkittävää liittyy CF PCa1 ja pCA2 kun eri cutoffs käytettiin, eli 15% ja 50%, vastaavasti (taulukko J S1 File). Siksi tutkimme kliininen tulos useiden
GSTP1
metylaatio alaryhmiä. Korkean riskin kasvainten luokiteltiin kolmeen ryhmään, jotka perustuvat
GSTP1
metylaatio tasolla, eli alhainen metylaatio (LM, metylaatio 15%), kohtalainen metylaatio (MM, metylaatio 15-50%) ja korkea metylaatio (HM, metylaatio 50%). Potilaat, joilla on joko alhainen tai korkea metylaatio, verrattuna kohtalainen metylaatio ryhmiä, oli merkittävästi suurempi riski CF koulutuksessa PCa1 kohortti, mikä näkyy yhden muuttujan Coxin regressioanalyysiä (taulukko 4; HR 2,96; 95% CI, 1,38 -6,36;
P
-arvo 0,005). Tämä lisääntynyt riski on validoitu pCA2 kohortin (taulukko 4; HR, 3,34; 95% CI, 1,03-10,89;
P
-arvo 0,045) sekä yhdistetyn kohortin (taulukko 4; HR, 2,59; 95% CI, 1,38-4,87;
P
-arvo 0,003). Lisäksi, yhden muuttujan Coxin regressioanalyysiä preoperatiivisen PSA, GS ja pT paljasti, että vain GS oli merkittävä ennustaja kliiniseen epäonnistumiseen sekä ryhminä (taulukko 4). Prognostisia voima GS näissä ikäryhmät on sopimuksia useiden aiempien tutkimusten [14,23,24].
edelleen tukevat käsitystä, että trichotomization korkean riskin PCa potilaat perustuu niiden
GSTP1
metylaatio paranee ennustuksen kliinisistä tuloksista, selviytyminen todennäköisyydet kullekin ryhmälle näytettiin käyttäen Kaplan-Meier koealojen (kuvio 3). Tämä analyysi paljasti merkittävän erotuksen kaarteissa sekä koulutukseen (log-rank testi,
P
-arvo 0,014) ja validointi (log-rank testi,
P
-arvo 0,043) kohorttien sekä yhdistetyssä kohortissa (log-rank testi,
P
-arvo 0,006) (kuvio 3A, 3C ja 3E). Vertailu LM + HM ja MM ryhmät paljasti, että yli puolet korkean riskin PCa potilaat luokiteltiin MM alaryhmä ja oli paljon parempi CF-elinaika PCa1 (log-rank testi,
P
-arvo 0,007) ja yhdistetty ryhmä (log-rank testi,
P
-arvo 0,002). Kuitenkin tämä ero oli rajatapaus, että pCA2 kohortti (log-rank testi,
P
-arvo 0,062).
Käyrät osoittavat CF-elinaika potilaiden alhaisesta (LM, 15%
GSTP1
metylaatio), kohtalainen (MM, 15-50%
GSTP1
metylaatio) ja korkea (HM, 50%
GSTP1
metylaatio) ryhmien PCa1 (A), pCA2 (C) ja PCa1 + 2 (E). Vertailu CF elinaika välillä MM ja LM + HM ryhmien PCa1 (B), pCA2 (D) ja PCa1 + 2 (F) on myös esitetty. CF, kliininen vajaatoiminta;
P
, log-rank-testi
P
-arvo.
P
-arvo, log rank -testi.
On tärkeää, että trichotomized
GSTP1
metylaation tullut itsenäisesti ennusta CF korjattuna pT, lopullinen GS, ennen leikkausta PSA sekä koulutukseen (taulukko 4; HR, 3,65; 95% CI, 1,65-8,07;
P
-arvo 0,001) ja validointi kohortteja (taulukko 4, HR, 4,27; 95% CI , 1,03-17,72;
P
-arvo 0,046), sekä yhteisessä kohortin (taulukko 4; HR, 2,74; 95% CI, 1,42-5,27;
P
-arvo 0,003 ). Muista testata muuttujien vain GS ilmennyt myös itsenäisenä ennustaja CF sekä yksi- ja yhdistetyn ikäryhmät. Täten DNA: n metylaatio on ennusteita riippumattomia GS korkean riskin PCa.
Seuraavaksi vertasimme ennustearvo mallin CF, mukaan lukien kaikki kliinis-patologisten parametrit, ja ilman trichotomized
GSTP1
metylaatio, avulla Concordance estimaatit (CPE) [19]. Suorituskyky toimenpiteet paranivat merkittävästi sisällyttämällä
GSTP1
metylaation kliinisessä mallia sekä ikäluokat (taulukko 5). Siten tarkkuus ennustavia malleja CF perustuu kliinis-patologinen parametreja voidaan edelleen parantaa sisällyttämällä trichotomized
GSTP1
metylaatio malli.
metylointi-ohjattu riski-ositus potilailla, joilla on korkean riskin PCa
Koska selviytymisen analyysit osoittivat, että potilailla, joilla on joko alhainen tai korkea
GSTP1
metylaatio ovat suurempi riski CF kuin ne, joilla on kohtalainen
GSTP1
metylaatiotasoilla, selvitimme metylaation tason muut 4 testattu merkkiaineita näissä alaryhmissä. Ensin kerrostunut potilaiden koulutuksen, validointi ja yhdistetty kohortteja kolmeen ryhmään, eli alhainen (alle 15%), kohtalainen (15% -50%) ja korkea ( 50%) metylaatio, jonka ranking ne mukaan
GSTP1
metylaatio tasolla (kuvio 4A). Kun tiedot kaikkien viiden markkerigeeni yhdistettiin, mediaani metylointi arvot LM ryhmissä ei ylittänyt 6% ja, lukuun ottamatta muutamia vieraita havaintoja, absoluuttiset arvot olivat alle 25% sekä yhden ja yhdistetyt kohortteja (kuvio 4B -4D). Tämä on yhdenmukaista korkeita Pearsonin korrelaatiokertoimet (taulukko H S1 File) ja ehdottaa, että vain pieni osa soluista LM kasvaimia metyloitu markkerigeenin. Sen sijaan mediaani metylointi arvot markkeri geenien MM /HM ryhmät täyttänyt 18/45% (harjoitussetti), 28/50% (validointi set) ja 25/50% (yhdistelmän), tässä järjestyksessä.