Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen

kysteiini dioksygenaasi 1

(

CDO1

) geeni on ei-hemi rakenteeltaan, rautaa sisältäviä metalloenzyme mukana muuntaminen kysteiinin kysteiinin sulfinaattiesterin, ja sillä on keskeinen rooli tauriinia biosynteesissä. Meidän etsiä uusia metyloidut geenin promoottorit, olemme analysoineet ero RNA ilmentymisen profiilit peräsuolen syöpä (CRC) solulinjoja tai ilman hoitoa 5-atsa-2′-deoksisytidiini. Joukossa identifioitujen geenien,

CDO1

promoottorin todettiin differentiaalisesti metyloitu ensisijainen CRC kudoksista korkealla taajuudella verrattuna normaaleihin paksusuolen kudoksiin. Lisäksi tilastollisesti merkitsevä ero taajuus

CDO1

promoottorin metylaation välillä havaittiin ensisijaisesti normaalien ja tuumorikudosten peräisin rinta-, ruokatorvi-, keuhko-, virtsarakko- ja vatsaan. Downregulation

CDO1

mRNA: ta ja proteiinia tasot havaittiin syöpäsolulinjoissa ja kasvaimissa, jotka ovat peräisin näistä kudostyypeistä. Expression of

CDO1

oli tiukasti hallinnassa promoottori metyloinnin, mikä viittaa siihen, että promoottori metylaatio ja vaiennettu

CDO1

voi olla yhteinen tapahtuma ihmisen syövän synnyn. Lisäksi pakko ilmentyminen täyspitkän

CDO1

ihmisen syöpäsoluissa merkittävästi vähensi kasvainsolujen kasvua käytettäessä

in vitro

soluviljelmässä ja /tai

in vivo

hiiri malli, kun taas pudotus on

CDO1

lisääntynyt solujen kasvuun viljelmässä. Tuloksemme sotkea

CDO1

uutena tuumorisuppressorigeeniä ja mahdollisesti arvokkaiden molekyyli- merkkiaine ihmisen syövän.

Citation: Brait M, Ling S, Nagpal JK, Chang X, Park HL, Lee J, et al. (2012) Kysteiini dioxygenase 1 Onko tuumorisuppressorigeeniä vaiennetaan Promoottori metylaation Useita ihmisen syövissä. PLoS ONE 7 (9): e44951. doi: 10,1371 /journal.pone.0044951

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 20 tammikuu 2012; Hyväksytty: 14 elokuu 2012; Julkaistu: 27 syyskuu 2012

Copyright: © Brait et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Cancer Institute (U01-CA84986 Early Detection Research Network) ja lentoemäntä Medical Research Institute (Myoung S. Kim). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Under välisen lisenssisopimuksen Oncomethylome Sciences ja Johns Hopkins University, D. Sidransky on oikeus osuuteen royalty saamien yliopiston yhteydessä myyntiä tahansa tuotteita kuvattu tässä artikkelissa. D. Sidransky omistaa Oncomethylome Sciences, SA kalusto, joka on asetettu tiettyjä rajoituksia yliopistopolitiikasta. D. Sidransky on maksettu konsultti Oncomethylome Sciences, SA ja on maksanut jäsen yhtiön tieteellinen neuvottelukunta. Johns Hopkins University mukaisesti eturistiriita politiikan hallitsee tämän sopimuksen ehtoja. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Syöpä aiheuttaa poikkeava geenisäätelyn, mukaan lukien inaktivaatio alipaineensäätöventtiileillä soluproliferaation ( lukien tuumorisuppressorigeeneille, APT) ja aktivoituminen positiivisia sääntelyviranomaisten (kuten onkogeenien). Lisäksi geneettisiä muutoksia, joihin mutaatiot onkogeenien ja APT, karsinogeeninen prosessi voi tapahtua epigeneettiset muutoksia geenien promoottorit [1]. Epigeneettisiä muutoksia, periytyviä muutoksia geenien ilmentymisen, jotka tapahtuvat ilman muutoksia DNA-sekvenssin, edistää ja etenemistä kasvainsolujen [2], ja pidetään tunnusmerkkejä syöpä. DNA: n metylaatio ja histoni asetylaatio ovat yleisimpiä ja tutkittu epigeneettiset muutokset [1]. On CG-rikkaita alueita kutsutaan CpG saaria, joihin voi sijaita 5’alueella mukaan lukien promoottori, transloitumatonta aluetta ja eksonin 1 mitään geenejä TSG toimintaa [3]. CpG-saarekkeiden ei yleensä metyloituja normaaleissa soluissa [3], mutta poikkeava hypermetylaation siinä CpG-saarekkeiden joka johtaa transkription inaktivointi ja geenien voi olla varhainen tapahtumia syövän synnyn ja pidetään yhteisen mekanismin menetys TSG funktio ihmisen syövissä [1], [4]. Tällä hetkellä se on hyvin vastaan, että epigeneettisellä muutokset jopa altistaa geneettisiä muutoksia aikana tuumorigeneesin [5]. Kliinisesti, TSG metylointi voidaan käyttää epigenetic biomarkkerina kasvaimen diagnosointia ja ennusteen ennustaminen. Niinpä tieto metylaatiovyöhykkeiden koko genomi voi auttaa tunnistamaan keskeiset APT inaktivoituu aikana kasvaimen muodostumisen [6], [7], [8].

Nisäkkäiden

kysteiini dioksygenaasi

(

CDO

, EY 1.13.11.20) on elintärkeä entsyymi ihmisten terveydelle mukana biohajoavuuden myrkyllisten kysteiinin ja siten sääntely kysteiinin pitoisuus elimistössä. Se on ei-hemin rakenteeltaan, rautaa sisältäviä metalloenzyme mukana muuntaminen kysteiinin epäorgaanisen sulfaatin, ja sillä on keskeinen rooli tauriinia biosynteesissä [9]. Avoin lukukehys

CDO

-geeni koodaa proteiinia, 200 aminohappoa (molekyylipaino 23 kd, joka sitoo yhden Fe

2

– ioni per molekyyli). Hiiren

CDO

ja rotan

cdo

on sama aminohapposekvenssi, joka on 92% identtinen ihmisen

CDO

, ja useimmat aminohapposubstituutiot ovat konservatiivisia vaihtoja.

CDO

geeni kattaa noin 15 kb ja sisältää 5 eksonia. 5′-reunustava alue ihmisen

CDO

geeni sisältää useita oletetun konsensus

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT säätelysekvenssejä, erityisesti sitoutumisen maksan tumatekijä-3 (HNF-3), ja sen homologeja, joiden tiedetään olevan mukana maksaan-geenistä transkription. Jos tällaisia ​​konsensus sitoutumiskohtia on yhdenmukainen korkein

CDO

mRNA löytyy maksauutteista verrattuna muihin kudosuutteita (munuainen, keuhko ja aivot) [10]. On olemassa kahdenlaisia ​​CDO; soluliman (CDO1) ja kalvoon sitoutuneita (CDO2), ja hiiren CDO1 on väitetty olevan mukana säätelyssä proteiinien toimintaa ja antioksidantti puolustusmekanismeja kyvyllään hapettaa kysteiinitähteiden [11].

Ihmisen

CDO1

geeni sijaitsee kromosomissa 5. q23.2 joka usein poistetaan pitkälle keuhkosyöpä [12]. Staub et ai. [13] oletettiin, että poistetaan tai epigeneettisten hiljentäminen kromosomaalisen alueen 5 q23.2 jossa

CDO1

sijaitsee, on usein mekanismi edistää peräsuolen kasvaimien syntyyn;

adenomatoottisen polypoosin coli

(

APC

) ja

mutatoitunut kolorektaalisyövässä

(

MCC

) sijaitsevat lähellä 5 q23 [12]. Se ilmentyy voimakkaasti maksassa ja istukassa, ja heikosti sydämessä, aivoissa ja haiman [14]. Kysteiini säätelee CDO1 liikevaihdon kautta Ubiqutin-26S-proteasomin-välitteisen hajoaminen [15], ja korkean tason kysteiini on sytotoksinen ja voi aiheuttaa nivelreuman [16], [17], [18], Parkinsonin taudin [17], Alzheimerin tauti [ ,,,0],17], lisääntynyt sydän- ja verisuonitautien riskiä [19] ja haitalliset raskaudesta [20]. Äskettäin yli-ilmentyminen CDO1 kuvattiin varten Sezaryn oireyhtymä, aggressiivinen ihon T-solulymfooman [21].

Aikaisemmin on raportoitu joukko kandidaattigeenejä jotka muodostavat osan syntymässä ”syöpä methylome” käyttämällä uutta promoottoria rakenne algoritmin ja mikrosirujen tuottaman tiedon 22 syöpäsolulinjasta peräisin 5 tärkeimmät syövän tyypit [22], [23]. Aikaisemmissa tutkimuksissa, jotka tutkimme, äskettäin tunnistettu syöpää erityisiä metyloituneiden geenien paneelia 300 primaaristen kasvainten, jotka edustavat 13 eri syövän;

onkostatiini M-reseptori-β

(

OSMR

) ja

β-1,4-galaktosyylitransferaasia 1

(

B4GALT1

) olivat kaksi uutta tunnistettujen geenien tutkimuksessa on metyloitavaa ensisijainen CRC kudoksissa mutta harvoin vastaavassa normaalissa vieressä limakalvolla ei-pahanlaatuisten normaali paksusuoli kudoksissa [23]. Lisäksi, yhdistelmä farmakologisen paljastumista ja oligonukleotidi mikrosiruanalyysillä [24], [25], [26] meille mahdollisuuden löytää uusia metyloitunut geenien ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) ja CRC-solulinjoja ja primaarisia kudoksissa.

NEFH

[27],

DFNA5

[26],

OSMR

[23],

LIFR

[28] ja

NMDAR2B

[25] edustivat geenejä, löysimme olevan epigeneettiseltä inaktivoitua ihmisen ESCC ja CRC korkealla taajuudella. mRNA ilmaisuja näiden geenien syövän kudoksissa myös merkittävästi alassäädetty verrattuna normaaleihin kudoksiin. Lisäksi toiminnalliset tutkimukset viittasivat kasvain tukahduttava rooleja näiden geenien ihmisen CRC ja ESCC solulinjoissa.

Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että

CDO1

oli yksi ehdokas geenien tunnistaa yhdistelmä farmakologinen peittymisen strategia ja ilmaisun microarray analyyseja. Havaitsimme usein promoottori metylaatio ja downregulation

CDO1

useita erityyppisiä ihmisen syövän. Funktionaaliset tutkimukset osoittivat, että

CDO1

satamat tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden.

Tulokset

CDO1

on epigeneettiseltä Inaktivoitu Human Colon Cancer

etsiessämme geenien epigeneettiseltä vaiennettu ihmisen CRC, suoritimme yhdistelmä farmakologisen paljastumista ja myöhemmin ero mikrosiruanalyysillä käyttäen mikrosiruja, jotka sisältävät 22284 selostukset (Affymetrix) [26]. Käytimme demetyloiva aine 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) aktivoi geenien epigeneettiseltä vaiennettu kolme CRC solulinjoissa (HCT116, HT29 ja DLD-1). Olemme aiemmin raportoitu valintakriteerit tunnistamisesta geenien usein inaktivoituu paksusuolen syövän DNA promoottori metylaatio [26]. Me uudelleen analysoitu ehdokas tuumorisuppressorigeeneille meidän geeni luetteloon ja totesi, että ilmaus

kysteiini dioksygenaasi 1

(

CDO1

) oli ”poissa” ennen lääkehoitoon vaan ”läsnä” jälkeen 5- atsa-dC kohtelu kaikissa kolmessa CRC testatuilla solulinjoilla. Poissa ja uudelleen aktivoitu

CDO1

ilmentymisen 5-atsa-dC viidessä CRC solulinjoissa (HCT116, HT29, DLD-1, RKO ja SW480) todensi RT-PCR-analyysi (Fig. 1A ).

, Expression of

CDO1

CRC solulinjoissa tutkittiin RT-PCR-analyysillä. Ei perusilmennystä

CDO1

nähtiin kaikissa CRC solulinjoissa, ja kaikki nämä solulinjat kanna

CDO1

metylaatio (M). Vaiennetaan

CDO1

aktivoitiin hoidon jälkeen demetyloiva aineen, 5-atsa-dC, mikä osoittaa, että

CDO1

metylaatio korreloi tiukasti menetys geenin ilmentymisen CRC solulinjoissa. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. m, solut vehikkeliä vain; a, solut, joita käsiteltiin 5-atsa-dC (5 uM kolme päivää). L, 1 Kb Plus DNA tikkaat. B, metylointi asema yksittäisten CpG: t saaren 5 CRC solulinjoissa ja 21 paria ensisijaisen CRC (PT) ja niiden vastaavassa normaalissa paksusuolen kudokset (PN) näytetään. Kaikkiaan 38 CGS luettiin ensimmäisestä viimeiseen CG sarjoissa kuten. Musta ympyrä, metylointi; valkoinen ympyrä, unmethylation; harmaa ympyrä, rinnakkaiselo Metyloitujen ja metyloitumattomat alleelit; murskautuvat ympyrä, määrittelemätön. C, Analyysi

CDO1

promoottorin aktiivisuutta lusiferaasireportterista määritys

CDO1

-negatiivinen (HCT116) ja positiivisia (HEK293). Promoottorikonstruktien (pGL2-

CDO1

– # 1 ja – # 2) oli esikäsitelty tai ilman

Sss

I metylaasin 8 tuntia ennen transfektiota. Korkea aktiivisuus

CDO1

promoottori havaittiin HEK293 jossa

CDO1

ilmaistiin. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen kasvu yli pGL2-perustoimintaan. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena, ja arvot ilmaisevat keskiarvoja ± SD. Keskiarvot on esitetty. D. sirontakuvaajaan on

CDO1

metylaatiotasoilla kudoksissa ja solulinjoissa (CL) (vasemmalla). TaqMan metylaatio arvot (TaqMeth V) on kuvattu Materiaalit ja menetelmä. TaqMan-MSP suoritettiin kahtena muodossa, ja kokeet toistettiin kahdesti. Tiedot osoittivat toistettavissa ja yhtäpitävät tulokset. PT, ensisijainen CRC; PN, vastaaviin normaaleihin paksusuolen kudoksiin paksusuolen syöpäpotilaiden; NN, normaali paksusuoli epiteelin ei-syöpäpotilasta. Viiva osoittaa optimaalinen raja-arvo

CDO1

lasketaan ROC-analyysi. Näyte numerot osoittavat TaqMeth V yli cut-off on merkitty. Yleinen TaqMeth V havaittu PT oli huomattavasti korkeampi kuin PN (oikealla). TaqMan arvo kaksi NN (22%, 2/9) oli yli raja-arvon (24,56 ja 17,86 kukin), mikä viittaa siihen, että alhainen CDO1 metylaatio voi johtua muita tuntemattomia mekanismeja. E, ROC käyrä analyysi TaqMeth V

CDO1

CRC. Area alla ROC (AUROC) kuljettaa tarkkuus erottamaan vastaaviin normaaleihin paksusuolen (PN) CRC (PT) suhteen sen herkkyys ja spesifisyys (

P 0,001

). Yhtenäinen viiva,

CDO1

; katkoviiva, ei syrjintää. F, metylaatiotasoilla normaalin (PN) ja kasvaimen kudokset (PT) yksittäisillä potilailla.

Sen tutkimiseksi,

CDO1

ilmentymistä säätelee promoottori metylaation, etsittiin CpG-saarekkeiden

CDO1

promoottori käyttämällä online sellaisia ​​ohjelmia Methprimer (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html).

CDO1

satamiin CpG saari promoottori lähelle transkription aloituskohdasta (TSS) (Fig. S1A). Analysoimme metylaatiostatuksen CpG saaren 5 CRC solulinjoissa (HCT116, HT29, DLD-1, SW480 ja RKO) ja 4 kasvaimen vieressä normaalilta näyttäviä kudokset (PN) by bisulfiitti-sekvensoinnilla. CpG Saari oli tiheään metyloitavaa CRC solulinjoissa, mutta ei normaalissa paksusuolen kudoksiin (kuvio. S1B 1 B). Osittainen demetylaatio on CpG-saarekkeen, kun 5-atsa-dC hoidon solulinjoissa vahvistettiin myös bisulfiitti-sekvenssianalyysi (tietoja ei ole esitetty). Olemme myös suorittaa COBRA rinnan bisulfiitti-sekvensointi vahvistavan

CDO1

metylaation 10 paria satunnaisesti valittua Hyväksytty kasvain (PT) ja normaalin paksusuolen kudokset (PN) (Fig. S1C). Taajuus

CDO1

metylaatio kasvaimissa (7/10, 70%) oli suurempi kuin vastaava normaaleissa kudoksissa (1/9, 11,11%). Analysoida

CDO1

metylaatiostatuksen perusterveydenhuollossa kasvaimissa, tutkimme 21 paria PT ja PN by bisulfiitti-sekvensoinnilla. Mukaan meidän perusteiden mukaisesti

CDO1

metylaatio solulinjoissa ja kudoksissa bisulfiitti-sekvensoinnilla (kuvattu materiaalit ja menetelmät), taajuus

CDO1

metylaatio kasvaimissa oli 100% (21 /21), ja että normaalissa metylaatio oli 0% (0/21), mikä osoittaa, että

CDO1

on hypermetyloitunut CRC (Fig. 1 B). Edustavia bisulfiitti-sekvensointi tulokset

CDO1

on esitetty kuvassa S1D.

Valaistaan ​​roolin DNA: n metylaation säätelyssä

CDO1

ilme, teimme kaksi lusiferaasireportterilla konstruktit (pGL2-

CDO1

– # 1 ja – # 2), joka sisältää eri osia

CDO1

promoottorisekvenssit (kanta -1100 bp +104 bp # 1, ja -430 bp ja +104 bp # 2) (Fig. 1 C, ylempi). Tyhjät pGL2-lusiferaasi plasmidit transfektoitiin mock toimintaa. Transfektoimme Näiden rakenteiden kahteen solulinjoihin;

CDO1

-negatiivinen HCT116-solut ja

CDO1

-positiivinen HEK293-soluissa. Aktiivisuus

CDO1

promoottori oli vähäistä HCT116-soluissa, mutta korkeatasoinen promoottorin aktiivisuutta havaittiin HEK293 (Fig. 1 C, alempi). Lisäksi sekä pGL2-

CDO1

– # 1 ja – # 2 konstrukteja oli samalla tasolla

CDO1

promoottorin aktiivisuutta HEK293-soluissa, mutta induktio CpG metylaatio

Sss

I metylaasin ennen transfektiota laski toiminnan minimitasolle. Nämä tulokset osoittavat, että DNA: n metylaatio CpG saaren on merkittävä rooli geenien hiljentäminen

CDO1

.

Opiskella promoottori metylaatio

CDO1

kvantitatiivisen TaqMan-MSP analyysi, suunnittelimme alukkeet ja koetin nimenomaan kohdistettu CpG saari

CDO1

promoottori (Kuva. S1A). Lisäsimme näytemäärät 100 paria ensisijaisen CRC (PT) ja vastaavat normaali paksusuoli (PN) kudoksiin. Yhdeksän normaalin paksusuolen limakalvon kudoksissa ei-syöpäpotilasta (NN) on sisällytetty vertailua metylaatio spesifisyys syövän ja muiden kuin syöpäpotilailla. Olemme myös 5 CRC solulinjoja, jotka olivat aiemmin analysoitiin TaqMan-MSP-analyysi. Jakauma metylaation arvojen (TaqMan metylaatio arvot, TaqMeth V) näytteille selkeä syövän tietty kuvio; tilastollisesti erilaiset PT ja PN (Fig. 1 D, vasemmalla). Johtuen heterogeeninen klonaalisia laastaria tiedetään laajentua kasvaimen rajojen alhainen metylaation PN myös yleisesti havaittu. Yleinen metylaatio taso

CDO1

havaittu PT (38.42 ± 22.97, keskiarvo ± SD, n = 100) oli huomattavasti korkeampi kuin PN (5,00 ± 6,51, keskiarvo ± SD, n = 100) (

P 0,0001, Wilcoxonin-Mann-Whitneyn testi

) (Fig. 1 D, oikea). Metylointi

CDO1

geenin kudoksessa osoittivat erittäin erotteleva vastaanotin-operaattori (ROC) käyrä profiilit, selvästi erottaa PT PN (Fig. 1 E). Ala ROC (AUROC) oli 0,962 ± 0,0138 (

P 0,001

). Jotta voidaan maksimoida herkkyyttä ja spesifisyyttä, optimaalinen cut-off metyloinnin

CDO1

geeni laskettiin ROC analyysi (arvo, 12.50) (PT

vs

. PN). Tällä cut-off, optimaalinen spesifisyys oli 93% ja herkkyys oli 91% (

P 0,001

,

Fisherin

testi). Lisäksi yksinkertainen taajuus, vertailusta metylaatiotasoilla PN ja PT samasta yksittäisillä potilailla osoitti, että suurin osa PT kanna paljon suuremmat arvot kuin PN (

P 0,0001, Wilcoxonin parittaista allekirjoittaneet-riveissä

test) (Fig. 1 F). Korkea

CDO1

promoottorin metylaation todettiin myös CRC solulinjoissa (5/5, 100%), sopusoinnussa bisulfiitti-sekvensointi ja COBRA tuloksia. Nämä tulokset osoittavat, että

CDO1

on syöpää nimenomaan metyloitavaa CRC suurella taajuudella.

CDO1

metyloidaan erilaatuisia Human Cancer

tutkia metylaatiostatuksen

CDO1

muissa kudostyypeissä, suoritimme TaqMan-MSP

CDO1

promoottori ensisijainen kudoksissa peräisin rinta-, ruokatorvi, keuhko-, virtsarakko- ja vatsaan. Kuten kuviossa 2A on esitetty,

CDO1

promoottori erittäin metyloitu kasvaimia kaikissa kudostyypeissä testattu. Rintojen näytteet koostuivat ei-tuumorigeenisiä (MCF-12A) ja 5 syöpäsolulinjoissa (BT20, MDA-MB-231, MCF-7, Hs748.T, Hs578.T), ja 3 eri primaaristen kudosten (34 PT, 10 PN, ja 10 NN). Kaksikymmentä seitsemän 34 (79%) rintojen PT kanna arvojen yläpuolella optimaalisen raja-arvo on 10, ja kukaan normaali rintakudosten sairastavista potilaista (PN) tai ilman (NN) syöpä ylittivät arvon (0%). Taso

CDO1

metylaatio MCF-12A oli alle cut-off.

CDO1

promoottori myös erittäin metyloitavaa virtsarakon syöpään. Neljäkymmentä kolme 55 (78%) virtsarakon PT kanna arvojen yläpuolella optimaalisen raja-arvo on 5, ja vain kaksi näytettä ulos 32 (6,2%) normaalissa virtsarakossa kudoksiin ylittivät raja-arvon. ROC-käyrä analyysi tuotti optimaaliset raja-arvot (Fig. 2B) sekä maksimaalinen herkkyys ja kunkin syöpä. Keskiarvo TaqMeth V AUROC, cut-off-arvot,% herkkyys ja tarkkuus, ja p-arvot tilastollisen analyysin kustakin näytteiden on esitetty taulukossa 1. herkkyys ja spesifisyys

CDO1

oli ohi 78% PT ja yli 90% PN vastaavasti kaikissa kudostyypeissä testattu. Nämä tulokset osoittavat, että

CDO1

on yleisesti metyloitu useita eri ihmisen syövän. Kliinis-potilaiden analysoitu tässä tutkimuksessa ei ollut saatavilla.

, kvantitatiivinen metylaatio tasot

CDO1

määritettiin ensisijainen kudoksissa peräisin rinta-, ruokatorvi, keuhko-, virtsarakko- ja vatsaan. TaqMan metylaatio arvot (TaqMeth V) on kuvattu Materiaalit ja menetelmä. PT, primäärikasvain; PN, vastaaviin normaaleihin kudoksiin; NN, normaaleissa kudoksissa ei-syöpäpotilasta; CL, solulinjat. Viivat osoittavat optimaalinen raja-arvo kunkin kudoksen. Arrow, MCF-12A, ei-tuumorigeeninen solulinja, kanna alhainen

CDO1

metylaatio (TaqMeth V, 6.2). Kaikki määritykset suoritettiin kahtena kappaleena muodossa, ja kokeet toistettiin kaksi kertaa. Tiedot osoittivat toistettavissa ja yhtäpitävät tulokset. B, ROC-analyysi (PT

vs

. PN) on

CDO1

useissa ihmisen syövissä. Yhtenäinen viiva,

CDO1

; katkoviiva, ei syrjintää.

CDO1

vaimentuu syöpäsolulinjoissa ja uudelleen aktivoida farmakologinen Demetylaatio

tutki transkriptiotasolla on

CDO1

RT-PCR ja qRT-PCR-analyysit syöpäsolulinjoissa peräisin rinta-, ruokatorvi, keuhko-, virtsarakko-, ja vatsa, ja ei-tuumorigeenisiä solulinjoja (HEK293 ja MCF-12A). Perusilmennystä

CDO1

oli tuskin havaittavissa syöpäsolulinjoissa, mutta voimakkaampi ilmentyminen havaittiin HEK293 ja heikosti MCF-12A solulinjoja (Fig. 3A). Tutkimme myös metylaatiotilan

CDO1

promoottori kussakin solulinjassa bisulfiitti-sekvensointi, ja totesi, että syöpäsolujen linjat

CDO1

menetys kanna tiheä metylaation

CDO1

promoottori (merkitty M).

CDO1

metylaatio ei havaittu HEK293-soluissa (U), ja sekä metyloidut ja metyloitumattomat alleelit havaittiin MCF-12-soluja (M /U). Lisäksi, 5-atsa-dC hoidon uudelleen

CDO1

ilmentymisen useimmissa syöpäsolulinjoissa (poikkeukset olivat A549 ja H1828), mikä osoittaa, että transkription ilmentyminen

CDO1

tiiviisti korreloi promoottorin metylaatio.

, Expression of

CDO1

solulinjoissa tutkittiin RT-PCR: llä tai qRT-PCR-analyysit. m, mock hoitoa. a, 5-atsa-dC käsittely (5 uM kolme päivää). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Metylaatiostatuksen

CDO1

promoottori kussakin solulinjassa tutkittiin ja merkitty M metylaation, U unmethylation, ja M /U rinnakkaiseloa Metyloitujen ja metyloitumattomien alleelien.

CDO1

oli täysin metyloitu kaikissa syöpäsolulinjoissa koska vain sytosiinin piikkejä havaittiin CpG: t sekvensoitiin (100% metylaatio), kun taas sitä ei metyloitavaa HEK293 koska vain tymidiini piikkiä havaittiin (0% metylaatio).

CDO1

oli osittain metyloitu MCF-12A koska sekä metyloidut ja metyloitumattomat alleelit havaittiin 10 CpG: t on

CDO1

promoottorit tutkittu. Kun sytosiini huippu verrattiin tymidiinin huippu kussakin CpG on 10 CpG: t, sytosiini huiput olivat määräävän (metyloitu), mutta koska nämä ”metyloitu CpG: t” havaittiin alle 50% CpG: t (10/34), se pidettiin ”metylointi-negatiivinen” kriteerien mukaisesti kuvatut materiaalit ja menetelmät. B. qRT-PCR suoritettiin cDNA potilaista peräisin paksusuolen, rinta-, ruokatorven, virtsarakon syöpä ja mahasyöpä (T) ja potilailla, joilla ei syöpä (NN) (ylempi). Suhteellinen ekspressio (Taitto) laskettiin vertaamalla suhde mRNA: n ilmentymisen

CDO1

että sisäinen kontrolli-geeni, β-aktiini.

CDO1

ilmentymisen taso määritettiin 10 keuhkosyöpäpotilaita ja 10 potilasta ilman syövän (alempi). 2? – () * 100, ilmaus

CDO1

suhteessa p-aktiini lasketaan kynnyssykli (C

t) kuin 2

-ΔCt (ACt = C

t,

CDO1

– C

t, β-aktiini). Kokeet tehtiin kahtena kappaleena, ja arvot ilmaisevat keskiarvoja ± SD. *,

P 0,05

in

T-

testi. C,

CDO1

ekspressiotaso tutkittiin viisi paria (A ~ E) sovitetun valmistettua cDNA potilaiden paksusuolen ja keuhkosyöpää. PT, primäärikasvain; PN, vastaaviin normaaleihin kudoksiin.

ekspression tutkimiseksi

CDO1

primaarisessa syövän, suoritimme qRT-PCR-analyysi cDNA: ita, jotka ovat peräisin potilaista, joilla paksusuoli-, rinta-, ruokatorvi-, virtsarakko- ja mahasyöpä (T, n = 1 kullekin kasvain) ja potilailla, joilla ei syöpä (NN, n = 1 jokaista normaali).

CDO1

oli dramaattisesti alassäädetty T verrattuna NN (Fig. 3B, ylempi). Yleinen keskiarvo

CDO1

ekspressiotaso 10 potilasta ilman syöpä oli noin 2,5 kertaa suurempi (19,14 ± 21,56) kuin 10 keuhkosyöpäpotilaita (8,03 ± 9,20) (Fig. 3B, alempi). Olemme myös suorittaa qRT-PCR 5 pareina valmistettua cDNA kasvain (PT) ja vastaavat normaalien kudosten (PN) paksusuolen ja keuhkosyöpään. Kaikki viisi kasvain tapausta paksusuolikudos näytteillä

CDO1

alassäätöä, ja 3 5 tapausta keuhkokudoksen näytetä kevyemmästä

CDO1

PT verrattuna PN (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tietty lasku

CDO1

mRNA on yleinen tapahtuma ihmisen syövän kehittymisessä.

CDO1

ilmentyminen tutkittiin myös käyttämällä Cancer Profilointi Array II, joka sisältää normalisoitua cDNA kasvain ja sovitetun ei-syöpä (normaali) kudoksien 19 erityyppisiä syöpiä. Kuten on osoitettu kuviossa 4,

CDO1

ilmentymistä havaittiin selvästi useimmissa vastaavaan normaaleissa kudoksissa (N) jono, ja alas-säädellä kasvainten yli 50%: lla potilaista, joilla paksusuolen, mahan, haiman, kilpirauhasen , ihon, munuaisten, virtsarakon, keuhkojen, rinta-, munasarja-, kohtu-, kohdunkaula ja ulkosynnyttimien syöpä. Toisaalta kasvua

CDO1

kasvaimissa havaittiin alle 20%: lla potilaista näitä syöpätyyppejä (taulukko 2). Vuonna keuhkosyöpä, kaikki kasvaimet (100%, 10 10) näkyy alas-säätely

CDO1

(Fig. 4, ylempi), kun taas ilmaus

CDO1

maksassa oli liian korkea vertailla normaalin ja kasvaimen kudokset (ei määritetty, n /d). Lisäksi tiheä

CDO1

alassäätöä ( 80%) havaittiin enimmäkseen peräisin olevissa näytteissä nainen syöpäpotilailla (rinta-, munasarja-, kohtu, kohdunkaula ja ulkosynnyttimet) (Fig. 4, alempi ). Siten

CDO1

on vaimentua useita ihmisen syövissä, erityisesti syöpien välillä naisten elinten.

Syöpä profilointi paneelit II suoritettiin vertaamaan

CDO1

ilmaisun välillä kasvain (T) ja vastaaviin normaaleihin ohjaus (N) kudoksiin useiden kudosten tyyppejä. Array hybridisoitiin

CDO1

cDNA-koetin leimattiin

32P-α-deoksisytidiinitrifosfaattia mukaan valmistajan protokollaa. Kudostyypin ja tapausten määrä down-regulation

CDO1 vs.

kaikista tapauksista on ilmoitettu. Arrow, downregulation

CDO1

kasvain verrattuna normaaliin kudokseen. Ubikitiini cDNA (Ubi) käytettiin kontrollina. n /d, ei määritetty.

tutkimiseksi proteiinin ilmentymisen

CDO1

teimme immunohistokemiallinen (IHC) värjäys käyttäen sekä paksusuolen ja ruokatorven kudosmatriisien normaali ja syöpä kudoksiin. Kun useiden elinten normaalin kudoksen ryhmän, joka sisältää ei-pahanlaatuisten kudosten (NN), jotka ovat peräisin ruokatorvi, mahalaukku, maksa, koolon-, keuhko- ja rinta- (# BN00011), ekspressio CDO1 proteiinin havaittiin kaikissa ei-pahanlaatuinen kudoksissa; CDO1 ilme oli positiivinen 6 tapauksessa 6 kaikille kudostyyppien yhtä poikkeusta lukuun ottamatta rinta- (4 tapauksessa 6) (tuloksia ei ole esitetty). Kuvio 5A ja kuvio S2A esittävät edustavia tuloksia kolmesta positiivisia jättämisten pahanlaatuisten koolonin (NN1 ~ NN3). Lisäksi, joukossa 36 ryhmien näytteet koostuvat adenokarsinoomat (AD), täsmäsi syövän vieressä normaalilta näyttäviä kudoksen (NAT) ja sovitettu syövän viereisiin kudoksiin (vieressä) kussakin ryhmässä, jotka olivat peräisin 36 yksittäisten paksusuolen syövän potilaille (# BC05021 ja # BC05022 ), alas-säätely CDO1 havaittiin 25 tapauksessa AD verrattuna NAT tai Vieressä kudoksen (69%) (kuvio. 5B Fig. S2B). Viisi tapausta 36 AD näkyy säätely ylöspäin CDO1, mutta muut kuusi tapausta ei esiintynyt eroa keskuudessa AD, NAT ja vieressä kudokset (tuloksia ei ole esitetty). Tiheä laski CDO1 ilmentymistä havaittiin myös 33 ulos 40 tapausta ESCC (PT) verrattuna vastaaviin normaaleihin näkymisen kudokset (PN) (82%) (Kuva. 5C Kuva S2C). Vain kaksi tapausta ESCC ilmeni kohonneita CDO1 ilmentymistä, ja viidessä tapauksessa ei ilmennyt eroja PT ja PN (tuloksia ei ole esitetty) (# ES801). CDO1 ilmentyminen analysoitiin sitten paksusuolen adenokarsinooman eri kasvain laadut ja NAT (# BC05118 ja # CO