Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä maailmanlaajuisesti. Tiedetään vain vähän roolista ensisijainen värekarvojen preinvasive ja invasiivisen eturauhassyövän. Kuitenkin, vähentynyt cilia ilmentyminen on havaittu ihmisen syövissä, mukaan lukien haiman syöpä, munuaissolukarsinooma, rintasyöpä, kolangiokarsinooma, ja melanooma. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia luonnehtia ensisijainen värekarvojen ilmaisun preinvasive ja invasiivisen ihmisen eturauhasen syöpä, ja tutkimaan korrelaatio ensisijaisen värekarvojen ja Wnt signalointireitille. Ihmisen eturauhasen kudoksia edustaja vaiheissa eturauhasen syövän muodostumisen (normaalin eturauhasen, eturauhasen intraepiteelisen neoplasia (PIN), ja invasiivisia eturauhassyövän (mukaan lukien hermoa hyökkäys)) värjättiin värekarvojen proteiineja. Taajuus ensisijainen värekarvojen määritettiin. Pieneneminen prosenttiosuus Värekarvallinen solujen PIN, kohdunkaulan syöpä ja hermoa invaasio vaurioita havaittiin verrattuna normaaliin. Cilia pituudet mitattiin myös epäsuorasti testaa toimivuutta. Värekarvojen oli lyhyempi PIN, syöpä, ja hermoa invaasio vaurioita, mikä viittaa toimintahäiriöön. Ensisijainen cilia on osoitettu tukahduttaa Wnt-reitin. Lisääntynyt Wnt signalointi on osallisena eturauhasen syöpä. Siksi tutkimme korrelaatiota menetys ensisijaisen värekarvojen ja lisääntynyt Wnt signalointia normaalissa eturauhasessa ja preinvasive ja invasiivisen eturauhassyövän. Tutkimaan Wnt signalointia meidän kohortin sarja kudosleikkeiden värjättiin β-kateniinin mittana Wnt signalointia. Nuclear β-kateniinin analysoitiin ja Wnt signalointia todettiin olevan suurempi YK-Värekarvallinen solujen normaalissa eturauhasessa, PIN, osajoukko invasiivisia syöpiä, ja hermoa hyökkäystä. Tuloksemme viittaavat siihen, että värekarvojen toiminta perustuu yleensä tukahduttaa Wnt-signalointireitin epiteelisoluissa ja jotka värekarvojen menetys voi olla rooli kasvoi Wnt signalointia joissakin eturauhasen syöpiä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että värekarvojen ovat vahingollisia ihmisen eturauhassyövän, ja lisätä Wnt signalointia tapahtuu osajoukko syöpiä.

Citation: Hassounah NB, Nagle R, Saboda K, Roe DJ, Dalkin BL, McDermott KM (2013 ) Ensisijainen Cilia menetetään Preinvasive ja invasiivinen eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (7): e68521. doi: 10,1371 /journal.pone.0068521

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 30 toukokuu 2013; Julkaistu: 02 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Hassounah et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Science Foundation of Arizona (https://www.sfaz.org), Cancer Biology Training Grant (NIH, T32CA009213), Arizona yliopisto Cancer Centerin Support Grant (NIH, P30CA023074), jossa R00 (NIH- NICHD, R00HD056965); ja parempi kuin koskaan Foundation (https://azcc.arizona.edu/outreach/bte). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ensisijainen cilium on mikrotubuluksiin-pohjainen organelliin, joka työntyy solukalvon ja toimii aivan kuten ”antenni” aistia solunulkoisia signaaleja. Ensisijainen värekarvat ovat yleensä liikkumattomia mutta aistii fysikaalisia ja kemiallisia signaaleja. Solut, joilla on primaarinen värekarvojen on vain yksi cilium ulottuu solun pinnalla. Juuressa ensisijaisen cilium on pohjapinta elin (tunnetaan myös äidin keskusjyvänen), joka on ankkuroitu solukalvoon. Pohjapinta kehon ydintyy mikrotubulusverkon nippuja, jotka ulottuvat ylös cilium (kuvio 1A). Satoja proteiineja on tunnistettu, jotka muodostavat ensisijaisen cilium [1]. Monet näistä proteiineista lokalisoituvat cilium säädellä sensorisen tai signalointitoiminto ensisijaisen cilium. Cilia toimivat kuten antenneja kautta tunnistava solunulkoisia signaaleja ja auttaa säätelemään solusignalointia; Esimerkiksi ensisijainen cilia ovat negatiivisia säätelijöitä Wnt-reitin [2,3]. Erityisesti ensisijainen cilia kostuta Wnt signalointia vastaus compartmentalizing Wnt signalointia proteiinien, kuten positiivisena säätelijänä Jouberin [3]. Cilia on osoitettu rooli kehitysbiologian ja ihmisten sairauksia tunnetaan ciliopathies (esim Joubert oireyhtymä (JBTS), PKD (PKD), Bardet-Biedlin oireyhtymä (BBS), ja nefronoftiisi (NPHP)) [4].

Kuvia (A) normaalissa eturauhasessa ja (B) invasiivisen eturauhassyövän. Sarjatuotantona vieressä Objektilasit värjättiin H pienempi tai yhtä suuri kuin 25

persentiilin normaalille kudosta). Tilastot suoritettiin käyttäen lineaarista regressiota (*** = p 0,001) (C, alhaalla). Prosenttiosuus potilaista, joilla epänormaalin korkea prosenttia värekarvojen (Q4, oranssi) tai poikkeuksellisen alhainen prosenttia värekarvojen (Q1, sininen). (D) Prosenttia Ki67 positiivisia invasiivisen syövän solujen ja hermoa hyökkäys syöpäsolujen potilasta kohden (x-akseli) versus prosenttia Värekarvallinen syöpäsolujen saman potilaan (y-akseli). Tilastollinen analyysi oli epäparametrinen spearman korrelaatio.

Cilia myös olla syy rooli kasvainten synnyssä [5,6]. Hiirimalleissa osoittavat, että joissakin yhteyksissä värekarvojen tarvitaan edistämään syövän kun taas muissa ympäristöissä menetys värekarvojen lisää kasvaimen esiintymistiheys. Alennettu cilia ilme on havaittu ihmisen syövissä kuten haimasyövän, munuaissolukarsinooma, rintasyöpä, kolangiokarsinooma, ja melanooma [7-11]. Nämä tutkimukset tukevat olettamusta, että ensisijainen värekarvojen voi toimia tuumorisuppressorina organelle joissakin kudoksissa. Menetys ensisijainen värekarvojen osoitettiin edelleen premaligni haiman intraepiteliaalisten neoplasia, mikä viittaa siihen, että cilia menetys ehkä tapahtua aikaisin, jotta haimasyövän muodostumisen [10].

taajuus ja toimivuutta ensisijainen värekarvojen preinvasive ja invasiivisia ihmisen eturauhassyöpä ei ole tarkasti tunnettu. Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä ja kuudenneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien miehillä maailmanlaajuisesti. Kanoninen Wnt-signalointireitin on liitetty ihmisen eturauhassyöpä, mutta rooli tämän reitin eturauhasen syöpä ei täysin ymmärretä. Nykyinen tutkimus on suunnattu luonteenomaiset ensisijaisen värekarvojen taajuuden ja toiminta ihmisen eturauhasen syöpä ja tutkia korrelaatio ensisijaisen värekarvojen ilmaisun ja Wnt signalointia. Osoitamme, että ensisijainen värekarvojen taajuutta laski kaikissa vaiheissa eturauhasen syöpä, varhaisesta preinvasive vaurioiden invasiivisia vaiheissa. Ensisijainen cilia pituudet ovat myös vähentyneet preinvasive ja invasiivisen eturauhassyövän, mikä viittaa toimintakyvyn menetystä. Olemme lisäksi osoittaa, että värekarvojen puuttuminen korreloi lisääntynyt ydinvoiman β-kateniinin lokalisointi normaalissa eturauhasessa ja ydinvoiman β-kateniinin on yliaktiivista PIN, osajoukko eturauhasen syöpiä, ja hermoa invaasio alueilla.

Materiaalit ja menetelmät

Human kudosnäytteiden

Kaikki formaliinilla kiinnitetyt parafinoidut kudosnäytteitä saatiin Tissue hankinta ja Cellular /Molecular Analysis Shared Service (TACMASS) yliopistossa Arizona Cancer Center. Eturauhasen kudosnäytteitä hankittiin potilailla, joille tehdään avoin radikaali prostatectomies vuodesta 2006 vuoteen 2009. Kudos vain yksi potilas oli hankittu höyläysleikkaus eturauhasen. Eturauhasen kudosta, kaikkiaan 32 korttelin päässä 25 tapausta valittiin perustuen läsnä kiinnostuksen kohteisiin, jotka tunnistettiin patologi katsomalla arkistoitu hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,1 ng /ml kahden peräkkäisen mittauksen. Valikoima aika välillä leikkauksen ja viimeisen seurannassa on 10 kuukautta 16 vuoteen. Patologisesti normaali, syöpä-free eturauhasen kudosten 10 potilasta käytettiin verrokkeina ja saatiin potilailla, joilla on virtsarakon syöpä, joille on tehty cystoprostatectomies.

Serial kudos leikattiin kunkin potilaan näytteestä. Ensimmäinen sarja osassa värjättiin H n = 8), eturauhasen intraepiteelinen neoplasia (PIN; n = 24), huonolaatuisen PIN (LG PIN; n = 13) ja korkea-asteen PIN (HG PIN; n = 18), matala-asteista (LG; Gleason summa pisteet = 6; n = 35) ja korkea-asteen syöpiä (HG; Gleason summa pisteet 6; n = 40), ja hermoa invaasio vauriot (n = 18). Kaikki kudostyypeistä otettiin radikaali prostatectomies, lukuun ottamatta patologisesti normaalin eturauhasen kudosta virtsarakon syöpäpotilailla (nämä olivat peräisin cystoprostatectomies). Seitsemän potilasta oli sekä LG (lisääntynyt ydinvoiman-to-sytoplasman suhde, ja lisääntynyt ydinvoiman koko) ja HG (läsnäolo näkyvä nucleoli, lisääntynyt ydinvoiman-to-sytoplasman suhde, ja lisääntynyt ydinvoiman koko) PIN. Gleason summa pisteet on luokitusmenetelmä käytetään arvioimaan erottelua [12].

Immunofluoresenssikoe

Kudos dia sarja H 25

persentiilin -1.5X kvartiiliväli, tai 75

persentiilin + 1.5X kvartiiliväli (avoimet ympyrät). Äärimmäinen harha määriteltiin joko 25

persentiilin -3x kvartiiliväli, tai 75

persentiilin + 3X kvartiiliväli (myydään ympyrät). Hyödynsimme saadut noin prosentin värekarvojen ja värekarvojen pituus löytyy normaalissa eturauhasessa perustaa sulku antamaan suhteellinen vertailu pisteen värekarvojen löytyy PIN ja syövän näytteitä. Ylempi ja alempi 25

th persentiilit valittiin suhteellista normaali cutoffs ja tämä pidettiin yhdenmukaiset koko analyysimme. Vuodesta boxplots prosentuaalinen potilaita, joilla on epänormaali prosenttia Värekarvallinen solujen tai epänormaali mediaani värekarvojen pituus laskettiin. Nämä epänormaalit mittaukset määritelty 75

th ja 25

th prosenttipisteet normaalista. Arvoja pidettiin epätavallisen suuri, jos ne laskivat yli 75

persentiilin normaalin ja epänormaalin alhaiset, jos ne laskivat tai sen alapuolella 25

persentiilin normaalista. Ei tiedetä mitään tarkkoja pituuksia värekarvojen tarvitaan normaalia toimintaa. Siksi meidän ylempi ja alempi 25

persentiilin sulku antaa vain viitekehyksen verrattuna normaaliin.

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta parafinoidut kudoksen diat värjättiin samanlaisella protokollaa käytetään immunofluorescently värjättyä dioja kuvattu edellä. Antigeeni haku suoritettiin, kuten on kuvattu, mutta jossa Vector antigeenin naamiointiryhmän Ratkaisu (1: 106) (Vector Laboratories, Cat # H-3300), jota seuraa sammutus endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus huoneen lämpötilassa 20 minuutin ajan käyttäen vetyperoksidia metanolissa (0,3% ). Objektilasit pestiin sitten PBS: lla (4 x 10 min), laitetaan Shandon peitelevyjen (Thermo Scientific, Cat # 72-110-017) ja sitten Sequenza Työnnä telineet (Thermo Scientific, Cat # NC0263065). Objektilasit blokattiin sitten 2,5% normaalia hevosen seerumia estopuskurilla (Vector Laboratories, Cat # S-2012) 20 minuutin ajan, ja sitten ChemMate Vasta-ainelaimennuspuskuri (Ventana Medical Systems, Inc., Cat # ADB250) vuohen seerumia (5 %) (Invitrogen Corporation, Cat # 16210-064) 45 minuuttia. Kaikki pesut ja esto vaiheet olivat huoneenlämpötilassa. Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin ChemMate Vasta ainelaimennuspuskuri. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: p-kateniinin primaarista vasta-ainetta (1: 400, hiiren monoklonaalinen IgG1, BD Transduction Laboratories, Cat # 610154) ja Ki67 (1: 100, hiiren monoklonaalinen IgG1, Dako, Cat # M7240, klooni MIB-1 ). Koolonadenokarsinooma kudosta dioja käytettiin positiivisena kontrollina β-kateniinin ja Ki67 värjäystä. Tissue diat sekundaarinen vasta-ainetta ainoastaan ​​käytettiin negatiivisena kontrollina. Primaaristen vasta-aineiden inkuboitiin kudoksia yön yli 4 ° C: ssa. Objektilasit pestiin sitten PBS: ssä (3 x 10 min). Universaali anti-kani-anti-hiiri-vasta-ainetta konjugoituna peroksidaasiin (ImmPress Universal Reagent, Vector Laboratories, Cat # MP-7500), inkuboitiin kudoksen kanssa 30 minuuttia, mitä seurasi pesu PBS: ssä 5 minuuttia. 3-amino-9-etyylikarbatsolia (AEC), joilla on suuri herkkyys substraatin (DAKO, Cat # K3461) oli käytössä, kun peroksidaasi substraatti β-kateniinin ja Ki67-värjäys. AEC inkuboitiin dioja 3 minuuttia β-kateniinin värjäys ja 7 minuuttia Ki67 värjäystä. Tissue huuhdottiin tislatulla vedellä 5 minuuttia. Hematoksiliini 1 (Thermo Scientific, Cat # 7221) käytettiin vastavärjäämiseksi kudoksen diat. Hematoksiliini 1 laimennettiin 1: 3 ja inkuboitiin kudoksen diat 15 sekuntia ja sitten huuhdottiin vesijohtovedellä kunnes vesi juoksi selvä. Faramount vesiliuosta Kiinnitys Media (Dako, Cat # S3025) käytettiin asennukseen dioja käyttäen 1,5 peitelaseille (0,16-0,19 mm paksuus) (Fisher Scientific, Cat # 12-544B).

immunohistokemia analyysi

Koko diat värjätty β-kateniinin skannattiin käyttämällä automaattista Dmetrix skanneri 20x suurennuksella (DMetrix Inc.). Diat värjättiin Ki67 skannattiin käyttäen 20x tavoite kanssa BioImagene skannerin (Ventana Medical Systems). Sama paikkoja käytetään ensisijaisesti värekarvojen analyysiä löytyivät viittaamalla käsinkirjoitetun H 6020 (26,3) 60-6411 (14,5) 65-6926 (34,2) 70-7416 (21,1) 743 (3,9) mediaani = 65 keskiarvo = 64 ± 7 Range = 46-77Gleason sum scoren = 75635 (46,7) 7-1040 (53,3) PIN laatu * n = 24Low grade13 (54,2) korkea grade18 (75) patologinen stagen = 77pT1-pT225 (32,5) pT352 (67,5) tilavuus suurimman kasvaimen (cc) n = 25 3,08 (32) 3,0-6,09 (36) 6,1-9,04 (16) 9,1-122 (8) 122 (8) mediaani = 4 keskiarvo = 6,3 ± 8,3 Range = 0.13-42Pre leikkauksen vapaa seerumin PSA (ng /ml)n=58 3.03 (5.2) 3,0-6,024 (41,4) 6,1-+9,015 (25,9) 9,1-124 (6,9) 1212 (20,7) mediaani = 6,4 keskiarvo = 11,2 ± 20,4 Range = 1.8-154Biochemical toistumisen * * n = 78Yes44 (56,4) No34 (43,6) Taulukko 1. Yhteenveto potilaan ja kliinisten tietojen.

* Seitsemän potilaan näytteitä sekä huono laatu ja korkea laatu PIN (eturauhasen intraepiteelisen neoplasia). ** Biokemiallinen toistumisen määriteltiin seerumin vapaan PSA 0,1 ng /ml kahden peräkkäisen mittauksen. Aika leikkauksesta kestää kirjattu PSA mittausten potilaille ilman biokemiallisten uusiutuminen vaihtelee 12,5 kuukaudesta 15,2 vuotta, ja potilaille, joilla uusiutumisen aika leikkauksesta biokemiallisten uusiutuminen vaihtelee 1,3 kuukaudesta 13 1 vuotta. CSV Lataa CSV

Menetys ensisijainen värekarvojen nähtiin eturauhasen preinvasive näytteistä (PIN, matala-asteista (LG) ja korkea-asteen (HG) yhdistetty). Mediaani prosenttiosuus Värekarvallinen epiteelisolujen PIN (mediaani = 5,7%) väheni 36% verrattuna normaaliin epiteelisolujen (mediaani = 8,9%; p = 0,24, kuvio 1C, ylä- ja taulukko S1A taulukossa S1). Vaikka tämä ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa, 70,8% PIN näytteillä oli epätavallisen alhainen (putoamisen tai sen alapuolella 25

persentiilin normaali, Q1) prosenttiosuus Värekarvallinen epiteelisolujen (kuvio 1 C, pohja ja taulukko S1B vuonna Taulukko S1). Myös yleinen merkittävä lineaarinen trendi laskeva prosenttiin värekarvojen yhä vakavuuden eturauhassyövän (p 0,0001; taulukko S1A taulukossa S1). Vaikka tämä malli yhä lisää vakavuutta normaalista, PIN, kohdunkaulan syöpä, ja sitten hermoa hyökkäyksen, me tunnustamme, että kaikki syövät kehittää tässä järjestyksessä. On huomattava, että erottamalla PIN näytteet LG ja HG ryhmien ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa prosentteina Värekarvallinen solujen koko tutkimuksen, niin LG ja HG PIN ei erotettu edelleen prosenttia värekarvojen analyysejä.