Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nature tappaja (NK) soluilla on tärkeä rooli anti-kasvain immunoterapian. Mutta se osoitti, että kasvaimen solut vaikuttivat mahdollisesti NK-solujen normaaliin toimintaan läpi joitakin molekyylejä mekanismeja kasvaimen mikroympäristössä.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuksessa analysoitiin muutoksen noin NK-solut pinta markkereita (NK-solujen reseptoreihin ) kautta immunofluoresenssilla, virtaussytometrialla ja reaaliaikaisen PCR: n tappoi toiminto hiiren pernan NK-solun ja ihmisen korkea /matala keuhkosyövän solulinjaa rinnakkaisviljelemällä. Lisäksi olemme hyväksytty edellä tulos keuhkosyöpä mallin SCID hiiri.

Tulokset

Osoitimme, että tunkeutuminen NK-solujen kasvaimen reuna liittyi keuhkosyöpää potilaiden ennustetta. Ja määrä NK-solun soluttautua keuhkosyövässä kudos liittyy läheisesti patologisen tyyppejä, koko ensisijainen syöpä, tupakointi historia ja ennusteen potilaiden keuhkosyöpä. Ilmaisu NK-solujen inhibiittori reseptoreita on lisääntynyt merkittävästi kasvainten mikro-ympäristö, vastakkaisiin ilmaus NK-solujen reseptorit vähentää upeasti.

Johtopäätökset

elinaika keuhkosyöpään potilaan positiivisesti liittyvät NK-solujen tunkeutuminen asteen keuhkosyöpä. Siten alas-säätely NKG2D, Ly49I ja säätely ylöspäin NKG2A voi ilmoittaa siedätyshoitoa mekanismi ja helpottaa etäpesäke kasvaimen ympäristössä. Tutkimuksemme tarjoaa enemmän teoriaa kliiniseen strategian noin kasvain immunoterapian.

Citation: Jin S, Deng Y, Hao J-W, Li Y, Liu B, Yu Y, et al. (2014) NK Cell Fenotyyppiset modulaatio Keuhkosyöpä Environment. PLoS ONE 9 (10): e109976. doi: 10,1371 /journal.pone.0109976

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: toukokuu 17, 2014; Hyväksytty 13 syyskuuta 2014; Julkaistu: 09 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Jin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Nuorten Research Fund päässä avustukset National Yhdestoista-Five-Year Key Tehtävä Projects of China (nro 2006BAI02A01) National 973 Program (nro 2010CB529405), Tianjin Scientific Innovation System Program (nro 07SYSYSF05000, 07SYSYJC27900), Kiinan ja Ruotsin Cooperative Foundation (nro 09ZCZDSF04100), apurahan National Natural Tiedesäätiö of China (nro 81201828), Young ihmiset Foundation Heilongjiangin maakunnan Kiinan (nro QC2012C013), Health Department Heilongjiangin maakunnan Kiinan (nro 2011-124) ja Harbin Medical University Cancer sairaalan suurhanke Foundation (nro: JJZ-2010-01). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia maailmassa, jolla on suuri sairastuvuus ja kuolleisuus, ja sen osuus on noin 25,4% kaikista kasvaimia. Se on ollut noususuunnassa esiintyvyys on viime vuosina [1] – [4]. American Cancer Society julkaisi tiedot osoittavat, että 222520 tapauksissa hengityselinten syöpää ja 157300 kuolemantapauksia vuonna 2010, mikä on ensinnäkin sairastavuuden ja kuolleisuuden kaikista pahanlaatuisia kasvaimia [5]. Kliinisessä tilastot vaihe IV ei Kiinassa osoitti, että 1-, 2-, 3-, 4- ja 5-vuoden pysyvyys oli 44%, 22%, 13%, 9% ja 6%: lla [6]. Tällä hetkellä, kirurginen resektio on edelleen tärkein tapa pidentää elinaikaa keuhkosyöpään, mutta eteneminen ja metastaasit keuhkosyöpään on suurin este parantaa tehoa ennuste keuhkosyöpään. Sillä perusteellisen tutkimuksen keuhkosyöpää pahanlaatuisia käyttäytyminen ja keskittyä kattava Etäpesäkkeisen keuhkosyöpää, on tarpeen vahvistaa asianmukaiset eläinmallissa tutkia keuhkosyöpä toistuminen ja etäpesäke ja sen kattavan hoito.

Natural killer (NK ) solu, joka tunnetaan myös suuri rakeinen lymfosyyttejä, on itsenäinen ja ei-spesifisen immuunijärjestelmän solu. Sillä ei ole MHC rajoituksia kohdesoluihin tunnustamista ja tuhoa, ja se voi suoraan tappaa kasvainsoluja ja viruksen tartunnan kohdesoluja ilman antigeeni esiherkistyneet [7], [8]. Se voi myös tuottaa suuren määrän immuuni-aktiivisen sytokiinien parantaa tai laajentaa sen kasvaimen vastaisen vaikutuksen, joka voidaan pitää ensimmäinen rivi isännän puolustusjärjestelmän [9]. Useat kokeelliset todisteet osoittivat merkittävää roolia NK solujen poistamisesta syöpäsoluja. Vivier ym raportissa, että pieni NK-solun sytotoksisuutta ääreisverenkierrossa korreloi lisääntyneen syöpäriski [10]. Lisäksi NK-solujen tunkeutumisatmosfääri tuumorikudokseen oli liittynyt hyvään ennusteeseen peräsuolen [11], mahan [12], ja keuhkojen [13] syöpiä.

kehittämiseen kasvaimen muodostumisen, pahanlaatuisten syöpäsolujen ja infiltroivia immuunijärjestelmän solut ovat vuorovaikutuksessa ja muodostuu kasvain mikro-ympäristössä. Useimmat julkaistut tutkimukset osoittivat, että suuri määrä immuunisolujen päätymisen kasvainkudokseen tärkeä rooli parantaa kasvaimen ennusteeseen [14], [15]. Mutta kuten me kaikki tiedetään, ennustetta keuhkojen liittyvien maligniteetteja on erittäin kauhea, vaikka on olemassa monia immuunisolujen keuhkoissa. Haluamme tietää, jos on olemassa ero koostumus immuunisolujen soluttautua pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset keuhkokudoksen alueilla, ja jopa toimi voisi edistää tätä vaikutusta. Esendagli G et.al havaittu, että ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla, NK-solut eivät melkein löydetty pahanlaatuinen kudos alueet, hyvänlaatuisen kollegansa valikoivasti asuu NK-solujen ja ne NK-solut osoittivat voimakasta sytotoksista aktiivisuutta ex vivo [16].

Joten vaikutus NK-solun reseptorin ilmentyminen ja toiminta voi olla erilainen aiheuttaman vuorovaikutuksen NK-solujen ja kasvaimen kasvaimen mikroympäristössä. Tutkimalla NK solut elimistössä ja /tai keuhkosyöpä mikro-ympäristö, keskustella sen jakelu, reseptorin ilmentyminen, toimintakyky keuhkosyöpä invaasio, etäpesäkkeiden ja ennuste, selventää mekanismia NK-solujen mukana keuhkosyöpä mikro-ympäristössä matkapuhelinverkon ja molekyylitasolla.

Materiaalit ja menetelmät

kasvainnäytteestä ja eettinen lausunto

Tämä tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Kaikki kasvainnäytteestä Tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin Tianjin Lung Cancer Institute ja Patologian osasto Tianjin Medical University General Hospital. Kaikki potilaat edellyttäen kirjallinen lupa varten otetaan näytteitä ja myöhempää analysointia. Ja tutkimuksen hyväksyi institutionaalisten eettisen komitean Tianjin Medical University General Hospital.

Parafiinit Näytteen ja Jäädytetyt kudosten alkuperä Keuhkosyöpä

Potilaat ovat oikeutettuja osallistumaan induktio vaiheessa tutkia, jos: histologiset tai cytologic diagnosoitu NSCLC (mukaan lukien suomuinen, adenokarsinooma ja suuri cell carcinoma); ei ole aiempaa systeemistä kemoterapiaa, sädehoitoa ja biotherapy keuhkosyöpään ennen leikkausta; mikään muu syöpä historiaa; ja ≤80 vuotiaita.

Parafiinit Specimen kerättiin 84 potilaalla diagnosoitiin keuhkosyöpä välillä January1st 2008 ja 31 tammikuu 2011 (64 miestä ja 20 naista). Mediaani-ikä potilailla oli 60,7 ± 7,9 vuotta (vaihteluväli 40-78 vuotta). On olemassa erilaisia ​​patologia tyyppiä: 37 levyepiteelikarsinooma syöpä potilailla, 37 adenokarsinooma potilaiden ja 10 suurta cell carcinoma potilaita. Tuolloin diagnoosi potilaat arvioitiin mukaan AJCC /UICC kuudennesta luokittelu painos seuraavasti: vaiheessa IIA-1 potilaalla, vaihe IIB- 4 potilasta, vaiheessa IIIA-58 potilasta, vaiheessa IIIB-12 potilasta, vaiheessa IV-9 potilailla. Näytteet levitettiin Tianjin Medical University patologia osasto.

Jäädytetyt kudosnäytteet tuotettu 66 kirurgiset näytteistä keuhkosyöpä välillä January1st 2008 January1st 2011. On myös 52 miestä ja 14 naista. Mediaani-ikä potilailla oli 60,5 ± 8,4 vuotta (vaihteluväli 40-78 vuotta). Oli myös eri patologia tyypit: 28 levyepiteelikarsinooma syöpä potilailla, 28 adenokarsinooma potilaiden ja 10 suurta cell carcinoma potilaita. Potilaat arvioitiin mukaan AJCC /UICC kuudennesta luokittelu painos seuraavasti: vaiheessa IIA-1 potilaalla, vaihe II B-4 potilasta, vaiheessa IIIA-45 potilasta, vaiheessa IIIB-9 potilasta, vaiheessa IV-7 potilaalla. Näytteet levitettiin Tianjin Lung Cancer Research Institute.

Immunofluoresenssikoe

immunofenotyypeissä analyysi CD56 ja CD16 tehtiin seuraavassa kuvatulla tavalla. Lyhyesti, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet (4 um) on lämmennyt astia 45 minuuttia, sitten poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen etanolia ratkaisuja. Leikkeet jälkeen upotettiin sitruunahappo-natriumsitraatin (pH 7) ja mikroaaltouuni suurella palo 5 min, matala palo 15 minuuttia, ja luonnollista jäähdytystä huoneenlämpöön hakea antigeenisyyden. Endogeeninen peroksidaasi pysäytettiin 3% H

2O

2 30 min. PBS-pesun jälkeen, leikkeitä inkuboitiin 2% BSA: ssa 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten inkuboitiin CD56 ja CD16-vasta-ainetta (Santa Cruz, laimennettiin 1:100) yön yli 4 ° C: ssa. Leikkeitä inkuboitiin hiiren anti-vuohi ja vuohen anti-hiiri-fluoresenssi-vasta-ainetta (Santa Cruz, laimennettiin 1:200) 35 minuutin ajan ja DAPI 5 min. PBS-pesun jälkeen neljännen kertaa, leikkeet asennus glyseroli (PH 9,0). Punainen fluoresenssi ilmaistaan ​​CD56

+, vihreä fluoresenssi ilmaistaan ​​CD16

+, sininen fluoresenssi ilmaistaan ​​solun tumassa. Voimme löytää CD56

+ ja /tai CD16

+ ilmentävät NK solussa. SPOT kuva-analyysi-ohjelmisto käytettiin analysoinnin. Prosenttiosuus CD56 ja /tai CD16-positiivisia soluja määritettiin laskemalla per jakso. NK solumäärän per view kenttä pisteytettiin seuraavien kriteerien: +, NK valkosolujen määrän per view kentän 10; ++, NK valkosolujen määrän per view alan 10, 20; +++, NK valkosolujen määrän per view alan 20. Kaikki kentät kappaleessa kolmessa riippumattomassa kokeessa laskettiin.

RNA: n uutto, cDNA-synteesi ja DNA eristys

kokonais-RNA uutettiin Trizol reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA: ta pilkottiin R Nase-free-D Nase-I (Promega, Madison, USA) ja käytettiin cDNA-synteesin kanssa käänteiskopioijaentsyymin järjestelmän (Takara Biotech, Dalian, Kiina).

Quantitative real-time PCR

cDNA-synteesi suoritettiin kuten edellä on kuvattu. Erityinen aluke RT kokeilun seuraavat: NK1.1: 5’TCTCTTGAATAAACACACAGCAT -3 ’, NKG2A: 5’CTGAGAAGGATTTTG -3’, NKG2D: 5’TTCTCACAGTTCCTCT -3 ’, LY49I: 5’TTCTATTCTTGCTTTAG -3 ”. Alukeparia ja GAPDH alukepareja käytettiin Q-PCR SYBR Esisekoite Ex Taq RT-PCR (Takara, Dalian, Kiina) kanssa ABI PRISM 7900 Reaaliaikainen System (Bio-Rad) seuraavin ehdoin: 95 ° C: ssa 30 s, 40 monistussykliä (95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s), ja sulamispiste sykli 60 ° C: sta 95 ° C: ssa. Aineisto analysoitiin käyttäen ABI PRISM 7900 Manager -ohjelmisto. Kaikki reaktiot suoritettiin kolmen teknisen rinnakkaista.

Cell

korkea ja matala etäpesäkkeiden suuret keuhkosyöpä solulinjat L9981-Luc ja NL9980-Luc Tianjin Lung Cancer Institute [17], [ ,,,0],18] pidettiin RPMI 1640-alustassa (Hyclone, America), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Hyclone, America) täysin kostutetussa inkubaattorissa (NuAire®, US Autoflow) 37 ° C: ssa 5% CO

2. Soluja pidettiin eksponentiaalinen kasvuvaiheessa kokeissa.

SCID malli

SCID (severe combined immuunipuutos) hiiret hankittiin Kiinan Academy of Medical Sciences eläimen laitokset asutettiin patogeenittomassa eläin tilat. Nainen käytetyt hiiret olivat 5-7 vk ikäisiä kokeen perustamisen jälkeen. Nainen SCID hiiriin (16 eläimiä kustakin koeryhmä) istutettiin ihonalaisesti oikeaan inguen 2 * 10

6 solua suspendoitiin 150 ul PBS: ää. Yhdeksän eläinten kontrolliryhmässä ei ollut rokotus. Kasvaimen koot mitattiin joka 7. päivä ja niiden fluoresenssin voimakkuus mitattiin Amerikan todellinen olemus elävän kuvantamisjärjestelmä (XENOGEN IVIS200). Sen jälkeen 6 viikon havainto, leikkely suoritettiin ja irrotetut kasvaimia, keuhkot ja perna poistettiin tarkempaan analysoimiseen. Nämä kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa tulosten varmistamiseksi. Eläin koemenettelyn hyväksyttiin komitean Ethics eläinkokeiden ja kokeet tehtiin noudattaen suuntaviivojen eläinkokeet Tianjin Medical University Cancer Research Center.

Lymfosyyttien kerätä ja virtaussytometria havaita

keuhkot ja pernat kiillotettiin palasiksi. Sitten lymfosyytit kerätään uutettiin lymfosyytti Separation Medium (Shenzhen, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. Prosenttiosuudet NK-solujen arvioitiin ja erotettiin virtaussytometrialla käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita (MoAb: t) ja anti-CD3

– FITC /NK1.1

+ PE (BD Phamingen, San Di-kirjain, CA). Analyysin aikana, CD3

– /NK1.1

+ Population määritettiin. Määrittämään pinnan ilmentyminen NK-solun ligandeihin NK-soluja, sitten solut värjättiin vuohen anti-hiiri-NK1.1-FITC, CD3- Alexa Fluor 647, NKG2A-FITC, NKG2D-PE, Ly49I-PE (BD Phamingen, San Di-kirjain, CA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Analyysi suoritettiin FACS Lajittelu (Becton Dickinson, Mountain View, CA) käyttämällä Cell Quest -ohjelmistoa (Becton Dickinson) ja solun pinnan ilmentyminen kvantitoitiin arvo keskimääräisen fluoresenssi-intensiteetit, jotka on saatu spesifisistä mAbeista.

Co-kulttuuri

Puhdistettu NK1.1

+ /CD3

– NK-solut (aktivoitu 100 U /ml IL-2 aikana 2 h) hiiren perna oli viljeltiin yhdessä keuhkosyöpä solulinja L9981-Luc /NL9980-Luc, kuten (A) 0.25:1, (B) 0.5:1, (C) 01:01 ja (D) 02:01 24, 48, 72 tuntia. Sen jälkeen co-kulttuuri, fluoresenssin intensiteetti NK-solujen mitattiin Amerikan todellinen olemus elävän kuvantamisjärjestelmä.

Quantitative real-time PCR

RNA eristettiin irrotetut kasvaimista kautta Trizol ja käännetyn transkriptoidaan käyttämällä erityistä pohjustus (Invitrogen). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin ABI PRISM 7900 väline, käyttäen SYBR green määrityksiä. Spesifisten alukkeiden on lueteltu seuraavassa (taulukko 1). Monistus suoritettiin seuraavasti. Alkuvaiheen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, malleja denaturoitiin 95 ° C: ssa 5 sekunnin ajan, alukkeet hybridisoitiin ja DNA laajennus suoritettiin 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan (kukin sykli toistettiin 40 kertaa). Ilmaisu kohdegeenien kompensoi käyttäen ilmaus GAPDH ja esittämä lauseke suhde käsittelemätön kontrolli solujen ja käsitellyt solut.

Tilastollinen

Kokeet suoritettiin kolmesti. Data esitetään keskiarvoina ± SD. Tilastollinen arviointi suoritettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA testejä tai rank-sum test kun mittaustiedot on Gaussin jakauma SPSS ohjelmiston järjestelmä, versio 17.0. Jos data on luettelointi data, Chi-square testillä.

P

arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Kaiken eloonjäämisaste verrattiin Kaplan-Meier edunjättäminen käyrä, log-rank rank-sum test käytetty ryhmien keskuudessa.

Tulokset

NK-solun lokalisointi ja morfologia ominaisuus keuhkosyöpä mikro-ympäristö

soluttautuneet NK solut keuhkosyövän kudoksessa keskittynyt lähinnä kasvain strooman muodostavat kasvain mikro-ympäristössä (kuva 1). NSCLC kudoksissa, CD56

+ NK-solujen kanssa 1, 2 ja 3 asteen tunkeutuminen oli 44,0%, 22,6%, 33,3%, CD16

+ NK solut olivat 45,2%, 22,6%, 32,1%, ja CD56

+ CD16

+ NK-solut olivat 45,2%, 23,8%, 31,0%, vastaavasti. Mitään merkittävää eroa ei havaittu (

p

0,05) kesken NK-solujen kanssa CD56 yksi positiivinen, CD16 yksi positiivinen ja CD56CD16 kaksinkertainen positiivinen keuhkosyövän kudosta (taulukko 1).

soluttautuneet NK solut keuhkosyövän kudoksessa keskittynyt lähinnä kasvain strooman. NK-solujen näyttelyissä CD56 yksi positiivinen (vihreä fluoresenssi), CD16 yksi positiivinen (punainen fluoresenssi) ja CD56CD16 kaksinkertainen positiivinen (keltainen fluoresenssi) on keuhkosyöpä strooman kudosta.

NK infiltraatiota ja keuhkosyöpäpotilaita kliinisen patologian fysiologinen ominaisuus

1, 2 ja 3 asteen kanssa CD56

+ CD16

+ NK-solujen tunkeutuminen oli 24,3%, 32,4%, 43,2% vuonna okasolukarsinoomia, ja 62,2%, 16,2 %, 21,6% vuonna adenokarsinooma ja 50,0%, 10,0%, 40,0% suurissa keuhkosyöpä, vastaavasti. Siellä oli merkittävä ero CD56

+ CD16

+ NK-solujen tunkeutuminen määrin eri patologisten keuhkosyöpään (

p

= 0,019) (kuvio 2, taulukko 2). Ilmaisu NK-solujen okasolusyöpä oli merkittävästi korkeampi kuin adenokarsinooma ja suuri cell carcinoma. 1, 2 ja 3 asteen kanssa NK-solujen tunkeutuminen oli 48,1%, 3,7%, 48,1% vuonna keuhkosyöpään potilailla, joilla ei ollut tupakointi, oli 42,1%, 31,7% ja 26,3% potilailla, joilla tupakoinnin historiaa. Tupakointi historia keuhkosyöpään potilaan liittyy NK-solujen infiltraatiota aste (

p

= 0,011). 1, 2 ja 3 asteen kanssa NK-solujen tunkeutuminen oli 60,6%, 18,4%, 21,1% T1-T2 syöpä, ja 42,1%, 31,7%, 43,5% T3-T4 syöpä, vastaavasti. Merkittävä ero NK-solun infiltraatiota asteen välillä havaittiin eri koko kasvain (

p

= 0,019) (taulukko 3).

. Lung squamous karsinooma; B. Lung adenokarsinooma; C. Suuri keuhkosyöpä. Ilmaisu NK solujen okasolusyöpä oli merkittävästi korkeampi kuin adenokarsinooma ja suurten cell carcinoma.

NK infiltraatiota ja keuhkosyöpäpotilaita ennuste

elinaika keuhkosyövän potilas oli positiivisesti yhteydessä NK-solujen tunkeutuminen asteen keuhkosyöpä. Mitä enemmän tunkeutuminen NK-solut olemassa, sitä pidempi elinaika potilaiden teki (

p

= 0,030) (kuvio 3, taulukko 4).

elinaika keuhkosyöpään potilaan positiivisesti liittyvät NK-solujen tunkeutuminen asteen keuhkosyöpä. Enemmän tunkeutumisen NK-solut oli olemassa, sitä pidempi elinaika potilailla ei. Potilaat tasolla 3 ryhmässä on pisin elinaika. Niistä kolme ryhmää tilastollista merkittävyyttä ovat exit. (

p

= 0,030)

Reaaliaikainen PCR vahvistaa NK-solujen tunkeutuminen määrin keuhkosyövän

Erot NK-solun reseptorien CD56 ja CD16 mRNA: n ilmentymisen eri patologinen keuhkosyöpään havaittiin ja varmistettiin Reaaliaikainen PCR. Huomasimme, että NK-solujen fenotyyppi mRNA eri histologinen keuhkosyövän on tilastollista merkitystä (kuva 4). Tämä on sen mukaan, minkä seurauksena on histologia.

NK-solujen reseptorit CD56 ja CD16 fenotyypin mRNA eri histologinen tyypit keuhkosyöpä on tilastollista merkitystä.

siirrettyjen kasvainten-keuhkometastaasitestissä mallit perustettu

siirrettyjen kasvainten-keuhkometastaasitestissä malleja onnistunut perustettiin SCID hiiri korkea (L9981) /low (NL9980) metastaattinen ihmisen suuret keuhkosyöpä solulinjat. Kaukainen etäpesäke ksenograftissa kasvain havaittiin fluoresenssikuvantamisella in vitro (Kuvio 5A). Verrattuna low-metastaattinen ryhmä (6,84 x 10

6 ± 3,26 x 10

6), keuhkojen metastaasit fluoresenssin arvo hiirten korkean metastaattinen ryhmä (30,97 x 10

6 ± 14,3 x 10

6) oli huomattavasti korkeampi kuin matalan metastaattinen ryhmä (

p

= 0,035) (Fig.5B, C, D).

V: Living fluoresenssikuvantamisella havaita hiirimallissa ( vasemmalla on oikea inguen ihonalaisesti kasvaimen 1 viikon ja keskellä on 6 viikkoa injektion jälkeen, oikealla on keuhkoetäpesäkkeet kasvainten kuudessa viikossa siirrostuksen jälkeen.), B: kasvukäyrä ihon alle siirteen kasvain SCID hiiri, C: keuhkojen metastaasien luminesenssikuvantamisessa on kasvain hiiren in vitro, D: vertailu luminesenssin arvo on välillä siirrettyjen kasvainten ja keuhkometastaasien korkea (L9981) /matala (NL9980) metastaattinen ihmisen suuri keuhkosyövän solulinjat.

NK-solujen fenotyyppiset modulaatiota keuhkosyöpä mikro-ympäristö

NK1.1

+ CD3

– NK solujen keuhkojen korkean metastaattisen ryhmässä (3,40 ± 0,90) olivat merkittävästi korkeampia kuin pernassa (0,10 ± 0,06) (

p

= 0,003). NK1.1

+ CD3

– NK-solut pernassa korkean etäpesäkkeiden ryhmässä (0,10 ± 0,06) olivat merkittävästi pienempi kuin matalan etäpesäkkeiden ryhmä (1,66 ± 0,82) ja kontrolliryhmän (3,80 ± 2,05) (

p

= 0,017,

p

= 0,025) (Kuva 6).

NK1.1

+ CD3

– NK solujen keuhkojen korkean -metastatic ryhmä oli merkittävästi suurempi kuin vuonna pernassa (

p

= 0,003). NK1.1

+ CD3

– NK-solut pernassa korkean etäpesäkkeiden ryhmässä (0,10 ± 0,06) olivat merkittävästi pienempi kuin matalan etäpesäkkeiden ryhmä (

p

= 0,017) ja valvonta ryhmä (

p

= 0,025).

NKG2D ilmentymistason NK pernasta korkean etäpesäkkeitä ryhmässä (4,17 ± 0,85) olivat huomattavasti alhaisemmat kuin kontrolliryhmässä (7,80 ± 2,67) (

p

= 0,034) ja alhaisen etäpesäkkeiden ryhmä (6,00 ± 0,96) (

p

= 0,040) (7B on kuvattu).

V: NKG2A ilmentymistaso NK solujen keuhkojen korkean metastasoitunut L9981 ryhmä oli merkittävästi suurempi kuin matalan metastasoitunut NL9980 ryhmä ja kontrolliryhmän (

p

= 0,000). Ly49I ilmentymisen määrä keuhkoihin L9981 ryhmässä ja NL9980 ryhmässä oli merkittävästi korkeampi kuin verrokkiryhmässä (

p

= 0,000) B: NKG2D ilmentymistason NK solut pernan L9981 ryhmässä (4,17 ± 0,85) olivat huomattavasti alhaisempi kuin kontrolliryhmän (

p

= 0,034) ja NL9980 ryhmä (

p

= 0,040). Ly49I ekspressiotaso NL9980 ryhmässä oli huomattavasti korkeampi kuin L9981 ryhmässä (

p

= 0.010) ja kontrolliryhmän (

p

= 0,004). C: NKG2A ilmentymistason NK solujen keuhkojen oli merkittävästi suurempi kuin perna korkean metastaattinen L9981 ryhmä (

p

= 0,007) ja Ly49I ilmentymisen määrä keuhkoissa oli huomattavan säädelty kuin pernassa (

p

= 0,003) D: ei ole merkittävää eroa kaikkien reseptorien ilmentymisen taso NK solujen olemassa pieni etäpesäkkeiden NL9980 ryhmä. E: Tällä Ly49I ekspressiotaso NK-solujen keuhkoista oli huomattavasti suurempi kuin pernasta kontrolliryhmässä (

p

= 0,033).

NKG2A ekspressiotaso NK-solujen keuhko (5,13 ± 2,36) oli merkittävästi suurempi kuin pernan (1,47 ± 0,68) korkean metastaattinen ryhmä (

p

= 0,007) (Fig.7C). NKG2A ilmentymistaso NK solujen keuhkojen korkean metastaattinen ryhmässä (5,13 ± 2,36) olivat merkittävästi korkeampia kuin alhaisen metastaattinen ryhmä (4,70 ± 1,96) ja kontrolliryhmän (0,73 ± 0,26) (

p

= 0,000) (kuvio 7A).

Ly49I ilmentymistason NK solujen keuhkojen korkean metastaattinen ryhmässä (4,82 ± 1,78) oli huomattavan säädelty kuin että pernassa (1,50 ± 0,10) (

p

= 0,003) (Fig.7C). Ly49I ekspressiotaso NK-solujen keuhkosta (2,79 ± 0,40) oli merkittävästi suurempi kuin pernasta (1,13 ± 0,40) kontrolliryhmässä (

p

= 0,033) (Fig.7E). Ly49I ilmentymistason NK solujen keuhkojen korkean metastaattinen ryhmässä (4,82 ± 1,78) ja alhaisen metastaattinen ryhmä (6,11 ± 2,23) oli merkittävästi korkeampi kuin verrokkiryhmässä (2,79 ± 0,40) (

p

= 0,000) (kuvio 7A). Ly49I ilmentymistaso NK solut pernassa matalan metastaattinen ryhmä (3,40 ± 1,00) oli huomattavasti korkeampi kuin korkean metastaattinen ryhmässä (1,50 ± 0,10) (

p

= 0.010) ja kontrolliryhmään (1,13 ± 0,40) (

p

= 0,004) (7B on kuvattu).

NK-solujen tappava vaikutus keuhkosyövän mikro-ympäristö

NK1.1

+ CD3

– NK-solut aktivoituvat IL-2 in vitro on merkittävä sytotoksinen aktiivisuus korkea /matala metastaattisen keuhkosyövän suuria soluja. Merkittävä ero havaittiin eri efektori-kohde-suhde (

p

= 0,005,

p

= 0,017). NK-solut oli korkeampi sytotoksinen aktiivisuus NL9980 kuin se L9981 samalla efektori-kohde-suhde (

p

= 0,035) (taulukko 5).

NK-solun reseptorin mRNA ekspressoidaan ihonalaisesti kasvaimen hiiren

siirrettyjen kasvainten of kasvain ryhmä, NKG2D ekspressiotaso NK-solujen korkean etäpesäkkeitä ryhmässä oli merkitsevästi korkeampi kuin alhaisen etäpesäkkeiden ryhmä (

p

= 0,018), ja Ly49I ekspressiotaso NK-solujen korkean etäpesäkkeitä ryhmässä oli myös huomattavasti korkeampi kuin alhaisen etäpesäkkeiden ryhmä (

p

= 0,001). Kuitenkaan mitään merkittävää eroa, että NK1.1 ja NKG2A ekspressiotaso NK-solujen välillä oli korkea ja matala etäpesäkkeiden ryhmä (

p

0,05) (Kuva 8).

NKG2D ilmentymistaso NK-solujen korkean etäpesäkkeitä L9981 ryhmässä oli merkitsevästi korkeampi kuin alhaisen etäpesäkkeiden NL9980 ryhmä (

p

= 0,018), ja Ly49I ekspressiotaso NK solujen L9981 ryhmässä oli myös huomattavasti korkeampi kuin NL9980 ryhmä (

p

= 0,001). Ei ole merkittävää eroa, että NK1.1 ja NKG2A ekspressiotaso NK-solujen oli olemassa korkean ja matalan etäpesäkkeiden ryhmä.

Keskustelu

Tämä tutkimus osoitti, että NK-solujen infiltraatiota ja NK-solujen reseptorin ilmentymisen muutos NSCLC kasvain ympäristössä. Meidän tutkimus, huomasimme, että NK-solut soluttautuneet lähinnä kasvain strooman muodostavat kasvain mikro-ympäristössä. Nämä havainnot ovat yhtäpitäviä aikaisempien havaintojen osoittavat, että keuhkojen kasvain mikro-ympäristö [16]. Lisäksi saimme yllätys, että määrä NK-solun soluttautua keuhkosyövässä kudos liittyy läheisesti patologisen tyyppejä, koko ensisijainen syöpä, tupakointi historia ja ennusteen potilaiden keuhkosyöpä.

Edellinen kirjallisuus ymmärtää, että jotkut molekyylit ilmentävät kasvaimeen ja jotkut meediot vapautuu kasvain yleisesti johti kasvaimen purkumekanismeja alkaen NK-solujen immunologisen valvonnan [19], [20]. On korkea kuin klassisen MHC I molekyyli HLA – E ja HLA – G kasvainsolun pinnalla. He olivat NK-solujen aktivoitumisen CD94 /reseptorin NKG2A ja solun pinnan immunoglobuliinivalmisteet näyte transkriptio molekyyli- 2 (ILT2) estävä ligandi, joka voi hillitä NK soluvaurioita toiminto [21] – [23]. Samaan aikaan, kasvainsolut voivat erittää joitakin tuumorisuppressorigeenin tekijät inhibition NK-solun funktion, kuten IL-10 [24]: n ja TGF-β [25]. Ympäröivät kasvain soluttautuminen NK-solujen, joitakin erityisiä muutoksia joissakin muissa ihmisen kasvaimissa oli tutkittu. Munuaisten syöpä, NK-solu kasvain vain aktivoitiin IL-2 stimulaation voi olla kohdesoluun ratkaisun toimintaa. Ja samaan potilaille oli huomattavia eroja ääreisverenkierron NK-solun fenotyypin kanssa kasvaimen [26] – [28]. NK-solun pinnan reseptoriin DNAM-1, 2B4, CD16 ilmentyminen pienentää munasarjasyövän, mikä voi johtaa siihen, että NK-solujen aktivaation toiminto pahoin vaurioituneet [29].

tutkimustulos nopea, että aktivoidun reseptorin NK solut säätyy alas ja estävän reseptorin NK-solujen on säädellään ylöspäin istutetut kasvain ja kaukainen etäpesäkeleesioita ihmisen suurten keuhkosyövän solulinjat, jotka saattavat olla pääasiallinen syy johtaa NK-solujen tappaminen kyky pieneni.

NKG2D on reseptori MHC-luokan I ketjuun liittyvä A ja B molekyylejä, jotka usein ilmaistaan ​​epiteelin syövät. Ligaatio NKG2D indusoi anti-kasvaimen efektorifunktioita sekä NK ja T-soluja. NKG2D tunnustamista on tärkeä rooli tuumorin immuunipuolustus [30] ja että NKG2D ensisijaisesti toimii laukaista perforiini-välitteisen apoptoosin [31]. Tutkimuksemme todentaa, että NKG2D ilmentymistason NK pernasta korkean etäpesäkkeitä ryhmä oli huomattavasti alhaisempi kuin kontrolliryhmän (

p

= 0,034) ja alhaisen etäpesäkkeiden ryhmä (

p

= 0,040). Vuonna siirrettyjen kasvainten of kasvain ryhmä, NKG2D mRNA ekspressiotaso NK-solujen korkean etäpesäkkeitä ryhmässä oli merkitsevästi korkeampi kuin alhaisen etäpesäkkeiden ryhmä (

p

= 0,018).

NKG2A on inhiboiva NK-reseptorin, joka on raportoitu muodostavan disulfidisilloitetun heterodimeerejä invariant CD94. NKG2A ligandi on tunnistettu HLA-E, ei-klassiset MHC-luokan I b-molekyylin, joka on laajalti jakautunut eri kudoksiin, näyttelyissä suhteellisen pieni pinta ilmaisua, ja se on rajoitettu polymorfismi [32]. Inhibitorinen reseptori CD94 /NKG2A on tärkeä rooli NK-solujen lyysin aktivoitujen CD4

+ T-solujen [33]. NKG2A ilmentymistaso NK solun keuhkojen oli merkittävästi suurempi kuin perna korkean metastaattinen ryhmä (

p

= 0,007). NKG2A ilmentymistaso NK solujen keuhkojen korkean metastasoitunut ryhmä oli merkittävästi suurempi kuin matalan metastasoitunut ryhmä ja kontrolliryhmän (

p

= 0,000). Siten alas-säätely NKG2D ja säätely ylöspäin NKG2A voi ilmoittaa siedätyshoitoa mekanismi ja helpottaa etäpesäke kasvaimen ympäristössä.

vuorovaikutus MHC-luokan I kanssa Ly49 reseptoreihin estää NK-solujen aktivaation ja siten hajotus kohdesolussa. Siten NK-solujen hyödyntää Ly49 reseptorit erilaistua ”itse” alkaen ”puuttuva-itse”. Menetys MHC-luokan I molekyylit kohdesoluihin vapauttaa NK-solun ja Ly49 estoa, jolloin NK-solujen sytotoksisuuden välittäjinä [34]. Ly49I ekspressiotaso NK-solujen keuhkoista oli huomattavasti suurempi kuin pernasta kontrolliryhmässä (

p

= 0,033). Ly49I ilmentymistason NK solujen keuhkojen korkean metastasoitunut ryhmän ja alhaisen metastasoitunut ryhmässä oli merkittävästi suurempi kuin kontrolliryhmässä (

p

= 0,000). Transplantoidussa kasvaimia kasvain ryhmä, Ly49I mRNA: n ilmentymisen taso NK-solujen korkean etäpesäkkeiden ryhmässä oli myös merkittävästi korkeampi kuin alhaisen etäpesäkkeiden ryhmä (

p

= 0,001).

Lisäksi korkeampi resistenttejä sytotoksinen aktiivisuus NK-solun olemassa ihmisen korkea-metastasoitunut suuri keuhkosyöpä solulinja L9981, joka on paljon suurempi kuin low-metastasoitunut suuri keuhkosyöpä solulinja NL9980. Lisäksi on mahdollista, että muut reseptorit NK-solujen muuttunut kasvaimen ympäristössä. Melanooma, NK-soluja voidaan merkittävästi parantaa ilmentymistä CD86, ja ligaatio CD86 CTLA4Ig merkittävästi lisääntynyt kyky NK-solujen kasvainsolujen tuhoamiseen [35].