Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Olemme hiljattain julkaissut harvinainen havaitseminen ksenotrooppiset hiiren leukemiaviruksen liittyvä virus (XMRV) (1/105) eturauhassyövässä (PCA) kudoksen potilaista Pohjois-Euroopassa PCR. Kiistanalainen keskustelua virus havaitaan PCA kudoksessa, verinäytteistä kärsivien potilaiden krooninen väsymysoireyhtymä (CFS), samoin kuin merkittävä määrä terveisiin kontrolleihin sai meidät syventää tutkimuksia havaitseminen XMRV infektion soveltaa erilaisia ​​havaintomenetelmiä (PCR, viljelemällä ja immunohistokemia [IHC]).

Menetelmät /Principal havainnot

Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) 92 PCA ja 7 terveillä verrokeilla eristettiin, PHA aktivoitu ja kasvatettiin yhdessä kanssa LNCaP solut jopa 8 viikkoa. Supernatantti näistä soluista pantiin reportteri solulinja, Derse-iGFP. Lisäksi PBMC: t ja Yhteisviljeltyjen LNCaP-solut testattiin läsnäolo XMRV PCR sekä Western Blot-analyysi. Vaikka kaikki PCR-monistukset ja Western Blot analyysit olivat negatiivisia merkkejä XMRV infektion Derse-iGFP soluilla eristetty GFP-positiivisten solujen kolmessa tapauksessa. Kaikissa kolmessa tapauksessa XMRV läsnäoloa ei voitu vahvistaa PCR-tekniikkaa. Lisäksi teimme XMRV erityisiä IHC on PCA kudosleikkeiden. Koko kudosnäytteiden (n = 20), sekä kudossiruina (TMA) sisältäen 50 eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH), 50 huono laatu ja 50 korkealuokkaisesta PCA kohdat ja TMA lukien rintasyöpä, paksusuolen syöpä ja normaaleissa kudoksissa värjättiin kaksi XMRV spesifisiä antiseerumeita. XMRV-proteiinin ilmentymistä ei havaittu missään syövän kohdissa mukana. Yksi BPH kudos näkyy XMRV erityisen proteiinin ilmentymistä satunnaisessa eristyksissä tyvisoluissa.

Johtopäätös

Emme voineet lopullisesti havaitsemaan XMRV verestä PCA potilaiden tai terveiden verrokkien ja ei ole vakuuttavaa näyttöä ja XMRV proteiinin ilmentymisen PCA, rintasyöpä ja paksusuolen syöpä kudosleikkeiden testattiin IHC värjäyksellä.

Citation: Stieler K, Schindler S, Schlomm T, Hohn O, Bannert N, Simon R, et ai. (2011) o havaitseminen XMRV verinäytteistä ja kudosleikkeiden eturauhassyöpään Potilaat Pohjois-Euroopassa. PLoS ONE 6 (10): e25592. doi: 10,1371 /journal.pone.0025592

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 06 syyskuu 2011; Julkaistu: 12 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Stieler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tällä hetkellä havaitseminen ksenotrooppisen Hiiren leukemiaviruksen liittyvä retrovirus (XMRV) ihmisen bio yksilöt on controversially keskustellaan vaihtelevat XMRV liittyessä kaksi suurta ihmisten sairauksia, krooninen väsymysoireyhtymä (CFS) [1], [2] ja eturauhassyöpä (PCA) [3], [4] on miesten luotu laboratoriossa epäpuhtauksien takia ksenograftin siirrostamalla kautta hiirillä [5] – [18].

vuonna 2006 XMRV on tunnistettu eturauhasen kudosta potilaiden tuttujen eturauhassyöpä (PCA), joka kantaa homotsygoottinen mutaatio RNaseL geeni (R462Q) [19]. Yhdistyksen välinen XMRV ja PCA oli vakavasti vahvistettiin tutkimukset osoittavat XMRV proteiinin ilmentymisen sekä läsnäolo XMRV sekvenssien jopa 26% kaikista PCA tapauksissa [3], [4], [20]. XMRV -proteiiniekspressio pääasiallisesti nähtävissä pahanlaatuinen epiteelin viittaa suorempi rooli kasvainten synnyssä. On kuitenkin olemassa useita tutkimuksia vain harvoin tai kokonaan ei ole havaita XMRV vuonna eturauhassyöpänäytteissä käyttäen PCR tai IHC menetelmillä [3], [4], [9], [21] – [26]. Havaitsimme äskettäin XMRV matalilla taajuuksilla (1%) satunnaisissa PCA näytteitä Pohjois-Euroopasta käyttäen PCR-monistus menetelmiä ja RNA eristettiin tuore kudosnäytteiden [27]. Expression of XMRV proteiinin sekä läsnäolo XMRV sekvenssien jopa 26% kaikista analysoitu PCA näytteistä osoitettiin vuonna 2009 soveltamalla immunohistokemiallinen (IHC) kokonaisten mount PCA kohdat anti-XMRV spesifistä antiseerumia [4], [20 ]. Kuitenkin viime raportin avulla Rauscher MLV gag antiseerumit joka tunnustetaan myös XMRV gag-proteiinia, ei vahvistanut näitä havaintoja [24]. Tutkimuksen mukaan Schlaberg et al. sai meidät uudelleen esiintyvyys XMRV PCA näytteistä IHC koska pesäketartunnat nähnyt IHC saattaa jättää väliin PCR-analyysillä. Lisäksi arvioimme läsnäolo XMRV proteiinin ilmentymisen osissa muiden pahanlaatuisten kasvainten sekä normaalia kudosta IHC. Käyttämällä äskettäin julkaissut anti-XMRV antiseerumia [4] sekä XMRV gag spesifistä antiseerumia emme pystyneet havaitsemaan XMRV gag-spesifisten solujen värjäys PCA tai muissa syöpäkudoksen. Kuitenkin yksi hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH) jakso selvästi näkyvissä positiivisia värjätyistä soluista käyttäen anti-XMRV gag k121 seerumin.

Vuonna 2009 XMRV tunnistettiin jopa 68% PBMC (perifeerisen veren mononukleaaristen solujen) näytteitä potilailta joilla on krooninen väsymysoireyhtymä ja 3-4%: n ohjaus kohortin osoitti merkkejä XMRV infektion [2]. PCR tiedot vahvistettiin soluriippuvaisesta sekä solu vapaa viruksen leviämistä verinäytteistä CFS potilaiden indikaattori soluihin. Kuitenkin useat myöhemmät tutkimukset muiden labs ei kyennyt todistamaan PCR eikä mitään virus siirtyy kokeet on toistettu mennessä [6], [9], [10], [11], [13], [15], [17 ], [18], [28], [29], [30], [31]. Äskettäin verinäytteistä CFS potilaat aiemmin raportoitu sisältävän XMRV sekvenssit uudelleen, kuitenkin tunnistettiin XMRV negatiiviseksi PCR-monistamalla strategioita ja serologia menetelmiä [12], [32].

Aiemmin tänä vuonna, kun taas tässä tutkimuksessa oli käynnissä, useita julkaisuja käsiteltiin aiheuttamia riskejä mukaan jälkiä hiiren DNA (parafiinileikkeillä, solulinjoja tai muista lähteistä) [7], [13], [15] ja riski väärän positiivisen PCR-tuotteiden joidenkin kaupallinen vahvistus sarjat [17], [33]. Lisäksi, Hue ja kollegat väittävät, että koska ei ole sekvenssin vaihtelu XMRV geenin fragmenttien potilaan isolaattien verrattuna sekvenssin vaihtelu tunnistettu XMRV positiivisen solulinjan 22Rv1, XMRV voi olla laboratorioon kontaminantin sijaan todellinen eksogeeninen ihmisen virus [11 ]. Vahva osoitus siitä, että XMRV on virusta ihmisen väestöstä on tunnistaa viruksen integraation sivustojen isännän genomissa [34]. Kuitenkin uudempi havainnot osoittavat, että kaksi integraation sivustot julkaistu aiemmin ovat samoja XMRV integraation sivustoja in vitro tartunnan solulinjassa DU145 [35]. Lisäksi Paprotka ja työtovereiden osoitettava, että XMRV peräisin kahdesta hiiren endogeenisen ennalta virukset, jotka tehtiin retrovirus- rekombinaatio soluviljelmässä siten viittaa siihen, että kaikki XMRV sekvenssit raportoitu tähän mennessä ei todennäköisesti peräisin tästä soluviljelmästä tapahtumaa [14]. Esitetyssä tutkimuksessa on osoitettu havaitsemista XMRV ja niihin liittyvien MLV-sekvenssejä ääreisverisoluissa eturauhassyövän potilaiden ja terveiden kontrollien motivoi havaitsemiseen XMRV verisolujen 3-4%: lla terveistä valvonnan [2], ja oletamme, että XMRV replikointi voitaisiin aktivoida immunosuppression vuoksi mukana PCA ja myöhemmin havaittavissa veressä potilaista. Yhteensä 100 verinäytettä mukana tutkimuksessamme. PBMC eristettiin, stimuloi ja sen jälkeen käytetään genomista DNA eristämistä tai viljelemällä kokeet Seuraavat julkaistut pöytäkirjat [1], [2]. Lisäksi uutteissa aktivoitu PBMC: t luodaan ja analysoitiin XMRV proteiinin ilmentymisen. Osoitamme, että PBMC: t yleensä voi olla in vitro tartunnan XMRV, jolloin 1-2% infektoiduissa soluissa, joita voidaan helposti seurata PCR: n tai proteiinin ilmentymisen analyysit mikä vahvistaa äskettäin julkaistut tulokset [10]. Vaikka virusgenomit ovat erittäin muokattu vuoksi Apobec rajoitusta, supernatantti XMRV tartunnan PBMC: istä tehokkaasti tartuttaa reportteri solulinja, Derse-iGFP. Tämä solulinja (tuottamat Vineet N. KewalRamani, National Cancer Institute, Frederick, USA) ilmaisee GFP toimittaja, joka aktivoidaan käänteistranskriptaasi ilmaisua. Vaikka herkkyys kaikki käytetyt tekniikat tutkimuksessamme on melko korkea, ei XMRV sekvenssit tai XMRV erityisen proteiinin ekspressiota havaittiin aktivoitu PBMC: t. Mielenkiintoista on, me havaittu supernatanttia 3/67 aktivoitu PBMC ja 2/67 viljelemällä kokeilut PBMC kanssa LNCaP, RT-aktiivisuuden tuloksena GFP-positiivisten Derse-iGFP soluissa, mutta emme pystyneet yksiselitteisesti todiste siitä, että nämä PBMC on tartunnan XMRV, muista RT-aktiivisuuden ei voida sulkea pois.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea liittovaltion Hamburg (no . OB-052-04).

Tutkimuskanta ja näytteenotosta. Tutkimus väestö ja näytteenotosta

verinäytteet 92 eturauhassyöpäpotilaalla (ikä 44-77) kerättiin yhtä päivää ennen eturauhasen. Kliiniset tiedot on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Lisäksi, verinäytteet 7 miestä (ikä 30-44) ilman mitään todisteita PCA oli mukana tutkimuksessa. Kaikki potilaat antoivat tietoon suostumus tieteelliseen käyttöön verinäytteiden; EDTA-verta potilaiden ja terveiden verrokkien käsiteltiin tiheysgradienttisentrifugaatiolla käyttäen Ficoll (Biocoll, Biochrom L6715). Ensisijainen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) erotettiin ja viljeltiin, kuten on kuvattu alla.

Solulinjat

Ihmisen eturauhassyöpä LNCaP (ATCC # CRL-1740), LNCaP DERSE- iGFP (saatiin ystävällisesti Vineet N. KewalRamani, National Cancer Institute, Frederick, USA) ja XMRV positiivinen ihmisen eturauhassyövän solulinja 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) kasvatettiin RPMI 1640: ssä (Gibco), jota oli täydennetty 10% FCS: ää, 5 % penisilliiniä /streptomysiiniä ja L-glutamiinia. Kroonisesti infektoiduissa LNCaP-soluja (XMRV) tuotettiin transfektoimalla proviraalisen XMRV VP62 DNA on julkaistu aiemmin [36] ja pidettiin useita viikkoja. PBMC: t eristettiin 10 ml: sta EDTA-verta ja viljeltiin RPMI 1640 (Gibco), samanlainen vahvistettu eturauhassyövän solulinjoissa, mutta lisäksi täydennetty PHA (5 ug /ml, Thermo Fisher Scientific) ja rhIL-2 (180 IU /ml, R D Systems).

viljelemällä kokeissa

1 ml solususpensiota, joka sisälsi 1 x 10

6-3 x 10

6 PBMC: t aktivoitiin 7 päivää, lisättiin 2 x 10

5 LNCaP-soluja ylläpidettiin 2 ml RPMI, joka sisälsi 8 ​​ng /ml polybreeniä 6-kuoppaisille levyille. Levyjä sentrifugoitiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja 800 x g. PBMC: t poistettiin 24 myöhemmin. LNCaP-soluja viljeltiin 6-8 viikkoa. Solut jaettiin kun maahan 100% konfluenssiin. Supernatantit otettiin sen jälkeen, kun 6 ja 8 viikkoa ja pantiin Derse-iGFP soluissa (katso alla).

positiiviset kontrollit ihmisen PBMC infektoitiin XMRV sisältävä supernatantti LNCaP XMRV soluja. Ilmoitetun määrän virusta, joka sisälsi supernatanttia XMRV tuottavista soluista (vähintään 80% yhtymäkohta) steriilisuodatettiin ja lisättiin 3 x 10

6 PBMC: t esi-aktivoitu kaksi päivää. Levyjä sentrifugoitiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja 800 x g. XMRV sisältävä supernatantti poistettiin seuraavana päivänä pelletoimalla solut 200 x g, pesemällä ne 10 ml: aan PBS (Gibco) ja levittämällä sen jälkeen ylimääräinen sentrifugointilla uudessa 6-kuoppalevyllä 2 ml RPMI, joka sisälsi PHA ja rhIL-2. PBMC viljeltiin 7 päivää ennen analysointia supernatantti, co-viljely, nukleiinihappo ja proteiinin uuttamalla.

Infektio käyttäen replikaatiokompetentin XMRV

XMRV VP62 proviraalinen DNA transfektoitiin LNCaP solut tuottamaan viruksen sisältäviä supernatantti kuten aiemmin on kuvattu [34], [36].

PCR

Genominen DNA uutettiin PBMC: istä käyttäen Qiagen QIAamp mini kit ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Nukleiinihapon pitoisuudet määritettiin käyttäen Nanodrop (Peqlab). Eri sisäkkäisiä PCR kohdistamista gag- ja env-sekvenssit tehtiin niinkin äskettäin julkaistu [1], [3], [19], käyttäen 650 ng templaatti-DNA reaktiota kohden. Gag ulkopuolella aluke: 419F 5’ATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGAC-3 ’, 1154R 5′-GCCGCCTCTTCTTCATTGTTCTC-3′; sisällä aluke: NP116F 5′-CATGGGACAGACCGTAACTACC-3’and NP117R 5’-GCAGATCGGGACGGAGGTTG-3 ’. Määrittää herkkyyden Gag PCR alunperin julkaissut Urisman et al. seuraavat alukkeet sovellettu: GAG 5’-CGCGTCTGATTTGTTTTGTT-3 ’, GAG tai 5’CCGCCTCTTCTTCATTGTTC-3’, GAG IF 5’TCTCGAGATCATGGGACAGA-3 ’ja GAG IR 5’AGAGGGTAAGGGCAGGGTAA [19]. Env-PCR suoritettiin, kuten julkaistiin äskettäin [3] käyttäen seuraavia alukepareja F 5’-ACCAGACTAAGAACTTAGAACCTCG-3 ’, R5′-AGCTGTTCAGTGATCACGGGATTAG-3′, IF 5’-GAACAGCATGGAAAGTCCAGCGTTC-3 ’ja IR-5′-CAGTGGATCGATACAGTCTTAGTCC-3’ . Eheyden DNA-näytteet ja läsnäolo oletettujen inhibiters kontrolloitiin monistamalla GAPDH, F 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ’ja R 5’ GAAGATGG TGATGGGATTTC-3 ’.

Western Blot

Solulysaatit muodostettiin käyttäen RIPA-puskuria, joka sisälsi 1% Triton-X 100 ja proteaasi-inhibiittorin yhdistelmää (Roche). Erityisen proteiinin vyöhykkeet havaittiin polyklonaalisella Env-vasta Rauscher 77S85 (lahja C. Stocking, Heinrich-Pette Institute, Hampuri, Saksa), XMRV erityiset kanin polyklonaalista Gag antiseerumia k121 ja p30-Gag tunnustaa hybridoomapintalietettä CRL-1912-soluja (ATCC) . Equal proteiinia määrät kaistaa kohti varmistettiin anti-ihmisen aktiini-vasta mAB 1501 (Chemicon) inkubointi. Havaitsemiseksi XMRV hiukkasten soluviljelysupernatanttia, steriilisuodatettiin elatusaineeseen infektoitujen solujen ultrasentrifugoitiin 1 tunnin ajan, 110,000 x g 4 ° C: ssa (Beckman SW60Ti). Pelletti on 11ml supernatanttia resuspendoitiin 10 ui PBS: ää ja analysoitiin immunoblottauksella.

Solun viiva parafiinileikkeillä ja TMA

1 x 10

7-soluissa (LNCaP, LNCaP kroonisesti tartunnan XMRV , 293T, 293T kroonisesti tartunnan XMRV ja hiiren SC1 solut) kiinteään 20 h 10% fosfaattipuskuriforaliinissa, upotettu agar ja prosessoidaan parafiinivahaa [37].

ennestään TMA sisältävä eturauhasessa ( 50 huono laatu PCA, 50 korkealaatuista PCA ja 50 eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH)) käytettiin IHC.

Immunhistochemistry

diat parafiinilla eturauhassyövän potilaiden taudin tuli parafiini käyttäen ksyleeniä. Antigeenin haku kohdat kuumennettiin 4 x 2 min sitraattipuskurissa käyttäen mikroaaltouuni (650W) ja jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Esto suoritettiin 30 minuutin ajan RT: ssä 10% sian seerumin vasta-laimennuspuskuriin (Dako). Jälkeenpäin endogeeninen biotiini estettiin käyttämällä Avidin /Biotiini Kit (Dako). Primääristä vasta-ainetta (laimennettu vasta-aine, laimennus puskuriin, jossa on 2% sian seerumia, anti-XMRV 1:7500, XMRV anti-gag k121 1:5000) inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa kosteassa kammiossa. Kontrollit olivat joko päällystettiin vastaavan ennalta seerumi (sama laimennus) tai vain vasta-laimennospuskuria 2% sian seerumia. Inkuboinnin kanssa sekundaarisen vasta-aineen – biotiini /streptavidiini leimattu – suoritettiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Myöhempää havaitsemista sitoutuneet vasta leimattu osat päällystettiin alkalisella fosfataasilla ratkaisu (Dako, AK 5000) mukaan valmistajan ohjeiden. IHC värjäys, joka sisälsi levamisoli estää endogeenisen alkalisen fosfataasin lisättiin dioja 15-20 min, kun taas counterstaining suoritettiin Mayers HAMIN ratkaisuja. Anti-XMRV Seerumin ystävällisesti Ila Singh (University of Utah, USA).

Tulokset

XMRV proteiinin ilmentymistä PCA kudoksessa IHC menetelmillä

Vuonna 2009 toteaminen 23% PCA osien positiivisia XMRV proteiinin ilmentyminen on raportoitu [4]. XMRV proteiinin ekspressio, joka on useimmissa tapauksissa paikallisia kasvaimen epiteelin korreloi voimakkaasti suurempi Gleason laadut. Mielenkiintoista on, että proteiinin ilmentymisen tietoja ei korreloinut PCR-tuloksiin. Yksi otaksuttu selitys vähä polttoväli tartunnan XMRV eturauhasen solujen, jotka ovat tuskin havaittavissa PCR: llä käyttämällä DNA koko vuori kudosleikkeiden mallina. Nämä löydökset eivät vahvistettiin toisessa tutkimuksessa [24]. Myötävaikuttaakseen selitys poikkeamia me seulotaan koko PCA kohdat sekä TMA käyttämällä äskettäin julkaissut anti-XMRV seerumia [4] ja kaniinin polyklonaalista anti-XMRV gag seerumia (gag k121).

Molemmat sera on testattu Western Blot analyysit gag k121 seerumin nimenomaan tunnustaa ksenotrooppiset gag-proteiinia, kun näyttö ei ristireaktiivisuus tahansa solun proteiinien. Sitä vastoin anti-XMRV seerumia [4] tunnustetaan myös solun proteiinien kuin tartunnan ihmisen ja hiiren solulinjoja (täydentävä kuva S1). Meillä syntyy parafiinileikkeillä edustavat ihmissolulinjat 293T, LNCaP, molemmat solulinjat infektoitiin XMRV ja hiiren solulinja SC1. Molemmat antiseerumit tunnistavat XMRV proteiinia ilmentävien solujen parafiinileikkeet esittää rakeinen värjäytymistä sytoplasmassa (kuvio 1). O värjäys infektoitumattomiin soluihin ja ei värjäytymistä SC1 hiiren soluissa havaittiin. Yhteensä 100 PCA (huono laatu ja korkea laatu PCA) ja 50 BPH edustettuina TMA sekä 10 suurta eturauhassyövän (korkea Gleason Score) analysoitiin gag k121 seerumin (taulukko 2). Lisäksi TMA sisältävät rinta-, paksusuolen ja eturauhasen syövän sekä useita normaaleja kudoksia testattiin XMRV proteiinin ilmentymisen. Kukin IHC värjäys ohjata, mukaan lukien positiivisia kontrolleja (parafiinileikkeitä solulinjat) ja negatiivinen kontrolli (ei ole lisätty ensimmäisen vasta-aineen) sekä korkeammat laimennoksilla ensimmäisen vasta-aineen. Mitään värjäytymistä syövän kohdissa havaittiin sekä suurin osa kontrollisilkkipaperia oli negatiivinen gag k121 värjäystä. Vain yksi osa BPH näkyy hyvin vähän satunnaisia ​​pohjapinta-positiivisiksi värjäytyneiden solujen anti-gag k121 seerumia (kuvio 2). Mikään TMA testattiin anti-XMRV seerumin koska korkean taustan vuoksi TMA sukupolvi menetellä on.

Parafiinisektioista solun linjajärjestelmän sisältävä XMRV infektoituneen solulinjoissa sekä ei infektoituneen solulinjoja värjättiin XMRV proteiinin ilmentymisen käyttäen anti-XMRV seerumia (A) tai anti-gag k121 polyklonaalista kanin seerumia (B). Suuremmat suurennokset näytetään XMRV infektoiduissa soluissa sekä luonnonvaraisesta hiirisolulinjaa, SC1.

1/50 BPH satunnainen positiiviset värjätyt solut havaittiin, joiden voidaan tyvisoluihin perustuu niiden lokalisointi eturauhasen.

Aktivoidut PBMC voidaan tartunnan XMRV kuitenkin XMRV replikaatio rajoitetaan PBMC.

jälkeen hypoteesin julkaisema Lombardi et al, että XMRV voi havaitaan PBMC jopa 67% CFS potilaista sekä enintään 4% terveiden valvontaa [2] me tarkoitettu aktivoimaan PBMC PCA potilaista ja verrokeilla ja näyttö XMRV infektion soveltamalla erilaisia ​​menetelmiä. Ensin vakiinnuttaneet XMRV tunnistus menetelmiä PBMC, jotka ovat olleet vitro tartunnan virussupernatanttia sisältävien VP62 XMRV. Provirus-DNA: ta käytettiin tuottamaan XMRV tarttuvan supernatantteja LNCaP-soluista, jotka tukevat vahvasti XMRV replikaation vahvan aktivointi LTR sekä puute retroviruksen rajoituksen tekijät Apobec 3G ilmaisun [36], [38] – [41]. PHA aktivoitu PBMC: itä in vitro tartunnan osoitetuilla määrillä virussupernatanttia (kuvio 3), jotka viljeltiin, kun läsnä on IL2 vielä 7 vrk. Virus, joka sisältää supernatantti ultrasentrifugoitiin ja viruksen pelletit (kuvio 3A) samoin kuin solulysaatissa (kuvio 3B) tartunta-PBMC: t analysoitiin Western blotting -tekniikalla varmistetaan ekspressio XMRV erityisiä proteiineja. Perustuen Western Blot kokeellisesti kroonisesti infektoiduissa LNCaP laimennetaan ilmoitetun solun määrä infektoimattomia 293T-solut (kuva S2) voidaan arvioida, että noin 1-2% PBMC ovat sairastuneet XMRV. Vain jos tartuttaa PBMC: t, joilla on korkea virustiittereitä me tehokkaasti havaita XMRV viruksen pelletti ultrasentrifugaation jälkeen ja Western blot -analyysi (kuvio 3A). Eristetyn genomisen DNA: Näiden in vitro XMRV tartunnan PBMC-oli positiivinen XMRV sekvenssien PCR: llä käyttäen 650 ng genomista DNA: ta ja kahta eri alukkeen sarjaa kohdistaminen gag ja env (kuvio 4A ja kuvio S3). Herkkyys kaikki PCR-reaktiot on osoitettu täydentävän kuviossa S4 kaikki PCR havaitsemiseksi 1-10 tartunnan solujen taustalla 10

6 infektoitumattomiin soluihin.

PBMC: t kahdesta eri luovuttajilta eristettiin, yhdistettiin, PHA stimuloi ja sen jälkeen infektoitiin osoitetuilla määrillä XMRV sisältävä supernatantti (kaista 1-5). Western Blot-analyysi solulysaattia tartunnan PBMC: istä suoritettiin 7 d viimeisen infektio (B). Supernatantissa tartunnan PBMC rikastettiin varten viruspartikkelien ultrasentrifugoimalla ja värjättiin CA lauseke (A). (C) 500 ui XMRV sisältävä supernatantti on peräisin PBMC: istä on esitetty A ja B käytettiin infektoimaan Derse-iGFP soluja, jotka analysoitiin GFP: n ilmentymisen 7 d viimeisen infektion FACS. Tittereitä merkitty GFP infektoivaa yksikköä /ml. (D) Infektio Derse-iGFP solujen 100fold lisääntynyt viljelemällä tartunnan PBMC-(esitetty (A)) ja LNCaP-soluja, 7 d, SN LNCaP-soluja levitettiin sitten Derse-iGFP soluja, jotka analysoitiin FACS: llä 5 d pi.

(B) Derse-iGFP solut infektoitiin 500 ul supernatanttia 22Rv1 soluista, mock infektoituneita soluja tai LNCaP viljellään kanssa XMRV tartunnan PBMC 14 d. 72 h ohi infektio Derse-iGFP soluja seurattiin GFP-positiiviset solut mikroskoopilla.

viljelemällä XMRV tartunnan PBMC kanssa LNCaP lisää merkittävästi herkkyyttä XMRV havaitsemisen.

Derse-iGFP solut altistettiin suodatettiin viljelmäsupernatanttia XMRV tartunnan PBMC:. 500 ui supernatanttia lisättiin 5 x 10

4 Derse-iGFP soluja, jotka pisteytettiin GFP: n ilmentymisen 7 d p.i. mikroskoopilla ja FACS-analyysi (kuvio 3C). Yleensä virussupernatanttia PBMC: istä on tarttuva, mutta vain hyvin harvat GFP-positiiviset solut havaittiin. Mielenkiintoista, jos cocultivate XMRV tartunnan PBMC kanssa LNCaP 5 d, sato supernatantti ja reinfect Derse-iGFP solujen suodatettu kelluva, herkkyys XMRV havaitseminen käyttäen Derse-iGFP solujen 100fold lisääntynyt Kuva 3D ja kuvio 4B.

PBMC PCA potilaat ovat negatiivisia XMRV havaitsemiseen PCR-analyysillä

tällä menetelmällä olemme eristetty PBMC: 92 PCA potilaista ja 7 terveillä vapaaehtoisilla Ficoll kaltevuus; eristetyt PBMC: t PHA aktivoidaan ja viljeltiin IL-2: 7 d. PBMC: t altistettiin eri määrityksissä esitetään kuviossa 5A: genomisen DNA: n eristäminen, jota seuraa XMRV erityisiä nested PCR soveltaa kahta julkaistu XMRV PCR strategioita [1], [3], [19]; viljelemällä aktivoitu PBMC kanssa LNCaP 8 viikkoa myöhemmin infektio Derse-iGFP soluihin käyttäen supernatanttia 6 viikkoa ja 8 viikkoa sen jälkeen viljelemällä. Lokalisointi eri alukesarjat käyttää, on esitetty kuviossa S3 ja herkkyys eri XMRV PCR: t näkyy kuviossa S4. Eheyden genomista DNA yhdessä ilman otaksutun PCR estäjien varmistettiin GAPDH vahvistus (kuva S4). Viljelyn PBMCdden, DNA valmistelut ja PCR-monistusta suoritettiin laboratoriot Heinrich-Pette Institute joissa ei ole muita XMRV tutkittu. Lisäksi kaikki sisäkkäisiä PCR: ää havaitsemaan XMRV sekvenssejä käytetään kahta eri alukepareja kohdistaminen gag, sekä äskettäin julkaissut sekä env PCR ajettiin kahden operaattorin käyttäen 650 ng genomista DNA: ta templaattina. Kaikki DNA-näytteet havaittiin olevan johdonmukaisesti negatiivisia (taulukko 3). PCR-reaktiot rutiininomaisesti ohjataan hiiren saastuminen käyttämällä alukkeita suunnattu retrotransposoneja, intracisternaalisesti Hiukkanen (IAP), kuten äskettäin julkaistu [15]. Mikään PCR-reaktiot olivat positiivisia hiiren DNA-sekvenssien (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Methods käyttää seulomaan XMRV PBMC: eissä PCA potilaiden ja terveiden verrokkien. (B) Derse-iGFP soluja 72 h p.i. jossa SN LNCaP viljellään 8 viikon ajan potilaan peräisin PBMC (ylempi paneeli). Alempi paneeli näyttää Derse-iGFP soluissa 72 tuntia infektoinnin jälkeen SN potilaasta peräisin PBMC jotka aktivoitiin PHA 7d.

67 PBMC näytteet viljellään kanssa LNCaP jopa 8 viikkoa ja SN LNCaP sovellettiin toimittaja solulinja Derse-iGFP. Tämä solulinja kantaa MLV vektori, joka johtaa ekspressio GFP reportteri, jos käänteiskopioijaentsyymin ilmaistaan. 72 h p.i. Derse-iGFP soluja seurattiin GFP: n ilmentymisen mikroskoopilla. 67 näytettä supernatantti PBMC: istä viljellään kanssa LNCaP-solujen, kaksi johti 2-3 GFP-positiivisten solujen 5 x 10

4-solut (kuvio 5B). Emme havainneet kasvua GFP-positiivisten solujen ajan osoittaa, ettei leviämistä virusinfektio. Mielenkiintoista supernatantti aktivoitujen PBMC nämä kaksi potilailla, joilla ei viljelemällä johti myös 1-2 GFP-positiivisten Derse-iGFP solua kuoppaa kohti. Eräässä tapauksessa kaksi riippumatonta PBMC-eristykset samasta potilaasta suoritettiin (# 99 ja # 100), jotka molemmat johti 1-2 GFP-positiivisten Derse-iGFP soluja. Kuitenkin molemmat eristykset suoritettiin samana päivänä saman operaattorin. PCR LNCaP viljellään kanssa PBMC Näiden kahden potilaan ei johtanut havaitsemiseen XMRV spesifiset sekvenssit sekä emme voineet kulttuuriin ja laajentaa GFP-positiivisten Derse-iGFP solujen myöhempää analyysejä.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme tutkineet havaitsemiseen XMRV eturauhassyöpäpotilailla tutkimalla eri diagnostisia bio näytteitä läsnäolo XMRV tai liittyvien MLV sekvenssit. Erityisesti olemme analysoitu PCA kudosnäytteiden sekä kudososat muiden pahanlaatuisten kasvainten ja normaaleissa kudoksissa varten XMRV proteiinin ilmentyminen IHC. Lisäksi PBMC 92 PCA ja 7 terveillä verrokeilla seulottiin läsnäolon XMRV sekvenssit ja talteenotto tarttuvan viruksen. PBMC-solut PHA aktivoitu, viljellään jopa 8 viikkoa ja XMRV läsnäolo tutkittiin joko nested PCR suunnattu kahdesta eri XMRV alueilla, Western Blot-analyysit käyttämällä erilaisia ​​anti-XMRV vasta-aineita tai infektio Derse-iGFP solujen soveltamalla supernatantti aktivoitu PBMC: tai supernatanttia LNCaP-solut viljellään kanssa PBMC jopa 8 viikkoa.

Emme voineet lopullisesti osoittamaan, että XMRV sekvenssit voidaan havaita aktivoida PBMC PCA verrattuna, vaikkakin kahdella potilaalla GFP-positiivisten Derse-iGFP soluja havaittiin. Molemmissa tapauksissa myöhemmin PCR-analyysit aktivoitujen PBMC sekä Yhteisviljeltyjä LNCaP olivat negatiivisia XMRV sekvenssit sekä emme löytäneet XMRV proteiinin ilmentymistä PCA osissa yksi näistä potilaista.

aiemmin julkaistu että XMRV sekvenssit vain harvoin havaitaan Saksassa käyttämällä cDNA tuotettu PCA kudoksesta RNA monistettiin PCR [27]. Samanlaisia ​​tuloksia tutkimuksesta Yhdysvalloissa on hiljattain julkaisema Switzer et al., [26]. On kuitenkin olemassa useita tutkimuksia ole yksilöity XMRV jaksoja PCA kudosta sekä olemassa tutkimuksia, joilla on korkeampi esiintyvyys XMRV PCA [3], [9], [21] – [24], [31], [42] . Harkitsee mahdollisuutta polttoväli XMRV infektion eturauhasen, joita voidaan hukata PCR-monistamalla vuoksi vain pieni osa soluista tartunnan perustimme IHC värjäystä käyttäen julkaistun anti-XMRV seerumia ja XMRV erityinen anti-gag seerumia. Emme onnistuneet havaitsemaan XMRV proteiinin ilmentymistä PCA kudoksessa, rintasyöpä tai paksusuolensyöpä kudosta sekä useimmat kontrollikudoksen (mukaan lukien 10 osiota: lisämunuaisen, paksusuoli, kohdun limakalvo, lisäkives, sydän, munuaiset, keuhkot, haima, istukka, korvasylkirauhasessa , perna, maha, poikkijuovaisten lihassolujen, kateenkorva, kitarisa ja kiveksissä) ei osoittanut mitään positiivista värjäytymistä gag k121 seerumia. Mielenkiintoista on, että käyttämällä anti-gag k121 seerumin olemme havainneet 1/50 BPH osat positiivinen XMRV proteiinin ilmentymisen. Proteiinin ilmentyminen todettiin muutama erillinen tyvisolujen eturauhasen epiteelissä. Tyvisolut puuttuvat PCA, tukee se, että XMRV todennäköisesti ei ole suoraan mukana PCA kehittämiseen. Pieni määrä koko vuori kudosleikkeiden tutkittiin voisi selittää välinen ero havaintomme ja aikaisempien havaintojen Schlaberg et al. [4]. Olemme vain värjättyä kymmenen koko vuori kudosleikkeiden molempien antiseerumien, anti-XMRV seerumia [4] ei käytetty TMA osissa johtuen korkeasta taustavärjäyksen. Aloia et ai. ja Sakuma et ai. sekä keskustella ristireaktiivisuutta anti-XMRV seerumi ihmisen proteiiniantigeenit johtaen IHC positiivista värjäytymistä PCA kohdissa [16], [24]. Havaitsemme joitakin ristireaktiivisuus julkaistun anti-XMRV seerumin Western blotit analysoidaan solulysaateista peräisin tartunnan ja muiden infektoituneiden solujen, mutta ei ollut taustaa havaittu parafiinileikkeillä solulinjojen tai kokonaisia ​​PCA kudoksesta käyttäen seerumia on ilmoitettu laimennoksina . Negatiivinen IHC värjäystä ei sulje pois mahdollisuutta muutaman solun kuljettavat XMRV provirus- sekvenssit, jotka voisimme kaipaamaan PCR-monistuksella. Emme koske DNA FISH teknologiaa havaitsemaan XMRV provirus- integraation ihmisen kudosta. Arviointia FISH positiivinen signaali 0,1% tai vähemmän soluja varsinkin jos vain yksi viruksen kopio per solu on odotettavissa, on erittäin altis virheille.

Äskettäin Lombardi et ai. raportoitu havaitseminen ja tarttuvien XMRV peräisin PBMC tai plasmasta potilaiden CFS by coculturing kanssa LNCaP [2]. Mielenkiintoista, 3-4% PBMC eristettiin verrokeilla havaittiin olevan positiivinen XMRV tarttuvan viruksen seurauksena yleinen huoli turvallisuudesta verituotteiden. Useat myöhemmät tutkimukset motivoi nämä tulokset eivät pystyneet vahvistamaan nämä alkuperäiset havainnot. Syyt diskordanssi- ovat epäselviä ja parhaillaan tutkitaan. Vaikka suurin osa tutkimuksista keskityttiin PCR tekniikoita sekä havaitseminen XMRV spesifisten vasta-aineiden ainoastaan ​​yhden tutkimuksen mukana viljelemällä aktivoitu PBMC CFS potilaille, joilla LNCaP [10] ja uudempaa Tutkimuksessa testattiin välittämistä XMRV plasmasta (johdettu CFS potilasta) ja LNCaP-soluja [43]. Molemmissa tutkimuksissa ei havaittu XMRV missään testatussa. Keskittyminen mahdollisuutta, että XMRV on sivullinen virus uudelleen eturauhassyöpäpotilailla yhdessä toteamisesta XMRV voidaan havaita PBMC potilaista [2] etsimme merkkejä XMRV infektion verisoluihin PCA potilaiden soveltamisessa PCR-tekniikan ja viljelemällä aktivoitu PBMC kanssa ilmaisin soluihin.