PLoS ONE: Anti-Cancer-IgM-vasta-PAT-SM6 sitoutuu korkealla Avidity levitettyyn proteiinivaste Regulator GRP78
tiivistelmä
monoklonaalinen IgM-vasta-PAT-SM6 peräisin ihmisen kasvaimista indusoi apoptoosia kasvainsoluissa, ja pidetään mahdollisena syöpälääkkeen. Ensisijainen tavoite PAT-SM6 on levitetyssä proteiinivaste säädin GRP78, yli-ilmentynyt ulkoisesti solun kasvainsolujen pinnalla. Pienen kulman X-ray scattering (SAXS) tutkimukset ihmisen GRP78 osoitti kahden domeenin käsipaino-muotoinen monomeeriä, kun taas SAXS-analyysi PAT-SM6 paljasti lautasen muotoinen rakenne mahtuu viisi kertaa symmetria, sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten liittyvien proteiinien. Laskeutumisnopeus analyysi GRP78 ja PAT-SM6 seosten osoitti heikkoa kompleksin muodostumisen ominaista dissosiaatiovakiot korkealla mikromolaarisella konsentraatioalueella. Sen sijaan entsyymi immunosorbenttimääri- määritykset (ELISA) osoitti vahvaa ja erityisiä vuorovaikutukset PAT-SM6 ja immobilisoitua GRP78. Näennäinen sitoutumisvakio arvioitiin PAT-SM6 saturaatiokäyrään korreloi voimakkaasti pitoisuus GRP78 päällysteenä mikrotiitterilevyjen lokeroon. Kokeissa, joissa käytettiin polyklonaalisia antiGRP78 IgG-vasta-aineita tai monoklonaalisia IgG johdannainen PAT-SM6 eivät osoittaneet samanlaista riippuvuutta. Kilpailu kokeiluja liukeneva GRP78 osoitti tehokkaampi estäminen PAT-SM6 sitova alhaisissa GRP78 pinnoitteen pitoisuuksina. Nämä havainnot viittaavat siihen, aviditeettijärjestyksellä perustuva sitova mekanismi, joka riippuu monen pisteen kiinnitys PAT-SM6 jotta GRP78 ryhmittyneet pinnalla lokeron. Analyysi ELISA dataa suurella GRP78 pinnoitteen pitoisuuksia tuotti dissosiaatiovakio on noin 4 nM. Ehdotamme, että biologinen vaikutus PAT-SM6 tuumorisolun apoptoosia voi riippua moniarvoisen luonteesta PAT-SM6 ja korkean aviditeetin sen vuorovaikutusta useiden GRP78 molekyylien ryhmittyneet on kasvainsolun pinnalla.
Johdanto-osan: Rosenes Z, Mulhern TD, Hatters DM, Ilag LL Power BE, Hosking C, et al. (2012) Anti-Cancer-IgM-vasta-aineen PAT-SM6 sitoutuu korkealla Avidity on auki taitettuna Protein Response Regulator GRP78. PLoS ONE 7 (9): e44927. doi: 10,1371 /journal.pone.0044927
Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat
vastaanotettu: 21 kesäkuu 2012 Hyväksytty: 09 elokuu 2012; Julkaistu: 19 syyskuu 2012
Copyright: © Rosenes et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Australian Research Council (LP100100392) lisätukea, jonka Patrys Oy rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut : Tämä työ on osittain tukevat Patrys Ltd, jonka tällä hetkellä kliinisten kokeiden PAT-SM6 mahdollisena anti-syövän hoitoon.
Johdanto
Natural IgM- vasta tärkeä rooli synnynnäisen immuunivasteen, jossa ne ovat mukana varhaiseen toteamiseen hiukkasia sekä havaitsemista muunnetun itse rakenteita myös kemiallisesti muunnetut proteiinit ja amyloidisäikeitä [1], [2], [3]. IgM-vasta-aineita myös osallistua tunnustamista ja poistaminen transformoitujen solujen tärkeänä puolustus syöpää vastaan [4]. Viimeaikainen kehitys ihmisen hybridoomateknologiaa [5] on johtanut eristämiseen suuri määrä monoklonaalisia vasta-aineita IgM-luokkaa peräisin kasvainten syöpäpotilaiden [6]. Monet näistä vasta-aineiden spesifisesti tappaa pahanlaatuiset solut indusoimalla apoptoottisten reittien [7], jossa tuodaan esiin mahdollinen käyttö monoklonaalisten IgM-vasta-aineiden uusien syövän hoitojen.
ihmisen IgM: n monoklonaalisella vasta-aineella, PAT-SM6 indusoi kasvainsolujen kuolemaa kautta apoptoottisen reitin mukana solunsisäisten lipidien kertymistä [8]. PAT-SM6 kohdistuu kasvainsoluihin, sitomalla proteiinin GRP78, joka on yli-ilmentynyt ulkoisesti solun tuumorisolujen pinnalla [9]. GRP78, joka tunnetaan myös nimellä BiP (immunoglobuliinin raskasketjun sitova proteiini), on jäsen lämpöä pösokkiproteiini 70 (HSP70), perheen, joka estää stressin indusoiman apoptoosin. PAT-SM6 sitoo myös low density lipoprotein (LDL) ja hapettuneen LDL: [8], joka johtaa toimiva malli kasvain-spesifisen apoptoottista aktiivisuutta PAT-SM6 jolloin PAT-SM6 tuottaa ylimäärin lipidin muodossa sitoutuneen LDL tai hapettuneen LDL osaksi kasvaimet sitoutumalla muutettu GRP78 läsnä kasvainsolujen pinnalla [8].
(A) GRP78 ilmennettiin ja puhdistettiin
E. coli
soluja, ja altistettiin ympyrädikroismilla spektroskopialla. Edustava radiotaajuuksia 0,15 mg /ml puhdistettua GRP78 25 ° C: ssa (avoimet ympyrät) ja sovitus välillä Dichroweb suodatinlaseilla asetettu sp175 (yhtenäinen viiva) on esitetty. (B) laskeutumisnopeus analyysi GRP78 suoritettiin sentrifugoimalla 0,4 mg /ml GRP78 28000 rpm analyyttisen ultrasentrifugissa. Tuloksena sedimentoituva absorbanssia rajoja seurattiin 280 nm ja edustavia tietoja esitetään avoimet ympyrät. Sopii Kokeellisten tietojen avulla c (S) sedimentaatio malli on esitetty yhtenäisillä viivoilla. Selvyyden vuoksi vain joka kymmenes skannaus näkyy. (C) kokojakauma tontteja 1,2 mg /ml GRP78 (yhtenäinen viiva) tai 0,6 mg /ml GRP78 (katkoviiva) laskettiin asentamisesta tiedot edustettuina (B) ja ac (S) sedimentaatio malli.
Pre-kliinisissä malleissa ihmisen syövän osoittavat PAT-SM6 kasvaimen kasvun inhibitiota [8], mikä viittaa mahdollisen hoidon syövän hoitoon. Turvallisuutta ja siedettävyyttä PAT-SM6 kuin syövän vasta-aine melanooman hoitoon on osoitettu äskettäin vaiheen I kliinisen tutkimuksen [10]. Jatkokehitys PAT-SM6 tehokkaana solunsalpaajaksi avustaa tarkempaa tietoa rakenteellinen perusta ja vahvuus vuorovaikutuksesta PAT-SM6 kanssa kohdeantigeeneinä. Tämä tieto on välttämätöntä, jotta tiedon ennustamiseen ei-toivottuja sivuvaikutuksia, jotka liittyvät terapeuttiseen käyttöön PAT-SM6 yksin tai yhdessä muiden aineiden kanssa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet rakenteen ja vuorovaikutuksia puhdistettiin PAT-SM6 rekombinantti ihmisen GRP78 ilmennettiin ja puhdistettiin bakteereista. Käyttäen sedimentoitumisnopeuden analyysi ja entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA: t), me osoitamme, että vaikka PAT-SM6 on suhteellisen alhainen affiniteetti yksittäisten GRP78 molekyylien vuorovaikutus PAT-SM6 kanssa GRP78 molekyylien ryhmittyneet pinnalla mikrotiitterilevyn on paljon vahvempi ja ominaista ilmeinen Sidosvoiman vakioita alhaisen nanomolaari- pitoisuusalueella.
Materiaalit ja menetelmät
ihmisen monoklonaalinen vasta-aine PAT-SM6 ja muunnetun heksameeristen johdannainen, PAT-SM6-hex, puuttuu tuloaan J ketju, ilmennettiin ja puhdistettiin stabiileja suspensioviljelmissä ihmisen solulinjan seerumittomassa tiedotusvälineet [11], [12]. Samanlaisia menetelmiä käytettiin ilmaisemaan ja puhdistaa IgG-johdannainen (PAT-SM6 IgG), joka koostuu raskaan ja kevyen ketjun sekvenssit PAT-SM6. Isotyyppikontrollia IgM saatiin Jackson Immuno- Labs, Inc, West Grove, PA. Koodaavan sekvenssin koko pituuden, ihmisen kypsän GRP78-geeni insertoitiin pPOW lämpöä induktion vektori, jolloin konstruktio, jossa on N-terminaalinen pelB erityssekvenssillä ja C-terminaalinen 6xHis-tag [13]. Proteiini ilmennettiin
E. coli
BL21 (DE3) solut ja puhdistettiin sitten liukoinen osa solulysaatista nikkelin affiniteettikromatografialla käyttäen 5 ml His-Trap-kolonniin (GE Healthcare) mukaan valmistajan protokollaa. Glukoosi-isomeraasia saatiin Hampton Research, Aliso Viejo, CA.
Ympyrädikroismi (CD) mittaukset
CD-spektri GRP78 (0,15 mg /ml) ja PAT-SM6 (0,15 mg /ml) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS; 20 mM natriumfosfaatti, 140 mM NaCl, pH 7,4) hankittiin käyttäen Avivin Model 62 DS CD spektrometri (Aviv Biomedical, Inc., Lakewood, New Jersey), 25 ° C: ssa 1 mm väyläpituutta kvartsikyvettiin, spektrinen kaistanleveys 1 nm, signaalin keskiarvon aika 2 s ja datan väli on 0,5 nm. Ellipticities in millidegrees korjattiin mittauksissa pelkän puskurin ja muunnetaan tarkoitetaan jäämien ellipticities (MRE) käyttäen kaavaa MRE = elliptisyytenä × MRW /(10 x c × l) jos MRW on keskimääräinen jäännöksen paino g /mol, c keskittymä mg /ml, ja l polun pituus cm. CD-spektrit analysoitiin saada arvioiden sekundaarisen rakenteen avulla Dichroweb [14].
(A) Raaka SAXS tiedot näkyvät ympyrät edustavat keskimääräistä voimakkuutta
I
(
q
) funktiona momentinsiirron
q
. Virhe palkit osoittavat ± 1 keskihajonta (σ). Musta symbolit:
I
(
q
) ≥ σ ja harmaa symboleja:
I
(
q
) σ. (B) Guinier juoni näille SAXS tietoja q.Rg 1.3. (C) Kratky käyrä SAXS datan. (D jolloin, Kratky tonttien ekstrapoloitiin alhaisilla
q
(
q
q
min) käyttämällä Guinier lähentäminen ja ekstrapoloitu suurilla
q
(
q
jossa
I
(
q
)
/I
(0) 0,01) käyttäen Porod lähentämisestä [18].
Ab initio
muoto rekonstruktiot leviä tiedot suoritettiin käyttäen DAMMIF [19] ja oli keskimäärin suodatetaan muotoja laskea kokonaisuuksista 10 rekonstruktioista käyttäen DAMAVER sarja ohjelmia [20]. Jäykkä runko hienostuneisuus lisäämällä puuttuvat segmenttien suoritettiin käyttämällä CORAL [21] useita ketju mallit. Teoreettinen sironta profiileja rakenteellisia malleja syntyi ja verrattiin kokeellisen SAXS dataa CRYSOL [22]. Rakenteelliset mallit ja muodon kirjekuoria, joissa optimaalisesti päällekkäin käyttäen SUPCOMB [23]. Tilastollinen vertailut sovituksen hyvyys teoreettinen sironnan profiileja rakenteellisia malleja kokeellista SAXS tietoja tehtiin laskemalla
F
-statistic varten paria sovitukset ja integroida sopiva
F
-jakaumaa [ ,,,0],24].
laskeutumisnopeus Analyysi
laskeutumisnopeus kokeet toteutettiin käyttäen XL-I analyyttinen ultrasentrifugilla (Beckman Coulter, Fullerton, CA), joka on varustettu An-60 Ti -roottorissa 20 ° C: ssa . Proteiininäytteet lisättiin kahden sektorin EPON täytetty centrepieces 20 mM natriumfosfaatti, pH 7,0, 100 mM NaCl, 55 mM arginiinia, että viittaus osastoon. Radial absorbanssi tiedot hankittiin roottorin nopeudella 28000 rpm, käyttäen aallonpituutta 280 nm, ja säteittäisellä välein 0,003 cm jatkuvassa skannaustila. Sedimentoituva rajat sovitettiin malliin olettaen jakauman sedimentaatio kertoimia ei-vuorovaikutuksessa lajeja, c (S), käyttäen ohjelmaa SEDFIT [25]. Data sovitettiin käyttäen regularisaatioparametri p = 0,95 ja kelluva kitkan suhteen.
(A) 0,15 mg /ml PAT-SM6 suoritettiin ympyrädikroismilla spektroskopialla. Edustava spektri 25 ° C: ssa (avoimet ympyrät) ja sovitus välillä Dichroweb suodatinlaseilla asetettu sp175 (yhtenäinen viiva) on esitetty. (B) laskeutumisnopeus analyysi PAT-SM6 suoritettiin sentrifugoimalla 0,4 mg /ml PAT-SM6 28000 rpm analyyttisen ultrasentrifugissa. Tuloksena sedimentoituva absorbanssia rajoja seurattiin 280 nm ja edustavia tietoja esitetään avoimet ympyrät. Sopii Kokeellisten tietojen avulla c (S) sedimentaatio malli on esitetty yhtenäisillä viivoilla. Selvyyden vuoksi vain joka kolmas skannaus näkyy. (C) kokojakauma tontteja pentameerisessa PAT-SM6 (yhtenäinen viiva) ja heksameerinen PAT-SM6 (katkoviiva) laskettiin asentamisesta tiedot edustettuina (B) ja ac (S) sedimentaatio malli.
entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) B
Antigeenit päällystettiin 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn lokeroita (Nunc Maxisorp) inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen levyt pestiin 3 kertaa PBS: ssä, 3 kertaa PBS: ssä + 0,1% Tween 20, 3 kertaa PBS: ssä ja blokattiin 5% (w /v) BSA: lla PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin sitten jälleen kuten edellä. Kaikki vasta-ainevalmisteet tehtiin 5% (w /v) BSA: ta PBS: ssä. Epäsuoria ELISA kokeet, vasta-aineet levitettiin suoraan levylle ja inkuboitiin 1 tunti. Kilpailukykyisen ELISA-vasta-aineita inkuboitiin liuoksessa eri määriä antigeeniä ennen levittämistä mikrotiitterilevyllä. Pesun jälkeen jälleen kuten edellä, peroxidise-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vuohen anti-kani-IgG: tä (Calbiochem), kanin anti-humaani-IgG: tä (Calbiochem) tai kanin anti-humaani-IgM: ää (Dako), riippuen primaarisen vasta-aineen lähteen ja luokka) oli levitettiin levylle ja inkuboitiin 1 tunti mukaan valmistajan ohjeiden. Lopullisen pesun jälkeen vasta-aineen sitoutuminen määritettiin käyttäen 100 ui kuoppaa kohti 3,3 ’, 5,5’-Tetramethylbenzidine substraattiliuosta (Sigma) ja mittaamalla värin muutos 655 nm: ssä. Aikakäyrän Värinkehitys olennaisesti lineaarisia optinen tiheys alueella 0-3. Mittaukset tehtiin 15 minuutin kuluttua lisäämällä substraattia. Kontrollikokeissa, joissa suora päällystys levyjen kanssa PAT-SM6, pitoisuusvälillä 0-2,5 ug /ml, systemaattinen kasvu havaittiin ELISA-signaalin lisääntynyt pinnoite keskittyminen, mikä merkitsee suoraa korrelaatiota ELISA signaalin ja vasta-aineen määrä levyyn sitoutuneen. ELISA tiedot titraus primaarisen vasta-aineen sitoutumisen immobilisoituun GRP78 analysoitiin olettaen yksinkertaista Langmuirin sitoutumisen isotermin kuvataan suhdetta Y = K
a /(1-K
a), jossa Y on suuruus ELISA-signaalin ja K
a = näennäinen sitoutumisvakio olettaen yhden luokan sitoutumiskohdista.
(A) raaka SAXS tiedot näkyvät ympyrät edustavat keskimääräistä voimakkuutta
I
(
q
) funktiona momentinsiirron
q
. Virhe palkit osoittavat ± 1 keskihajonta (σ). Musta symbolit:
I
(
q
) ≥ σ ja harmaa symboleja:
I
(
q
) σ. (B) Guinier juoni näille SAXS tietoja
q
.
R
g
1.3. (C) Kratky käyrä SAXS datan. (D harmaa ympyrät), GRP78 (10 uM; mustat ympyrät) ja seoksesta PAT-SM6 (0,4 uM) ja GRP78 (10 uM, kiinteät linja). Kiinteä harmaa viiva on summa radial jakaumien saatu PAT-SM6 ja GRP78 yksin, olettaen ole vuorovaikutusta.
laskeutumisnopeus tiedot puhdistettiin GRP78 osoitti yhden suuren sedimentoituvan rajan (kuva 1). Tietojen analyysissä oletetaan jatkuvan kokojakauma kuin vuorovaikutuksessa lajia määräävä laji ominaista sedimentaatiovakio, kitka- kerroin ja molekyylimassa sopusoinnussa läsnäolo GRP78 monomeerin (taulukko 1). Tämän lisäksi merkittävä laji, data tunnistettu pitoisuudesta riippuvaa suurempien lajien (S20, w noin 7,2 S) johtuvan läsnäolo dimeerin hidas tasapainossa hallitseva monomeerilajia.
SAXS tiedot grp78 on esitetty kuviossa 2A. Guinier juoni näistä tiedoista (kuvio 2B) oli lineaarinen matalissa
q
(jossa
q
.
Rg
1,3) ja jäyhyyssäde (
R
g
) saatu kulmakerroin oli 45,5 ± 2,2 Å. Massa GRP78 monomeerin arvioitiin alla oleva pinta-Kratky plot (kuvio 2C) on 89,5 kDa, joka on 22% suurempi kuin teoreettinen arvo 73,2 kDa. Kun otetaan huomioon, että in-line geelisuodatuskromatografialla antoi meille mahdollisuuden poistaa sironnan osuus kaikista dimeeri, tämä analyysi antaa monomeerinen proteiini tiheys 0,85 g.cm
-1, joka on osoitus diffuusi elektronitiheys erittäin joustavan molekyyli [28]. Tarkastus Porod-Debye koealojen (kuvio 2D 2E) osoitti GRP78 SAXS tiedot eivät tasaantuvan kuin
I
(
q
).
q
4 vs.
q
4, mutta teki tasanne kuin
I
(
q
).
q
3 vs.
q
3, mikä edelleen tukee ehdotusta, että GRP78 on erittäin joustava, mutta sisältää merkittäviä taitettu rakenne [28]. Kontrollina, samanlainen analyysi suoritettiin SAXS tallennetut kompakti pallomainen proteiini, glukoosi-isomeraasia. Nämä analyysit osoittivat tasanne sekä
I
(
q
).
q
3 vs.
q
3 ja
I
(
q
).
q
4 vs.
q
4 tonttien ja antoi tiheydeksi 1,32 g.cm
-1, joka on erinomaisessa sopimus aiempien tutkimusten kanssa, tämän molekyylin [28].
konsentraatio GRP78 päällysteenä kuoppiin oli 30 ug /ml. V: Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat PAT-SM6 (kaistat 1 ja 3), anti-GRP78 (kaista 2) ja valvonta isotyypin IgM-vasta-aine (kaista 4). Kaistalla 3, alkuperäisen pinnoitteen askel GRP78 jätettiin pois. B: Ensisijainen aine oli PAT-SM6. Inkuboinnit suoritettiin 20 mM natriumfosfaattipuskuria, jossa ei ole lisätty NaCl: lla (kaista 5), 140 mM NaCl (kaista 6) ja 500 mM NaCl: lla (kaista 7). C: Ensisijainen aine oli PAT-SM6. Inkuboinnit suoritettiin 20 mM natriumfosfaattipuskuria, 140 mM NaCl pH-arvoilla 6 (kaista 8), 7,4 (kaista 9) ja 8 (kaista 10).
Ab initio
muoto mallintamista GRP78 suoritettiin seuraava arviointi hiukkasen vektorin etäisyyttä kertymäfunktio
P
(
r
) epäsuoralla Fourier-muunnoksella. Suurin mitta (
D
max
) alkaen
P
(
r
) analyysi arvioitiin olevan 134 Å. Kuvio 2F esittää tuloksena keskimääräinen tilavuus suodatettua SAXS malli päällekkäin NMR puhdistettu täyspitkää rakennetta DnaK [26]. Yleinen muoto ja keskimääräinen suhteellinen orientaatio N-domeeni ja C-domeenista GRP78 on sopusoinnussa NMR-tiedot DnaK, edelleen vahvistetaan pääasiassa monomeerisen luonteen ja oikea laskostuminen bakteerien ilmaistuna ihmisen GRP78 tuote.
karakterisointi puhdistettu PAT-SM6
rakenne ja liuos käyttäytymistä puhdistettua PAT-SM6 myös ominaista. CD-spektrit PAT-SM6 paljasti yhden vähintään noin 215 nm, mikä viittaa pääasiassa β-levyn sekundaarisen rakenteen (kuvio 3). Tulokset suurempia kuin aikaisempien CD tutkimuksia sekundaarirakenteen IgM-vasta-aineiden [29]. Analyysi CD tietojen PAT-SM6 osoitti sekundaarinen rakenne koostuu noin 3,8% A-helices, 51% A-säikeet, 7,7% kierrosta ja 35,8% järjestämättömiä rakenne. Laskeutumisnopeus tiedot PAT-SM6 osoitti yhden suuren rajan (kuva 3). Analyysi tiedoista, olettaen jatkuva sedimentaatiovakio jakelua ei-vuorovaikutus lajien, paljasti yhden suuren ja yksi pieni väestö ominaista keskimääräinen sedimentoitumisen kertoimia 17 S ja 24 S, vastaavasti (taulukko 1). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia läsnäolon monomeerisen ja dimeerisen IgM lajit [30]. Parhaiten sopivan saadun arvon kitka- suhdetta, f /fo, käytettiin analysoimaan yleistä muotoa PAT-SM6 monomeeri. Tiedot osoittavat epäsymmetrisen muoto vastaa litistynyt ellipsoidi parametrien lueteltu taulukossa 1. Sedimentation nopeustieto saatiin myös heksameerinen PAT-SM6 johdannainen, PAT-SM6-hex, puuttuu J ketju [11]. Koko-jakelu analyysi tiedot osoittavat suurta sedimentoituva lajin tunnettu s20, w ja f /fo-arvot 17,6 S ja 1,95, vastaavasti.
Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat: A. PAT-SM6; B. polyklonaalista GRP78; C. PAT-SM6-hex ja D. PAT-SM6 IgG. Grp78 pinnoite pitoisuudet olivat 30 ug /ml: lla (umpinaiset ympyrät), 15 ug /ml: lla (avoimet käänteiset kolmiot), 7,5 ug /ml: lla (täytetyt neliöt), 3,75 ug /ml: lla (avoimet vinoneliöt), 1,88 ug /ml: lla (umpinaiset kolmiot) , 0 ug /ml (avoimet ympyrät). Yhtenäiset viivat ovat parhaiten sopiva viiva lasketaan yksinkertainen sitova isotermi.
. Sitova vakioita PAT-SM6 (umpinaiset ympyrät) ja PAT-SM6-hex (avoimet ympyrät). B. Sitoutuminen vakioita PAT-SM6 IgG (umpinaiset ympyrät) ja anti-GRP78 (avoimet ympyrät).
SAXS tietoja PAT-SM6 on esitetty kuvassa 4A. Guinier juoni (kuva 4B) on lineaarinen matalissa
q
(
q
.
R
g
1,3) ja
R
g
saatu kulmakerroin oli 122,0 ± 1,4 Å.
D
max
arvioitiin
P
(
r
) analyysi on ~4.2 nm ja molekyylimassan peräisin alueelta alle Kratky juoni ( Kuva 4C) oli 1,06 x 10
6 Da. Nämä arviot Massan,
R
g
ja
D
max
arvot PAT-SM6 ovat hyvässä sopusoinnussa luettuina edellisten SAXS tutkimuksista IgM [31]. Jälleen läsnäolo tasangolla juoni
I
(
q
).
q
3 vs.
q
3 (kuvio 4D) ja puute tasangolla
I
(
q
).
q
4 vs.
q
4 plot (kuvio 4E) osoitti taitettu rakenne merkittävä joustavuus [28].
Ab initio
muoto mallintaminen PAT-SM6 ei lähentymässä fyysisesti realistinen muoto ottamatta käyttöön nimenomaista symmetria rajoitteita. Sen sijaan mielivaltaisesti asettamalla viisinkertaiseksi symmetria, sovituksen hyvyys teoreettisen SAXS profiilit malleja eri symmetrioita (P2, P3, P4, P5 ja P6) ja SAXS tietoja verrattiin [24]. Viisinkertaisen symmetria tuottivat parhaiten, mikä oli huomattavasti parempi, että sopii nelinkertaisella tai kuusinkertaisesti symmetria (
P
(
F
) arvot 0,036 ja 0,004, tässä järjestyksessä) . Keskimääräinen SAXS muoto malli PAT-SM6 monomeerin viisinkertaiseksi symmetria sopi hyvin yleinen ominaisuuksia tunnettu edellisessä elektronimikroskoopilla, SAXS ja homologiamallinnusta tutkimukset IgM [31], [32], [33]. Multi-ketju jäykän rungon hienosäätö vastaan SAXS tietojen suoritettiin käyttäen Fab-fragmentteja joustavasti liitetty Fc-fragmentit perustuen IgE [34], kuten per viimeaikaiset EM mallintaminen [33]. P5 symmetria määrättiin ja suhteellinen orientaatio Fc fragmenttien rajoitti etäisyys rajoituksia vastaavat välisten alayksikön disulfidisidoksia [35]. SAXS
ab initio
muotomalliin näkyy päällekkäin jäykän rungon puhdistettu SAXS malli (kuvio 4F). Molemmat SAXS mallit viittaavat siihen, epäsymmetria suhteellinen asemointi kaksi Fab-fragmenttia kussakin viidestä raskas ketju-kevyt ketju -parin, joka on sopusoinnussa EM muoto rekonstruktiot [35]. Nämä rakenteelliset tutkimukset vahvistavat suhteellisen homogeenisia PAT-SM6 valmistelu ja soveltuvuus ratkaisu tutkimuksia vuorovaikutusta antigeenejä.
. Pitoisuus GRP78 päällysteenä kuoppiin oli 7,5 ug /ml. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat PAT-SM6 (5 ug /ml, umpinaiset ympyrät) ja polyklonaalisia anti-GRP78 (avoimet ympyrät). Tulokset on myös esitetty Verrokkikokeissa jättämällä GRP78 takki käyttämällä primaaristen vasta-aineiden PAT-SM6 (5 mg /ml, mustat kolmiot) tai anti-GRP78 (avoimet neliöt). B: n sitoutuminen PAT-SM6 (5 ug /ml) immobilisoitiin GRP78 eri GRP78 pinnoite pitoisuuksien puuttuessa (mustat pylväät) tai läsnä ollessa (harmaa palkki) liukoisen GRP78 (4 mg /ml). C: Liukeneva GRP78 inhiboivan vaikutuksen PAT-SM6 sitoutuminen immobilisoituun GRP78 eri GRP78 pinnoitteen pitoisuuksia. Pitoisuudet PAT-SM6 ja liukoisen GRP78 käytettiin 5 ug /ml ja 4 mg /ml.
Interaction of PAT-SM6 kanssa GRP78 Solution
laskeutumisnopeus analyysi käytettiin vuorovaikutuksen tutkimiseksi PAT-SM6 ja GRP78. Säteittäinen skannaa kuviossa 5A, saadaan seos, PAT-SM6 (0,4 uM) ja GRP78 (10 uM), osoittavat hidas ja nopeasti liikkuvan rajat vastaa suunnilleen rajan nopeudet saadaan erilliset näytteet GRP78 ja PAT-SM6 , vastaavasti (kuviot 2 ja 4). Jatkuva kokojakauma analyysi saatujen tietojen varten PAT-SM6-GRP78 seoksen vahvisti kaksi pääpopulaatiota ominaista keskimääräinen sedimentoitumisen kertoimilla samanlainen keskiarvot GRP78 ja PAT-SM6. Analyysi alapuolisen alueen väestö vastaa PAT-SM6 osoitti pientä laskua pinta-alaltaan noin 10%, vastaa menetys materiaalia. Tämä menetys johtui muodostumista ja nopea ehtyminen suurten vasta-aine- antigeeni-kompleksit. Lisätodisteita menetystä materiaalin, kompleksin muodostumisen vuoksi on vertaamalla säteen skannaa otetaan yhdellä kertaa pisteen PAT-SM6 yksin, GRP78 yksin ja seos PAT-SM6 ja GRP78. Tulokset osoittavat, että tasanne arvo PAT-SM6-GRP78 seos on pienempi kuin yhdistetty optinen tiheys etsii erillisten komponenttien, osoittaa kompleksin muodostumisen. Vaikeutena on tietojen analysointi heikkoja palautuva komplekseja on dynaaminen luonne vuorovaikutusten ja monimutkaisuus sovittamalla tiedot tiettyihin malleihin [36]. Kuitenkin kuviossa 5C olevat tiedot osoittavat menetys vain pieni määrä PAT-SM6 yhtä suuri komplekseja, mikä vastaa noin 10%: PAT-SM6. Koska kokonaispitoisuus PAT-SM6 ja GRP78 Näissä kokeissa käytetty oli 0,4 uM ja 10 uM, vastaavasti, tämä arvio osuus kompleksin saanto arvio dissosiaatiovakio, olettaen 01:01 monimutkainen, noin 90 uM. Tämä suhteellisen alhainen sitoutumisaffiniteetti on tyypillistä IgM-antigeenin vuorovaikutus verrattuna vuorovaikutusta affiniteetin hittyneenä IgG-vasta-aineita ja niiden sukulais-antigeenit [37].
ELISA analyysi vuorovaikutus PAT-SM6 ja GRP78
vuorovaikutus PAT-SM6 kanssa GRP78 immobilisoidaan mikrotiitterilevyn analysoitiin käyttämällä ELISA-määritystä. Tulokset kuvassa 6 osoittavat vahvan signaalin joko PAT-SM6 tai anti-GRP78 primaarisena vasta-aineena. Ohjaus kokeissa jättämällä ensimmäisen GRP78 päällyste menettelyä tai käyttämällä IgM isotyyppikontrolli-vasta-aine antoi signaalin, joka oli lähellä taustan. Suuruus positiivisen signaalin välisen vuorovaikutuksen PAT-SM6 immobilisoidulla GRP78 oli samanlainen näytteitä inkuboitiin 20 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 7,4, verrattuna PAT-SM6 näytteitä PBS: ssä, kun taas signaali oli merkittävästi vähentynyt, kun NaCl-pitoisuus kasvoi 500 mM. Sitoutumisen PAT-SM6 immobilisoituun GRP78 oli samanlainen inkubaatioissa suoritetaan pH-arvoilla 6, 7,4 ja 8.
Koska suhteellisen vahva signaali havaittiin vuorovaikutusta PAT-SM6 kanssa GRP78 ELISA määrityksissä (kuvio 6) verrattuna suhteellisen heikko vuorovaikutus päätellä laskeutumisnopeus tutkimuksissa (kuvio 5B ja C) lisäksi suoritettiin kokeita sen määrittämiseksi vahvuuden vuorovaikutusten havainnoitiin ELISA-olosuhteissa. Tulokset kuviossa 7A esittävät ELISA signaali määritetään funktiona PAT-SM6 pitoisuus eri pinnoitus pitoisuuksia GRP78. Tulokset osoittavat tyypillisiä saturations käyrät, joissa suuruus ELISA-signaalin värikylläisyyden lisääntyy systemaattisesti päällysteen pitoisuus GRP78 PAT-SM6 on lisääntynyt. Myös kuviossa 7 on ohjattu kokeita käyttäen eri pitoisuuksia anti-GRP78, PAT-SM6-hex ja PAT-SM6 IgG. Kussakin tapauksessa on järjestelmällinen kasvu suuruus kyllästyminen käyrät lisääntynyt GRP78 päällysteen pitoisuus.