Krooninen sairaus

tiivistelmä

Muuta isännässä ja /tai ihmisen papilloomaviruksen (HPV) DNA: n metylaatio profiili on luultavasti yksi tärkeimmät tekijät vastaavat maligni kehittyminen kohdunkaulan leesioita syövän. Tutkia niitä muutoksia tutkittiin 173 kohdunkaulan näytteitä eri laatuja kohdunkaulan leesion, normaalista kohdunkaulan syöpään. Metylaatiostatuksen yhdeksän solun geenin promoottorit,

CCNA1

,

CDH1

,

C13ORF18

,

DAPK1

,

HIC1

,

RARβ2

,

hTERT1

,

hTERT2

ja

TWIST1

, tutkittiin metylaatiospesifisen polymeraasiketjureaktiolla (MSP). Metyloinnin HPV18 L1-geenin tutkittiin myös MSP, kun taas metyloitu sytosiinien neljän alueen, L1, 5’LCR, tehostaja ja promoottori HPV16-genomin kattavan 19 CpG sivustoja arvioitiin bisulfiitti-sekvensoinnilla. Tilastollisesti merkitsevä metylaatio biomarkkerit erottamaan kohdunkaulan esiasteleesioita normaaleista kohdunkaulan olivat pääasiassa

C13ORF18

ja toiseksi

CCNA1

, ja ne erottaa kohdunkaulan syöpä normaaleista tai kohdunkaulan esiasteleesioita olivat

CCNA1

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

ja

TWIST1

. Lisäksi metylointianalyysi yksittäisten CpG sivustoja HPV16-genomin eri näytteessä ryhmissä, erityisesti 7455 ja 7694 sivustoja, osoittautui tärkeämpiä kuin yleinen metylointi taajuus. Valtaosa HPV18 positiivista näytettä sisälsi sekä metyloitu ja metyloitumaton L1-geeniä, ja näytteitä L1-geenin metyloidut muodot yksin oli parempi ennuste kun korreloi isäntäsolun geeni promoottorit ”metylaatio profiileja. Lopuksi, sekä solu- ja viruksen metylaation biomarkkerit tulisi käyttää seurantaan kohdunkaulan leesion etenemistä estää invasiivisen kohdunkaulan syövän.

Citation: Milutin Gašperov N, Sabol I, Planinić P, Grubisic G, Fistonić I, Ćorušić A, et ai. (2015) Metyloidut Host Cell Gene Promoottorit ja HPV tyyppi 16 ja 18 ennakointi kohdunkaulan solumuutoksia ja syövän. PLoS ONE 10 (6): e0129452. doi: 10,1371 /journal.pone.0129452

Academic Editor: Robert Dante, Institut national de la Sante et de la Recherche médicale, FRANCE

vastaanotettu: 24 joulukuu 2014; Hyväksytty: 08 toukokuu 2015; Julkaistu: 09 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Milutin Gašperov et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki Kroatian tiede, koulutus ja urheilu (avustus 098-0982464-2510). MG tuki myös Euroopan unionin seitsemänteen tutkimuksen, teknologian kehittämisen ja esittelyn avustussopimuksen nro 316289. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suhde ihmisen papilloomaviruksen (HPV) asema ja kohdunkaulan syöpä (CC) kehittäminen on vakiintunut. On olemassa ainakin 15 onkogeenisia tai korkean riskin (HR) HPV-tyypit, joista tyypit 16 ja 18 edistävät jopa 71% syöpätapauksista [1]. Sitä vastoin DNA: n metylaation solujen ja virusten geenit, jolloin hiljentäminen geenin ilmentymisen, on vähemmän tutkittu kohdunkaulan cancerogenesis [2], vaikka se on yksi varhaisista tapahtumista syövän monissa muissa syöpätyypeissä [3]. DNA: n metylaatio usein tapahtuu sytosiineista CpG dinukleotideissä geenien tuumorisuppressorien, transkriptiotekijät ja solukierron sääntelyviranomaiset estävät täten geeniekspressiota promoottori hiljentäminen [4].

CC esiintyminen on melko harvinaista verrattuna laajaa HPV-infektio ; useimmat naiset ovat todennäköisesti tartunnan ainakin yksi, jos ei useita HPV aikana sukupuolielämään, ja vain pieni osa kehittyy kohdunkaulan syövän esiasteita ja kohdunkaulan syöpä [5,6]. Liittyviä tekijöitä etenemistä syöpää edeltävät kohdunkaulan muutokset,

i

.

e

. piilevä HPV-infektio syöpään eivät ole vakiintunut. Sekä virusten ja isäntäsolujen geenejä voidaan kohdistaa DNA metylaatio koneen [4]. Se, että metylaatio solun geenejä voidaan havaita myös näytteistä jopa seitsemän vuotta ennen kohdunkaulan syövän diagnosointiin [7], oli yksi syy tähän tutkimukseen. Lisäksi perustuu havaintomme metyyliryhmät ovat stabiileja vuoden ajan DNA eristämisen ja varastointia -20 ° C: ssa ja noudattaa diagnoosi ryhdytään näytteenottoa. Lisäksi metylointi HPV-genomin voisi olla isännän puolustusmekanismi vaimentamiseksi transkription vieraan DNA: n tai strategian että virus käyttää ylläpitää pitkän aikavälin infektion immunosurveilance paeta tai molemmat [8,9]. Oletimme, että metylaatio CpG sivustoja HPV16 ja HPV18 genomien että tukahduttaa transkriptio HPV-geenien on yksi niistä tekijöistä, jotka ovat mahdollisesti merkityksellisiä kohdunkaulan syöpää aiheuttavia etenemistä. Siksi tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet HPV16 ja HPV18 positiivinen kohdunkaulan näytettä ja analysoitiin CpG metyloinnin HPV16 ja HPV18 genomit sekä useita keskeisiä isäntäsolut geenejä.

On olemassa voimakas tarve luoda tarkkoja diagnostisia ja ennustetekijöitä metylaatio profiilin paneelin geenejä, jotka voivat tehdä eron normaalien cervices, kohdunkaulan solumuutoksia ja syöpää. Tutkittuaan kirjallisuudessa keskitytään tässä asiassa käyttävät samanlaista näytettä altaan ja laboratoriolaitteet [10-14], olemme kaventuneet valinta yhdeksän solujen geenien tutkittu tässä tutkimuksessa:

CCNA1

(CCNA1, sykliini A1)

CDH1

(CDH1, kadheriinin 1, tyypin 1, E-kadheriinin),

C13ORF18

(KIAA0226L, KIAA0226 kaltainen),

DAPK1

(DAPK1, kuolema liittyvä proteiinikinaasi 1),

HIC1

(HIC1, hypermetyloitunut syöpä 1),

RARβ2

(WR, retinolihapporeseptori, beeta),

hTERT1

,

hTERT2

(TERT, telomeraasin käänteistranskriptaasia), ja

TWIST1

(TWIST1, kierre perhe bHLH transkriptiotekijä 1). Promoottori metylaatio

CCNA1

,

C13ORF18

ja

RARβ2

johtaa häiriöitä solusyklin, metylaatio

CDH1

,

DAPK1

hTERT1

,

hTERT2

ja

HIC1

edistävät syövän etenemisessä lisäämällä leviämisen, invaasio ja /tai etäpesäkkeitä, kun metyloidut

TWIST1

tarkoittaa heikentynyt cellular erilaistumista. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää metylointi profiilin isäntäsolun geenin promoottorit ja samanaikaisesti metylaatiostatuksen HPV16 ja 18 genomit tunnistaa paras metylaation ja ennustavia biomarkkereita kohdunkaulan muutoksiin.

Tulokset ja keskustelu

Tämä on yksi harvoista tutkimuksia kattava kokoelma useita kohdunkaulan näytteiden hyvin määritelty eri sytologisten /histopatologinen diagnoosi, joka analysoi DNA: n metylaatio useiden solun geenin promoottorit sekä HPV16 ja HPV18 genomien. Samanlaisia ​​tutkimuksia on tehty useita kirjoittajat vaan joko rajoitettuun määrään solugeenistä promoottorien tai rajoitetun määrän analysoitu HPV-tyyppien [15-17].

On joitakin alan kirjallisuudessa tietoja metylaatiostatuksen solujen geenien, seuraavat

CCNA1

,

CDH1

,

C13ORF18

,

DAPK1

,

HIC1

,

RARβ2

,

hTERT1

,

hTERT2

ja

TWIST1

kohdunkaulan syövän solulinjoissa CaSki-, SiHa ja HeLa [12,18-20]. Tässä metylaatio profiilit yhdeksän geenin promoottorit testattiin solulinjoissa CaSki- ja SiHa vahvisti, että kaikilla testatuilla geeni promoottoria metyloitavaa CC. Solulinjassa HeLa, vain

DAPK1

promoottori ei ollut metyloitua. Metylointi profiileja edellä mainitun geenin promoottorit arvioitiin eri näytteessä ryhmiin: näytteet on normaali, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 ja HSIL /CIN3 sytologia, ja histopatologisesti vahvistetaan CC (taulukko 1). Näytteessä ryhmän normaali sytologia oli 20,0% (8/40) HPV positiivisia yhden tai useamman HR-HPV: t, joista neljä HPV16. Suurin osa näytteistä metyloitiin useimmissa testattu geenin promoottorit.

CDH1

havaittiin metyloitavaa useimmissa tapauksissa (82,5%), jonka jälkeen

HIC1

(67,5%),

RARβ2

(62,5%), ja

DAPK1

(55,0%). Koska ne on todettu erittäin metyloituja normaalissa kohdunkaula, nämä geeni promoottorit eivät ole ihanteellisia metylaatio biomarkkereita kohdunkaulan syövän synnyn. Toisin kuin meidän havaintojen Flatley

et al

. [21] löydetty

CDH1

promoottori metyloitavaa vain 2,3% normaalia kohdunkaulan näytteistä. Sen sijaan,

hTERT1

todettiin metyloitumaton kaikissa tapauksissa.

hTERT1

promoottori näyttää lupaavalta metylaation biomarkkereiden ollessa metyloitumaton normaalissa kohdunkaula. Sikäli kuin tämä, on olemassa ristiriitaisia ​​havaintoja Iliopoulos

et al

. [22], joka löysi

hTERT1

promoottori metyloitavaa suurempi osuus 26,6% normaalissa kohdunkaula. Se, että metylaatio profiili

hTERT1

promoottori edelleen suhteellisen alhainen kohdunkaulan esiaste muuttuu, eli LSIL /CIN1 (12,5%), HSIL /CIN2 (5,1%) ja HSIL /CIN3 (7,1%), ja lisäykset CC näytteistä (70,0%) suosii hypoteesia (taulukko 1). Vaikka hieman vähemmän ilmaisseet samansuuntaisia ​​metylaatio dynamiikkaa on havaittu

hTERT2

ja

TWIST1

promoottorit. Niinpä hypermetylaation kaikkien kolmen geenin promoottorit,

hTERT1

,

hTERT2

ja

TWIST1

voisi olla hyvä kohdunkaulan syöpä biologisten merkkiaineiden, kun vahvistus suurempi näyte allas. Näytteessä ryhmän LSIL /CIN1 diagnoosi oli 55,0% (22/40) HPV positiivisten näytteiden joista kuusi HPV16 ja yhdeksän HPV18.

CDH1

ja

HIC1

promoottoria metyloitavaa eniten tapauksia (75,0%, molemmat), kun taas

TWIST1

oli metyloitumaton kaikissa tapauksissa. Sen sijaan, Flatley

et ai

. [21] ovat havainneet

CDH1

ja

HIC1

promoottorit metyloitavaa paljon vähäisemmässä määrin näytteissä samalla diagnoosi, 1,8% ja 7,7% tapauksista, vastaavasti. Vuonna linjassa havainto, korkea

HIC1

metylaatio (67,6%) ja täysin puute metylaation

TWIST1

promoottori saman diagnoosin havaittiin Feng

et al

. [23]. HPV havaittiin 32 40 näytettä (80,0%) kanssa HSIL /CIN2 diagnosointiin, mukaan lukien kuusi HPV16 ja seitsemän HPV18. Koska hävinnyt bisulfiittikonversion yhdessä näytteessä, tutkimusryhmä edelleen mukana 39 HSIL /CIN2 näytteet, jotka on erityisesti luokitella sellaisiksi Kroatian irtosolunäyte luokitus, ”Zagreb 2002” [24], jotta tulkita hienoja eroja LSIL ja HSIL. Tässä jälleen, että suurin osa näytteistä metyloitiin useimmissa testattu geenin promoottorit,

CDH1

on metyloitu useimmissa tapauksissa (79,5%), kun taas

hTERT2

oli metyloimatonta kaikissa tapauksissa. Niistä 42 näytteitä HSIL /CIN3 diagnoosi HPV havaittiin 36 näytettä (85,7%), joista 17 HPV16 ja viisi HPV18. Eniten metyloitua tapauksia havaittiin

CDH1

(76,2%), ja alhaisin

hTERT2

(2,4%) promoottori. Muut kirjoittajat raportoitu metylaatio saman geenien samasta näytteestä ryhmään mutta hieman eri prosenttiosuuksia metylaation kutakin geeniä promoottori [21,23]. Kun tarkastellaan dynamiikka metylaation profiilin näiden kahden geenin promoottorit, näyttää siltä, ​​että

CDH1

promoottori jatkuvasti hypermetyloitunut, kun taas

hTERT2

promoottori on paljon vähemmän metyloidut normaalista korkealuokkaisesta kohdunkaulan solumuutoksia . CC ryhmässä oli 81,8% (9/11) näytteet positiivisia HR-HPV, joista seitsemän HPV16 ja yksi HPV18. Yksi CC näyte, vaihe IV-A, erittäin nekroottista, HPV-negatiivinen ja metyloitumaton joko geenin promoottori jätettiin lisäanalyysejä. Suurin osa tutkittujen geenin promoottorit metyloitiin tässä näytteessä ryhmässä, jotka vaihtelevat 60,0% ja

DAPK1

100,0% for

CDH1

promoottori. Niistä CC diagnoosi

hTERT2

promoottori metyloitavaa 60,0% näytteistä. Kun kyseessä on

hTERT

suurempi geenin ilmentyminen saavutetaan hypermetylaatiota. Tutkimuksessa Kumari

et al

. [25] hoito 5-atsasytidiini ja siitä demetylaation

hTERT

promoottori johti vähenemiseen geeniekspression. Tämä oli vastoin, mitä on havaittu tavanomaisilla tuumorisuppressorigeeneille. Mahdollinen selitys tähän ilmiöön on se, että metylaatio on

hTERT

promoottorit on heterogeeninen, ja että vain metyloitumattomat alleelit on ilmaistu [12]. Todellakin, että havaittiin tutkimuksessa Zinn

et al

. [26], jossa suurin osa syöpäsolujen linjojen oli

hTERT

promoottori tiheästi metyloitu, mutta CpG: t ympäri transkription aloituskohdasta huomattavan määrän

hTERT

alleelit olivat metyloimaton. Lopuksi tässä havaittu hypometylaatio normaaleissa kohdunkaula merkitsee alhaisempia ilmaus

hTERT

geeni ja alempi telomeraasiaktiivisuuteen. Tämä voi selittää paremmin ennusteen potilaita, joilla CC joiden kasvainsolujen puuttuu

hTERT

promoottori metylaatio [27]. Promoottori metylaatio havainnot muiden kirjoittajien CC näytteistä korreloivat hyvin meidän. Metylointi vaihtelee yli 65%:

hTERT

ja

DAPK

promoottorit [22], 41%

DAPK

, ja vähemmän

CDH1

,

HIC

ja

RARβ

promoottorit [21]. Saat suurempi määrä promoottoreita,

hTERT

,

CDH1

,

DAPK

,

HIC1

ja

RARβ of the metylointi vaihtelee jopa enemmän, välillä 0 100% [27-29].

Tässä olemme tunnistaneet viisi metylaatio biomarkkereiden ehdokkaita,

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

, ja

TWIST1

, jonka promoottori metylaatiostatus erottaa CC normaalista ja HSIL /CIN3 näytteet (taulukko 2). Etenemistä HSIL /CIN1 ja HSIL /CIN2 näyttää liittyvän suurempiin metyloinnin

RARβ2

ja

TWIST1

promoottori, vaikka tilastollinen merkitys on pienempi

RARβ2

( Fisherin testiä p = 0.024696) kuin

TWIST1

(Fisherin testiä p = 0,001030). Myöhäisessä kohdunkaulan muutokset, CC näyttää ominaista korkea metylaation

hTERT1

,

hTERT2

, ja

TWIST1

promoottori, ja alemmassa määrin

RARβ2

promoottori. Olemme myös ryhmitelty kohdunkaulan esiasteleesioita (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 ja HSIL /CIN3) arvioimaan eroja normaalin, kohdunkaulan solumuutoksia, ja CC. Tällaisessa vertailussa

CCNA1

ja

C13ORF18

promoottorit paljasti tilastollisesti merkitsevästi hypermetyloitunut kohdunkaulan esiasteleesioita verrattuna normaaliin cervices (Fisherin testiä p = 0,023742 ja 0,022603, vastaavasti). Lisäksi metylointi näiden kahden potentiaalisen biomarkkerit verrattuna normaaliin cervices näyttää olevan varhainen tapahtuma kohdunkaulan cancerogenesis, jossa

C13ORF18

promoottori on tilastollisesti merkitsevästi metyloitu LSIL /CIN1 ja HSIL /CIN2 (Fisherin tarkka testi p = 0.036738 kummassakin tapauksessa), kun taas

CCNA1

promoottori on tilastollisesti merkitsevästi metyloitavaa HSIL /CIN3 (Fisherin testiä p = 0,010994). Siksi tilastollisesti merkitsevä metylaatio eroja normaalin kittaus vaurioita ja CC on havaittu viisi geenin promoottorit:

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

ja

TWIST

. Yhteenvetona, nämä geeni promoottorit edustavat mahdollisimman hyvä metylaatio biomarkkereita havaitsemiseksi kohdunkaulan muutoksia ja voisi olla hyödyllistä kliinisessä työssä. Näyttää siltä, ​​että kohdunkaulan cancerogenesis on lukuisiin DNA: n metylaatio. Ensisijaisesti jotkut geenipromoottorit ovat metyloituja, kuten

C13ORF18

seurasi

CCNA1

, ja sitten toiset, eli

hTERT1

,

hTERT2

ja

TWIST1

(kuvio 1).

LSIL, matala-asteista levyepiteelisyöpä intraepiteliaalisten vauriota; HSIL, laadukkaat levyepiteelisyöpä intraepiteliaalisten vauriota; CIN, CIN-muutos; ↑, hypermetyloitunut; ↓, hypometyloidut.

Muut kirjoittajat määräytyy joidenkin valittujen geenien yhtä hyvä biomarkkereita, mutta useimmiten yhtenä biomarkkeri erottaa tietyn diagnoosin. Esimerkiksi Yang

et al

. [13] valittu

CCNA1

ja

C13ORF18

niin hyvä metylointi biomarkkereita erottaa näytteitä CIN2 + diagnoosi normaalista näytteistä. Kitkumthorn

et al

. [18] valitsi hypermetylaatiota

CCNA1

promoottori biomarkkerina varhaisen diagnoosin invasiivisia CC, De Wilde

et al

. [12] valitsi eriytetty metyloinnin

hTERT

diagnosoida CC, kun taas Eijsink

et al

. [14] tunnistettiin

C13ORF18

ja

TERT

yhdessä

EPB41L3

ja

JAM3

, kuten parhaiten metylointi biomarkkereita CC. Näin ollen, kirjallisuudesta on vaikea määrittää paras metylaatio biomarkkereita. Vuonna genomin laajuinen tutkimus, jossa Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip menetelmä varmistimme korkea metylaatio taso

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

ja

TWIST1

promoottorit CC verrattuna normaaliin kudokseen. Kuitenkin valvomattoman hierarkkinen klusterointi johti toisen sarjan geenejä ehdokas biomarkkereita,

RGS7

,

LHX8

,

STGALNAC5

,

TBX20

,

KCNA3

, ja

ZSCAN18

[30], joita ei ole arvioitu tässä. Lisäksi samassa tutkimuksessa [30], käyttäen mRNA ilmaisun aineistoja ulkoiseen validointi, osoitimme hyvä johdonmukaisuus DNA metylaatio datan ja geenien ilmentymisen array. Siksi voimme päätellä, että DNA: n metylaatio on hyvä ennustaja geenin ilmentymisen; Näin ollen, DNA: n metylaatio testit ovat hyviä ja riittävästi valinnanvaraa parantamaan diagnostiikan, lavastus ja ennustavat kliinisen tutkimuksen kustannusten takia ja aika hyöty yli geeniekspressioanalyysissä.

Tutkimme myös CpG metylaatiostatuksen HPV16 ja HPV18 genomien korrelaatio sytologisten /histopatologinen diagnoosi ja metylaatiostatuksen solujen geenien. Metylointi kuviot HPV16-genomin on analysoitu bisulfiitti sekvensoimalla kunkin 19 CpG sivustoja vuoksi discrepant saaduilla tiedoilla. Kuten odotettua, metylaation HPV16 genomin 12 näytettä eri diagnooseja, korreloi samat kuin SiHa solulinjan (S1 taulukko). Useimmat metyloitu CpG: t in HPV16 genomissa SiHa soluja havaittiin L1 ja promoottorialueen, kun taas suurin osa metyloimattomien CpG: t vuonna 5’LCR alueella ja tehostajana (kuvio 2). Usein molemmat kopiot HPV16 metyloituja ja metyloimattomien havaittiin kaikissa diagnoosi vaihtelee normaalista cervices kohdunkaulan syöpä, jossa metylaation profiilit CC näytteistä oli hyvin samankaltainen kuin yksi niistä SiHa solulinjan. Lähes kaikki näytteet, joilla oli normaali sytologia (N) metylointi profiili oli eroavat SiHa-soluissa ja CC näytteitä. Kaikki kolme ryhmää näytteitä kohdunkaulan esiaste muutokset (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 ja HSIL /CIN3) oli hyvin samankaltainen HPV16 metylaatio profiileja. Tämän vuoksi samankaltaisuuden metylaatiokuvion, kaikki kolme kohdunkaulan esiaste muutokset on esitetty yhdessä kuviossa 3B. Lisäksi kaikki CpG-sivustoja, jotka metyloitiin ja metyloitumaton samasta näytteestä on esitetty metyloitu (kuvio 3). Tuloksemme tukevat havaintoja Kalantari

et al

. [31], että HPV-genomi on normaalisti hypermetyloitunut ja tarvitsee vain yhden kopion olevan kopiointia aktiivinen. Kuten tässä esitetään, hyvän metylaation biomarkkereiden on tärkeämpää määritellä tarkasti metylaatio prosenttiosuus erityisten CpG sivustojen HPV16 genomissa kuin yleinen metylaation eri näytteessä ryhmissä. Tässä havaitsimme, että kohdunkaulan syövän esiasteita vaurion ryhmä oli alhaisin yleinen metylointi korko (33%), kun taas näytteiden normaali sytologia ja CC oli 53% kaikkiaan metylaatio korko, molemmat. Nämä tulokset ovat osittain eri mieltä päätelmien muut kirjoittajat, jotka väittävät, että metylaatio HPV16 on alhaisin normaalissa ja korkein CC näytteissä [17,32,33]. Tässä tutkimuksessa varastoalueelta 19 tutki CpG sivustoja HPV16-genomin, kaksi näyttävät olevan merkittävin, CpG 7455 (5’LCR) ja CpG 7694 (tehostajana), jossa täydellinen puuttuminen metylaation löytyi karsinoomanäytteistä ja SiHa- solulinja, kun he olivat erittäin metyloituja (100% normaalista kolot 83% esiasteleesioita CpG 7455) ja kohtalaisen metyloitu (75% normaalista kolot ja 33% lähtöaineiden vaurioiden CpG 7694) muissa näytteessä ryhmissä. Edelleen, CpG: t asemissa 7434 ja 7461 olivat metyloituja 50% näytteistä on normaali sytologia mutta ei metylaatio havaittiin esiasteleesioita, CC tai SiHa solulinjassa. Sitä vastoin CpG 31 metyloitiin ainoastaan ​​CC näytettä (50%) ja SiHa-solulinjassa. CpG: t asemissa 37 ja 52 olivat metyloitavaa 75% näytteistä normaali sytologia ja 100% esiasteleesioita, CC ja SiHa solulinjassa. CpG 58 metyloitiin 50% näytteistä normaali sytologia ja 100% esiasteleesioita ja CC, sekä SiHa solulinjassa. Metylointi ei havaittu CpG: t asemissa 7535 ja 7862 vuonna kumpikaan näytteistä tai SiHa solulinjassa. Sitä vastoin CpG 7682 metyloitiin kaikissa tutkituissa näytteissä, edeltäjä kohdunkaulan solumuutoksia, CC ja SiHa solulinja (kuviot 2 ja 3). Eri metylaatio taajuudet HPV16-genomin samassa CpG sivustoja havaintomme ja erilaisiin johtopäätöksiin ovat raportoineet Kalantari

et al

. [34]. Kuitenkin samanlaisia ​​havaintoja CpG metylaatio profiileja CC näytteiden meidän havaittiin tutkimuksessa Bhattacharjee ja Sengupta [35]. Siten täydellinen puuttuminen tai alhainen CpG-metylaation 5’LCR ja tehostajana, eikä promoottori alueella on ratkaisevaa HPV toimintaa ja näin ollen kuolemattomaksi isäntäsolujen.

N, normaali sytologia; I, LSIL /CIN1 diagnoosi; II, LSIL /CIN2 diagnoosi; III, HSIL /CIN3 diagnoosi; CC, kohdunkaulan syöpä; SiHa-, kohdunkaulan syövän solulinja; M, metyloitu; U, metyloimattomia; M + U, metyloidut ja metyloitumattomat kanssa pääasiassa metyloituja DNA; U + M, metyloidut ja metyloitumattomat kanssa pääasiassa metyloitumaton DNA.

Normal cervices (N = 40); kohdunkaulan esiasteleesioita, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 ja HSIL /CIN3 (N = 121); kohdunkaulan karsinooman näytettä (N = 10). CpG sivustoja, jotka olivat metyloituja ja metyloimattomien samasta näytteestä esitetään tässä metyloitu.

Tutkiminen HPV18 L1-geenin metylaatio 22. näytteistä (S1 taulukko) MSP menetelmällä havaitsimme, että se korreloi sytologinen /histopatologinen diagnoosi, ja voivat paremmin ennustaa taudin ennusteeseen. Erityisesti, useimmat analysoiduista näytteistä ja HeLa-solulinja sisälsi sekä metyloidut ja metyloitumattomat muotoja HPV18 L1-geenin (taulukko 3). Tosiasia on, että L1-geeni säilyy ehjänä kohdunkaulan leesioita ja syövän näytteet, jopa silloin, kun HPV-genomin integroituu isäntäsolun [36]. Metylointi HPV18 L1-geenin kohdunkaulan esiasteleesioita ja CC näytteitä oli linjassa diagnoosi ja metylointi profiilia HeLa solulinjan. Erityisesti meidän näytteitä, jotka sisältävät vain metyloidut muoto HPV18 L1-geeni oli parempi ennuste;

i

.

e

. Näytteiden solun geenejä metyloitu vähäisemmässä määrin, ja useimmiten ne, joita ei ole tilastollisesti osoittaa mahdollisia biomarkkereita. Turan

et al

. [37,38] todettiin myös molemmat kopiot HPV18 HeLa-solulinjassa, jossa ylimäärä metyloitu muodon, kun taas hypermetylaatiota HPV18 L1 kaikissa karsinoomia ja puute metylaation useimmissa oireeton smears ja heikompilaatuisen vaurioita. Lisäksi Badal

et al

. [39] ovat ilmoittaneet, että HPV18-genomi hypermetylaation HeLa-solulinjassa ja CC näytteet osoittavat, että HPV on todellakin kohdistettu solun DNA: n metylaatio koneita, jotka voivat vaikuttaa myöhään ja varhaisen geenin transkription.

Future tutkimukset validoida käyttö metyloitu HR-HPV niin ennakoiva ja /tai diagnostisia biomarkkeri kohdunkaulasyövän riskin joukossa HPV-positiivisten naisten [32,40,41]. Erityisesti MSP-alukkeiden HPV16-genomi, jotka kattavat CpG: t 7455 ja 7694 olisi suunniteltava, jotta vältetään kallista ja aikaavievää bisulfiitti sekvensointi, ja sellaisenaan, yksinkertaistaa kliinisiä sovelluksia. Meidän huomioon HPV-genomin metylaation testaus yhdessä solun geenin metylaatio testausta triage naisten korkean riski kehittää kohdunkaulan syövän myös jo keskusteltu [10,27,42], mutta kysymys jää joka HPV-tyypit, jotka HPV-genomin alueet ja joka solun geenit analysoida. Uskomme, että tulokset esitellään tässä tutkimuksessa hiljaista jälkeen vahvistuksen useampia näytteitä, voisi ratkaista nämä huolet. Siksi ehdotamme, että kaikki HR-HPV-positiivisten naisten saada testattu varten metylaatio

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

ja

TWIST1

promoottorit sekä ainakin HPV16 CpG 7455 ja 7694 sivustoja, ja HPV18 L1-geenin metylaatio. Testitulokset tulee korreloi, ja jos lisääntynyt metylaation ehdokas biomarkkereiden geenien ja muutti metylaatio profiilia HPV16 ja 18 genomin naisten tulisi hoitaa ja myöhemmin seurataan kauttaaltaan (kuvio 1). Lisäksi perustuu todellisiin tietoa solujen ja virusten DNA: n metylaatio mahdollinen käyttö demetylaatio huumeiden [27,43], kuten DNA metyylitransferaasien estäjiä voitaisiin pitää terapeuttisia vaan tulisi soveltaa hyvin varovasti.

Material ja menetelmät

valmisteluryhmä

tutkimus ryhmään kuului 173 kohdunkaulanäytettä naisten normaali sytologia, syövän esiasteita (levyepiteelisyöpä intraepiteliaalisten vaurioita, matala-asteista, LSIL ja korkea-asteen, HSIL),

i

.

e

. CIN-muutos (CIN) luokka 1-3, luokitellaan ”Zagreb 2002”, joka on linjassa ”NCI Bethesda System 2001” [24], ja histopatologisesti vahvisti CC [44]. Varastoalueelta näytteiden säännöllisiä diagnostiikan klo Rudjer Boskovic Institute, Zagreb, 40 näytettä normaali sytologia, 40 kanssa LSIL /CIN1, 40 kanssa HSIL /CIN2 ja 42 näytteitä HSIL /CIN3 diagnoosi tehtiin sattumanvaraisesti metylaation analyysejä. Lisäksi 11 CC (8 levyepiteelikarsinooma ja 3 adenokarsinooma) näytteet otettiin cytobrush juuri ennen kirurgisia toimenpiteitä.

Ethics lausunto

Suullinen potilas /osallistuja suostumus saatiin kullekin kohdunkaulan näytteestä joka kerättiin sekä HPV diagnostisia ja tutkimustarkoituksiin. Kirjallinen potilas /osallistuja suostumus ei ollut tarpeen, koska jokainen kohdunkaulan näyte on liitetty laboratorion palvelupyyntö muotoja, jotka on allekirjoitettava ja hyväksyttävä harjoitellaan lääkäri, joka on vastuussa sanallinen potilas /osallistuja lupaa (kirjannut kliinikon on Laboratory palvelupyyntö muodot). Näin ollen vain näytteitä potilaista /osallistujista, jotka suullisesti sovittu olivat mukana tässä tutkimuksessa. Asiaa potilastiedot (ikä, Sytologisten diagnoosi, HPV havaitseminen ja kirjoittamalla tulos) ja uutettu DNA edelleen koodattu ja käsitellään anonyymisti laboratoriossa. Tutkimus saavutettiin tutkimushankkeen ”Poikkeava DNA: n metylaation HPV liittyviä vaurioita” (Grant 098-0982464-2510 tukee Kroatian tiede, koulutus ja urheilu), joka hyväksyttiin sekä näytekokoelmatodistuksen menettelyn eettisiä hallitus Rudjer Boskovic Institute, ja eettisiä hallituksen Sisters of Mercy Hospital, ja Clinical Hospital Center Zagreb joka on linjassa Helsingin julistuksen (DOH /Oct2008).

DNA: n valmistus

DNA kohdunkaulan näytteistä eristetty BioRobot EZ1 (Qiagen, USA) valmistajan ohjeita. Sen jälkeen, kun DNA: n eristämiseksi, puhdistettua DNA liuotettiin 50-100 ui tri-tisleen steriiliä vettä ja säilytettiin -20 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka. Kukin DNA analysoitiin spektrofotometrisesti ja visuaalisesti 1% agaroosigeelielektroforeesilla, ja visualisoitiin UV-säteilyn Alliance 4,7 (UVITEC Cambridge, UK) [45].

HPV havaitseminen ja genotyypityksen

Detection ja genotyypin HPV aiemmin kuvanneet Milutin-Gasperov

et al

. [46] Lyhyesti, kolmet konsensusalukkeilla (PGMY09 /PGMY11, L1C1 /L1C2-1 /L1C2-2 ja GP5 + /GP6 +) käytettiin HPV havaitsemiseen, ja tyyppi-spesifisiä alukkeita HPV genotyypitys tyyppejä 6/11, 16 , 18, 31, 33, 45, 52 ja 58. PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesilla 2% agaroosigeeleillä värjättiin etidiumbromidilla.

Solulinjat

eristetty DNA: t, HPV16: sta positiivinen CC solu linjat, CaSki- (ATCC CRL-1550) ja SiHa (ATCC HTB-35), ja HPV 18 positiivinen, HeLa (ATCC CCL-2), käytettiin positiivisina kontrolleina poikkeavan metylaation profiileja solujen geenien ja vastaavien HPV genomeja. CaSki- solut sisältävät integroidun HPV16-genomi (noin 600 kopiota solua kohti) sekä sekvenssit liittyvät HPV18. SiHa solut sisältävät integroidun HPV16-genomi (1-2 kopiota solua kohti), kun taas HeLa-solut sisältävät HPV18 sekvenssit.

bisulfiittimodifiointi DNA muuntaminen

DNA kohdunkaulan näytteiden muokatun natriumbisulfiitin avulla EpiTect bisulfiittimodifiointi (Qiagen, USA) ja puhdistettiin sitten mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, kaikki metyloitumattomat sytosiinit muunnetaan urasiilin mukaan vetysulfiittikäsittelyä, kun metyloidut sytosiinit säilyvät muuttumattomina.

Isäntäsolu geenin promoottorit ”metylaatio määritys

Metylointi profiileja

CCNA1

( kromosomi 13: 36432177-3643232),

CDH1

(kromosomi 16: 68737114-6873722),

C13ORF18

(kromosomi 13: 46387345-4638746),

DAPK1

(kromosomissa 9 : 87497883-87497981),

HIC1

kromosomi 7: 19117831-19118031,

RARβ2

(kromosomi 3: 25428191-2542842),

hTERT1

(kromosomi 5: 1295019-1295259 ),

hTERT2

(kromosomi 5: 1294824-1295014) ja

TWIST1

(kromosomi 7: 19117831-19118031) geenin promoottorit tunnistettiin. -Geenin promoottori metylaatiostatuksen saatiin metylaatiospesifisen Polymerase Chain Reaction (MSP) spesifisten alukkeiden kanssa metyloidut muodot geenin promoottorit. Samaa menetelmää käytettiin havaitsemiseen metyloitumattoman muotoja saman geenin promoottorit, paitsi

C13ORF18

promoottori. Positiivisuus Näytteiden metyloitumattomilla muotoja geenin promoottorit toimi sisäisen valvonnan, koska kohdunkaulan tahroja sisältävät seokset solujen monipuolinen metylaatiostatuksen vastaanottavan geenin promoottorit [17]. MSP ja -olosuhteet valitun geenit on jo kuvannut Yang

et al

. [13,47], Feng

et al

. [23], Kitkumthorn

et al

. [18], ja DESSAIN

et al

. [19], mutta olosuhteet muutettiin useimmissa tapauksissa tässä. Lyhyesti, 5 min denaturaatio 95 ° C: ssa seurasi 45 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 56-61 ° C: ssa 30 s, pidennys 72 ° C ° C: ssa 50-, ja lopullinen 7 minuutin pidentäminen 72 ° C. Pariutumislämpötilan vaihteli eri alukkeilla: 56 ° C

hTERT1

(U, metyloimattomia alukkeet) ja

TWIST1

(M, metyloitu alukkeet), 58 ° C: ssa

CCNA1

(M) ja

CCNA1

(U), 59 ° C: ssa

CDH1

(U),

C13ORF18

(M),

DAPK1

(