Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia esiintyy monenlaisia ​​fysiologisia ja patologisia tiloja, mukaan lukien kasvaimen kehittymisen. Kasvainsolujen on sopeuduttava hypoksia muuttamalla niiden geenien ilmentymistä ja proteiinisynteesiä. Täällä osoitti, että hypoksia estää käännös aktivaation kautta PERK ja inaktivaation mTOR ihmisen paksusuolen syövän HCT116-soluissa. Pitkäaikainen hapenpuute (1% O

2, 16 h) dramaattisesti estää yleinen käännös HCT116-soluissa, mutta valitut mRNA: t pysyvät tehokkaasti käännetty sellaisissa olosuhteissa. Käyttämällä microarray analyysi polysome- liittyvien mRNA: iden, tunnistimme useita hypoksian geenien translaatiotutkimukseen tasolla. Tehokkaasti käännetty mRNA: t aikana hypoksiaa todensi polysomiesitys profiloinnin ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR. Pathway rikastamiseen analyysi osoitti, että monet jopa geenien osallistuvat lysosomissa, glykaanitähteen ja rasva-aineenvaihduntaan, antigeenin esittelyn, soluadheesiota, ja remontin soluväliaineen ja solun tukiranka. Suurin osa alas geenien osallistuvat apoptoosiin, ubikitiinistä välittämä proteolyysiä, ja oksidatiivisen fosforylaation. Edelleen tutkimus osoitti, että hypoksia indusoi lysosomaalisen autophagy ja mitokondrioiden kautta translaation sääntelyä HCT116-soluissa. Runsaus useita translaatiotekijöiden ja mTOR-kinaasiaktiivisuuden osallistuvat hypoksian aiheuttaman mitokondrioiden autophagy sisään HCT116-soluissa. Meidän tutkimukset korostavat translationaalisen sääntelyn kasvainsolun sopeutumista hypoksia.

Citation: Lai MC, Chang CM, Sun HS (2016) Hypoksia indusoi Autophagy kautta Translational Up-asetus Lysosomaalinen proteiinit ihmisen koolonkarsinoomasoluissa . PLoS ONE 11 (4): e0153627. doi: 10,1371 /journal.pone.0153627

Editor: Vladimir Trajkovic, School of Medicine, University of Belgrad, Serbia

vastaanotettu: 02 marraskuu 2015; Hyväksytty: 02 huhtikuu 2016; Julkaistu: 14 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Lai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta Ministry of Science and Technology, Taiwan (NSC100-2320-B-006-021-MY3 on MCL ja NSC101- 2627-B-006-005 HSS) ja Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPD3E0012). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä ihmisillä. Joka vuosi yli miljoona potilasta on diagnosoitu CRC maailmassa. Ilmaantuvuus CRC on noussut tasaisesti viimeisten 20 vuoden aikana [1]. Tutkimukset CRC ovat antaneet arvokasta tietoa monivaiheinen geenitekniikan avulla syövän [2, 3]. Valtaosa CRC laukaisee mutaatiot adenomatoottisen polypoosin coli (

APC

) geeni [4], joka indusoi muodostumista varhaisen adenooma. Kehittäminen paksusuolen syöpä edistää lisäksi useita geneettisiä mutaatioita, mukaan lukien

KRAS

,

Smad4

, ja

TP53

, jotka mahdollistavat adenooma kasvua ja karsinooman etenemistä. Parempi käsitys molekyylitason mekanismeista CRC eteneminen voi helpottaa uusien syövän hoito. Kuluneen vuosikymmenen aikana useita uusia molekyylikohteista tutkitaan parhaillaan hoitoon CRC [5].

Koska nopeaan lisääntymiseen ja poikkeava angiogeneesi, kasvainten sisältävät alueita, joilla oli eriasteista hypoksian [6]. Kasvainsolujen on sopeuduttava hypoksinen stressiä muuttamalla niiden geenien ilmentymistä ja proteiinisynteesiä [7]. Näihin muutoksiin kuuluvat energia-aineenvaihduntaan, angiogeneesi, solumigraatio, kasvaimen invaasio ja metastaasi, solusyklin säätelyssä, tulehdusreaktio, ja pH: n [8-10]. Kasvain hypoksia ajatellaan olevan keskeisessä osassa kasvaimen etenemiseen ja maligniteetti. Läsnäolo hypoksisten solujen kiinteiden kasvainten liittyy huonoon ennusteeseen monissa syöpien [6]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että hypoksisia kasvainsoluja ovat vastustuskykyisiä sädehoidon [11, 12], ja monet yleisesti käytetyt kemoterapeuttiset aineet [13]. Siksi on syytä tutkia geenin ilmentymisen säätelyyn ihmisen syöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa.

Vastauksena hypoksia, soluihin nopeasti nostaa hypoksia-indusoituva tekijä 1 (HIF-1) [14, 15], heterodimeerin, joka koostuu happea herkkä HIF-1α-alayksikön ja konstitutiivisesti HIF-1β alayksikköön. HIF-1 säätelee hapen homeostaasin aikana hypoksia mukaan kopiointia kohdentamalla yli 100 geenit, jotka sisältävät hypoksian reagoivat elementit (hRes) niiden promoottorit [16, 17]. Lisäksi transkriptio, translaatio pidetään tärkeä tekijä hypoksian säännellään geeniekspression [18, 19]. Metabolinen merkintöjä tutkimukset osoittivat, että hypoksia estää maailmanlaajuinen käännös monissa eri solulinjoissa [20-23]. Yleinen käännös merkittävästi estyy hapenpuutekriisistä ( 0,02% O

2) tai pitkäaikainen hypoksia (≦ 2% O

2, 16 h) [21, 22, 24-26]. On raportoitu, että nisäkkäiden rapamysiinin kohde (mTOR) ja Endoplasmakalvosto asukas kinaasi (PERK) avainrooleja translaation asetuksessa aikana hypoksiaa [26-28]. Hypoksia estää kinaasiaktiivisuutta mTOR ja johtaa defosforylaatiota translaation aloitus- tekijä 4E-sitovat proteiinit (4E-BP:). Defosforylaatio 4E-BP lisää heidän sitoutumisaffiniteettia käännöksen aloittamista tekijä EIF4E ja siten estää cap-riippuvaisten käännös häiritsemällä yhteenliittymän EIF4E kanssa eIF4G. Toisaalta, hypoksia indusoi laskostumattoman proteiinin vaste (UPR), jota esiintyy seurauksena solulimakalvoston (ER) stressi, ja johtaa aktivoitumiseen PERK [21, 24, 27]. Aktivoitu PERK fosforyloi eukaryoottisia translaation aloituksen tekijä 2 alayksikön α (eIF2α) ja estää näin translaation aloituksen estämällä muodostumista eIF2-GTP-tRNA (i) Met kolmen komponentin kompleksin [29].

Vaikka yleinen käännös on suurelta osin esti aikana hypoksia, valitut mRNA: t pysyvät tehokkaasti käännetty sellaisissa olosuhteissa. Kääntäminen hypoksia-reagoivien geenien edellyttää vaihtoehtoisia menetelmiä, kuten sisäiset ribosomien (IRES) [30, 31] ja ylävirtaan avoin lukukehys (uORF) [32]. IRES on monimutkainen RNA rakenteellinen elementti, joka aloittaa käännöksen suoraan rekrytoimalla ribosomien löytää aloituskodonin päälle mRNA. Uskotaan, että hypoksia tukahduttaa cap-riippuvaisten mutta ei IRES-välitteisen translaation aloituksen [29]. Hypoksia-reagoiva geenien HIF-1α ja VEGFA on osoitettu säilyttää kääntämisen kautta IRES aikana hypoksia [33, 34]. Kuitenkin mekanismi translaation asetuksen aikana hypoksia ei vielä täysin ymmärretä, ja se voi vaihdella solutyypeistä ja hypoksinen olosuhteet.

Autophagy on solu biologinen prosessi, joka heikentää tarpeettomia tai huonosti proteiineja ja soluelimiin säilyttää ravinteiden ja energian homeostaasin aikana stressiolosuhteissa [35]. On raportoitu, että hypoksia indusoi autophagy on HIF-1-riippuvaisella tavalla [36, 37]. Kuitenkin translaation sääntely on myös tärkeä rooli hypoksian aiheuttaman autophagy. Tässä tutkimuksessa käytimme polysomiesitys profilointiin kytketty koko ihmisen genomin ilmaisun array tunnistaa kandidaattigeenit joiden käännöstä säätelevät hypoksia ihmisen paksusuolen syövän HCT116-soluissa. Toiminnallinen merkinnästä kandidaattigeenejä osoittaa, että hypoksia säätelee kääntäminen paljon liittyvien geenien lysosomissa ja eri metaboliareitteihin. Tulosten mukaan hypoksia indusoi autophagy läpi translaation säätely ylöspäin lysosomaalisten proteiinien HCT116-soluissa. Meidän tutkimukset korostavat translationaalisen sääntelyn kasvainsolun sopeutumista hypoksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hypoksinen hoito

HCT116-solut (ATCC

® CCL247

™) kasvatettiin MEM-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa. For hypoksinen (1% O

2) Altistuksen jälkeen solut siirrettiin suunniteltu hypoksian kammio (NexBiOxy Inc., Hsinchu, Taiwan), joka huuhdottiin 95% N

2 ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

plasmidit ja transfektio

ilmentävien plasmidien FLAG-merkittyä villityypin mTOR tai konstitutiivisesti aktiivisia mutantteja (L1460P E2419K) ostettiin Addgene (Cambridge, MA). Cell transfektio suoritettiin käyttämällä transfektioreagenssia Lipofectamine

® 2000 (Thermo Fisher Scientific), pääasiallisesti mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

RNAi-välitteinen pudotus

Kaikki tarvittavien plasmidien RNAi -välitteisen knockdown toimitti National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan). Kaksi pLKO.1-shRNA vektoreita käytetään pudotus PSAP ja LAMP2 olivat seuraavat: TRCN0000217974 (shPSAP), ja TRCN0000029263 (shLAMP2). Transfektioreagenssi Lipofectamine

® 2000 (Thermo Fisher Scientific) käytettiin siirtämään plasmidi DNA HCT116-soluissa. Solut kerättiin 3 päivää transfektion jälkeen analyysiä varten.

Sakkaroosi kaltevuus sedimentaation ja polysomi profilointi

Solut kerättiin kylmässä PBS: ssä, joka sisälsi 100 ug /ml sykloheksimidiä. Kaikki seuraavat vaiheet suoritettiin 4 ° C: ssa. Solupelletit suspendoitiin uudelleen RSB-150 (10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 3 mM MgCI

2, ja 150 mM NaCl), joka sisälsi 100 ug /ml sykloheksimidiä, 40 ug /ml digitoniinia (Calbiochem), 20 U /ml RNasinia (Promega), ja 1X proteaasiestäjäseostabletit (Thermo Fisher Scientific). Kun oli inkuboitu jäillä 5 minuutin ajan, solut hajotettiin viemällä 26 neulan viisi kertaa. Sytoplasminen Uutteet otettiin talteen sentrifugoimalla 3000 x g: ssä 2 minuutin ajan, ja kirkastettiin edelleen sentrifugoimalla 11000 x g: ssä 15 minuutin ajan. Näytteet ladattiin lineaarinen 15-40% sakkaroosigradientissa ja sentrifugoitiin 38000 rpm: ssa 3 tunnin ajan Beckman SW41 roottoria. Sentrifugoinnin jälkeen kokonais-RNA uutettiin kustakin fraktiosta käyttämällä fenoli /kloroformi-uutto, kun läsnä on 1% SDS: ää ja 0,25 M NaCl: a, jota seurasi etanolisaostus. Sillä polysomiesitys profiilin analyysiä, gradienttien seurattiin 254 nm: ssä käyttäen ISCO fraktiointia järjestelmä (Lincoln, NE).

Immunoblottausmääritys

Proteiinit siirrettiin PVDF Transfer Membrane (PerkinElmer). Proteiini blotit blokattiin 3% kuorittua maitoa TBST-puskurissa (100 mM Tris-HCI (pH 7,6), 150 mM NaCl ja 0,05% Tween 20) RT: ssä 1 h. Primaaristen vasta-aineiden mukana kanin anti-fosfo-eIF2α (Ser51) (1: 1000 laimennos, Cell Signaling), hiiren anti-eIF2α (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46 ) (1: 1000 laimennos, Cell Signaling), hiiren anti-4E-BP1 (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), hiiren anti-β-aktiini (1: 2500 laimennos, Sigma-Aldrich), hiiren anti-HIF- 1α (0,2 ug /ml; BD Transduction Laboratories), vuohen anti-Glut1 (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-VEGF (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-LC3B (1: 1000 laimennus, Cell Signaling), kanin anti-p62 (1: 2000 laimennos, MBL), kanin anti-α-tubuliinin (1: 2000 laimennus, Cell Signaling), kanin anti-GNS (1: 200 laimennos, GeneTex), kanin anti- -PSAP (1: 1000 laimennos, GeneTex), hiiren anti-TPP1 (1 ug /ml; Abcam), hiiren anti-ATPB (0,5 ug /ml; Abcam), kanin anti-LAMP2 (1: 1000 laimennos, GeneTex), kaniini-anti-EIF4E (1 ug /ml; Abcam), ja kanin anti-eIF4A1 (1 ug /ml; Abcam). Blotteja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla estopuskurissa huoneenlämpötilassa 2 h, jonka jälkeen inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita, huoneenlämpötilassa 2 tuntia. Detection suoritettiin käyttäen Immobilon Western Kemiluminesenssiin HRP Substrate (Millipore) X-ray elokuva altistumista.

mikrosiruanalyysi

mikrosiruanalyysi, eristetty RNA puhdistettu kanssa RNeasy Mini Kit (Qiagen) . Noin 6 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen oligo-d (T) aluke, joka sisältää T7-RNA-polymeraasin promoottorin sekvenssin 3′-päässä. Biotiini-leimattu komplementaarinen RNA (cRNA) valmistettiin

in vitro

transkription, jota seuraa metalli- aiheuttama hydrolyysi 94 ° C: ssa. Myöhemmin hajanainen cRNA hybridisoitiin päälle Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 45 ° C: ssa 16 tuntia. Myöhemmät pesu ja värjäys suoritettiin fluidivoimaan Station-450 ja GeneChips skannataan Affymetrix GeneChip- Scanner 7G. Raaka microarray data analysoitiin edelleen käyttämällä GeneSpring GX 10 ohjelmisto (Silicon Genetics).

RT-PCR ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

RT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan mRNA: n ilmentymisen tasoa. Uutettu RNA käänteistranskriptoituneet cDNA käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Saatu cDNA tehtiin tavanomaisella PCR: llä tai kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysillä. Tavanomaisia ​​PCR suoritettiin käyttämällä GoTaq DNA-polymeraasia (Promega), ja eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita: p-aktiinin (forward-aluketta (FP): 5’CATCCACGAAACTACCTTCAACT3 ’ja reverse-aluke (RP): 5’TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG3’), HIF-1α (FP : 5’TGGACTCTGATC ATCTGACC3 ’ja RP: 5’CTCAAGTTGCTGGTCATCAG3’), ja VEGFA (FP: 5’CCTGGT GGACATCTTCCAGGAGTACC3 ’ja RP: 5’GAAGCTCATCTCTCCTATGTGCT GGC3 ”) [38].

Quantitative real-time PCR oli suoritettiin käyttäen StepOnePlus

™ Real-Time PCR Systems mukaan toimittajien suositusten (Thermo Fisher Scientific). Käytetyt alukkeet kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä on lueteltu S1 taulukossa. Tasot mRNA havaittiin Fast SYBR

® Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Kvantitatiivinen analyysi suoritettiin mittaus CT-arvoja eksponentiaalisen vaiheen vahvistusta. Suhteellinen kvantitointi arvot laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmä [39].

Pathway rikastamiseen analyysi

toiminnallinen merkinnästä hypoksian geenien suoritettiin käyttäen julkisesti saatavilla DAVID Bioinformatics Resources Version 6.7 -ohjelmistoa (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) reitin tietokannasta. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin modifioidun Fisherin testiä. P-arvo = 0 edustaa täydellistä rikastamiseen. P-arvo 0,05 on suunnitellusti voimakkaasti rikastunut merkinnän luokkiin.

Virtaussytometrianalyysi

Soluviljelmät ratkaisevan värjättiin akridiinioranssilla (AO, Sigma-Aldrich) pitoisuudella 5 ug /ml 15 minuuttia ja sitten pestiin PBS: llä. AO on fluoresoiva kationinen väriaine, jota voidaan käyttää mittaamaan tasoa happamien vesicular soluelimiin (lysosomeihin) solujen sisällä. Tasot happamia vesicular soluelimiin analysoitiin käyttäen FACSCalibur (BD Biosciences), jossa eksitaatio asetettu 488 nm, ja emissio loisteputki AO havaittiin FL-3 kanava (670 nm).

mitokondrion kalvon potentiaali oli määritetään tetrametyylirodamiini metyyliesteri (TMRM). Soluviljelmiä erittäin värjättiin 0,5 uM TMRM 30 min 37 ° C: ssa ja sitten pestiin PBS: llä. Fluoresenssin voimakkuus TMRM analysoitiin käyttäen virtaussytometrialla FL-2-kanavan (564 ~ 606 nm). Näytteet analysoitiin käyttäen CellQuest- Pro 4.0.2 ohjelmisto (BD Biosciences) ja kvantifiointi suoritettiin käyttämällä WinMDI 2,9 ohjelmistoa (Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA).

LysoTracker värjäystä

LysoTracker Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific) käytetään tutkimaan biosynteesiä ja kertymistä lysosomeihin mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, HCT116-soluja kasvatettiin peitelaseihin leimattiin LysoTracker Red DND-99 (1: 5000 laimennos) 1 h kasvuolosuhteissa. Leimauksen jälkeen solut pestiin kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 3% formaldehydiä PBS: ssä 30 minuutin ajan. Perusteellisen pesemisen jälkeen PBS: llä, näytteet asetettiin välittömästi ja havaittiin käyttämällä käännettyä fluoresenssimikroskooppia (Zeiss Axio Observer A1, Saksa) on varustettu CCD-kameralla.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvo ± keskivirhe ja analysoitiin käyttäen GraphPad Prism 4.0 ohjelmisto (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen paritonta t-testiä. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Yleistä käännös on altis hypoksia HCT116-soluissa

On raportoitu, että yleinen käännös estyy hypoksia erilaisissa solutyypeissä, mutta hypoksia-reagoiva geenit voivat paeta translaation tukahduttamisen aikana hypoksia [32-34, 40]. Täällä suoritimme polysomiesitys profiloinnin ja RT-PCR havaitsemaan polysomal jakeluun spesifiset mRNA. MRNA /ribosomi-kompleksit erotettiin 11 jakeet käyttäen lineaarista 15-40% sakkaroosia gradienttisentrifugoinnilla (kuvio 1A). Jakauma mRNA sisällä polysomal jakeet kuvastaa sen translaation tehokkuutta. Ensinnäkin, käytimme eri peräsuolen syövän solulinjat tutkia vaikutukset hypoksia käännös- ja havaittu, että pitkäaikainen hypoksia (1% O

2, ≧ 16 h) aiheutti dramaattisen eston yleisen kääntämisen HCT116-soluissa (S1 kuvio). Translaation tehokkuutta taloudenhoito geeni β-aktiini muuttuu ~ 60%: sta noin 30% sisällä 16 tunnin altistumisen hypoksian (kuvio 1 B). Koska PERK ja mTOR-kinaasien on ehdotettu tärkeitä tekijöitä translaation asetuksessa aikana hypoksiaa [27], siksi analysoi fosforylaatiota asemaa niiden loppupään substraattien, eIF2α ja 4E-BP1, in HCT116-soluissa hypoksiaolosuhteissa. Immunoblot-analyysi osoitti, että pitkäaikainen hypoksia johtaa lievään nousuun eIF2α fosforylaation (kuvio 1 C), ja 4E-BP1 vähitellen defosforyloitiin kuluessa 16 tunnin altistumisen hypoksia HCT116-soluissa. Tämä osoittaa, että hypoksia estää yleinen käännös ainakin osittain aktivoimalla PERK ja inaktivaation mTOR in HCT116-soluissa.

. Sytoplasmisen uutteet ladattiin lineaarinen 15-40% sakkaroosigradienttisedimentaatiolla ultrasentrifugointi. Sentrifugoinnin jälkeen polysomikirjaston profiili piirrettiin A

254 arvoja (ylempi) ja RNA uutettiin kunkin fraktion analyysiä varten. Puhdistettu RNA erotettiin 1% formaldehydi /agaroosigeelille, ja rRNA visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä (alempi). Jakauma ribosomien alayksiköiden ja polysomeihin on merkitty. B. HCT116-soluja käsiteltiin hypoksian (1% O

2) 0, 4, 8, 16, ja 24 h. Polysomal jakelu β-aktiini-mRNA: n havaittiin polysomi profiloinnin ja RT-PCR: llä. Translaation tehokkuutta β-aktiini-mRNA: n laskettiin ja ilmoitetaan prosentteina eri ajankohtina. C. fosforylaatio tila eIF2α ja 4E-BP1 määritettiin immunoblot-analyysi HCT116 altistuneiden solujen hypoksia annetun ajanjakson ajan. Tasot fosforyloitua (PI) ja koko proteiinit havaittiin erityisiä vasta-aineita fosfo-eIF2α (Ser51), eIF2α, fosfori-4E-BP1 (Thr37 /46), ja 4E-BP1. Detection of β-aktiini-proteiinin toimi latauskontrollina. D. immunoblot-analyysi HIF-1α, GLUT1, VEGFA, ja β-aktiini-proteiinien HCT116 altistuneiden solujen hypoksia 16 tuntia. Detection of β-aktiini-proteiinin toimi latauskontrollina. E. HCT116-soluja kasvatettiin normoksia (21% O

2) tai hypoksian (1% O

2) 16 tuntia. Solut kerättiin ja lysoitiin RSB-150-puskuria. Sytoplasminen uutteet ladattiin lineaarinen 15-40% sakkaroosigradientissa ultrasentrifugoinnin ja kerätään 11 ​​fraktioita (1 ml /jae). RNA eristettiin kustakin fraktiosta havaittiin RT-PCR: llä ja alistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Polysomal Gradientin sisältää jakeet 7-11. Translaation tehokkuutta β-aktiini, HIF-1α, ja VEGFA mRNA: t laskettiin ja ilmoitetaan prosentteina. 28S ja 18S rRNA: ita suoraan näkyviksi etidiumbromidivärjäyksellä. Jakauma ribosomien alayksiköiden ja polysomeihin osoitetaan.

tutkia muutoksia kääntämisen aikana hypoksia, HCT116-soluja kasvatettiin normoxic (21% O

2) ja hypoksinen (1% O

2) viljelyolosuhteet 16 tuntia. Kuten odotettua, hypoksia stabiloi HIF-1α-proteiinin ja indusoi ilmentymistä HIF-1 kohdegeenien GLUT1 ja VEGFA in HCT116-soluissa (kuvio 1 D). Olemme myös suorittaa polysomiesitys profilointia ja RT-PCR arvioida translaation tehokkuutta valittujen mRNA: iden. Denaturoivalla agaroosigeelielektroforeesilla rRNA osoitti siirtymistä saadun mRNA polysomeista osaksi translaation aloitus- komplekseja (kuvio 1E, alempi paneeli). Kerääntyminen 18S ja 28S rRNA matalan molekyylipainon ribosomaalisen (fraktiot 5-6; hypoksia) osoitti translaation tukahduttamisen aikana hypoksiaa. Polysomal jakautuminen β-aktiini-mRNA ilmeisesti väheni hypoksisiin HCT116-soluissa verrattuna normoxic ohjaus (kuvio 1 E, yläpaneeli). Suuri osa β-aktiini-mRNA (68,7%) liittyi polysomeilla in normoxic HCT116-soluissa, kun taas vain 32,0% ja β-aktiini-mRNA pysyi liittyy polysomeilla vuonna hypoksinen HCT116-soluissa. Sen sijaan polysomal jakelu HIF-1α ja VEGFA mRNA: t ovat suhteellisen ei vaikuta hypoksian (kuvio 1E, keskimmäinen paneeli). Yli puolet HIF-1α (58,1%) ja VEGFA (53,8%) mRNA: t jäi liittyv polysomeilla kuluttua 16 h altistumisen hypoksia. Yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, [33, 34], HIF-1α ja VEGFA mRNA: t on kyky paeta translaation sorron aikana hypoksiaa. Siksi oletetaan, että valitut mRNA: t pysyvät tehokkaasti käännetty HCT116-soluissa hypoksisissa olosuhteissa.

Translational sääntely valittujen mRNA HCT116-soluissa aikana hypoksiaa

tutkimiseksi vaikutusta hypoksia kääntämisen, me hyödynnetty polysomiesitys profilointi kytketty cDNA mikrosiruanalyysi seulontaan hypoksian geenien. Sekä polysomiesitys liittyvä mRNA: t ja yhteensä RNA normoxic ja hypoksinen HCT116-solut eristettiin ja altistettiin mikrosirujen hybridisaatio. Polysomi liittyvät mRNA: t eristettiin altaan polysomal fraktiot (kuvio 1A, fraktiot 8-11) analysointia varten translatome. Kokonais-RNA uutettiin samasta näytteiden analysointiin transcriptome. Translationaalinen muutos mRNA mitattiin muutos runsaasti polysomal RNA normalisoitu muutoksen runsaasti kokonais-RNA kunkin mRNA: ta (kuvio 2, polysomal /yhteensä). Geenit muutoksiin polt- taa 2-kertaiseksi altistumisen jälkeen hypoksia pidettiin hypoksia-säänneltyjen kandidaattigeenejä. Kaikki kandidaattigeenit jaettiin neljään ryhmään: säädelty ja alas geenien joko translaation tai transkription tasolla (kuvio 2). Tämän seurauksena 1036 asti geenien ja 480 alas geenien tunnistettiin translatome analyysi. Rinnakkainen transcriptome analyysi tunnistettu 144 up-geenien ja 134 alas geenien. Kuitenkin vain ~ 32% hypoksian geenien transkriptiotasolla näytteille merkkejä translationaalisen myötäsääntelyä in HCT116-soluissa aikana hypoksian (kuvio 2, Venn kaaviot). Tämä osoittaa, että hypoksia saattaa vaikuttaa eri osa kohdegeenien välisen translatome ja transcriptome.

tulokset mikrosiruanalyysi analysoitiin GeneSpring GX 10 ohjelmisto. Geenejä ≧ 2-kertainen muutos polysomal /kokonais-RNA-suhde tai kokonais-RNA määriteltiin hypoksian geenien. Tulokset saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Hypoksia geenien jaettiin neljään ryhmään: säädelty ja alas geenien translaatiotutkimukseen (translatome) ja transkription (transcriptome) tasot, tässä järjestyksessä. Venn kaavio kertoo päällekkäisyyden hypoksian geenien välillä translatome ja transcriptome. Numerot päällekkäisillä alueet osoittavat hypoksian geenien sekä translaation ja transkription tasot HCT116-soluissa.

validointi kandidaattigeenejä joiden käännös on säädelty hypoksia vuonna HCT116-soluissa

Voit tarkistaa microarray data, useita kandidaattigeenit analysoitiin polysomiesitys profiloinnin ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR. Polysomal yhdistys β-aktiini-mRNA ilmeisesti väheni HCT116 altistuneiden solujen hypoksia (kuvio 3A). Sen sijaan, polysomikirjaston liittyvä mRNA: t sekä translaation ja transkriptionaalisesti up-geenien

GLUT1

,

ADM

, ja

VEGFA

nostettiin HCT116-soluissa aikana hypoksia verrattuna ja normoksia (kuvio 3B), mikä osoittaa, että kolmen geenin edelleen tehokkaasti käännetty hypoksiassa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin translaation mutta ei transkriptionaalisesti up-geenien

HSPA5

,

VCAN

, ja

GPR126

(kuvio 3C). Laskennan jälkeen nämä translaation up geenien kasvoi translaatiotutkimuksessa tehokkuus aikana hypoksiaa verrattuna normoksia (kuvio 3D). Validoinnin tulokset kokeista ovat pääosin yhdenmukaisia ​​microarray mittauksiin. Tämä osoittaa, että monet geenit voivat paeta translaation tukahduttamisesta ja pysyvät tehokkaasti käännetty HCT116-soluissa aikana hypoksiaa.

Useat up geenien translaatiotutkimukseen tasolla (translatome) in hypoksinen HCT116-soluja validoitu. RNA eristettiin sakkaroosigradientissa fraktiointi analysoitiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä. Jakauma mRNA kussakin fraktiossa laskettiin ja ilmoitetaan prosentteina (%). A. Polysomal profiilia β-aktiini toimi negatiivisena kontrollina. B. Polysomal profiilit jopa geenien sekä translaation ja transkription tasolla (

GLUT1

,

ADM

, ja

VEGFA

). C. Polysomal profiilit jopa geenien translaatiotutkimukseen muttei transkription tasolla (

HSPA5

,

VCAN

, ja

GPR126

). D. Translationaalinen tehokkuutta β-aktiini, GLUT1 ADM, VEGFA, HSPA5, VCAN, ja GPR126-mRNA: laskettiin ja ilmoitetaan prosentteina (%) vuonna HCT116 soluja normoksia ja hypoksiaa. Pylväsdiagrammit osoittavat keskiarvo ± keskivirhe ainakin kolmesta itsenäisestä kokeesta (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

Pathway rikastamiseen analyysi hypoksia -regulated geenien translaation tasolla

jotta saadaan käsitys biologisten toimintojen hypoksian geenien, polku rikastus analyysi suoritettiin käyttäen DAVID bioinformatiikan Resurssit 6.7 ohjelmisto kartoittaa geenien biologinen reittien määrittelemän Kegg reitin tietokanta. Tulokset osoittivat, että hypoksia johtaa translaatio- ylössäätöä geenien, jotka toimivat lysosomissa, glykaanitähteen ja rasva-aineenvaihduntaan, antigeenin käsittely ja esittely, soluadheesiota, ja remontin soluväliaineen (ECM) ja solun tukirangan (taulukko 1). Sen sijaan, hypoksia alas-säätelee geenien translaation mukana apoptoosin, ubikitiini-välitteisen proteolyysiä, ja oksidatiivinen fosforylaatio (taulukko 2). Merkittävä tehtävä lysosomeihin on ruoansulatuskanavan autophagy eukaryoottisoluissa. Siksi oletetaan, että hypoksia indusoi lysosomaalisen autophagy ja aineenvaihdunnan uudelleenjärjestely turvata energian homeostaasiin kautta translaation mekanismi.

Hypoksia indusoi lysosomaalisen autophagy ja mitokondrioiden kautta translaation sääntely HCT116-soluissa

Olemme tunnistaneet 35 luennan up geenien, jotka toimivat siinä lysosomireitin vuonna HCT116 altistuneiden solujen hypoksia (taulukko 1). Mielenkiintoista, kaikki 35 lysosomaalisen geenejä säädellään ylöspäin aikana hypoksiaa translaatiotutkimukseen tasolla itsenäisesti transkription (taulukko 3). Tämä osoittaa, että translaation sääntely voi olla ratkaiseva rooli hypoksian aiheuttaman autophagy. Lysosomeihin voidaan mitata virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen solut akridiinioranssilla (AO), joka on lysosomotropic heikko emäs, joka kerääntyy happamalla vesicular soluelimiin eläviä soluja. Fluoresenssin voimakkuus AO oli merkittävästi lisääntynyt HCT116-soluissa sen jälkeen, kun altistus hypoksialle 24 h (kuvio 4A), mikä viittaa siihen, että hypoksia johtaa kasvuun sisällön lysosomeihin. Seuraavaksi me käytetään LysoTracker Red DND-99, fluoresoivaa acidotropic väriaine merkintöjä ja seuranta hapan soluelimiin elävissä soluissa, tahra lysosomeihin. Lysosomeihin värjättiin kirkkaan punainen HCT116-soluissa, ja hypoksia aiheuttaa laajentuneen lysosomeihin verrattuna normoksia (kuva 4B). Tulokset osoittavat, että hypoksia koko kasvaa lysosomaalisen tilavuus. Olemme edelleen tutki induktion autophagy tarkkailemalla autophagy markkeriproteiinina kevytketjun 3 (LC3) in HCT116-soluissa hypoksiaolosuhteissa verrattuna normoksia. Muuntaminen LC3-I LC3-II ja hajoamista koko LC3 (LC3-I plus LC3-II) käytettiin määrittämään muutosten laajuus autophagy [41]. Immunoblot-analyysi osoitti, että LC3-I LC3-II konversio (LC3-II /LC3-I-suhde), lisättiin, ja kokonaismäärä LC3 on vähentynyt HCT116 altistuneiden solujen hypoksia 24 h ja 48 h (kuvio 4C, vasen paneeli ), mikä viittaa siihen, hypoksian indusoiman autophagy. Olemme myös havainneet autophagy markkeriproteiinina p62, joka hajoaa aikana autophagy [41]. Johdonmukaisesti, määrä p62 osoitti myös vähentyneen merkittävästi hypoksinen HCT116-soluissa (kuvio 4C, oikea paneeli). Voit tarkistaa hypoksian aiheuttaman translaation säätely ylöspäin lysosomaalisen proteiinien (taulukko 3), havaitsimme sekä proteiini- ja mRNA tasot lysosomaalisen geenien glukosamiinin (N-asetyyli) -6-sulfataasi (

GNS

), prosaposin (

PSAP

), ja tripeptidyylipeptidaasi 1 (

TPP1

). Altistuksen jälkeen hypoksia 24 tuntia, taso GNS ja PSAP proteiinien kasvoi ~ 2-kertainen verrattuna normoksia (kuvio 5A). Taso TPP1 proteiinin myös hieman lisääntynyt aikana hypoksiaa. Kvantitatiivinen määritys osoitti, että mRNA tasot GNS, PSAP, ja TPP1 eivät vaikuta merkittävästi hypoksian (kuvio 5A). Tulokset osoittavat, että hypoksia rikastaa lysosomaaliset proteiinit läpi translaation mekanismien.

. HCT116-soluja kasvatettiin normoksia (21% O

2) tai hypoksian (1% O

2) 24 tuntia. Solut värjättiin akridiinioranssilla (AO), ja analysoitiin virtaussytometrialla mittaamiseksi sisällön lysosomeihin. Pylväsdiagrammit näyttää fluoresenssin voimakkuuden keskiarvolla AO vähintään kolmen erillisen kokeen (** p 0,01). B. HCT116-soluja kasvatettiin normoksia (21% O

2) tai hypoksian (1% O

2) 24 tuntia. Lysosomeihin leimattiin LysoTracker Red DND-99 1 h elävien solujen ja noudatettava käännetyn fluoresenssimikroskoopilla. C. HCT116-soluja altistettiin hypoksialle (H) tai normoksia (N) 24 tunnin ja 48 tunnin. Yhteensä solu-uutteita analysoitiin immunoblottaus LC3 ja β-aktiini vasta-aineita (vasen paneeli). LC3-I ja LC3-II kvantitoitiin ja autophagy mitattiin vaihtelut suhde LC3-II /LC3-I ja kokonaismäärä LC3 (LC3-I plus LC3-II) normalisoidaan p-aktiini varten jokaisen kunnossa. Pylväsdiagrammit näyttää suhteelliset LC3 proteiinin taso normalisoidaan P-aktiini ainakin kolmesta itsenäisestä kokeesta (** p 0,01). Yllä Näytteet analysoitiin myös immunoblottauksella p62 ja α-tubuliinin vasta-aineita (oikea paneeli).