Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hyaluronaani (HA) on hiilihydraatti soluväliaineen kasvaimen edistävät vaikutukset erilaisia ​​syöpiä. Tässä tutkimuksessa on osoitettu rooli HA matriisin etenemisen ja ennusteen ihmisen virtsarakon syövän tutkimalla ilmentymistä ja toimintaa HA liittyviä geenejä.

Methods

kudosnäytteitä 120 potilailla, joilla on eri vaiheet siirtymäkauden solujen virtsarakon syöpä, joille on tehty kirurginen hoito virtsarakon syövän yliopiston sairaalan Essen analysoitiin. mRNA-ekspressiotasot HA-syntaasin (HAS1-3) ja HA-reseptorit (RHAMM ja CD44) arvioitiin reaaliaikaisen RT-PCR verrattuna terveisiin virtsarakkokudos kontrollina. Vuonna uni- ja Coxin monimuuttuja suhteellinen vaara selviytyminen regressioanalyysi, vaikutus geeniekspressiotasot eloonjäämiseen arvioitiin.

vitro

knock-alas RHAMM, CD44 ja ON isoentsyymien saavutettiin siRNA ja lentiviraalinen shRNA in J82 virtsarakon syöpäsoluja. Transfektoidut solut analysoitiin

vitro

osalta leviämisen, solusyklin ja apoptoosin. J82 solut jälkeen knock-alas RHAMM oli ksenosiirrettyjä koskevat miesten nu /nu kateenkorvattomissa hiirissä seurata kasvaimen etenemistä

vivo

.

Tulokset

invasiivisia kasvaimen vaiheissa RHAMM-, HAS1 ja HAS2 mRNA-ekspressiotasot olivat koholla taas HAS3v1 väheni verrattuna ei-invasiivisia kasvaimia. Myöhemmin Kaplan-Meier-analyysi paljasti alennetaan virtsarakon syövän erityinen selviytymisen potilailla, joilla on korkea RHAMM mRNA ja alhainen HAS3v1 ilme. Kohonnut RHAMM invasiivisten kasvainten vahvistettiin RHAMM immunohistokemiallisesti. Lisäksi monimuuttuja-analyysi paljasti, että vain RHAMM ilmentyminen liittyi huonoon ennusteeseen riippumaton muista eloonjäämistekijöiden (HR = 2,389, 95% luottamusväli 1,227-4,651, p = 0,01). Lentivirusvektorikonstruktit RHAMM knock-down paljasti alennetaan J82-solujen lisääntymisen

vitro

ja vähensi ksenograftin kasvaimen kasvu

vivo

.

johtopäätös

tiedot viittaavat siihen, että RHAMM keskeinen rooli välittämisessä etenemisen lihas-invasiivisen virtsarakon syöpä ja suosittelee RHAMM lisäarviointia ennustetyövälineenä merkki tai terapeuttisena kohteena virtsarakon syövän hoidossa.

Citation : Niedworok C, Kretschmer I, rock K, vom Dorp F, Szarvas T, Heß J, et al. (2013) vaikutus reseptorin Hyaluronaani-välitteisen Liikkuvuus (RHAMM) Human uroteelin Syöpä virtsarakon. PLoS ONE 8 (9): e75681. doi: 10,1371 /journal.pone.0075681

Editor: Nikos K Karamanoun, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: 14 marraskuu 2012; Hyväksytty: 21 elokuu 2013; Julkaistu: 17 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Niedworok et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat DFG Fi682 /4-1 ja IFORES Program yliopiston Essen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) virtsarakon on yhdeksäs yleisin pahanlaatuinen sairaus, jolla on maailmanlaajuinen 5 vuoden esiintyvyys 860299 urosta ja 249966 naisilla [1]. Ei-lihas-invasiiviset kasvaimet (Ta) eteneminen lihaksiin-invasiivinen sairaus (T2-T4) on harvinainen ja esiintyy 3-5% kaikista tapauksista [2]. Vaikka potilaalla on geneettisesti stabiili nonmuscle invasiivisia huono laatu kasvaimet osoittavat kiitettävä 5 vuoden pysyvyys 96%, potilailla, joilla on syvä lihaksen soluttautua korkealaatuista kasvaimet ovat pahin ennuste on 5 vuoden eloonjäämisaste noin 20% [2,3]. Vuonna exophytic, nonmuscle invasiivisia huono laatu kasvaimet höyläysleikkaus (TUR) on paikallinen, virtsarakon säilyttämiseen, hoitomuoto. Lihasten soluttautuminen kasvaimia radikaali cystectomy laajennetulla lantion imusolmuke leikkelyn on yleisesti hyväksytty hoito parantava tarkoitus. Jos potilaalla on vaikea samanaikaisia ​​sairauksia vaihtoehtoisen hoitovaihtoehto on yhdistetty kemo- ja sädehoidon. Kuitenkin lihas soluttautuminen siirtymäkauden solukarsinoomat virtsarakon edustavat heterogeeninen ryhmä kasvainten osalta kliiniseen tulokseen. Jos potilaalla on pT3 /4 kasvaimia noin 50% ovat vaarassa kehittää etäpesäkkeitä huolimatta laajennetaan leikkauksen. Siksi on erittäin tärkeää valaista patofysiologiaan BC ja kehittämään tarkempia diagnostisia markkereita etenemistä tämän alijoukon lihas-invasiivisia karsinoomia, jotka antavat korkea syöpäriski kuolleisuutta.

Hyaluronaani (HA) on polymeeri vuorotellen N-asetyyliglukosamiinia ja glukuronihapon jäännökset ja on yksi tärkeimmistä hiilihydraattikomponentteja solunulkoisen matriisin (ECM). HA syntetisoidaan kolme HA-syntaasi (HAS) isoentsyymien (HAS1, HAS2, HAS3) ja on joko säilytetään lähellä solun pintaan, jossa se muodostaa perisellulaarinen HA-rikas mikroympäristössä tai vapautuu solun pinnalla ja talletetaan soluväliaineen. HA itsessään ei ole muuttamassa, mutta on osoitettu tukea monia tärkeitä tekijöitä pahanlaatuisen solun fenotyyppiin, kuten solujen lisääntymisen, migraation ja kestävyys apoptoosin [4]. Jopa tulehdus voidaan edistää HA muodostamalla erityyppisillä ryhmillä, HA-kaapeleita, jotka sitovat monosyyttien ja lymfosyyttien ja siksi uskotaan parantaa tulehdus [5].

Eri syöpien liittyy lisääntynyt kasvainsolujen tai strooman soluun HA ja ero ilmentyminen HAS-isoentsyymien [6]. Toistaiseksi ei ole selvää, onko tietty yhdistys HAS isoentsyymien erityisiä syöpä yksiköiden heijastaa eri biologisia rooleja HAS isoentsyymien tai on seurausta (i) esiintyy erilaisia ​​autokriinisiä ja paracrine tekijöitä ja /tai (ii) erityinen solu tyypit mukana jokaisessa syövän kokonaisuus. On kuitenkin todennäköistä, että HAS isoentsyymien on eroa koko erittyvän HA-polymeerin, joka voisi peräkkäin herättää erilaisia ​​biologisia toimintoja [7]. Tehokkain mekanismi muuttaa pituus HA polymeerit ovat hyaluronidaaseista (HYAL), joka on osoitettu voimakkaasti tukemaan tuumorin progressiota, tuottaa HA-fragmenttien (SHA), jotka ovat aktivaattoreita HA signaloinnin joko CD44 tai Toll-kaltaiset reseptorit. Lisäksi SHA on sekaantunut kasvainangiogeneesissä joka osaltaan kasvain tukeva vaikutus HA [8,9]. Yleensä HA indusoi solujen signalointi kautta HA reseptorien kuten CD44 ja reseptori hyaluronaanin välittämän liikkuvuutta (RHAMM). Molemmat HA reseptorit ovat sekaantuneet etenemisen syövän todennäköisesti edistämällä pahanlaatuinen syöpäsolu fenotyypit [4,10]. Erityisesti, aktivointi ERK1 /2 signalointireitin ja PI3K reitti voisi edistää kasvaimen edistävät vaikutukset sekä reseptoreihin. RHAMM todettiin reseptori osallistuu soluliikkuvuus aikana fysiologisia ja pahanlaatuisten prosessien [11,12]. RHAMM voi liittyä solun pinnalla tai funktion solunsisäisiä. RHAMM on mukana ECM aiheuttama soluviestitykseen läpi säännellä vakauden keskipiste kiinnitysalueisiin [13,14] ja aktivoi Ras-, src-, Erk-kinaasi ja proteiinikinaasi-C [15]. Lisäksi solunsisäistä muodossa RHAMM sitoutuu mitoottisiin karat [16] ja säätelee mitoosin [17]. Tässä suhteessa sekä yliekspressio ja menetys RHAMM, aiheuttaa häiriön sukkularihmaston ja sen jälkeen geneettinen epävakaus [17]. Kun taas HA on periaate ligandi RHAMM, CD44 sitoo myös useita muita ligandeja, kuten osteo-, fibronektiini tai kollageeni [18]. Mielenkiintoista on, että joissakin tapauksissa RHAMM ja CD44 näyttävät jopa tehdä yhteistyötä suhteen signalointi [19]. Lisäksi HA on annettu välittävän chemoresistance joko ohjaamalla levittämistä syöpälääkkeet [20] ja /tai vaikuttamalla monilääkeaineresistenssi kuljettajat, jotka välittävät ulosvirtaus vierasaineiden [20,21].

BC on tutkittu aikaisemmin suhteen HA ja HA-liittyviä geenejä. Aiemmat tutkimukset paljastivat, että erityisesti HAS1 isoentsyymi liittyy BC etenemiseen [22,23]. Lisäksi erittyminen virtsaan HA perustettiin indikaattorina huonon ennusteen BC [24]. Äskettäin taas HAS1 mRNA: n ekspressio liittyi BC etäpesäkkeitä [25]. Toinen tärkeä havainto on, että Hyal1 on haitallinen merkitys ihmisen BC ja Hyal1 liittyy korkealaatuista BC [26-28]. Lisäksi korkea ilmentyminen Hyal1 on hiljattain ehdotettu ennustaa asteittaista lihas-invasiivisia ja toistuva BC ja yhdistää etäpesäkkeitä ja laski tautikohtaisten selviytyminen [29]. Kaiken kaikkiaan käytettävissä olevat tiedot HA BC viittaavat lisääntynyt synteesi HA lähinnä HAS1 ja hajoaminen kasvaimen edistämään SHA by HYAL 1. Puolestaan ​​vaikutukset HA ja SHA todennäköisesti transdusoitiin aktivoimalla HA-reseptoreihin. Vuonna BC tietyt silmukoitumisvarianttia CD44, kuten CD44V8-10 olivat upregulated ja liittyy huono prognoosi [30,31]. Lisäksi on osoitettu, että CD44 saattaa olla mukana angiogeeninen vaste HA BC [22]. Kuitenkin viime analyysi paljasti, että CD44v oli voimistunut ja CD44s säädeltiin vähentävästi ilman diagnostisia tai ennusteen arvioinnissa [30]. RHAMM on kuvattu voimistuvan, mutta myös ilman selkeää korrelaatiota kliinisten parametrien [25,32]. Koska se vaikuttaa uskottavalta, että määrä HA-reseptorien on tärkeä rooli transduktion HA signaloinnin ja siten etenemisessä ihmisen BC tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia ilmentymistä HA-reseptorit ja HAS isoentsyymien sekä saavuttaa mekanistinen tiedot potilaan kollektiivinen ominaista 50% lihas-invasiivisia BC.

Materiaalit ja menetelmät

kasvainnäytteestä

Geenien ilmentyminen analyysi suoritettiin vuonna kudosnäytteistä 120 potilasta eri vaiheissa siirtymäkauden solun BC (31xTa, 24xT1, 21xT2, 25xT3, 19xT4), joille tehtiin kirurginen hoito BC yliopistossa Clinics of Essen vuosina 1990 ja 2004. Kaikki pakastetut kudosnäytteet leikattiin ja värjättiin H kanin anti-Ki67 IgG, 01:25, (Novus Biologicals, Ltd., Cambridge, UK). Inkubaation jälkeen primaarisen vasta-aineen huuhdottiin, estettiin 3% H

2O

2 liuokseen 5 minuutin ajaksi ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja huuhdeltiin jälleen kolme kertaa 5 minuuttia. Jokaisen värjäystä negatiivinen kontrolli osia jättämällä pois primaarinen vasta-aineen mukana. Detektio suoritettiin käyttäen 3,3′-diaminobenzidin (DAB). Ainakin kolme edustavalla valokuvattiin käyttäen Leica® DM2000 järjestelmä ja kvantitatiivinen analyysi värjäytymisen intensiteetti suoritettiin käyttämällä ImageJ kuvankäsittelyohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) aikaisemmin kuvatulla [33].

Reaaliaikainen-RT-PCR

mRNA eristettiin flash-jäädytetty kasvainkudoksen käyttäen RNeasy kokonais-RNA sarjat (Qiagen, Hilden, Saksa). RNA-pitoisuus arvioitiin fotometrinen mittaus 260/280 nm. 1 ug RNA: ta käytettiin cDNA-synteesi käyttäen QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) on 7300 reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa). Primer sekvenssit kiinnostavia geenejä käytettiin kuten edellä on kuvattu [14]. Ekspressiotasot normalisoitiin GAPDH ilmaisun ja lasketaan käyttäen ΔΔC

) menetelmällä.

Soluviljely ja knock-down HA liittyvien geenien

J82 BC solut luonnehditaan huono laatu soluja korkean maligniteetin [34], ja saatiin ATCC

® (Manassas, VA, USA) ja viljeltiin tavanomaisissa RPMI, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Kolhi alas RHAMM ihmisen J82 BC soluja, lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) sekvenssin kohdistaminen RHAMM (5′-CCGGCGTCTCCTCTATGAAGAACTACTCGAGTAGTTCTTCATAGAGGAGACGTTTTTG-3 ’), kloonattiin pLKO.1 vektoriin käyttäen Mission

TM lentiviraalinen shRNA knock-down-järjestelmä (Sigma-Aldrich

®). Salattu shRNA käytettiin kontrollina. Tuotanto vektori, kulttuuri ihmisen alkion munuaissoluja (HEK-293T), sato yhdistelmä-hiukkaset ja lentiviraalinen transduktio ihmisen J82 Uroteelisyöpäsolujen tehtiin kuten aiemmin on knock-down of RHAMM [14]. Seitsemän päivän kuluttua lentiviruksen transduktion J82-solujen shRHAMM mRNA ilmentymistä RHAMM oli laskenut alle 40% verrattuna J82 transdusoitujen solujen kanssa sekoitetun sekvenssin sisältävillä verrokeilla. Sen jälkeen soluja käytettiin vierassiirrekokeissa. Leviämisen jälkeen määritettiin edellä kuvatulla tavalla [14]. Ylimääräisiä

in vitro

kokeet J82 solut käsiteltiin siRNA repiä alas RHAMM, CD44, HAS1, HAS2 ja HAS3. Näitä kokeita varten seuraavasti siRNA-sekvenssejä (Qiagen, Saksa) käytettiin: siRHAMM (Hs_HMMR_9); siHAS1 (Hs_HAS1_4); siHAS2 (Hs_HAS2_4); siHAS3 (Hs-HAS3_7); siCD44 (Hs_CD44_5); ohjaus (Ctrl_AllStars_1).

estävät HA synteesiä J82-solujen 4 metyyliumbelliferonia (4-MU) liuotettuna DMSO sovellettiin (300 uM). Lisäksi valitaan kokeita eksogeenisen HA (Healon 5, Abbott) käytettiin pitoisuutena 100 ug /ml.

Solusyklianalyysiä ja apoptoosin

solusyklin etenemistä analysoitiin jälkeen knock-down ja RHAMM ja ilmaistaan ​​prosentteina solujen G0 /G1 ja G2 vaiheessa. Lyhyesti tumat J82-solut leimattiin guava Cell Cycle Reagent (Millipore) mukaisesti valmistajan protokollan ja näytteet analysoitiin käyttäen guava easyCyte -virtaussytometrillä. Apoptoosi arvioitiin solujen prosenttiosuus Saharan G1 vaiheessa [35]. PARP immunoblottauksella polyklonaalista PARP-vasta-ainetta (1: 1000, Cell Signaling, # 9542) käytettiin primäärisenä vasta-aineena ja tunnistus tehtiin näkyväksi vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta konjugoituna IR-Dye 800 (1: 10000, LI-COR Biosciences) käyttämällä Odyssey Near Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences).

Vieraslajisiirteen eläinmallissa

Male nu /nu kateenkorvattomissa hiirissä (8-12 viikkoa vanhoja) käytettiin ksenografti of J82 solut. 100 ui PBS: ää con-TaiNing 1×10

6 kasvainsolut pantiin subkutaanisesti molempiin kylkiin eläimistä. Kasvaimen kasvua seurattiin 45 viikkoa. Tänä aikana eläimiä seurattava voimakkaan kasvaimen kasvua ( 15 mm), haavaumia, huomattava painon lasku ( 20%) tai kliinisiä merkkejä kivusta ja epämukavuutta, joka olisi ollut syytä uhrata sairastavilla henkilöillä. Kuusi eläintä ryhmää kohti (knock-down ja ohjaus) sai solut 7 päivää lentiviraalinen knock-down edellä kuvatulla tavalla. Kasvaimen kasvu mitattiin paksuus kahdesti viikossa 45 päivää. Sen jälkeen eläimet tapettiin (niska sijoiltaan), kasvaimet kerättiin ja vahvistettu immunohistologisia värjäystä. Näytteitä maksan ja keuhkojen saatiin etsimään metastaattista kasvaimen kasvua värjäämällä. Hiiret kokeet suoritettiin sääntöjen mukaisesti ja standardeja LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) ja Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. LANUV hyväksyi kokeita ja vahvisti, täyttävätkö laatuvaatimuksia. Hanke samaistetaan numero 87-51.04.2010.A149.

Tilastollinen

Geenien ilmentyminen analysoitiin joko varianssianalyysillä ja Bonferronin post-hoc testi tai Studentin

t

testi tarvittaessa. Data esitetään keskiarvoina ± SEM. Tilastollinen merkittävyys määritetty tasolla

p

0,05. Tiedot koskevat kliiniset tulokset potilaasta parametrit puuttuvat normaalijakaumaa, joten niistä analysoitiin ei-parametriset kaksitahoiset Wilkoxon rank sum test (Mann-Whitney) ja pareittain ryhmässä vertailuja. Stage-riippuvainen korrelaatiot laskettiin Pearsonin korrelaatiota testaus. Kokonaiselinajan analyysiin ja tautikohtaista eloonjääminen tehtiin käyttämällä molempia, epidemiologiset yksi- ja monimuuttuja Coxin suhteellinen vaara selviytyminen regressioanalyysi ja Kaplan-Meier eloonjäämistä testi, IBM SPSS® tilastollinen analyysi (versio 18.0, Chicago, IL, USA) .

tulokset

Potilastiedot

kaikkiaan 55 potilasta kärsi pinnallinen sairaus (pTA ja pT1), 65 potilailla diagnosoitiin lihas-invasiivisen sairauden (epätasaisesti 21 potilasta, joilla pT2-tautia, 25 pT3 ja 19 pT4). Kasvaimet olivat huono laatu (G1 /G2) 63 tai korkealaatuista (G3) 57 tapauksissa. Imusolmuke positiivisuus oli läsnä 23/120 potilailla. 74 potilasta kärsi ensisijainen BC taas 46 potilasta koki uusiutuva sairaus. 55 potilasta hoidettiin höyläysleikkaus TCC, 65 tapauksissa radikaali cystectomy suoritettiin. Tupakointi tila tunnettiin 83 potilasta, 49 olivat tupakoitsijoita ja 34 oli tupakoimattomia. Mediaani seuranta-aika oli 34 kuukautta, maksimiaika seuranta oli 189 kuukautta. Mediaani potilaan ikä oli 65 vuotta (32-87 vuotta). Kliiniset tiedot potilaan ominaisuudet esitetään osana Taulukko 1.

n

RHAMM

P

CD44p

P

HAS 1

P

HAS 2

P

HAS 3v1

P

geenin exp. valuesgene exp. valuesgene exp. valuesgene exp. valuesgene exp. valuesΣ = 120median (alue) mediaani (alue) mediaani (alue) mediaani (alue) mediaani (alue) Age≤ 65572,400 (0.00-13.43) 0.7620.320 (0.00-1.92) 0.2530.08 (0.0-7.55) 0.6030.51 (0.01-7.96) 0.10210.62 (0.069-50.82) 0,065 65632.420 (0,06-14,76) 0,260 (0,00-1,24) 0,12 (,0-+103,04) 0,7 (0,0-13,68) 6,465 (0,0-+35,65) GenderMale932.340 (0.00-14.76) 0.4940.305 (0.00-1.26) 0.1850.07 ( ,0-103,04) 0.0720.52 (0,0-8,69) 0.0597.73 (0,0-34,59) 0.608Female272.570 (0,29-13,40) 0,260 (0,00-1,92) 0,235 (0,0-7,55) 1,02 (0,01-13,68) 6,18 (0,12 -50,82) Smokingyes492.265 (0.06-13.40) 0.0930.310 (0.02-1.65) 0.7270.08 (0.0-7.55) 0.4550.695 (0.0-13.68) 0.3158.74 (0.04-35.65) 0.777no342.860 (0.67- 14,76) 0,270 (0,00-1,92) 0,235 (0,0-103,04) 0,66 (0,02-8,69) 9,04 (0,02-50,82) Ta311.460 (0,04-7,01) 0.0270.300 (0,11-1,43) 0.20.02 (0,0-3,14) 0.0660.125 (0,01-4,43) 0.02911.43 (0,46-34,59) 0.392T1242.420 (0.19-10.12) 0.5440.205 (0.06-1.20) 0.9120.06 (0.0-0.99) 0.0520.685 (0.0-13.68) 0,78410 0,62 (0,0-30,13) 0.021T2212.890 (0.00-11.86) 0.960.170 (0.02-1.03) 0.2150.21 (0.0-103.04) 0.1370.68 (0.16-8.69) 0.7974.98 (0.77-11.09) 0.613T3252 .710 (0.66-9.18) 0.4010.310 (0.00-1.92) 0.9560.64 (0.01-7.23) 0.0550.81 (0.01-7.96) 0.9395.73 (0.02-50.82) 0.529T4193.815 (0.06-14.76) 0,470 ( 0,02-1,65) 0,125 (0,0-7,55) 1,14 (0,0-2,92) 3,26 (0,12-20,61) Non-inv.551.685 (0.04-10.12) 0.0030.270 (0.06-1.43) 0.7440.02 (0.0-3.14) 0.0010.22 (0.0-13.68) 0.0067.675 (0.0-36.65) 0.001Invasive652.875 (0,00-14,76) 0,310 (0,00-1,92) 0,26 (,0-+103,04) 0,805 (0,0-8,69) 1,98 (+0,04-+50,82 ) GradeG1201.250 (0.16-3.89) 0.0210.260 (0.16-1.20) 0.3030.02 (0.0-3.14) 0.3570.155 (0.02-13.68) 0.48112.5 (0.28-29.38) 0.279G2432.445 (0,04-10,12) 0.1790.250 (0,02-1,43) 0.2240.03 (+0,0-+103,04) 0.0010.36 (0.01-8.69) 0.0268.875 (0.77-34.59) 0.001G3572.810 (0,00-14,76) 0,330 (0,00-1,92) 0,27 (0,02-7,55) 0,83 (0,0-7,96) 3,925 (0,0-50,82 ) Low- grade631.770 (0.04-10.12) 0.0060.260 (0.28-0.46) 0.2430.03 (0.0-103.04) 0.0010.29 (0.01-13.68) 0.01411.09 (0.28-34.59) 0.001High-grade572.850 (0,00-14,76) 0,325 (0,00-1,92) 0,265 (0,0-7,55) 0,82 (0,0-7,96) 4,25 (0,0 -50,82) Imuneste nodeN0 /Nx972.240 (0.00-14.76) 0.0050.270 (0.00-1.65) 0.5140.07 (0.0-103.04) 0.0150.61 (0.0-13.68) 0.3027.675 (0.0-35.65) 0.046N 233,970 (0,06-11,86) 0,430 (0,00-1,92) 0,405 (0,0-5,62) 0,93 (0,11-7,96) 1,98 (0,04-5,82) Primary742.225 (0.17-11.86) 0.0290.305 (0.00-1.92) 0.9570.125 (0,0 -7,55) 0.5750.645 (0,0-7,96) 0.4648.21 (0,0-50,82) 0.902Recurrent462.760 (+0,00-+14,76) 0,310 (0,00-1,31) 0,115 (,0-+103,04) 0,55 (0,0-13,68) 6,95 (0.02- 35.65) Taulukko 1. RHAMM mRNA: n ilmentymisen tasot ovat koholla lihas-invasiivisia kasvain vaiheissa, korkea-asteen kasvaimet, positiivinen imusolmuke tila ja kasvaimen uusiutumisen.

mRNA geeniekspressiotasot HA liittyvien geenien (RHAMM, CD44, HAS1, – 2 ja – 3v1) tuumorinäytteissä 120 potilasta, joilla BC sairaus. Luonnehdinta on stratifioitiin (A) ikä, sukupuoli sekä tupakoinnista ja (B) kasvaimen vaiheessa kasvain luokittelua, imusolmuke tila ja ensisijainen kasvaimia versus uusiutuva kasvain tauti. Tiedot analysoitiin käyttäen yhden muuttujan Coxin suhteellista vaara selviytyminen regressioanalyysi, yhteensä n = 120. CSV Lataa CSV

mRNA Expression

arvioida yhdessä kasvain soluttautumista ja erilaistamattomuuden, HAS1, HAS2, HAS3v1, RHAMM ja CD44 mRNA: n ilmentymisen tasot määritettiin BC kudoksessa 120 potilaiden taitteeseen kontrollikudoksen, käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen-RT-PCR: llä (taulukko 1, kuvio 1). Tämän seurauksena RHAMM ekspressiotasot olivat koholla tunkeutumisen kasvaimissa verrattuna ei-invasiivisia kasvaimia (RHAMM: ei-invasiivisen kasvaimet 1,69-kertainen (Ta + T1), invasiiviset kasvaimet 2,88-kertainen (T2-4), p = 0,003). Lisäksi mRNA ilmaus HAS1 ja HAS2 merkittävästi yläreguloituja lihas-invasiivisia kasvain vaiheessa (pT2, pT3 ja pT4). Sen sijaan HAS3v1 kohosi kaikissa kasvain vaiheissa verrattuna terveisiin virtsarakkokudos mutta laski lisääntynyt kasvaimen lavastus (non-invasiivisen kasvaimet 11,26 kertaiseksi (Ta + T1) ja invasiivisia kasvaimet 4,72-kertainen (T2-4), p 0,001; data lasketaan kuten mediaani). Lisäksi CD44 ei voimistunut verrattuna kontrolleihin eikä niitä säännellä suhteen lihas-invasiivisuus.

RHAMM, CD44, HAS1, HAS2 ja HAS3v1 mRNA: n ilmentymisen ihmisen BC kudoksessa esitetään boxplot-kaaviot 25% 75% välein pienimmästä suurimpaan viikset. Real-time-RT-PCR: llä (yhteensä potilasta n = 120, ei-invasiivisia kasvainten n = 55, invasiiviset kasvaimet n = 65; Ta n = 31, T1 n = 22, T2 n = 21, T3 n = 25, T4 n = 19; huono laatu n = 63, korkealaatuista n = 57).

Samanlaisia ​​tuloksia saatiin suhteessa kasvainsolujen luokittelua. RHAMM, HAS1 ja HAS2 mRNA: n ilmentymisen tasot olivat lisääntyneet huomattavasti korkeampi kasvaimen lajittelusta (G1 vs. G2-3; RHAMM, 1,77 kertaisesti huono laatu, 2,81-kertaisesti korkealaatuista kasvaimissa, p = 0,006; HAS1, 0,02-kertaisesti huono laatu ja 0,26 kertaiseksi korkealaatuista yksilöiden, p 0,001; HAS2, 0,29-kertaisesti huono laatu ja 0,82-kertaisesti korkealaatuista kasvaimissa, p = 0,014). Jälleen HAS3v1 mRNA ekspressiotasoja voimakkaasti yläreguloituja G1 vertailuryhmän mutta laski korkeamman kasvain luokittelu (HAS3, 10,91 kertainen valvonnan huono laatu verrattuna 3,93-kertaisesti korkealaatuista havaintojen p 0,001). Lisäksi CD44 ei todettu eroja myös suhteessa kasvainsolujen luokittelua.

Imusolmuke tila liittyi myös merkittäviä eroja ilmennystasoissa useiden geenien. Kasvainkudoksessa imusolmuke positiivinen potilaista havaittiin korkeampi RHAMM ja HAS1 mRNA ekspressiotasoja verrattuna niihin, joilla negatiivinen imusolmuke tila. HAS3v1 ilmentymistasot pienenee potilailla, joiden positiivinen imusolmuke tila (taulukko 1 B) verrattuna imusolmuke negatiivinen yksilöitä. Mielenkiintoista on, että RHAMM mRNA: n ekspressio oli ainoa HA-liittyvä geeni, joka on merkittävästi lisääntynyt toistuvien kasvainten verrattuna ensisijaisen kasvaimia.

Protein Expression ihmisen kasvainnäytteissä

edelleen karakterisoimiseksi ilmentymisen RHAMM vuonna ihmisen BC immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin 20 edustaja tapauksissa (4 kukin PTA- pT4). RHAMM värjäys osoitti harvoin värjätään solut papillaarisen non-invasiivisen kasvaimet (kuva 2 A). Normaalissa virtsarakossa kudosmorfologia ei vaikuttanut näihin papillaarinen pinnallinen kasvaimia ja RHAMM oli pääasiallisesti sijaitsevat uroteeliin. Kehittyvien lihas invaasio, RHAMM positiiviset värjätään kasvaimen solut alkavat muodostaa erillisen solun klustereiden sisällä lihaskudosta virtsarakon seinämän (kuva 2 B) ja yleinen värjäytymisen intensiteettiä ja kudosten sisältö RHAMM positiivisten solujen lisääntynyt. Vuonna dedifferentoituneiden syvä invasiivisia ja ei-elin rajoittuu kasvaimien histopatologisia vaiheessa pT4, RHAMM positiivisia kasvainsoluja kaikkialle jaetaan ihmisen kasvainnäytteestä. Pääosin kasvainsoluja, mutta myös vähemmässä määrin stroomasolut ilmaistaan ​​RHAMM (kuva 2 C). RHAMM positiivinen alue jae oli 3,3% ei-invasiivisia kasvaimet (PTA-1) verrattuna 21,6% lihasten-invasiivisia havainnot (pT2-4, p = 0,03, kuva 2 D). Kasvu RHAMM korreloi myös kasvaimen lisääntyvän vaiheessa (p = 0,0129, kuvio 2 E).

(A-C), joka edustaa immunohistologinen värjäys RHAMM parafiiniin upotetut ihmisen BC kudosta. (A) nonmuscle-invasiivisia kasvain vaiheissa T1 rakko rakenne on säilynyt. (B) kudoksen korkea vaiheessa kasvainten pahanlaatuiset solut alkavat lisääntyä ja muodostaa itsenäisiä soluklusterien ympäröi stroomasolut (pT2). (C) ei-elimessä suljetussa kasvain vaiheessa (pT4), rakko rakenne on vakavasti häiriintynyt tunkeuttamalla syöpäsoluja. (D) alueella osa RHAMM positiivisten solujen on kohonnut erittäin lihas-invasiivisia kasvaimen vaiheissa määritettynä kuva-analyysillä (ei-invasiivisia, n = 8; invasiivisia n = 12; * p = 0,03, t-testi). (E) korrelaation RHAMM positiivisen alueen osa, jossa korkeampi kasvaimen vaiheissa (n = 4; * p = 0,0129, Pearson-korrelaatio); keskiarvo ± SEM.

Korrelaatio tautikohtaisia ​​Survival ja Gene Expression

Potilaat, joilla on korkea ja matala ilmentymisen vastaavat geenit jaettiin kahteen ryhmään käyttäen mediaaniarvon kuin leikkaus- pois. Tulokset univariate COX analyysi on lueteltu taulukossa 2. ikä, sukupuoli ja tupakointi osoitti mitään vaikutusta eloonjäämisaste. Kuten odotettua, korkea kasvain vaiheessa korkealaatuista ja positiivinen imusolmuke tila osoitti merkittäviä negatiivinen korrelaatio tiettyyn tautiin ja kokonaiselossaolo. Huomattavaa on, että korkea RHAMM ja HAS2 mRNA: n ilmentymisen tasot ovat merkitsevästi yhteydessä huonoon tautikohtaisia ​​ja kokonaiselossaolo. Sen sijaan korkea HAS3v1 mRNA ilmaisu korreloi suotuisa kokonaiselossaoloaika ja syöpää erityisiä selviytymisen.

Taulukko 2A:

muuttujat

Kokonaiselossaoloaika

tautikohtaisia ​​selviytymisen

n

HR

95% CI

P

HR

95% CI

P

Ikä

≤ 65

57

viite.

viite.

65

63

1.111

0,715-1,726

0,64

1.171

0,701-0,959

0,546

Sex Female27ref.ref. Male930.6770.411-1.1150.1260.6430.362-1.1420.132Smoking no49ref.ref. yes340.8970.535-1.5050.6810.6040.322-1.1000.099Table 2B:

Stage

Non-inv. (Ta-T1) 55ref.ref. Invasiivinen (T2-T4) 653.4162.110-5.529 0.0015.7663.039-10.940 0.001Grade Low-grade63ref.ref. Korkean grade573.1241.964-4.969 0.0013.8342.189-6.713 0.001Lymph solmun tila N- /Nx97ref.ref. N + 233.7062.198-6.250 0.0015.0662.871-8.938 0.001Prior toistuminen Primer74ref.ref. Recurrent461.3410.848-2.1200.211.2060.705-2.0650.494Table 2C:

RHAMMlow56ref.refhigh562.4991.556-4.013 0,001. 3.3551.887-5.965 0.001CD44plow55ref.ref.high550.8480.533-1.3470.8480.8770.511-1.5040.633HAS 1low49ref.ref.high461.6260.983-2.6880.0581.7310.970-3.0890.063HAS 2low53ref.ref.high531.741.080- 2.8030.0231.7941.033-3.1180.038HAS 3v1low55ref.ref.high540.5650.352-0.9060.0180.5860.340-1.0110.055Table 2. potilaille, joilla on lihas-invasiivisen kasvaimet huono tautikohtaisia ​​selviytymisen liittyy korkea RHAMM ja korkea HAS2 mRNA: n ilmentymisen tasoilla.

Overall ja tautikohtaista eloonjäämisen potilailla, joilla urothelial TCC ryhmiteltynä (A) potilaan ominaisuudet: ikä, sukupuoli ja tupakointi (B) taudin aiheuttaman kliinisiä parametrejä: kasvain vaiheessa kasvain luokittelua, imusolmuke tila ja primaarikasvainten versus toistuvien kasvaintauti (C) HA liittyvien geenien (RHAMM, CD44, HAS1, – 2 ja – 3v1). Univariate Coxin suhteellinen vaara eloonjääminen regressioanalyysia käytettiin data-analyysin, yhteensä n = 120. Lyhenteet: HR – riskisuhde CI – luottamusväli, ref. – Tarkoite. CSV Lataa CSV

Kaplan-Meier selviytymisen analyysin potilasryhmää jaettiin kolmeen ryhmään, joka koostuu 40 potilasta kussakin. Erityisesti huomattavasti syöpään liittyvän kuolleisuuden liittyi keskitason ja korkean RHAMM mRNA: n ilmentymisen (kuvio 3A). Expression of low HAS3v1 mRNA myös liittyi huono syöpäspesifisessä eloonjäämisen (kuvio 3E). Sen sijaan korkea HAS-1, ja HAS-2 ilmaisun osoitti vain suuntaus vähentynyt selviytymisen ja CD44 ei liittynyt eroja tautikohtaisia ​​eloonjäämiskäyrien (kuva 3B-D). Sen arvioimiseksi, onko analysoitu geeniekspressiotasot tuottaa riippumatonta prognostista tietoa, cox monimuuttuja vaara regressiomallit käytettiin. Parametrit, jotka vaikuttavat selviytymistä univariate analyysejä, sisällytettiin multivariate malleissa. Tärkeää on, korkea RHAMM mRNA ekspressiotasot ja imusolmuke positiivisuutta havaittiin itsenäisesti liittyy lisääntynyt syöpäkuolleisuuden riskiä (taulukko 3, HR = 2,179, 95% luottamusväli 1,182-4,017, p = 0,013, ja HR = 2,389, 95% CI 1,227-4,651, p = 0,010).

potilasta kohortti jaettiin kolmeen alaryhmään koostuu korkean, keskitason ja alhaisen ilmentymisen joko RHAMM, CD44, HAS1, -2 tai -3 mRNA (AE). Kaplan-Meier eloonjäämistä Testi suoritettiin osoittaa merkittävää lisäystä riskiä syöpään liittyvien kuolemaan alaryhmien korkea ja väli RHAMM mRNA ekspressiotasoja verrattuna alhainen RHAMM mRNA: n ilmentymisen (A). Transcript tasot CD44 (B), HAS1 (C) ja HAS2 (D) on liittynyt merkittäviä muutoksia tautikohtaisia ​​selviytymistä. Erityisesti korkea HAS3v1 mRNA ilmentyminen oli merkitsevästi liittyy pienempi riski syövän erityisiä kuolema verrattuna osaryhmään matala- ja keskiaktiivisen HAS3v1 mRNA: n ilmentymisen (E). Tiedot yhteensä n = 120 potilasta; analyysi suoritettiin kolmeen ryhmään (n = 40 kussakin) korkea, väli- ja matala mRNA: n ilmentymisen vastaavien geenien.

tautikohtaisia ​​selviytyminen

Etäpesäke elinaika

muuttujat <