Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kehitetään kattava yleiskatsaus kopioluvun poikkeamia (CNAs) vaiheessa II /III peräsuolen syöpä (CRC), me tunnettu 302 kasvainten PETACC-3 kliinisessä tutkimuksessa. Mikrosatelliitti-vakaa (MSS) näytteet (n = 269) oli 66 minimaalinen yhteinen CNA alueilla, joilla usein voitot 20 q (72,5%), 7 (41,8%), 8 q (33,1%) ja 13 q (51,0%) ja tappiot 18 (58,6%), 4 q (26%) ja 21 q (21,6%). MSS kasvaimet ovat huomattavasti enemmän CNAs kuin mikrosatelliitti-instable (MSI) kasvaimia: sisällä MSI kasvainten uusi deleetio tuumorisuppressorigeenin WWOX 16 q23.1 tunnistettiin (p 0,01). Focal aberraatioita tunnistetaan synergisillä menetelmällä vahvisti amplifikaatioita onkogeenien kuten EGFR, erbB2, CCND1, MET, ja MYC, ja deleetioita tuumorisuppressoreilla lukien TP53, APC, ja Smad4, ja geenin ilmentyminen oli erittäin yhtäpitävä kopioluku poikkeama näiden geenien. Novel amplikonit mukana otaksuttu onkogeenien kuten WNK1 ja HNF4A, joka osoitti myös korkea vastaavuutta välillä kopiomäärä ja ilme. Survival analyysi liittyy tiettyyn potilas segmentin esillä on kromosomi 20 q voitot parannettua kokonaiselossaolo, mikä saattaa johtua suurempi geenien ilmentymisen kuten EEF1B2 ja PTK6. CNA klustereiden myös ryhmitelty kasvaimia ominaista huono ennuste BRAF-mutantti-kaltainen allekirjoitus on peräisin mRNA tiedot tästä kohortissa. Me kertoo vielä ei-satunnainen korrelaatio CNAs keskuudessa linkittämättömän loci, kuten positiivinen korrelaatio 20 q vahvistuksen ja 8 q voitto, ja 20 q voitto ja kromosomi 18 tappiota, sopusoinnussa yhteistyössä valinta näiden CNAs. Nämä tulokset vahvistavat ei-satunnainen luonne somaattisten CNAs vaiheessa II /III CRC ja korosta loci ja geenit, jotka voivat olla tärkeä rooli ajo kehittämiseen ja tuloksista tauti.

Citation: Xie T, d ’Ario G, Lamb JR, Martin E, Wang K, Tejpar S, et ai. (2012) Kattava karakterisointi genominlaajuisten Copy Number Aberrations kolorektaalisyövässä paljastaa Novel Onkogeenit ja Patterns of Muutokset. PLoS ONE 7 (7): e42001. doi: 10,1371 /journal.pone.0042001

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

vastaanotettu: 25 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 28 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 31 heinäkuu 2012

Copyright: © Xie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta Swiss National Science Foundation (SNF 320030_135421) ja Foundation Medic ja myöntämiselle Krebsforschung Schweiz (KFS 02697-08-2010) AR ja MD. ST on vanhempi kliininen tutkija on tieteellisen tutkimuksen rahasto Flanders ja on saanut tutkimusapurahat Belgian liittovaltiosta syöpää vastaan ​​ja Belgian National Cancer Plan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: TX, JL, KW, MM, SW, PR ja JGH ovat tai työskentelivät Pfizer Inc kuitenkaan tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mikään muu kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) toisella sijalla keuhkosyöpää sekä ilmaantuvuus ja kuolleisuus kehittyneissä maissa [1]. Sille on ominaista erittäin mutkikkaita somaattisten geneettisiä muutoksia onkogeenien ja tuumorisuppressoreita jotka ohjaavat aloittaminen ja eteneminen [2], [3], [4]. Ymmärtäminen solu- ja molekyylitason mekanismeja, joilla nämä geneettiset muutokset helpottavat paksusuolen syövän muodostumisen on kriittinen kehittämiseen kohdennettujen hoitostrategioita valvomiseksi taudin etenemistä minimoiden myrkyllisiä haittavaikutuksia.

Yksi vakiintunut geneettinen mekanismi, jolla syöpäsolut muuttavat toimintaa onkogeenien ja tuumorisuppressoreita kautta muutoksia geenien annoksen. Yksityiskohtainen kuvaus DNA kopioluvun poikkeamia (CNAs) ovat auttaneet tunnistamaan merkittäviä onkogeenien kuten ErbB2 ja EGFR sekä tuumorisuppressoreilla kuten TP53 [5]. Lukuisat tutkimukset ovat dokumentoitu genominlaajuisten somaattisia CNAs CRC [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15] , [16], [17], [18], joista osa on yhdistetty kliiniseen tulokseen tai metastasointiin [19], [20], [21], [22], [23], [24]. Kuitenkin monet näistä tutkimuksista ovat rajoittaneet vaatimaton otoskoko, alhainen resoluutio määrityksiä, tai puute liittyviä kliinisiä kommentointi, erityisesti alkuvaiheen (II /III) paksusuolensyöpä. Niinpä kattava yleiskatsaus CNAs ja niiden yhdessä tulos vaiheen II /III paksusuolen syöpä ei ole kehitetty.

Kartoitimme somaattisia CNAs on kokoelma 302 vaiheen II /III koolonsyöpien johdettu Pan Euroopan Trials in adjuvantissa Colon Cancer (PETACC) -3 tutkimuksessa, laajassa, satunnaistetussa faasin III arvioinnin roolin irinotekaanin lisättiin fluorourasiili (FU) /leukovoriiniin (FA) adjuvanttina hoitoa paksusuolensyöpä [25]. Tässä esitetyt tulokset tutkia suhdetta CNA, mRNA [26] ja tulokset, ja edistää kattavan molekyyli- katsauksen vaiheen II /III paksusuolensyöpä, joka on ensiarvoisen puhdistettavaksi hoitoisuusluokituksen ja tehokasta hoitoa.

materiaalit ja menetelmät

kliiniset ja mRNA tiedot PETACC-3 potilaat

Kaikki vaiheen II /III paksusuolen syöpäpotilaiden mukana tässä tutkimuksessa olivat peräisin PETACC-3 kliinisessä tutkimuksessa [25], jossa vähintään 5 vuotta kliinistä seurantaa kullekin potilaalle. Ikä, sukupuoli, vaiheessa MSI (mikrosatelliittimarkkereita-instable) sekä BRAF ja KRAS mutaatio tilan potilasryhmässä ovat taulukossa S1. mRNA ilmaisu aineisto generoidaan ALMAC peräsuolen syövän DSA alustan (Craigavon, Pohjois-Irlanti), kuten on raportoitu aiemmin [26]. Potilaan ja etiikka hyväksyntä tässä tutkimuksessa saatiin PETACC-3 Translaatiotutkimuksen työryhmä (PTRW).

Molecular Inversion Probe Data Generation

DNA otot suoritettiin macrodissected formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin -Embedded (FFPE) kasvainkudoksen kertynyt yhdeltä 5 uM dia 835 potilaan näytteistä. Kasvainkudoksessa kussakin jaksossa tunnistettiin ja merkitty pätevä patologi (F. Bosman). Normaalille valvonta, DNA eristettiin näytteitä riittäviä määriä histopatologisesti normaali vieruskudos kaukana kasvain marginaalit. DNA kvantifioitiin PicoGreen määritystä. Näytteissä, jotka tuottivat vähemmän kuin suositellut tulo DNA määrä (75 ng), DNA siirrettiin osaksi Molecular Inversion Probe (MIP) vahvistus, merkintöjä, ja hybridisaatio protokollia käyttämällä Affymetrix n OncoScan V1.0 FFPE Pikapalvelut (Affymetrix, CA) . Näytteitä että epäonnistuneet PCR-monistamisen tai näytetään mediaani keskiarvo Pairwise Difference (MAPD) ​​ 0,6 hybridisaation jälkeen poistettiin kädessä, jolloin 302 Tuumorinäytteissä yhdessä 44 viereiseen normaaliin otoksia kuin lähtötilanteessa normaali vertailuryhmässä. Tyypillisesti näytteet alle 20 ng tulo DNA epäonnistui MIP vahvistus cutoff ja ei hoitanut eteenpäin array hybridisaatio. Näytteitä, joissa on vähintään 75 ng tulo DNA yleisesti tuotti korkealaatuinen kopio numero data (MAPD 0,6). Tulokset vaihtelivat panos DNA määriä 20-75 ng, jossa MAPD 0,6 suodatin palveli poistaa epänormaali näytteitä.

Kopioi numero Data Analysis

Kopioi numero Aineisto analysoitiin Nexus Copy numero 6.0 -ohjelmisto (Biodiscovery, Inc., CA, USA). Raaka kopioluku tiedot kustakin koetin tarjoamien Affymetrix oli tasoitetaan toisen asteen korjauksen, jonka NEXUS ja keskitetty käyttäen diploidinen alueilla. CNA taajuus vertailuja keskuudessa näyte ryhmiä (esim MSS vs. MSI; vaihe-II vs. vaiheen III) suoritettiin käyttäen NEXUS oletusarvo kynnysarvot 15%: n ero ja merkitys p 0,01 (Fisherin tarkka testi). Luodaksesi kopiomäärä segmentteihin ja minimaalinen yhteisiä alueita (MCRs), käytimme muokattua versiota Circular Binary Segmentation (CBS) algoritmi [27] kutsutaan ”Sijoitus Segmentation” in NEXUS. P-arvo sulku CBS oli 1.0e-6, ja segmenttejä jaettiin 1 5 jäteastioita: monistetaan ( 3,8 kopiota), sai (2,3-3,8 kopiota), muuttumattomana (1,7-2,3 kopiota), poistettu (0,5 1,7 kopiota) tai homozygously poistettu ( 0,5 kappaletta). MSO taajuus merkitsevyyden testausta käytimme p-arvo cutoff 0,01 tilastolliseen merkitys testaus Poikkeava Kopioi numero (STAC) menetelmä [28]. Hierarkkinen klusterointi CNA suoritettiin NEXUS liian (täydellinen sidos, sukupuolikromosomeiksi huomiotta). Havaita polttoväli monistuksia, haimme synergisillä (Perimän merkityksellisten tavoitteet Ravussa) versio 2.0 [29] käyttäen Q-arvo sulku 0,25. Geenit raportoitu GISTIC2 vahvistus piikkejä tutkittiin edelleen, jos ne rikastettu biologista reittejä. Käytimme kanoninen reitin tietokannan tarjoamat MSigDB [30]. Pathway geeni, joissa on alle 10 jäsentä vähintään 500 jäsentä jätettiin pois. Fisherin testiä käytettiin pääsy jos nämä geenit ovat yliedustettuina. FDR laskettiin perustuen 100 permutaatiot, jossa satunnainen sarjaa geenien samankokoisia testattiin. Käytimme myös Fisherin testiä, onko taajuuksia tiettyjen CNAs eroavat toisistaan ​​eri potilasryhmissä (vaihe II vs. III, MSI vs. MSS jne). Survival-analyysi suoritettiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmä, jossa on p-arvo (log-rank-testi) cutoff 0,01. Analysointiin CNA /CNA korrelaatioita, Pearson korrelaatio laskettiin geeni- tasolla kaikki parit geenien kuten aiemmin on kuvattu [31]. Johtamiseksi geeni tasolla yhteenvetoja kopiomäärä data, me osoitetaan kopiomäärä arvot segmentin (t) limittäin geeni: kun oli useita segmenttejä geenissä rajan, me keskimäärin kopio numerot näissä segmenteissä. Kaikki genomia perustuvia tietoja raportoidaan käsikirjoitus perustuvat NCBI rakentaa 36 (hg18) ihmisen genomin.

Expression Data Analysis

Geenien ilmentyminen tietoja PETACC-3 potilaalla oli raportoitu aikaisemmin [26]. Me sovitettu sen geenin tasolla kopioluku tiedot ENT- REZ tunnus. Kopioi numero ja geenien ilmentyminen tietoja oli samanaikaisesti käytettävissä 213 269 MSS potilaalla, joiden CNA tietoja. Voit testata cis-korrelaation geenin kopioluvun ja oman mRNA: n ilmentymisen tasolla koko kasvaimia, me luokiteltu potilaat mukaan niiden poikkeamia tila (vahvistus, voitto, ei-muutosta, menetyksen tai homotsygoottisia poistetaan) liittyy ilmaus arvoja koetin asettaa kartoitus samaan geeniä.

tulokset

Kopioi numero Aberrations ja mikrosatelliittimerkkien Epävakaus

33 302 näytteiden analyysimme olivat mikrosatelliitti instable (MSI): yhdenmukainen aiempien tutkimusten [ ,,,0],19], [32], keskimäärin CNAs vuonna MSI kasvainten (10,2 ± 6,5) oli merkitsevästi pienempi (p 0,01, kaksi otoksen t-testi) kuin keskimäärin CNAs mikrosatelliitti vakaa (MSS) kasvaimet (33,2 ± 17.6). Kuitenkin kaksi polttoväli alueet poistettiin huomattavasti useammin MSI näytteet: chr16q23.1 (chr16:77,231,391-77,261,567 BP) 24,2% MSI näytteistä vs. 7,1% MSS näytteistä (p 0,01), ja chr20q11.1 (CHR20 :28,118,678-28,244,164) in 24,4% MSI näytteistä vs. 8,9% MSS näytteistä (p 0,01). Mielenkiintoista on, että vain geenin sisällä 16 q23.1 lokus on WWOX tuumorisuppressori, estäjä WNT /beeta-kateniinin reitti [33], joka on usein aktivoidaan paksusuolen syöpä.

Toistuva CNAs, Novel Onkogeenit ja haavoittuvuus Väylät

Koska suhteellisen alhainen CNA levinneisyys MSI kasvainten, fokusoimme analyysejä 269 MSS kasvaimia. Kuten on raportoitu aiemmin [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17] taajuudet kopioluvun voittoja ja tappioita koko genomin ei satunnaisesti jakautuneet (kuvio 1A), jossa CNAs yksittäisistä kopioida voittoja ja tappioita laaja kromosomialueita, keskeiselle homotsygoottisia deleetioita ja korkean tason monistuksissa (kuva 2). Yleisin alueet vahvistuksen kattoi kromosomialueita 7 p, 8 q, 13 q, ja 20 q, ja yleisin alueilla menetys kattoi 8 p, 17 p, ja 18 q (kuvio 1A).

(A) taajuudet kopioluvun voitto (edellä akseli, sininen) ja kopioluvun tappio (alla akseli, punainen) poikki ihmisen genomin. (B) merkitys polttovälin monistukset havaita synergisillä 2.0. Kromosomi kannat ilmaistiin y-akselilla, jossa sentromeeriantigeenin kantoja katkoviivoin. Kymmenen Merkittävimmät synergisillä piikit näkyvät punaisella tekstillä. Muita synergisillä huiput koodaavat perustettu onkogeenin mustalla tekstillä. Tiedot kaikille synergisillä huiput on esitetty taulukossa S3.

(A-H) Copy numero tonttien koko genomin järjestetty kromosomi järjestyksessä lyhyen varren kromosomin 1 (1pter) pitkään käsivarteen kromosomi X (Xqter) 8 riippumatonta kasvainnäytteestä. Amplikoneja erityisen kiinnostavia, on merkitty nuolilla, sekä vakiintuneiden onkogeenien. Tiedot koskevat kaikkia amplikonien ja synergisillä huiput ovat taulukossa S3.

päästääkseen paremmin, me tiivistää toistuva kromosomi ja -tappioiden Minimal Common alueiden (MCRs) käyttäen Merkittävä testaus Aberrant Copy Number (STAC) [28], ja synergisillä [29] korostamaan ehdokas onkogeenit että MCRs perustuu focality ja amplitudi kopioluvun muutos. Kaikkiaan 66 MCRs tunnistettiin taajuuksilla yli 10% (taulukko S2): oli 25 MCRs voiton vaihtelevat 251 Kb 104 Mb ja 41 MCRs tappion vaihtelevat 286 kb ja 138 Mb. Synergisillä auttoi tarkentaa MCRs on loci ja geenien erityinen merkitys (taulukko S3). Monet merkittäviä piikkejä tunnistaa synergisillä sisälsi perustettu onkogeenien kuten CCND1, CDX2, EGFR, erbB2, MET, ja MYC (kuvio 1 B), sekä tuumorisuppressorit kuten APC, Smad4, ja TP53. Useat onkogeenisel- huiput johtuivat korkean amplitudin polttoväli tapahtumia osajoukko kasvaimia (kuvio 2), ja nämä polttoväli monistumiset johtanut merkittäviä lisäyksiä mRNA ilmaisu useita näistä geeneistä. Erittäin merkittävä synergisillä piikkejä ei liittynyt vakiintunut onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla sisältää 12 p13.33 (kuvio 2E, F) ja 20 q13.12 (kuvio 2G, H), joka oli toistuva korkean suuruus polttoväli monistuksia, sekä 14 q32.31 jotka eivät erittäin monistettu, oli voittoja riittävän uusiutumisen ja focality jotka tekevät erittäin merkittävä synergisillä Q-arvo (kuvio 1 B, taulukko S3). Kun synergisillä amplikonin tietojen kiteytämme 114 ehdokas syövän kuljettajien taulukossa S4, joka sisältää kaksitoista (10%) perustettiin onkogeenien kuten MYC, KRAS, ja MET. Otaksuttu onkogeenejä lukien WNK1 (kuvio 3A) ja HNF4A (kuvio 3B) on Q-pisteet, monistetaan taajuus, ja cis-vaikuttavan vaikutukset mRNA jotka ovat verrattavissa vakiintuneen onkogeenien (kuva S1). Analyysimme on kaventunut yli 6000 geenit MCR genomin alueita ja hallittavissa olevan noin 100 edelleen kokeellista validointia.

Tuumorinäytteet jaotella CNA asema (poistetaan, menetys, normaali, vahvistus, vahvistus ) varten osoitetun geenin. Paneelit osoittavat ilmentymisen tasolla luokka kullekin probeset päässä ALMAC alustan (katso materiaalit ja menetelmät), joka edustaa tiettyä geeniä. Arvot keskitetty kunkin probeset; luokat piirretään jos siellä oli vähintään yksi näyte sitä.

edelleen etsiä malleja vaikuttaa reitin muutoksia, kartoitimme luettelo geenien monistettiin CRC (taulukko S4) päälle kanoninen molekyyli signalointireittien ja solutason prosesseja. Taulukossa 1 on esitetty ylhäältä kanoninen reittejä mahdollisesti vaikuttaa monistettujen geenien. Solusyklin on yksi rikastettu reitit vaikuttavat somaattisten CNA, joissa geenit, kuten CCND1, MYC, TFDP1 ja YWHAZ. Kegg ”Pathways in Cancer” taustalla laaja kirjo vaikutus somaattisten CNAs vuonna moniosaisia ​​keskeisten reittejä syövän samanaikaisesti. Tarkemmin, olemme myös todettu yksittäisiä syöpään liittyvien polkuja, jotka ovat merkittävästi yliedustettuina cis toimivien geenien ohjaavat somaattisten CNAs, mukaan lukien erbB signalointi reitin ja MAPK-kinaasin signalointireitin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä somaattiset CNAs koodaavat uusia kasvaimia synnyttävän kuljettajan geenejä ja mahdollisia terapeuttisia kohteita paksusuolensyöpä.

CNA Clustering ja ei-satunnainen CNA korrelaatiot CRC

Suoritimme ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi maailmanlaajuisen CNA datan ja tunnistaa kolme suurta klustereita. Vaikka emme löytäneet merkitseviä iän, sukupuolen, vaihe tai KRAS-mutaatio asema, havaitsimme, että BRAF villityypin kasvaimia merkittävästi rikastettu Suurin ryhmä ja BRAF mutanttien pienimpiä klustereiden (p 0,01). Aiemmin [26] kehitti BRAF-mutantti geeniekspression allekirjoituksensa PETACC-3 kohortti ja tutkittu sen ennustetekijöiden vaikutuksia. Niistä 213 MSS potilaalla on mRNA ilmaisun tietoja, allekirjoitus tunnistettu 37 ”BRAFm-like” näytettä (sisältäen 8 BRAF mutantit) sekä 176 ”ei-BRAFm-like” näytteitä. Me uudelleen juoksi clustering analyysi näistä 213 näytteistä (kuvio 4A), ja sen on todettu erittäin merkittävä rikastuminen ”ei-BRAFm-like” näytettä (p 0,01) suurin klusteri (ryhmä 2) ja ”BRAFm-like” näytteiden ryhmä 1 (P 0,01, taulukko 2). Verrattuna klusterin 2, ryhmä 1 esittää paljon pienempi taajuuksilla vahvistus /poisto tapahtumia, erityisesti CHR 13 q, 14 q, 18 q ja 20 q (kuvio 4B). Lähempi tarkastelu paljastaa, että ryhmä 1 on kokonaan tyhjentynyt alkaen CNAs at CHR20 taas 95% klusterin 2 näytettä oli CHR20 monistettu. Nämä tulokset tukevat sen havainnon kanssa suhteellisen pienempi ilmentymisen CHR20 geenien BRAFm kaltainen suhteessa muuhun BRAFwt näytteiden [26].

(A) Kolme suurta klustereita. Oikeanpuoleinen merkintä osoittaa, kunnossa, BRAFm (keltaisella, BRAF mutantteja, sininen, BRAF villi-tyyppejä), KRASm (mutantit vihreä), ja BRAFm kaltainen (vihreä, BRAFm kaltainen, punainen, ei-BRAFm-like). Violetti väri osoittaa puuttuvat arvot. (B) Genome laajuinen taajuus juoni kopioluvun voitto (edellä akseli, sininen) ja kopioluvun tappio (alla akseli, punainen) yli kolme suurta klustereita.

aiemmin raportoitu, että solulinjoja CNAs on linkitys loci oli usein korreloi keskenään ja että tällaiset korrelaatiot olivat todennäköisesti seurausta valinta [31]. Sen arvioimiseksi, samanlainen ilmiö oli havaittavissa kliinisissä vaiheen II /III MSS paksusuolen syöpä, teimme pari-viisasta korrelaatiot kopioluvun kaikkien geenien (~22 k) poikki genomin. Kuten odotettua, vieressä (liittyy) geenit korreloivat voimakkaasti (kuvio 5A, lähellä lävistäjä). Korkeammalla tasolla joitakin kromosomi käsivarret tuli linkitys (esim chr1p vs. 1 q, 10p vs. 10 q) tai anti-korreloivat (esim CHR 8 p vs. 8 q). Lisäksi oli lukuisia korrelaatioita linkittämättömien loci (kuvio 5A, off-diagonaalinen), mikä viittaa siihen, co-valikoima näitä genomialueiden. Esimerkiksi kromosomi 8 p tappiot korreloi tappiot kromosomien 17 s ja 18, yhdessä kromosomin 20 q. Kromosomi 13 voitot korreloivat kromosomissa 14 tappioita. Jakelu-geeni-geenin yhdistysten oli merkittävästi erilainen kuin satunnaistamisen CNV datan (kuvio 5B). Samanlainen kuin mitä havaittiin muille syövän hoito [31], [34] oli mittakaavasta rakenne, jossa muutama geenit korreloivat voimakkaasti monia muita geenejä, kun taas useimmat geenit korreloivat vain muutamia geenejä. Tämä viittaa siihen, että pieni joukko DNA loci toimii solmukohtien erittäin sattumanvaraisen hierarkkinen rakenne.

(A) Pair-viisasta korrelaatiot lasketaan geenikopiomäärä tilataan kromosomi kantoja läpi genomin X ja Y akselit, punaisella osoittaa positiivinen korrelaatio ja sininen osoittaa negatiivinen korrelaatio. Punainen diagonaalinen edustaa korrelaatio geenin itsensä kanssa. Oikeassa alakulmassa ja vasemmassa yläkulmassa osia kuvaajan ovat peilikuvia toisistaan ​​esittää kopioluvun korrelaatiot linkitys loci. (B) Log /log tontteja merkittäviä geeni /geeni korrelaatioita (| R | ≥0.3).

suhde CNA vaiheeseen ja Outcome

tunnistaa yksittäisiä CNAs jotka liittävät kasvain vaiheessa vertasimme CNA taajuuksilla vaiheen II (n = 30) ja vaiheen III MSS näytteitä (n = 239). Vaikka molemmat ryhmät olivat samanlaisia ​​malleja CNA, häviämä kromosomissa 3p14.2 oli merkittävästi (p 0,01) korkeampi taajuus vaiheessa III kasvaimet (24,3%) verrattuna vaiheen II kasvaimet (3,3%). Tämä locus koodaa FHIT, ehdokas tuumorisuppressori ja apoptoottisten säädin kolorektaalisyövässä [35], ja korkeampi taajuus poisto vaiheessa III kasvaimissa viittaa siihen, että menetys FHIT toiminta saattaa edistää etenemistä paksusuolensyöpä alemmalta korkeammalle edennyt sairaus .

suuri joukko vaiheen II /III MSS paksusuolisyövän näytteiden liittyvät aika-uusiutumisen, toistumisen vapaa-eloonjääminen (RFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) saatiin ainutlaatuisen mahdollisuuden tunnistaa CNAs liittyy tulokset. Käyttämällä Kaplan-Meier-analyysi, ensin tutkitaan, onko ch20q vahvistus paljasti näyte klustereiden kuvattu aikaisemmin johtaa tilastollisesti merkittäviä eroja eloonjäämistä. Sai MCR kromosomissa 20 q11.21-q13.33 (chr20:29,297,270-62,435,964 bp) merkitsevästi yhteydessä parannettu OS vaiheessa III kasvaimet (p 0,01). Synergisillä tunnistettu yksi amplikonia tässä MCR päälle 20q13.33 (chr20:61,440,621-61,778,204 bp), joka myös merkitsevästi yhteydessä parannettu OS. Tämä alue on noin 300 kb sisältää yhden mielenkiintoisia geenejä, kuten EEF1A2 ja PTK6. Anand et ai. raportoitu [36] EEF1A2 n yli-ilmentyminen noin 30% munasarjojen kasvaimia ja joidenkin vakiintuneiden munasarjasyöpäsoluja. Kuitenkin korkea EEF1A2 proteiinin ilmentyminen liittyi merkitsevästi lisääntynyt 20 vuoden eloonjäämistä naisten vakavien munasarjojen kasvaimia [37], tai ensisijainen rinta- kasvaimia, ja tämä suojaava vaikutuksen ajatellaan johtuvan EEF1A2 n voimakasta ilmentymistä vähentämällä aggressiivisuus [ ,,,0],38]. PTK6 myös raportoitu [39] positiivisena liittyy etäpesäkkeitä elinaika rintasyöpä ja osoittaa vahvaa cis CN /mRNA korrelaatio meidän analyysi (taulukko S4). Tässä CNA tiedot viittaavat siihen, että monistuminen 20 q13.33 lokus voisi olla merkittävä prognostinen merkkiaine CRC syöpä.

Lisäksi chr20q vahvistus, haimme Kaplan-Meier-analyysi suhteen arvioimiseksi kaikkien muiden MCRs ja synergisillä huiput RFS ja käyttöjärjestelmän. Ei ollut merkittäviä assosiaatioita MCRs tai synergisillä huippuja versus OS tai RFS II vaiheen kasvaimista, mikä saattaa johtua rajallinen määrä näytteitä tässä ryhmässä (n = 30). Kuitenkin deleetio kromosomissa 10 p (Chr10:0-10,743,764 bp) oli merkitsevästi yhteydessä huonoon RFS vaiheessa III kasvaimissa yksin (p 0,01) tai vaiheen II /III kasvaimet yhdistettynä (p 0,01), sekä huono OS vaiheessa II /III kasvaimet yhdistettynä (p 0,01). Samoin poistetaan MCR 19 p13.12 (chr19:14,425,490-15,580,441 bp) liittyi merkitsevästi OS (p 0,01) vaiheen II /III kasvaimet yhdistetään (Kuva S2).

Keskustelu

päätavoitteet tässä tutkimuksessa olivat kehittää kattava yleiskatsaus kopioluvun poikkeamia (CNAs) ja niihin liittyvien geenien vaiheen II /III paksusuolensyöpä, valottaa taustalla biologian, ja liittää CNAs kanssa lopputulokseen. Alueet toistuvat ja polttoväli CNA havainneet näissä kasvaimissa korostavat genomialuetta todennäköisimmin koodata onkogeenien ja tuumorisuppressoreilla. Perustettu onkogeenit tunnistettu tässä tutkimuksessa, jotka edustavat positiiviset kontrollit sisältävät MYC, CDX2, EGFR, MET, erbB2, ja CCND1.

Näkyvin uusi amplikoneja tunnistettu tässä tutkimuksessa sisällä 12 p13.33 ja useiden lokusten 20. q (20 q11.21, 20 q13.12, 20 q13.31). 12 p13.33 amplikoni koodaa kiehtova ehdokas WNK1, jäsen wnk perheen seriini /treoniinikinaaseja, jotka vaikuttavat MAPK signalointi ja erilaisia ​​syövän tunnusmerkkejä kuten solusyklin etenemisen, kiertäminen apoptoosin, invaasio ja etäpesäkkeiden, ja metabolisen sopeutuminen [ ,,,0],40]. Monimutkainen kuvio voitot ja vahvistus kromosomissa 20 q ehdottaa useita kasvaimia synnyttävän ohjaimet tässä kromosomissa käsivarteen, sopusoinnussa havaintojen rintojen kasvaimia [41] ja muita syöpätyyppeihin. 20 q13.12 amplikoni, joka havaittiin useita kasvaimia (kuvio 2G, 2 H) ja on merkittävin synergisillä huippu 20. q, koodaa 11 geenejä, joista yksikään ei ole yksiselitteisesti kuvattu onkogeeninen kuljettajia paksusuolen syöpä. Siitä huolimatta raportoitiin toimintoja joitakin näistä geeneistä viittaavat siihen, että lisätutkimuksia on perusteltua. Esimerkiksi transkriptiotekijän HNF4A kontrolloi epiteelisolujen polariteetin ja edistää suolen kasvainten hiirissä [42]. WISP2 (WNT1 Inducible Signaling Pathway proteiini 2 /CCN5) säätelee aktiivisuus transformoivan kasvutekijä â (TGFa) signalointireitin ja geenien ilmentymistä, jotka liittyvät epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon [43]. Huippu 20 q13.31 koodaa BMP7, jäsen TGFa superperheen proteiinien, joiden yli-ilmentymisen kolorektaalisyövässä merkittävästi korreloi markkereita patologinen aggressiivisuuden kuten maksan etäpesäke ja on riippumaton ennustetekijä kokonaiselinaika [44]. Toiminnallisen kuvauksen näistä ja muista ehdokas onkogeenien paksusuolensyöpä soluviljelmässä, potilaasta peräisin ksenografteja tai geneettisesti hiiren mallien avulla selvittää mahdolliset toiminnalliset vaikutukset. Pathway analyysi aiemmin esitettyihin tarjoaa paitsi parempaa ymmärtämistä mahdollisen biologisen yhteydessä ehdokas CNA kuljettajien vaan myös auttaa päätellä muiden geenien muuttunutta koulutusjakson joka hoitovaihtoehdot voivat olla käytettävissä. Toisaalta, selviytyminen analyysi osoittaa parantuneen eloonjäämiseen näytteen segmentin CHR20 q13.33 vahvistus. Tämä yhdistys on ristiriidassa havaintojen toista ryhmää, jotka ilmoittivat monistamiseen 20 Q13 on osoittaa huonompi eloonjäämiseen satunnaisissa paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [45]. Tarkka perustana ristiriita kanssa havainnot ei ole selvä, vaikka analyysit Aust et al. olivat huomattavasti pienempi kohortti (120 näytettä).

analyyseja assosiaatioita CNA ja lopputulos tässä joukko vaiheen II /III koolonsyöpien paljasti kolme loci jotka liittyivät merkittävästi yleistä (OS) tai toistumisen elinaika (RFS). Poistaminen distaalisen kärjen kromosomin 10 p (10 p15.3-P14) oli yhteydessä huonoon OS ja RFS, vaikka välimainos poisto kromosomin 19 p (19 p13.12) oli yhteydessä huonoon OS, ja voitto 20 q liittyi huomattavasti parempi OS vaiheessa III kasvaimia. Vaikka 10 p poistot, 19 p poistot, ja 20 q voitot on aiemmin raportoitu vaiheen II /III koolonsyöpien [16], mitään näistä loci on aiemmin yhdistetty tulos näissä kasvaimissa. Sitä vastoin emme noudata merkittävää yhdistysten lopputulokseen aiemmin raportoitu CNAs kuten poistamisesta 16 p13.2 vaiheessa II /III paksusuolensyöpä [46], tai poistetaan 5 q34 ja voitto 13 q22.1 II vaiheessa kasvaimissa [ ,,,0],17]. Yksi mahdollinen selitys näille näennäinen erot voivat liittyä rajallinen valta vastaavien tutkimusten. Vaiheen III MSS kasvaimia, meidän tulokset edustavat analyysien huomattavasti korkeampi näytenumeroita (n = 239) verrattuna julkaistu teos (varten esimerkiksi 31 vaiheen III kasvaimia [46]). Vaiheen II MSS kasvaimia, meidän näytesarja alitehoinen, jotka edustavat 30 näytettä verrataan 41 [46] ja 39 [17] kasvaimia aikaisemmissa tutkimuksissa. Nämä tulokset korostavat tarvetta laajat analyysit suuria kokoelmia kliinisesti selityksin tuumorinäytteistä kuten vaiheessa III MSS kasvain asetettu kuvattu tässä työssä.

Meillä on myös raportoitu olevan selkeästi ei-satunnainen korrelaatio linkittämättömien DNA loci kanssa asteikolla vapaa rakenne vaiheen II /III paksusuolensyöpä. Nämä erittäin kytketty rakenteet viittaavat sykli satunnainen vaihtelu kopiomäärä seurasi valinta osajoukko muutokset valikoivaa etua kasvaimen aloittamista ja etenemistä. Vaikka tämä on pitkäaikainen ajatus syöpä, korrelaatio linkittämättömien loci viittaa siihen, että erittäin määräsi rakenteisiin voi syntyä, mahdollisesti keskittyi biologisia toimintoja tärkeitä kasvain. Tulevaisuuden analyysit voitaisiin arvioida vaikutusta liitoksen purkamista kopioluvun korrelaatiot geenien ilmentymisen, kuten rikastuminen polkuja ja verkostoja, ja määritetään, onko mRNA ohjataan pari korreloivat loci päällekkäisyyttä, jossa itsenäinen vaikutus kullakin loci oli havaittavissa. Tämä tunnistaa polkuja, jotka valikoivasti muuteta kasvaimen kehittymisen ja jotka näin ollen voivat edustaa uutta kohdistettavia toimintoja.

tukeminen Information

Kuva S1.

Boxplots EGFR, erbB2 ja MYC: n mRNA: n ilmentymisen ryhmitelty CNA tila.

doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s001

(PPT) B Kuva S2.

Kaplan-Meier -käyrät osoittavat CNAs osoittaa merkittävää yhteyttä kokonaiselossaolo.

doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s002

(PPT) B Taulukko S1.

Ominaisuudet potilaiden tutkimuksessa mukana.

doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s003

(XLS) B Taulukko S2.

Vähäinen yhteinen alueet on yksilöity 269 MSS vaiheen II /III paksusuolensyöpä näytteitä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s004

(XLS) B Taulukko S3.

synergisillä huiput tunnistetaan 269 MSS vaiheen II /III paksusuolensyöpä näytteitä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s005

(XLS) B Taulukko S4.

Vaikuttavat geenit valituilla synergisillä amplikoneja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s006

(XLS) B