Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

yli-ilmentyminen ERG transkriptiotekijän takia genomista

ERG

-rearrangements määrittelee erillinen molekyyli alatyypin eturauhasen kasvaimia. Yksi seurauksista ERG kertyminen on modulaatio solun geeniekspressioprofiili. Tudor domain sisältävä proteiini 1-geenin (

TDRD1

) raportoitiin ekspressoitua eri välillä

TMPRSS2: ERG

-negatiivinen ja

TMPRSS2: ERG

-positiivinen eturauhassyöpää. Tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia antaa mekanistisen selityksen transkription aktivoituminen

TDRD1

in ERG uudelleenjärjestely-positiivisia eturauhasen kasvaimia.

Menetelmät /Principal Havainnot

Gene ekspressiomittaukset reaaliaikaisella kvantitatiivinen PCR paljasti merkittävä koekspressoimalla

TDRD1

ja

ERG

(r

2 = 0,77), mutta ei

ETV1

(r

2 0,01) ihmisen eturauhassyövän

in vivo

. DNA: n metylaatio analyysi MeDIP-Seq ja bisulfiitti sekvensointi osoitti, että

TDRD1

ilmentyminen korreloi käänteisesti DNA: n metylaatio on

TDRD1

promoottori

in vitro

ja

in vivo

(ρ = -0,57). Niinpä demetylaation

TDRD1

promoottori

TMPRSS2: ERG

-negatiivinen syöpäsolujen DNA metyylitransferaasin estäjien johti

TDRD1

induktio. Manipuloimalla

ERG

annostus kautta geenien ja pakotti ilmaisun osoitamme, että ERG hallitsee menetys DNA: n metylaatio on

TDRD1

promoottori liittyvä CpG-saarekkeen, mikä

TDRD1

yli-ilmentymisen.

Johtopäätökset /merkitys

osoittaa, että ERG omiaan aiheuttamaan häiriötä kudosspesifisellä DNA metylaatiokuvion klo

TDRD1

promoottori. Tämän seurauksena

TDRD1

tulee transkriptionaalisesti aktivoida

TMPRSS2: ERG

-positiivinen eturauhassyöpä. Koska esiintyvyys ERG fuusioiden,

TDRD1

yliekspressio yleinen muutos, ihmisen eturauhassyövän, joita voidaan käyttää hyväksi diagnostisia toimenpiteitä tai.

Citation: Kacprzyk LA, Laible M, Andrasiuk T, Brase JC, Borno ST, Fälth M, et al. (2013)

ERG

indusoi Epigeneettiset aktivointi Tudor Domain sisältävien Protein 1 (

TDRD1

) in

ERG

Rearrangement-Positive Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (3): e59976. doi: 10,1371 /journal.pone.0059976

Editor: Bandana Chatterjee, University of Texas Health Science Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 syyskuu 2012; Hyväksytty: 19 helmikuu 2013; Julkaistu: 29 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Kacprzyk et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Saksan liittovaltion opetus- ja tutkimusministeriö (https://www.bmbf.de/en/) puitteissa Program for Medical Genome Research (NGFNplus, IG-Eturauhassyöpä, 01GS0890 ja 01GS0891, IG-Mutanom , 01GS08107; Suoliston muokkaaja, 01GS08111) sekä Helmholtz International Graduate School for Cancer Research, että DKFZ ((www.dkfz.de/phd/)). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin puolet ihmisen eturauhassyövän tapauksista tunnistetaan PSA-seulonta satama genomista uudelleenjärjestelyjä, joissa androgen reagoiva säätelyelementtejä on asetettu rinnakkain geenit koodaavat transkriptiotekijät ETS perhe [1] – [3]. Tämän seurauksena, ETS geenit kytkeytymään androgeenireseptorin (AR) signalointia ja yli-ilmentynyt fuusio–positiivisia eturauhastuumorit [4] – [6]. Yleisimpiä näistä genomisen uudelleenjärjestelyjä,

TMPRSS2

:

ERG

geenin fuusio, johtaa voimakkaaseen yliekspressio ERG transkriptiotekijä, joka on muuten puuttuu soluissa eturauhasen epiteelin [7] ; fysiologisissa olosuhteissa

ERG

näyttää kudoksen vapaan ekspressiokuvio ja transkriptoidaan in hematopoieettisten linage [8] ja endoteelisolujen [9]. Kysymys siitä, miten ERG kertyminen vaikuttaa biologia eturauhassyöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

on saavuttanut merkittävää kiinnostusta. Tähän asti ERG ehdotettiin moduloida fenotyypin eturauhasen syöpäsolujen monenlaisia ​​prosesseja, mukaan lukien: häiriöt AR signaloinnin [10], aktivointi c-myc signalointi [11], ja estrogeenireseptori-verkon [12], aktivointi Wnt-reitin ja induktio epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon [13], edistämällä solujen invaasiota [14], fyysinen vuorovaikutus PARP1 [15] ja TGF-β /BMP signalointi [16]. Kasvaimet kätkeminen ERG fuusio todettiin myös rikastuttaa menetyksestä

PTEN

tuumorisuppressoriproteiinia [17], [18]. Niinpä hiirimalleissa eturauhassyövän ERG osoitettiin yhteistyöhön PI3K koulutusjakso ajaa karsinogeneesi [19], [20]. Kertyminen ERG todettiin myös olevan yhteydessä muuttuneeseen DNA metylaatiokuvion eturauhassyöpäsoluissa [10], [21], [22]. Analyysi eturauhassyövän transcriptome suorittaa meitä ja muut osoittivat, että kasvaimia kätkeminen

TMPRSS2

:

ERG

fuusio osuus ainutlaatuisen geeniekspressioprofiili joka merkittävästi poikkeaa profiileista hyvänlaatuista eturauhasen kudosten ja pahanlaatuiset kasvaimet puuttuu fuusio [1], [10], [12], [13], [16], [23]. Erityisesti, kasvaimet yli-ilmentävät ERG on tunnusomaista transkription moduloinnin liittyvien geenien Wnt ja TGF-β /BMP reitit [16], β-estradioli-verkon [12], [23] ja NF-KB: n reitin [24].

Niistä geenit vapautettiin

ERG

-rearranged eturauhassyöpä, ainakin kaksi riippumatonta tutkimusta tunnistettu Tudor domain sisältävä proteiini 1 (

TDRD1) B kaikkein ilmentyvät eri geenin välillä

ERG

uudelleenjärjestely-positiivinen ja -negatiivinen eturauhassyöpä, lukuun ottamatta

ERG

itse [16], [23]. Samoin

ERG

,

TDRD1

ei puhtaaksi normaalissa eturauhasessa epiteelissä [25], [26].

TDRD1

on alun perin tunnistettu syövän /kives-antigeeni, eli geeni, joka ilmentyy kiveksissä ja syöpä, mutta hiljainen aikuisen somaattisten kudosten [26]. Sen hiiri ortologi,

Tdrd1

, ilmentyy spermatogeneesin aikana, jos se toimii konservoituneen Pirna polku tukahduttaa aktiivisuuden LINE1 retrotransposonien metylointi [27]. Tuoreen tutkimuksen zebrafish ehdotti, että Tdrd1 toimii molekyyli- tukirakenteena Piwi proteiineja, piRNAs ja Pirna tavoitteet [28]. Sekä hiiren ja seeprakala, Tdrd1 tarvitaan oikean funktio Pirna reitin ja

Tdrd1

tyrmäys hiiren johtaa viallisen spermatogeneesin [28], [29].

Täällä raportissa, että

ERG

ja

TDRD1

ovat yhteistyössä ilmaistaan ​​ihmisen eturauhasen syöpien ja tarjoamme mekanistinen selitys havaittuun co-ilmaisua. Osoitamme, että ERG aktivoi

TDRD1

transkriptio indusoimalla menetys DNA: n metylaatio on

TDRD1

promoottori liittyviä CpG-saarekkeen. Ehdotamme, että tämä epigeneettiset seurauksena

TMPRSS2: ERG

fuusio merkitsee uudella mekanismilla, joka saattaa selittää osan transkription moduloinnin aiheuttama ERG ihmisen eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

eturauhasen kudosnäytteitä saatiin University Medical Center Hamburg Eppendorf. Hyväksyntä tutkimuksessa saatiin paikallisesta eettisen komitean ja kaikki potilaat sopivat kudoksiin näytteenotto tieteellisiin tarkoituksiin.

eturauhasessa Näytteet, Genominlaajuiset Expression profilointi ja metylointianalyysi

Tiedot ihmisen näytteiden kerääminen, RNA: n, muuntaminen cDNA ja genominlaajuisten ilmentymisen profilointi on kuvattu muualla [16]. DNA: n uutto ja genominlaajuisia metylointianalyysi by MeDIP-Seq on kuvattu muualla [22]. Tiedot genominlaajuisten ilmentymisen profiloinnin ja genominlaajuisia metylointianalyysi ovat julkisesti saatavilla Gene Expression Omnibus tietokantaan (liittymistä numerot GSE29079 ja GSE35342).

TMPRSS2: ERG

fuusio tila määritettiin PCR: llä käyttäen aikaisemmin kuvattuja alukkeita [30] ja qPCR [16]. Näytteet, joille sekä mRNA: n ilmentymisen ja DNA: n metylaatio oli saatavilla, olivat mukana analyysissä.

Cell Culture

VCAP, NCI-H660, LNCaP, DU145, PC-3, ja RWPE -1-solut saatiin ATCC: ltä (Manassas, VA, USA). BPH-1-soluissa olivat ystävällinen lahja Doris Mayer (DKFZ, Heidelberg). K-562 ja KG-1-solut toimittanut Christoph Plass ja Peter Krammer, vastaavasti (DKFZ, Heidelberg). MOLT4 ja CMK-solut saatiin DSMZ (Braunschweig, Saksa). Vcap soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Gibco). NCI-H660-soluja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco), jota oli täydennetty 5% FBS: ää (Gibco), 2 mM L-gluatmine, 0,005 mg /ml insuliinia, 0,01 mg /ml transferriiniä, 30 nM natriumseleniitti, 10 nM hydrokortisoni ja 10 nM beeta-estradiolia (kaikki Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). LNCaP ja DU145 pidettiin RPMI-1640 (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. PC-3-soluja viljeltiin F12-K-alustassa (ATCC), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. RWPE1 soluja viljeltiin keratinosyyttien seerumia, johon on lisätty 0,05 mg /ml naudan pituary uutetta ja 5 ng /ml yhdistelmä-DNA-EGF: ää (Gibco). BPH1-soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 20 ng /ml 5α-dihydrotestosteronin (Sigma). K-562 ja MOLT-4-soluja viljeltiin RPMI-1640 ja jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, KG-1 ja CMK-soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 20% lämpöinaktivoitua FBS: ää.

Generation Stabiilin LNCaP kloonien ja induktio transgeeniekspression

ERG koodaussekvenssi (eksonit 4-11 maasta NM_004449.3), mikä vastaa TMPRSS2: ERG fuusio T1 /E4 [31], monistettiin NM_004449. 3-sisältävää plasmidia (Genomics ja Proteomiikka Core Facility, DKFZ) PCR: llä käyttämällä alukkeita: eteenpäin GCAGGCTCCACCATGACCGCGTCCTCCTCCAG, käänteinen CAAGAAAGCTGGGTCTTAGTAGTAAGTGCCCAGAT. Transfektoitu stabiilisti LNCaP-kloonia, kuten aikaisemmin on kuvattu [32]. Siirtogeenin ilmentyminen indusoitiin 50 ng /ml doksisykliiniä (Sigma).

RNA uuttaminen ja Käänteinen transkriptio

Kokonais-RNA eristettiin eksponentiaalisesti kasvavia solulinjoja käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa ) seuraten valmistajan ohjeita. cDNA-synteesi performend käyttäen SuperScript III-käänteistranskriptaasia (Life Technologies) ja oligo-dT-alukkeita (Sigma-Aldrich) noudattaen valmistajan ohjeita. Mittaamiseen LINE1-ORF2 mRNA kokonais-RNA käsiteltiin Turbo DNaasia (Life Technologies) poistamiseksi kontaminoivan genomisen DNA: n. DNaasi-käsitelty RNA puhdistettiin sitten käyttämällä RNeasy MinElute uudelleenjärjestäminen Kit (Qiagen) ja alistettiin käänteistranskriptio käyttäen RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, Kanada) ja satunnaisia ​​heksameerialukkeita.

Kvantitatiivinen RT- PCR

Gene ekspressiotasot mitattiin LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche, Mannheim, Saksa). cDNA vastaa 10 ng kokonais-RNA: ta käytettiin kuoppaa kohti. Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena kappaleena. Taqman (Applied Biosystems) ajettiin 2x absoluuttinen QPCR Mix (ABgene, Thermo Fischer, Epsom, UK). Universal Probe Kirjasto (UPL) järjestelmän määritykset (Roche) suoritettiin käyttämällä 480 Probes Master (Roche). Raaka Cp-arvot laskettiin Roche Lightcycler 480 ohjelmiston avulla toinen johdannainen suurin menetelmä. Analyysit ja alukesekvenssit on lueteltu taulukossa S1 yhdessä vastaava luku numeroita. Expression tasot on esitetty absoluuttisina lukuina (Cp) tai lauseke suhteessa sisäisenä standardina geeni (käyttäen ΔCp menetelmä).

Western-blottaus

Eksponentiaalisesti kasvavat solut lyysattiin RIPA-puskurilla (50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS), jota oli täydennetty 5 mM EDTA ja HALT Protease Inhibitor Cocktail (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Proteiinikonsentraatiot määritettiin BCA Protein Assay Kit (Pierce). Ellei toisin ole mainittu, 30 ug proteiinia lysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Macherey-Nagel, Düren, Saksa) ja tutkittiin vasta-aineet on lueteltu taulukossa S1. Signaalit havaittiin käyttämällä ECL substraattiliuosta [33] ja äänitetty Fusion-SL 3500 WL kuva mittausjärjestelmällä (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Ranska).

siRNA-välitteinen geenien

Kaikki siRNA käytettiin tutkimuksessa syntetisoitiin Dharmacon (Thermo Fisher Scientific, Epsom, UK) ja suspendoitiin uudelleen 1 x siRNA Buffer (Dharmacon). Ellei toisin mainita, solut ympättiin yksi päivä ennen transfektiota yhtymäkohdassa 50-70%. siRNA transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAi Max (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektio kompleksit valmistettiin seerumittomassa OptiMEM-alustassa (Gibco) ja lisättiin täydellistä kasvualustaa 20:80 v /v suhteessa. Lopulliset pitoisuudet siRNA: iden olivat 50 nM (ei-suunnattu altaan siRNA, ERG siRNA) tai 25 nM (TDRD1 siRNA). Kaikki siRNA tutkimuksessa käytetyt on lueteltu taulukossa S1.

CpG Island määrittely ja bisulfiittimodifiointi DNA Sequencing

TDRD1

-promoottorin liittyy CpG-saarekkeen määriteltiin mukaan oletuksena kriteerit tarjoamat UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/). Genomi-DNA uutettiin soluista käyttäen QIAamp DNA veren Mini Kit (Qiagen). Natriumbisulfiitti muuntaminen DNA suoritettiin EpiTect bisulfiittimodifiointi Kit (Qiagen) käyttämällä 1 ug genomista DNA: ta. 525-bp: n DNA-fragmentti, joka sisälsi TDRD1 promoottorin liittyvän CpG-saari monistettiin HotStarTaq-DNA-polymeraasia (Qiagen) käyttämällä alukkeita, jotka on lueteltu taulukossa S1. PCR-tuote kloonattiin pCR2.1-vektoriin käyttäen TOPO TA -kloonaustarvikesarjaa (Life Technologies). TOP10 kemiallisesti kompetentteja soluja (Life Technologies) transformoitiin ligaation tuote. Sen jälkeen, kun sininen-valkoinen seulonta, plasmidit sisältäviä pesäkkeitä insertin tehtiin Sanger sekvensointi (GATC, Konstanz, Saksa). Raaka Sangerin sekvensointia lukee analysoitiin metylaation tapahtumia käyttäen verkkotyökalu Bisma [34].

5-atsa-2′-deoksisytidiini hoito

LNCaP tai VCAP-solut ympättiin poly-L- lysiini (Sigma-Aldrich) päällystettiin 12-kuoppaisille levyille alhaisella tiheydellä. Kuten seuraavana päivänä solut käsiteltiin ajoneuvon (0,1% DMSO: ta, Applichem, Darmstadt, Saksa) tai osoitettujen konsentraatioiden 5-atsa-2′-deoksisytidiini (Sigma-Aldrich) viiden peräkkäisen päivän ajan. 24 tunnin välein, kasvualusta korvattiin tuoreella valmisteltu väliaine, joka sisältää joko 5-atsa-2′-deoksisytidiinin tai ajoneuvon.

solunelinkykyisyysmääritys

elinkelpoisuuden määritystä, 2.5×10

4 Vcap soluja siirrostettiin musta pohja 96-kuoppaisille levyille (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) 80μl normaalin kasvualustaa. 24 tunnin kuluttua solut transfektoitiin siRNA: illa, kuten on kuvattu edellä, ja tämä päivä oli jäljempänä ”päivä 1”. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kanssa CellTiter-Blue solunelinkykyisyysmääritys (Promega Corporation, WI, USA) päivinä 1, 3, 5, 7 ja 9 mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresenssi rekisteröitiin Tecan Infinite M200 (TECAN Group Ltd, Männedorf, Sveitsi).

Statistical Data Analysis

Kaikki tulokset analysoitiin käyttämällä GraphPad Prism 5.04. Määrälliset tulokset on esitetty keskiarvona ± SEM (standard keskivirhe) lasketaan suoritetaan kaikki kokeet, ellei toisin ole mainittu. Kaikki vertailut koeryhmään suoritettiin Mann-Whitneyn-Wilcoxonin testi Bonferroni korjaus (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). Spearman (

ρ

) ja Pearson (r) korrelaatiokertoimet laskettiin GraphPad Prism 5.04.

Tulokset

TDRD1

koekspressoituu kanssa

ERG

mutta ei

ETV1

Human eturauhassyöpä

aikaisemmat ilmentymisen profilointi tutkimus ihmisen eturauhassyövän yksilöitä paljasti, että

TDRD1

on lisäksi

ERG

, kaikkein ilmentyvät eri geenin välillä

TMPRSS2

:

ERG

-negatiivinen ja positiivisia kasvaimia [16]. Meillä on siis suoritettu korrelaation analyysi tietojen 93 eturauhasen kudosnäytteistä (46 hyvänlaatuinen, 30

TMPRSS2: ERG

-negatiivinen, 17

TMPRSS2: ERG

positiivisten eturauhasen kasvaimet) ja totesi, että mRNA tasot

ERG

ja

TDRD1

mitataan ihmisen eksoni 1.0 ST Array ovat huomattavan korreloivat kaikissa näytteissä (r

2 = 0,84), mikä viittaa mekanistinen yhteys näiden kahden geenin välissä. Sen sijaan,

TDRD1

ei koekspressoitu

ETV1

(r

2 = 0,05), joka on ETS transkriptiotekijä havaittiin satunnaisesti järjestää uudelleen eturauhasen syöpä. Jotta vahvistaa nämä havainnot, mittasimme

TDRD1

,

ERG

ja

ETV1

mRNA tasoilla kvantitatiivinen RT-PCR samassa näytesarja. Jälleen

TDRD1

ilmentyminen havaittiin korreloivan

ERG

(r

2 = 0,77), mutta ei

ETV1

(r

2 0,01 ) ilmentymistä (Fig. 1a). Laatia riippumaton validointi havaintomme, me epäili Oncomine tietokannan [35] avulla ”TDRD1” ja ”eturauhassyöpä” hakutermeinä. Analyysi Kahden määriteltyjä tutkimuksia tukee havaintomme: in data Grasso et al. [36]

ERG

oli päällimmäinen geeni yhteistyössä ilmaistaan ​​

TDRD1

. Kun tiedot Taylor et al. [17],

TDRD1

todettiin sovitettava ilmaista

ERG

(r

2 = 0,55) mutta ei

ETV1

(r

2 = 0,02) ympäri 149 ensisijainen eturauhasen kasvaimia. Jotta selittää havaitun co-ilmaisun, käytimme solu malleja eturauhassyövän, mukaan lukien solut, jotka edustavat hyvänlaatuinen (RWPE-1, BPH-1), fuusio-negatiivinen (PC-3, DU145),

ERG

-rearranged (VCAP, NCI-H660) ja

ETV1

-rearranged (LNCaP) eturauhassyöpä. Gene ekspressiomittaukset eturauhasessa solulinjoissa ilmeni, että vaikka

TDRD1

mRNA-tasot olivat riippumattomia

ETV1

ilmaisua, ilmeinen yhdistyksen välillä

TDRD1

ja

ERG

ilme

in vitro

(Fig. 1b). Yksikään solulinjoista ilman

ERG

yliekspressio ilmaistaan ​​

TDRD1

, kun taas NCI-H660 ja VCAP solulinjat, jotka molemmat satama

TMPRSS2: ERG

fuusio ilmaistuna korkea tasot

TDRD1

(Fig. 1b). Sitten kysyi korkea molempien

TDRD1

ja

ERG

lähetti-RNA ERG-positiivisten eturauhasen solujen kääntää huomattavia määriä vastaavat proteiinit ja totesi, että VCAP ilmentävät ERG ja TDRD1 at tasojen western blottauksella (kuvio. 1 c). Perustuen ensimmäisten tulosten, päätimme käyttää VCAP soluihin kuin

in vitro

malli tutkia mekanistisen suhde

ERG

ja

TDRD1

geenien

ERG –

jäsensi eturauhassyöpää.

(A) Korrelaatio analyysi mRNA mitattuna qRT-PCR

TMPRSS2: ERG

-negatiivinen (ERG-, n = 30) ja

TMPRSS2: ERG

positiivisia (ERG +, n = 17) eturauhasen syövät sekä viereisen hyvänlaatuista eturauhasen kudosta (n = 46). Pearsonin korrelaatiokerroin on esitetty. (B) analyysi mRNA eturauhasessa solulinjoissa qRT-PCR. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena. Ihmisen kiveksen RNA: ta käytettiin positiivisena kontrollina

TDRD1

ilme. (C) analyysi proteiinin ilmentymistä eturauhasen solulinjojen western blottauksella. (D) analyysi mRNA: n ekspression hematopoieettisten syöpäsolun riviä qRT-PCR. Kaksi itsenäistä kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

TDRD1

ei koekspressoitiin

ERG

vuonna Hematopoieettinen Syövät

Jotkut hematopoieettiset syövät yli-ilmennä ERG proteiini [37], [38] ja tiedetään, että myelooinen, T- ja Bcell leukemiat riippuvaisia ​​ERG niiden kunnossapitoon [39], [40]. Meillä on siis tutkittu

ERG

ja

TDRD1

koekspressoimalla by qRT-PCR paneelissa solulinjojen edustavat eri hematopoieettisten syöpien. Vaikka olemme havainneet korkea

ERG

mRNA useissa syöpäsolulinjoissa peräisin hematopoieettisperäisissä, vastaava ilmaus

TDRD1

mRNA oli noin 50 kertaa pienempi kuin Vcap-soluissa (kuvio. 1d). Laajentaa analyysia siitä solulinjoissa, vertasimme

ERG

ja

TDRD1

mRNA: n ekspression eturauhaskudoksiin ja sytogeneettisesti epänormaali akuutti myelooinen leukemia (CA-AML) mitattiin samalla alustalla (Human Exon 1.0 ST Array) [41]. Toisin kuin havaintomme eturauhassyövässä (r

2 = 0,84),

ERG

ja

TDRD1

ei koekspressoidusta CA-AML (r

2 = 0,07 ).

ERG

on myös raportoitu olevan yli-ilmentynyt Ewingin sarkoomaa [42] – [45]. Meillä on siis analysoinut käytettävissä geeniekspressioprofilointi tutkimuksia Ewingin sarkooma kasvaimia varten

TDRD1

ja

ERG

ilmaisun [46], [47]. Toisin kuin eturauhasen syöpä, ei ollut koekspressio

ERG

ja

TDRD1

missään näistä tutkimuksista (r

2 = 0,03 ja 0,02, vastaavasti). Tämä viittaa siihen, että ilmentäminen rinnakkain

ERG

ja

TDRD1

on spesifinen eturauhasen syöpään.

ERG transkriptiotekijä on ylläpidettävä korkea

TDRD1

ekspressio

TMPRSS2: ERG

positiivisten solujen

ilmentäminen rinnakkain kaksi geeniä voidaan selittää muun muassa sääntely yksi geenien muiden tai niiden keskinäinen asetuksella on rehu-eteenpäin silmukka. Voit testata näitä mahdollisuuksia, me köyhdytettyä joko ERG tai TDRD1 proteiinin VCAP soluissa RNA-interferenssi ja määritettiin mRNA- ja proteiini molempien geenien ilmentymistä. Hiljentäminen

ERG

80% hyötysuhde johti 3,9-kertainen downregulation

TDRD1

mRNA 72 h transfektion (P 0,0001, Fig. 2a). Sen sijaan vaimentaminen

TDRD1

ei aiheuttanut muutoksia

ERG

mRNA ilmaisun. Analyysi vastaavan proteiinin tasot Western blot osoitti, että hiljentäminen

ERG

ja

TDRD1

geenit oli erittäin tehokas, mikä johtaa täydelliseen ehtyminen sekä proteiinien soluista (Fig. 2b). Vaikka knockdovvn

ERG

aiheutti syvällinen downregulation TDRD1 proteiinia 72 tunnin, ei tällaisia ​​vaikutuksia ERG havaittiin jälkeen hiljentäminen on

TDRD1

geeni. Samanlainen ilmentymiskuvio havaittiin myös 48 h transfektion jälkeen (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi jatkuva läsnäolo ERG tarvitaan ylläpitää korkeaa ekspressiota

TDRD1

in Vcap soluihin ja havaittu koekspressio kahden geenin eturauhasen kasvaimia voidaan selittää yksisuuntaisen aktivoinnin

TDRD1

kautta ERG transkriptiotekijä.

(A)

ERG

ja

TDRD1

mRNA ekspressiotasot VCAP soluissa mitattiin 72 tunnin kuluttua geenin hiljentäminen siRNA: illa. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena kappaleena. (B) ERG ja TDRD1 proteiinin ilmentymistä VCAP soluissa 72 tunnin kuluttua geenin hiljentäminen siRNA: illa.

TDRD1

promoottori-liittyvä CpG Island on hypometyloidut in

TMPRSS2: ERG

-positiivinen eturauhaskasvaimissa

Expression of

TDRD1

yhdessä muiden ituradan geeneistä, tiedetään tukahdutettu somaattisten kudosten epigeneettisellä hiljentäminen [26], [48 ]. Siksi tutkittiin metylaatiotilan

TDRD1

promoottori ja siihen liittyvä CpG-saarekkeen yhteydessä

ERG

uudelleenjärjestelyjä. Me tarkastetaan metylaatio DNA ympärillä

TDRD1

transkription aloituskohdasta eturauhastuumoreissa, että olimme analysoitiin MeDIP-Seq [22], ja löysi tämän alueen differentiaalisesti metyloiduksi välillä kasvaimia ja ilman

TMPRSS2: ERG

geeni fuusio. Tarkemmin sanottuna 1 kb alueella, joka kattaa

TDRD1

promoottori liittyvä CpG saari oli merkittävästi hypometyloidut

TMPRSS2: ERG

positiivisia kasvaimia verrattuna hyvänlaatuisia ja

TMPRSS2: ERG

-negatiivinen kasvaimet (P 0,0001, Fig. 3a). 500 emäsparin ikkuna välittömästi alavirtaan CpG-saarekkeen ei ilmennyt eroja DNA: n metylaatio välillä ERG-negatiivisten ja ERG-positiivisia kasvaimia (P = 0,41, Fig. 3a). Lisäksi DNA-sekvenssi, joka reunustaa oletetun

TDRD1

promoottori ei ole differentiaalisesti metyloitu minkä tahansa kolmesta ryhmästä (P 0,05), mikä osoittaa, että ero DNA: n metylaation tapahtuu välittömässä läheisyydessä

TDRD1

transkription aloitus- päällä, mutta ei sen ympärille. Huomattavaa on, että keskimääräisen tason

TDRD1

promoottori metylaatio korreloi käänteisesti

TDRD1

mRNA kaikissa 93 näytettä (

ρ

= -0,57), mikä viittaa siihen, että menetys promoottori metylaatio edistää merkittävästi

TDRD1

yli-ilmentymisen

TMPRSS2: ERG

fuusio-positiivisten eturauhassyöpä (Fig. 3b).

(A) analyysi

TDRD1

promoottori metylaatio eturauhasen kasvaimia MeDIP-Seq. Arvot edustavat keskiarvoa aste DNA: n metylaatio on 500-bp jäteastioita. (B) Korrelaatio analyysi

TDRD1

promoottori metylaatio ja

TDRD1

mRNA ilmaisun eturauhassyövässä. Spearman korrelaatiokerroin on esitetty.

ERG aiheuttama menetys Epigeneettiset Repression klo

TDRD1

Promoottori on Major mekanismi

TDRD1

aktivointi

Koska differentiaalisesti metyloitu alue ulottui CpG-saarekkeen liittyvä

TDRD1

promoottori ja CpG-saarekkeiden tiedetään olevan rooli säätelyssä transkriptio [49], olemme suorittaneet bisulfiitti sekvensointi

TDRD1

-associated CpG saari eturauhasen solulinjoissa. Huomasimme, että CpG-saarekkeen oli täysin metyloitu hyvänlaatuinen soluissa ja ERG-negatiivinen syöpäsolun linjat, joiden keskimääräinen metyloinnin vaihtelee 89,3% ja LNCaP 98,6% PC-3 (Fig. 4a). Sitä vastoin CpG metylaatio oli lähes kokonaan poissa

TMPRSS2: ERG

positiivisia solulinjoja NCI-H660 ja VCAP (11,4% ja 0,7%, tässä järjestyksessä). Vertailu

TDRD1

mRNA (Fig. 1b) DNA metylaation CpG-saaren

TDRD1

promoottori (Fig. 4a) paljasti käänteinen korrelaatio kahden parametrin poikki tutkitaan solulinjoja, jotka oli mukaisesti vastaavien tietojen eturauhasen kasvaimia. Koska karu eroja DNA: n metylaatio on

TDRD1

promoottori välillä ERG-siirrettävissä ja loput solulinjoissa, me arveltu, että menetys DNA: n metylaatio on

TDRD1

promoottori on tärkeä mekanismi vastuussa

TDRD1

aktivointia. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi käsittelimme ERG-negatiivinen LNCaP-solujen DNA-metyylitransferaasi-inhibiittorin 5-atsa-deoksisytidiini (desitabiini; [50]). Viiden päivän hoidon submikromo- laarisena pitoisuudet decitabine havaitsimme annoksesta riippuva nousu ekspression

GSTP1

geeniä, jonka tiedetään vaiennetaan metylaation LNCaP-soluissa [51] (Fig. 4b). Erityisesti

TDRD1

mRNA voimistuvan yli 25-kertaisesti. Näin ollen, sen jälkeen, kun lisäys

TDRD1

mRNA-tasot, TDRD1 proteiini tuli havaittavissa LNCaP-soluissa immunoblottauksella (Fig. 4b, insertti), joka osoittaa, että DNA: n menettämisen metylaatio voi hyvinkin olla riittävä ajamaan

TDRD1

ilme.

(A) DNA metyloituvuutta

TDRD1

promoottori liittyvää CpG saari eturauhasen solulinjoissa bisulfiitti sekvensoinnilla. Keskimääräinen metylaatio taso koko CpG-saarekkeen lasketaan viidestä sekvensoitiin pesäkettä näkyy (%). (B) analyysi mRNA: n ekspression LNCaP-soluissa hoidon jälkeen demetyloiva aineen 5-atsa-2′-deoksisytidiini. Aseta: analyysi proteiinin ilmentymisen LNCaP hoidon jälkeen 5-atsa-2′-deoksisytidiini. 75 ug proteiinia lysaatti LNCaP käytettiin kaistaa kohti. (C) analyysi mRNA ilmaisun vakaa LNCaP kloonien yli-ilmentävät

ERG

. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena. Aseta: ERG ilmaus analyysi 48 h LNCaP klooneja western blottauksella. (D) bisulfiittimodifiointi sekvensointi

TDRD1

promoottori liittyvää CpG saari LNCaP 48 tuntia induktion jälkeen ERG ilmaisun kanssa doksisykliini. (E) bisulfiittimodifiointi sekvensointi

TDRD1

promoottori liittyvät CpG-saarekkeen 96 h kuluttua hiljentäminen on

ERG

in VCAP soluissa. Tiedot näytetään (D) ja (E) ovat keskiarvoja% metylaation koko CpG-saarekkeen lasketaan 11-12 sekvensoidaan klooneja.

Voit tarkistaa ERG voivat jäljitellä vaikutuksia kohdistuu

TDRD1

ilmentymisen demetylaation LNCaP-genomin, me syntyy stabiili LNCaP-solut yli-ilmentävät koodaava sekvenssi

TMPRSS2: ERG

fuusio T1 /E4 indusoituva tavalla. Induktio

ERG

ilmaisutapoja doksisykliinihoidon johti lähes 5-kertainen

TDRD1

mRNA, kun taas doksisykliini ollut vaikutusta

TDRD1

ilmaisun LNCaP Klooni, joka käsitti tyhjä ekspressiovektori (Fig. 4c). Olemme käyttäneet bisulfiitti sekvensointi analysoida vastaavaan DNA metylaatiostatuksen

TDRD1

promoottori liittyvät CpG-saarekkeen kun ERG induktion. ERG yliekspression johti hypometylaatio

TDRD1

promoottorialue 27% tutkituista alleelien, vaikka emme noudata mitään hypometylaatio päälle doksisykliinikäsittely tyhjän vektorisäädön (Fig. 4d, Fig. S1a). Koska päinvastainen kokeilu eli ehtyminen ERG in VCAP soluissa RNAi, on johtanut downregulation TDRD1 ilmaisun (Fig. 2) olemme myös suoritettu bisulfiitti sekvensointi

TDRD1

CpG-saarekkeen jälkeen ERG hiljentämisen VCAP solut. 96 h transfektion jälkeen, hiljentäminen ERG 65% hyötysuhde johti lähes 3-kertainen keskimääräisen DNA: n metylaatio on CpG-saarekkeen, 15,7% Metyloitujen CpG: t ei-kohdistuksen ohjaus 45% soluissa käsitelty siRNA kohdistaminen

ERG

(Fig. 4e, Fig. S1B).

edellä mainitut havainnot osoittavat, että DNA: n metylaatio asema

TDRD1

promoottori ja siten transkriptioaktiviteettia ovat mekaanisesti liitetty tasoihin ERG transkriptiotekijän eturauhasen syöpäsoluja.

Differential rooli

TDRD1

kiveksissä ja eturauhassyöpä

evoluution säilyneet Pirna reitin tärkeä rooli miehen ituradan spermatogeneesin aikana [52] – [54]. Komponentit Pirna reitin teko tukahduttaa toimintaa transposonien, mahdollisesti jotta eheys säilyy ituradan aikana kromosomien genominlaajuisten demetylaatio in alkuitusolujen [55] – [57]. Tutkimukset suoritettiin hiiren ja seeprakala ovat osoittaneet, että Tdrd1, ortologi ihmisen

TDRD1

, on osa Pirna reitin, joka spesifisesti vuorovaikuttaa Pirna liittyvien proteiinien voimistavan Pirna-välitteisen hiljentäminen LINE1 retrotransposonien. Näin ollen menetys Tdrd1 hiiren oli osoitettu johtavan LINE1 derepressiota [27], [58]. Ihmisillä neljä ortologeihin koodaavat Pirna liittyvien proteiinien olemassa:

PIWIL1

–

PIWIL4

[59]. [17].