Krooninen sairaus

tiivistelmä

läsnäolo syövän kantasoluja (CSCS) tai kasvaimeen aloittamista solut voivat aiheuttaa syövän uusiutumiseen sallivassa solu-microenvironment vuorovaikutuksen edistäminen invaasio glioblastoma (GBM) ja neuroblastooma (NB). Soluväliaineen (ECM) pienet leusiinirikkaita proteoglykaanien (SLRPs) pelata useita rooleja kudoksessa homeostaasin remodeling soluväliaineen (ECM) komponenttien ja moduloiva solunsisäinen signalointi reittejä. Koska niiden yleiseurooppalaisen estävistä ominaisuuksista vastaan ​​reseptori (RTK: t), SLRPs raportoidaan aiheuttavan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista

in vitro

ja

in vivo

. Kuitenkin niiden roolit näyttävät olevan kudosspesifisiä ja ne ovat mukana myös syövän solujen vaeltamiseen ja lääkeresistenssi, pohjustaa monimutkaisiin erilaisia ​​skenaarioita. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, onko SLRPs dekoriini (DCN) ja lumican (LUM) rekrytoidaan soluun plastisuus ja microenvironmental mukauttaminen eriytetty syöpäsolujen aiheuttama kohti varren kaltainen fenotyyppi. Kelluva neuropallojen muodostettiin käyttämällä CSC rikastuksen väliaine (hermostoputken kantasolujen seerumittomassa väliaineessa, NSC SFM) on perustettu SF-268 ja SK-N-SH-syöpäsolulinjoja, solu malleja GBM ja NB, vastaavasti. Molemmissa malleissa, ajan funktiona synergistinen aktivaatio DCN ja LUM havaittiin. Korkeimmat DCN ja LUM mRNA /proteiinin ilmentyminen havaittiin jälkeen solujen altistuksen NSC SFM varten 8/12 päivää, kun otetaan huomioon nämä solut niin SLRP ilmentäviä (SLRP

+) CSC-kaltainen. Mikroskooppitutkimus kuvantaminen osoitti solujen heterogeenisyys sekä GBM ja NB neuropallojen ja tunnistaa sisäisen elävien solujen. Vanhempien solulinjat sekä GBM ja NB kasvoi ainoastaan ​​pehmeällä agar + NSC SFM, kun taas toissijainen neuropallojen (peräisin SLRP

+ t

8 CSC-like) osoitti pienempi lisääntymistä hinnat kuin ensisijainen neuropalloja. Mielenkiintoista, SLRP

+ CSC kaltainen peräisin GBM ja NB neuropallojen oli resistenttejä temotsolomidille (TMZ) pitoisuuksina 750 uM. Tuloksemme viittaavat siihen, että GBM ja NB CSC kaltainen edistää aktivoitumista valtavia määriä SLRP vastauksena CSC rikastamiseen, samanaikaisesti hankkimalla TMZ vastus, solu heterogeenisyys, ja lepotilassa fenotyyppi, mikä viittaa romaanin keskeinen rooli SLRP vuonna lääkeresistenssin ja solu plastisuus CSC-like, joka mahdollistaa solujen eloonjäämistä ja ECM /kapealla modulaatio potentiaalia.

Citation: Farace C, Oliver jA, Melguizo C, Alvarez P, Bandiera P, Rama AR, et al. (2015) Microenvironmental modulaatio Decorin ja Lumican in temotsolomidi hylkivät Glioblastoma ja Neuroblastooma Cancer Varsi kaltaisia ​​soluja. PLoS ONE 10 (7): e0134111. doi: 10,1371 /journal.pone.0134111

Editor: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, University of Kreeta, Kreikka

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 06 heinäkuu 2015; Julkaistu: 31 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Farace et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Fundació la Marato TV3, Project nro 111431.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Background

glioblastoma (GBM) ja neuroblastooma (NB) ovat yleisimpiä ja tappava hermoston pahanlaatuiset syövät aikuis- ja lapsipotilailla, vastaavasti. Maailman terveysjärjestö arvioi GBM aggressiivisin astrosytooman ja se voi kehittyä toissijainen GBM huonolaatuisesta gliooma tai

de novo

nopean etenemisen kuolemaan [1]. Sen sijaan, NB pääasiassa syntyy hermostopienasoluille kuin neuroendocrine syöpä sympaattisen hermoston, ja 60% lapsipotilaista osoittavat etäpesäkkeitä diagnoosin [2]. Vaikka temotsolomidia (TMZ) -an alkylointiaineella, joka indusoi solukuoleman koko DNA alkyloimalla /metylaation guaniini jäännökset yhdessä muiden lääkkeiden tai sädehoidon edustavat ensisijaisena hoitona lisäämällä yleistä (OS) potilaista, joilla GBM tai NB [ ,,,0],3, 4], lääkeresistenssin ja syövän etenemistä ovat yleisiä. Koska GBM on erittäin invasiivinen aivoissa ja NB on taipumus tunkeutua muihin elimiin, potilas OS edelleen heikko ( 1,5 vuoden GBM potilaille ja 4 vuotta NB potilasta) [5, 6].

hoito epäonnistumisen syöpäpotilailla on aiemmin liittyvät syöpään kantasolujen (CSC) alapopulaatioiden, joka jatkumisen varmistamiseksi syövän heterogeenisyys, ja nämä CSC -alapopulaatioiksi ovat vastustuskykyisempiä valikoivaa lääkkeitä läpi useita yhteisiä vaiheet itseuudistumisen ja erilaistuminen [7-9]. Etäpesäke ja syövän uusiutumiseen liittyvät myös käyttäytymistä CSCS, mukaan lukien niiden lepotilassa fenotyyppi, leviämiskyky, kiertämisen ja immuunijärjestelmän [10]. Runsas tutkimus osoittaa, että solut varsi kaltaisia ​​soluja on varustettu luontainen koneita, joka suojaa niitä radio /kemoterapiaa [11, 12]. Tämä sisältää varren liittyviä mekanismeja, kuten suojaavan solu- markkinaraon ja muutokset geenien säätelyyn osallistuvan solusyklin, DNA korjaus, lääkeainemetaboliaan, ja lääkevuoto- [13]. Lääkeresistenssin ja solujen invaasiota potentiaali CSCS myös kasvavan palautuva epiteelin-to mesenkyymisoluyhteisviljelmissä fenotyypin siirtymä (EMT) [14, 15], joka esitetään yhteenveto EMT normaalissa organogeneesin ja kehittämiseen [16, 17].

useita microenvironmental signaaleja, kuten uudelleenjärjestely soluväliaineen (ECM), hypoksia, ja autokriininen /parakriininen tekijät, voidaan määrittää varsi ja syövän solukohtaloina [18-25], ja liipaisin tai estävät EMT prosessien [26, 27]. Siksi ECM glykoproteiineja ja proteoglykaanien, jotka pystyvät muuntamaan sekä ECM ympäristön ja solunsisäinen signalointi reitit ovat erittäin tärkeitä syövän mikroympäristössä [28-30]. Pieni leusiinirikkaita proteoglykaanien (SLRPs), jakaa strategisesti domainia, ovat selkeä esimerkki edellä mainitusta käsitteestä. Leusiini runsaasti proteiinia ydin (40-50 kDa) sitoutuvat useiden kasvutekijöiden (GF), ja membraanireseptorit, kun taas haarautuminen glycosaminoglycanic sivuketjut osallistuvat ECM-kollageenin kokoonpanon ja myös kalvon reseptorin sitoutumisen. Mielenkiintoista on, että vaikka ne yleiseurooppalaisen estävistä ominaisuuksista vastaan ​​reseptori (RTK: t) ja syövän kasvua väyliä, The ”vartija matriisista” dekoriini (DCN) ja lumican (LUM) SLRPs voisi käyttää syöpää ehkäisevistä vaikutuksista

in vivo

ja

in vitro

[31-33]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat valottaa vasta havaittuihin kudosspesifisiä ominaisuuksia sekä DCN ja LUM normaaleissa kudoksissa ja pahanlaatuisen syövän microenvironment. Ilmoittama muut kirjoittajat, osittainen gliooma esto DCN Geeniterapiassa kokeissa rotilla tuo mukanaan huomattavaan vähenemiseen mikrogliasoluilla tunkeutumisen [34], mikä voi vaikuttaa syövän esto

in vivo

. DCN myös parantaa kiertämisen immuunijärjestelmän ja lihasten hyökkäys eturauhassyövässä

in vivo

[35], ja kiinnostavuus odottamaton suoja- ja antiapoptoottisten vaikutuksia glioomasolulinjoja hypoksisissa olosuhteissa [36]. Suun pahanlaatuinen okasolusyöpä soluja, ydin- lokalisointi DCN näyttää parantaa solujen invaasiota

kautta

ydin- kasvutekijän reseptorin (EGFR) koulutusjakson [37, 38], kun taas luusarkoomasoluissa, DCN-välitteistä kasvun pidätys vältetään

kautta

pitkittynyt aktivaatio kalvo EGFR [39]. Kliinisesti DCN on ehdotettu säätelijänä solunsalpaajaresistentti mekanismin suusyövän [40] ja jotka liittyvät lääkeresistenssin ja vähentää eloonjäämisen GBM potilailla [41]. Samoin kuin DCN, LUM on raportoitu välittävän tuumorisuppressiogeeneksi. Kuitenkin LUM ilmentyy korkealaatuisesta haimasyöpä alhaisella eriytyminen [42] ja GBM potilailla, samoin. LUM estää myös soluadheesiota ja edistää muuttoa luusarkoomasoluissa säätelemällä transformoivan kasvutekijä β2 (TGF-β2) /Smad2 [43], ja 70-kDa LUM proteoglykaani näyttää parantaa syövän solujen lisääntymistä ja estää migraation haiman syöpäsoluja. Lisäksi yhdessä DCN, LUM oli yläreguloituja sisplatiini kestävä pään ja kaulan syöpäsolut [44].

On huomionarvoista, että SLRPs ilmaistaan ​​kantasolujen markkinaraon kanan alkion [45], aivojen endoteelisolujen soluihin [46] ja progenitorisolujen eri solutyyppejä [47] ja NB solussa subpopulaatio vastetta hermo- kasvutekijää välittämää neuriittien kasvua [48]. DCN johdettu astrosyytit myös estää hermostoputken kantasolujen /kantasolujen erilaistumista kohti hermosolu kaltainen solurakenne [49]. Muuttaminen mekaaniset ominaisuudet kolmiulotteinen (3D) kollageenimatriiseihin, SLRPs rekrytoidaan aikana ontogenic (kehityksen) EMT [50], solujen esiaste vaeltamisen ja erilaistumisen [51], ja haavan paranemista /kudosten korjaamiseen vastauksena keskushermoston vamma ja tulehdus [52]. Tässä yhteydessä on mahdollista, että pienet DCN ja LUM proteoglykaanien rooli biologiassa CSCS hermoston alkuperää. Tätä varten tutkimme osallistumista DCN ja LUM GBM ja NB CSC kaltaisia ​​malleja, simuloidaan ilmiöitä ankkurointi menetyksen ja irtoaminen eriytetty syöpäsolujen taustalla EMT prosessi, ja niiden suhdetta CSC-käyttäytymistä ja soluvasteen TMZ. Tässä tutkimuksessa raportoimme ensimmäistä kertaa massiivisen synergistinen ilmaus DCN ja LUM SLRPs GBM ja NB solulinjoja altistettiin kelluva 3D neuropallo-pohjainen CSC kaltainen rikastamiseen. Neuropallo micrographs korostavat varsi kaltainen heterogeenisuus ja solujen polarisoituminen 3D NB ja GBM malleja. Lisäksi SLRP

+ NB ja GBM CSC kaltainen eristettiin neuropallojen osoittivat alempi leviämisen hinnat, vähemmän apoptoosin, ja suurempi lääkeresistenssin kuin vanhempien solulinjat, mikä viittaa siihen, keskeinen ja yhteisvaikutukset roolit DCN ja LUM että TMZ vastus, selviytyminen ja huolto lepotilassa, hitaasti pyöräily, CSC kaltainen osapopulaatioiden.

Methods

solulinjat ja CSC rikastamiseen

tässä tutkimuksessa kaksi perustettu GBM ja NB solulinjoja otettiin. SK-N-SH solulinja on kaupallinen epiteelisolulinja alun perin peräisin luuytimestä etäpesäke on 4-vuotias valkoihoinen nainen kärsivät NB, ja se oli aikaisemmin rikastettu CSC kaltainen. Sen sijaan, SF-268 on nonepithelial solulinja on peräisin korkealaatuisesta anaplastinen astrosytooma, jota ei ole koskaan käytetty CSC kaltainen rikastamiseen. Vakiintuneet SK-N-SH (American Type Culture Collection) ja SF-268 syöpäsolulinjoista (ystävällisesti antamat Instrumentation Scientific Center Granada University) rutiininomaisesti yllä Adherenttiviljelmissä (yksisolukerroksiin) Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM ), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Konfluentit solut irrotettiin 5 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) -ethylenediaminetetraacetic happo (EDTA), 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan, pestiin kahdesti PBS: ssä, ja aliviljeltiin yksittäiskerroksina. CSC rikastuminen syöpäsolulinjojen suoritettiin muodostamalla neuropallojen hermostoputken kantasolujen seerumia (NSC SFM) [53, 54], joka sisältää KnockOut DMEM /F12 plus 20 ug /ml emäksistä fibroblastikasvutekijää (bFGF), 20 ug /ml epidermaalista kasvutekijää, 1 x StemPro Neural Supplement (Invitrogen, Paisley, UK), 1% L-glutamiinia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. NSC SFM korvattiin välein 2 päivää sen jälkeen lievä sentrifugoinnin neuropallojen.

RNA ja määrällisiä käänteistranskriptio (qRT) -PCR

ilmentyminen DCN ja LUM mRNA: t tutkittiin t

0 solujen ja neuropallojen jälkeen 4 (t

4), 8 (t

8), ja 12 päivää (t

12) CSC rikastamiseen. Kantasolulinjoista DMEM käytettiin ohjaus (t

0). RNA uutettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen, MD, USA) ja kvantifioitiin Nanodrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific, DE, USA). RNA (1 ug) kustakin näytteestä oli päinvastainen transkriptoidaan M-MLV käänteistranskriptaasia (Sigma, Italia), mukaisesti valmistajan ohjeiden ja SYBR Green-monistaminen (Applied Biosystems, Foster City, CA) suoritettiin CFX96 Real -Time PCR Detection System (Bio-Rad, Italia), kuten aikaisemmin on raportoitu [55]. PCR-Sykliohjelma oli: 50 ° C (2 min), 95 ° C (2 min), 42 sykliä: denaturointi 95 ° C: ssa (30 s), hehkutus 56 ° C: ssa (30 s), ja pidennys 72 ° C (40 s), jonka jälkeen sulamiskäyräanalyysi (vaihteluväli 56-95 ° C), jossa n välein 0,5 ° C /5 s arvioimiseksi alukkeen spesifisyys. Alukesekvenssejä olivat: eteenpäin 5′-GGA CCG TTT CAA CAG AGA GG-3 ’, käänteinen 5′-GAC CAC TCG AAG ATG GCA TT-3′ (DCN); eteenpäin 5’- TGG AGG TCA ATC AAC TTG AGA A-3 ’, käänteinen 5′-CAA ACG CAA ATG CTT GAT CTT-3′ (LUM); eteenpäin 5’-CAA GGA GTA AGA CCC CTG GAC-3 ’, käänteinen 5′-TCT ACA TGG CAA CTG TGA GGA G-3′ (glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi, GAPDH); eteenpäin 5’-GGC ATC CTC ACC CTG AAT GA-3 ’, käänteinen 5′-AGG TGT GGT GCC AGA TTT TC-3’ (β-aktiini, ACTB). Kohde-transkriptit olivat itsenäisesti normalisoitiin GAPDH ja ACTB (siivous geenejä), ja RNA: ta t

0-solut käytettiin kalibroidaan. Tulokset ilmoitettiin Logaritmiasteikolla kuin kertaiseksi muutoksia (FCS), jossa 2

-ΔΔCt menetelmällä.

Western blotting

Koko proteiiniuutteita saatiin kanssa pulssi sonication cellular pelletit 200 ul: aan uuttopuskuria, joka sisälsi 50 mM Trizma-emäs, 0,25 mM sakkaroosia, 5 mM EDTA (pH 7,4), 0,5% Triton-X 100 ja 1% proteaasiestäjäseostabletit. Proteiinin pitoisuudet määritettiin Bradfordin menetelmällä. Proteiinit (50 ug) sekoitettiin 1: 1 2 x Laemmli-puskuria, kuumennettiin 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan, ja ladattiin 12% denaturoivalla SDS-PAGE-geeli, jossa Kaleidoskooppi edeltäkäsin värjätyt standardit. Proteiinit erotettiin elektroforeettisesti vakiojännitteellä (90 V) 90 min ajan ja imeytettiin 0,45 pm nitroselluloosakalvoa alla puolikuiva olosuhteissa Trans-Blot SD Semi-Dry Sähköforeesisiirto Cell (Bio-Rad, Espanja) 25 minuutin ajan 200 mA. Membraanit blokattiin 5% kuorittua maitoa PBS: ssä, inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli kanin polyklonaalista anti-LUM-vasta-ainetta (laimennettu 1: 100; sc-33785, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai hiiren monoklonaalinen anti-DCN vasta-ainetta (1:50, sc-73896, Santa Cruz Biotechnology) estopuskurissa, pestiin 4 kertaa pesuliuoksella (0,1% Tween PBS: ssä), inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1 h: n sopivia monoklonaalisia piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1: 5000, Sigma Aldrich), ja pestiin jälleen pesuliuoksessa. Blotit havaittu ECL Western blotting tunnistus reagenssit (Amersham, UK). Molecular Imager VersaDoc MP 4000 järjestelmä (Bio-Rad, Hercules, CA) käytettiin kemiluminesenssin visualisointi. Kalvoista poistettiin ja inkuboitiin hiiren monoklonaalisella anti-β-aktiini-vasta-ainetta (1: 30000, Sigma Aldrich), kuten kuormituksen valvonta.

Soft kasvustoilla

solulinjoja viljeltiin pehmeässä agar arvioimaan niiden pesäkkeiden tai neuropallo muodostumiselle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteet, DMEM tai NSC SFM. Tutkitaan leviämisen SLRP

+ CSC kaltainen jälkeen CSC rikastamiseen 8 päivää (t

8 CSC-like), toissijainen neuropallojen muodostettiin t

8 CSC kaltainen. Lyhyesti, StemPro Accutasella soluhajotusprosessin Reagent (Invitrogen) käytettiin erottamaan näitä t

8 neuropalloja. Trypaanisiniekskluusiolla Testi suoritettiin ja 5 x 10

3 /ml soluja kerättiin 2 x DMEM tai NSC SFM. Solut sekoitettiin 1: 1 esilämmitettyä liuos, joka sisälsi 0,6% ultrapuhdasta agaroosia PBS: ssä (0,3% lopullinen agarkonsentraatio), ympättiin kolmena rinnakkaisena kuuden kuoppalevyille 2 ml jähmettyi 0,6% pohja agaria, ja niitä inkuboitiin kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa 5% CO

2. Pehmeä agar Viljelmät valokuvattiin päivittäin alle käännetyn faasikontrastimikroskoopissa (Nikon Eclipse TE 2000-S).

Voimansiirto ja pyyhkäisyelektronimikroskooppisesti kuvantamisen

Kahdeksan päivän (t

8 ) neuropallojen kerättiin, pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 2,5% glutaraldehydillä 0,1 M PBS: ssä (pH 7,4) 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Kiinteän neuropallojen pestiin huolellisesti neljä kertaa PBS: ssä, jälkikiinnitettiin 1% osmiumtetroksidilla (OsO

4) 0,1 M PBS: ssä 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, ja säilytettiin PBS: ssä 4 ° C: ssa, kunnes upottamisen. Näytteitä käytetään lähetykseen (TEM) poistettiin vesi sarjassa lisäämään asetonipitoisuudet ja upotettiin epoksihartsiin varten ultrathin leikkaamista 60 ° C: ssa yön yli. Ultraohuen viipaleet leikataan kanssa 8800 Ultratome (LKB, Bromma, Ruotsi) värjättiin 4% uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla ja katsellaan Zeiss EM 109-902 siirto elektronimikroskoopilla (Zeiss, Oberchochen Saksa). Sillä pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM), The jälkikiinnitettiin neuropallojen inkuboitiin puhdasta heksametyylidisilatsaania 1 tunti 4 ° C: ssa, kuivattiin kriittisessä pisteessä kuivaimen (Polaron, Watford, UK) ja metalloitua käytettäessä S150A sputter Päällystysterät (Edwards, Crawley, UK) skannausohjeet Quanta 200 (FEI, Eindhoven, Alankomaat) tai DSM 962 SEM välineitä (Zeiss, Oberchochen, Saksa).

TMZ hoitoa ja MTT-määritystä

Single soluja yksikerroksissa ja t

8 neuropallojen molempien solulinjojen kerättiin kuten edellä on kuvattu. Solujen elinkelpoisuus testattiin trypaanisiniekskluusiolla ja 5 x 10

3 solua /kuoppa siirrostettiin 96 kuopan mikrotiitterilevyille, DMEM tai NSC SFM. Seuraavana päivänä elatusaine korvattiin tuoreella elatusaineella tai ilman eri pitoisuuksien kanssa temotsolomidin (25-1500 ug /ml; Sigma, Madrid, Espanja). DMSO: ta sisällytettiin ajoneuvon ohjaus. Jokainen ehto testattiin kuusi kuoppaa. Kolme päivää myöhemmin väliaine korvattiin tuoreella kasvualustalla, säilyttämiseksi temotsolomidin toimintaa. Loppupiste on temotsolomidin hoidon määritettiin päivänä 6. Lopuksi, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidin (MTT) kolorimetristä määritystä suoritettiin (Sigma). Lyhyesti, 20 ui MTT /kuoppa lisättiin ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa. 4 tunnin kuluttua väliaine poistettiin varovasti, ja DMSO: ta lisättiin liuottamiseksi formatsaanin suolat. Reaktiot mitattiin Multiskan EX mikrolevyfotometriä (Thermo Scientific, Madrid, Espanja) aallonpituudella 570 nm. Temotsolomidi annos-vaste ilmaistiin prosentteina (%) inhibition solun metabolisen aktiivisuuden että verrattuna käsittelemättömiin soluihin ja säädettiin ajoneuvon ohjaus. Inhibitio solukasvun TMZ arvioitiin neljänä kokeita.

Tilastollinen

Opiskelijan kaksisuuntainen

t

testiä käytettiin määrittämään tilastollisen merkityksen eroja TMZ hoitotuloksia varten SLRP

+ CSC kaltainen ja vanhempien solulinjoissa. Erot qPCR-geenin ilmentyminen arvioitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA). Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p 0,05.

Tulokset

DCN ja LUM ilmaisun aikana neuropallo-pohjainen CSC rikastamiseen

Neuropalloja sekä SF-268 ja SK-N-SH solulinjat hankittu säännöllisesti 3D konformaatioita johtuva jatkuva radial leviämisen useimpien solujen saavuttaen 50 pm 4 päivän jälkeen (kuvio 1A). QRT-PCR-analyysi osoitti, että DCN ja LUM mRNA ilmaisun, lukuun ottamatta LUM SF-268 t

12, lisääntynyt alle CSC rikastamiseen olosuhteissa molemmissa solulinjoissa, jolla on suurin DCN ja LUM mRNA ilmaisun arvot 8 päivän kuluttua (t

8). Verrattuna vanhempien solulinjojen (t

0), ja ottaen huomioon ACTB kuten taloudenhoito geeni, GBM CSC kaltainen olivat rikastettu LUM mRNA (FC

Lum

= t

0: 1; t

4: 11,00; t

8: 21.70; t

12: 9,51) kuin DCN mRNA (FC

Dcn

= t

0: 1 ; t

4: 6,32; t

8: 17,87; t

12: 11,08) (p 0,01). Samoin NB CSC kaltainen osoittivat korkeampia LUM mRNA (FC

Lum

= t

0: 1; t

4: 29.04; t

8: 105,78; t

12: 60.12) kuin DCN mRNA-tasot (FC

Dcn

= t

0: 1; t

4: 23.02; t

8: 80,44; t

12: 40.22) (p 0,01; Kuva 1B).

(A) neuropallo sukupolven SF-268 ja SK-N-SH solulinjoissa. Bar, 50 pm. (B) ilmentäminen DCN ja LUM mRNA CSC rikastamiseen kulttuureissa. qRT-PCR tulokset olivat normalisoitiin ACTB ja graafisesti suhteelliset kertaisesti muutokset (FCS) välillä neuropallojen eri ajankohtina (t4, t8, ja T12) ja tarttuva t

0 solut 2

-ΔΔCt menetelmällä. Kaikki DCN ja LUM FC arvot neuropallojen olivat tilastollisesti merkitseviä (* p 0,01). (C) Western blotting-analyysi DCN ja LUM. p-Actin käytettiin lastaus ohjaus. Yhteensä DCN ja LUM tasot olivat korkeammat neuropallojen kuin tarttuvien solujen molempien solulinjojen. 70-kDa LUM isoformi oli voimistunut vuonna neuropallojen molempien solulinjojen, korkein ilmaisua t8 neuropalloja. Tarttuneesta SF-268-solut osoittivat perusilmennystä 37 kDa LUM ydinproteiinituotteen.

Proteiini analyysi osoitti selvästi kasvua LUM proteiinia (70 kDa) aikana CSC rikastamiseen. Korkein LUM ekspressiota havaittiin sekä SF-268 ja SK-N-SH-t

8 neuropallojen (kuvio 1C). Sitä vastoin 40 kDa: n LUM-proteiini havaittiin paljon vähemmän ilmaisu, että 70 kDa: n LUM sekä SF-268 ja SK-N-SH, ja erityisesti t

12 (kuvio 1C). Toisaalta, olemme havainneet merkittävää kasvua DCN ( 150-kDa) proteiinin ilmentymistä sekä SF-268 ja SK-N-SH t

12 neuropallojen taas 40 kDa DCN-proteiini havaittiin hyvin heikosti, jossa vaikeassa lausekkeen. Mukaan mRNA tuloksiin, 8-päivää SLRP

+ CSC kaltainen (t8 CSC-like) on johdettu sekä GBM ja NB solulinjat kirjoittautunut lisäanalyysiä.

Soft kasvustoilla of SLRP

+ CSC kaltainen ja vanhempien solulinjoissa

arvioimiseksi eroja solujen kasvua välillä CSC kaltainen ja vanhempien solulinjat, toissijainen neuropallojen alkaen SLRP

+ t

8 CSC kaltainen tuotettiin pehmeällä agarilla ja verrattiin vanhempien-soluista peräisin ensisijainen neuropalloja. Ankkuroinnista riippumaton pehmeä kasvustoilla osoitti neuropallo siirtokunnissa NSC SFM, kun taas mitään tai alhainen pesäkkeitä vanhempien solut olivat kasvaneet DMEM-pohjainen pehmeä agar määrityksessä jälkeen 22 päivää (kuvio 2A). Ensisijainen SK-N-SH neuropallojen olivat suurempia kuin SF-268 neuropallojen saavuttaen 200 pm 3 viikon kuluttua, ja oli osoittanut selvästi näkyvä tumma ytimen sisällä 3D-rakenteen. Pehmeä kasvustoilla t

8 GBM ja NB CSC kaltainen (SLRP

+) kasvoi pieninä toissijainen neuropallojen vuonna NSC SFM ja uteliaasti myös pieniä pesäkkeitä DMEM 30 päivän jälkeen (kuvio 2B). Toissijainen neuropallojen olivat pienempiä kuin ensisijainen neuropallojen ja intrasphere korosti soluja (tumma ytimet) olivat havaittavissa vain toissijainen SF-268 neuropallojen 2 viikon kuluttua, kun taas toissijainen SK-N-SH neuropallojen säilyttänyt läpikuultava.

(A) Ensisijainen pehmeä agar neuropallojen päässä vanhempien solulinjoista. Puuttuminen pesäkkeiden muodostuminen puolikiinteässä DMEM (22 päivää) ja neuropallo muodostumista puolikiinteässä NSC SFM (14 ja 22 päivää). (B) Toissijainen pehmytagar neuropallojen alkaen SLRP

+ CSC kaltaisen eristetyn t

8 neuropalloja. Neuropalloja kertyi sekä puolikiinteässä DMEM ja puolikiinteät NSC SFM (14 ja 22 päivää), mikä viittaa hidas pyöräily käyttäytyminen CSC kaltainen ja jäljellä kuoleman kiertämisen aktiivisuus DMEM-kasvanut toissijainen neuropalloja. Bar, 50 pm.

heterogeenisiä ultrastructures GBM ja NB neuropallojen

Ultrastructural kuvantamisen avulla TEM ja SEM osoitti laaja cellular heterogeenisuus t

8 neuropallojen molempien solulinjojen. SEM kuvantaminen neuropallon pintojen osoittivat suurempaa pakattu soluja NB neuropallojen kuin GBM neuropallojen, kun taas reuna-solujen GBM neuropallojen oli enemmän ohut kalvo extroflections kuin SK-N-SH neuropallojen (kuviot 3A, 3B, 4A ja 4B ). Viereinen elektronitiheisiin ja elektroni läpäisevien solujen ja satunnaista apoptoottisia soluja havaittiin GBM neuropallossa kehien (Kuva 3C-3E). Perifeerinen solut NB neuropallojen oli polarisoitunut, enemmän OsO

4 värjäytymistä sytoplasmassa kuin sisemmän solut, ja se sisälsi tiheä rakeet, endosyyttisiin rakkulat, ja muutama kalvo extroflections (kuvio 4C-4E). Laajoilla alueilla solukuoleman, tunnettu kalvo kupliminen, solu rypistymistä, apoptoottiset kappaleet, ja laaja ydinvoiman tiivistetään heterochromatin, havaittiin keskellä neuropallojen molempien solulinjojen (kuviot 3G, 3H, 4G ja 4H). Kuitenkin aktiivinen mitoosin ja elävien solujen lähelle sisemmän korosti sivustot havaittiin myös, sekä GBM ja NB neuropallojen (kuviot 3G, 3I, 3J, 4F ja 4J). Mielenkiintoista on, että nämä mikroympäristön-resistenttien solujen hypoksinen neuropallojen ydin osoitti sisennetty ytimet, suuria määriä euchromatin ja selvästi näkyvissä mitokondrioiden laite.

(A) SEM-kuva koko SF-268 neuropallo (1000 x). (B) SEM kuva neuropallon pinnan (2200 x). (C-J), TEM kuvia sisä- ja oheislaitteiden neuropalloja. Tiedot ohut kalvo extroflection (C-D), vuorovaikutukset elektronitiheisiin ja elektroni läpäisevien solujen (E), tiedot solu-soluadheesion (F), kärsivät sivustoja sisempi aloilla, nekroottista (G) ja apoptoottinen ( H) solut, eläviä soluja, ja yksityiskohdat mitokondrioiden laitteen sisä- aloilla (I, J). Huomautus apoptoottisten solujen kehällä on neuropallo (D) ja elävien solujen lähelle kärsimystä sivustoja (I). Bar: (C-E) ja (G-I), 5 um; (F ja J), 1 pm.

(A) SEM-kuva koko SK-N-SH neuropallo (950 x). (B) SEM kuvantaminen neuropallo pinnan (3000 x). (C-J) TEM kuvia sisä- ja oheislaitteiden neuropallo. Tiedot solun rakkulat, solu polarisaatio, ja irtoaminen (C-E), elävien solujen sisä- neuropallojen ja yksityiskohdat mitokondrioiden laitteen (F), kärsivät sivustoja sisempi aloilla, nekroottista (G) ja apoptoottisten solujen (H ja I), ja intrasphere mitoosi tapahtuma (J). Bar: (C-J), 5 um.

TMZ hoitoa ja MTT-määritystä SRLP

+ CSC kaltainen ja vanhempien solulinjoissa

Low-alue TMZ pitoisuudet ( 0-500 uM) ei aiheuttanut merkittäviä eroja aineenvaihdunnan toimintaan SF-268 vanhempien solujen ja SRLP

+ t

8 CSC kaltainen. Kuten kuviossa 5A, metabolista aktiivisuutta emosoluilta vaihteli 76,14%: sta 100% (94,63% ± 7,10%), kun taas metabolista aktiivisuutta SRLP

+ t

8 CSC kaltainen vaihteli 80,71%: sta 100% (88,22% ± 5,43%). Korkeammat pitoisuudet TMZ (750-1500 uM) indusoi merkittäviä eroja SLRP

+ t

8 CSC kaltainen ja emosolulinjassa. Näissä pitoisuuksissa metabolista aktiivisuutta SF-268 emosolulinjassa vaihteli 38,99%: sta 58.86% (51,80% ± 7,59%), kun taas SF-268 SRLP

+ t

8 CSC kaltainen vaihteli alkaen 79,09%: sta 79,64% (78,94% ± 0,45%) (p 0,05). SF-268 vanhempien IC

50 oli noin 1250 uM, ja ei yltänyt IC

50 SF-268 SRLP

+ t

8 CSC kaltainen.

(A) SF-268 tarttuvien solujen

versus

SF-268 SLRP

+ t

8 CSC kaltainen. (B) Tarttuneesta SK-N-SH-solut

versus

SK-N-SH SLRP

+ t

8 CSC kaltainen. Solujen kasvun estäminen mukaan pieniä annoksia TMZ (0-500 uM) oli suurempi t

8 CSCS kaltainen kuin vanhempien solulinjoissa, joissa merkitys SK-N-SH-soluja (* p 0,05, kuvio 5B). Sen sijaan, solujen kasvun esto suuria annoksia TMZ at, joka vastaa farmakologisia annoksia ( 750 uM), oli suurempi vanhempien soluissa kuin t

8 CSCS kaltaisten solujen CSC rikastusta molempien solulinjojen (* p 0,05, kuvio 5A ja 5B). DMSO tausta vähennettiin näytteistä ja säätöarvot, ja tiedot näytetään keskimääräisenä (SD) on [(A

näytteet-A

DMSO) /(A

ohjaus-A

DMSO)] * 100 neljästä itsenäisestä kokeesta.

Alhaisilla ja korkeina pitoisuuksina, TMZ indusoi merkittäviä eroja aineenvaihdunnan toimintaan SK-N-SH vanhempien soluihin ja SRLP

+ t

8 CSC -pitää. Kuten kuviossa 5B, metabolista aktiivisuutta käsiteltyjen solujen 0-500 uM temotsolomidin vaihteli 75,08%: sta 100% (88,41% ± 6,70%), vanhempien soluja ja 66,86%: sta 100% (74,70% ± 10,84%) ja SRLP

+ t

8 CSC kaltainen (p 0,05). Kuitenkin solut, joita käsiteltiin 750-1500 uM TMZ, metabolista aktiivisuutta kytketään ja vaihteli 42,91%: sta 68,56% (54.96% ± 9,61%) vanhempien soluja ja 63.92%: sta 70,61% (66,64% ± 2,50%) ja SRLP

+ t

8 CSC kaltainen (p 0,05). IC

50 SK-N-SH vanhempien soluissa oli noin 1250 uM, eikä saavuta IC

50 SK-N-SH t

8 SRLP

+ CSC kaltainen.

keskustelu

kantasolu teoria syöpä on uutta ymmärrystä syövän kehityksen mielestä oncogenesis on poikkeava organogeneesin [56]. Koska CSC-vastaavat ovat läsnä syöpä kasvaimeen aloittamista solujen ja verenkierrossa olevia kasvainsoluja, he saattavat vuorovaikutuksessa ja reagoida CSC markkinarako, joka voi moduloida solukohtaloina, edistää syövän kudoksen heterogeenisuus ja lääkeresistensseihin [57]. Tämä plastisuus helpottaa ankkurointi menetys ja solun liikkuvuus, tuottava verenkierrossa olevia kasvainsoluja

kautta

EMT on opastava mikroympäristön. Eri CSC osapopulaatioiden on löydetty samassa kasvain [58], hälventää kaikki epäilys rooleista CSCS syövän heterogeenisyys ja microenvironment modulaatio, ja näin ollen lääkeresistensseihin [59, 60]. Useat aiemmat tutkimukset raportoitu SLRP proteiinien rintojen [61], haiman [62], ja peräsuolen [63], kohdun kohdunkaulan [64], eturauhas- [30], ja keuhkojen syövät [65], muun muassa korostamalla kiistanalainen roolit DCN ja LUM syövän biologian. Tuloksemme ovat ensimmäinen todiste siitä, kuinka merkittävä DCN ja LUM CSC biologian, mikä osoittaa merkittävästi lisääntynyt mRNA ja proteiini tasoilla molempien SLRPs GBM ja NB CSC kaltainen. Vaikka LUM mRNA ja proteiini lisääntyi t

8 neuropalloja, DCN mRNA lisääntyi t

8 ja DCN proteiinia t

12. Tämä seikka voi selittää erot DCN ja LUM vuonna intrasphere ansastusta ja ehkä CSC erityisiä posttranskriptionaalisella sääntelymekanismeja, jotka ovat vielä tuntemattomia. Lisäksi vaikutus kasvutekijöiden ja niiden reseptorien, kuten niiden EGF ja TGF-β1, vuonna DCN modulaatio ja kaupan on osoittivat aikuisten solujen [66, 67], mikä viittaa otaksuttu ylikuuluminen on DCN ja kasvutekijöiden reittejä CSC, ansaitsevat edelleen mekanistista tutkimuksiin.

3D tumorsphere kulttuureissa kunnostetussa seerumittomassa alustassa, jotka muodostavat menetelmiin kehitys neuropallon viljelmiä käytetään hermo kantasolujen ja esisolujen tutkimus [68-70], katsotaan edustavan

in vitro

syövän mallien käyttökelpoisia CSC kaltainen rikastamista ensisijainen [71-75] ja perustettu syöpäsolulinjat [76, 77]. Täällä, tätä mallia käytettiin saavuttaa neuropallo-pohjainen seerumitonta CSC rikastaminen ihmisen GBM ja NB syöpäsolulinjat, parantamalla solu plastisuus kautta solu erilaistamattomuuden kohti varsi kaltainen fenotyyppi.