PLoS ONE: diosgenin, steroidista saponiini, Estää Migration ja Invasion of Human Eturauhassyöpä PC-3 solujen vähentämällä matriisimetalloproteinaasientsyymien Expression

tiivistelmä

Background

diosgenin, steroidista saponiini saatu sarviapilalla (

Trigonella foenum graecum

), havaittiin käyttää anti-syöpää aiheuttavia ominaisuuksia, kuten proliferaation estossa ja apoptoosin indusoimiseksi erilaisissa kasvainsoluissa. Kuitenkin vaikutus diosgenin syövän etäpesäkkeitä jää epäselväksi. Tavoitteena on tutkia vaikutusta diosgenin siirtolaisuudesta ja invaasio ihmisen eturauhassyövän PC-3-solut.

menetelmät ja tärkeimmät havainnot

diosgenin esti leviämisen PC-3 solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Kun käsitelty myrkytön annokset diosgenin, solumigraation ja invaasiota olivat merkittävästi tukahdutti in vitro haavan paranemista määritys ja Boyden kammion invaasiomääritys, vastaavasti. Lisäksi diosgenin vähentää toimintaa matriisin metalloproteinaasi-2: n (MMP-2) ja MMP-9 gelatiinitsymografialla määrityksessä. MRNA taso MMP-2, -9, -7 ja solun indusoija matriksimetalloproteinaasi (EMMPRIN) on myös tukahdutettiin, kun taas kudoksen estäjä metalloproteinaasi-2 (TIMP-2) lisättiin diosgenin. Lisäksi, diosgenin poistettiin ilmentyminen verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) PC-3-soluja, ja putken muodostumisen endoteelisoluissa. Meidän immunoblottauksella analyysit osoittivat, että diosgenin voimakkaasti tukahdutti fosforylaation phosphatidylinositide-3-kinaasi (PI3K), Akt, solunulkoisen signaalin säätämiseen kinaasin (ERK) ja c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK). Lisäksi diosgenin vähensi ydin- taso tumatekijä kappa B (NF

κ

B), mikä viittaa siihen, että diosgenin esti NF-KB: n aktiivisuutta.

Päätelmä /merkitys

tulokset viittasivat siihen diosgenin esti muuttoliike ja hyökkäys PC-3-solujen vähentämällä MMP ilme. Se esti myös ERK, JNK ja PI3K /Akt signalointipolkujen sekä NF

κ

B toimintaa. Nämä havainnot paljastavat uusia terapeuttisia mahdollisuuksia diosgenin in antimetastaattisia terapia.

Citation: Chen PS, Shih YW, Huang HC, Cheng HW (2011) diosgenin, steroidista saponiini, Estää Migration ja Invasion of Human Eturauhassyöpä PC-3 solujen vähentämällä matriisimetalloproteinaasientsyymien Expression. PLoS ONE 6 (5): e20164. doi: 10,1371 /journal.pone.0020164

Editor: Robert E. Means, Yale Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 helmikuu 2011; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 23, 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

diosgenin on luonnossa esiintyvä steroideihin saponiinia läsnä erilaisia ​​kasveja kuten fenugreek (

Trigonella foenum graecum

) ja juuret luonnonvaraisten yam (

Dioscorea villosa

) [1]. Diosgenin on käytetty perinteisessä lääketieteessä kuin antihypercholesterolemia, antihypertriacylglycerolemia, diabeteslääkkeiden ja antihyperglycemia agentti [1], [2], [3], [4]. Useat raportit ovat osoittaneet, että diosgenin estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia laajassa valikoimassa kasvainsolujen ihmisen koolonin [5], osteosarkooma [6], leukemia [7], erytro- [8], rintojen [9], ja maksan [10] . Syövän vastaisen vaikutuksen diosgenin on osoitettu läpi solusyklin pysähtymiseen [7], [11], aktivointi p53 ja kaspaasi-3 [5], [7], [8], [12]. Lisäksi diosgenin estää NF-KB: n aktiivisuutta ja NF-KB-säänneltyjen geenien ilmentyminen ja myöhemmin vähentää leviämisen, invaasio ja osteoklastigeneesin [6], [13]. Diosgenin myös poistetaan COX-2 [11] ja lipoksigenaasin [14], jotka ovat sekaantuneet syövän synnyn ja tärkeitä kohteita syövän kemopreventiossa ja hoito. Siksi diosgenin saattaa olla syövän kemoterapia-potentiaali ja sen toimintaan liittyy useita solu- ja molekyylitason tavoitteita.

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu kasvaimia miehillä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus Yhdysvalloissa [ ,,,0],15]. Vaikka eturauhassyöpä alkuvaiheessa voidaan hoitaa leikkaus ja androgeenipuutteen terapiassa se lopulta edetä enemmän pahanlaatuisia, etäpesäke, ja hormoniresistentti eturauhassyöpä (HRPC), joille ei ole olemassa parantavaa hoitoa [16], [17] . Näin ollen, innovatiivisten hoitojen eturauhassyövän tarvitaan. Koska pitkälle edenneen eturauhassyövän solu erittäin invasiivisia potentiaalia johtaa korkea sairastuvuus ja kuolleisuus, eston ja metastaasit voisi olla hyvä lähestymistapa hoitoon HRPC.

Syöpä etäpesäke on erittäin koordinoitua vaiheittain prosessi, joka sisältää irtoaminen solujen primaarikasvaimen, paikallinen proteolyysi soluväliaineen (ECM), tunkeutumista tyvikalvon läpi hiussuonten ja imusuonten, intravasation, ja sitten invaasio uuteen kudokseen ja kasvua [18], [19]. Prosessi etäpesäke edistetään ilmaisemalla ja erittämällä erilaisia ​​proteolyyttisiä entsyymejä, jotka voivat huonontaa useimmat ECM komponentteja. Matrix (MMP), perheen Zn-riippuvaisten endopeptidaasit, ovat merkittäviä proteaasit osallistuvat kasvaimen solujen vaeltamiseen, levittää, kudosinvaasio ja etäpesäkkeiden [20]. Niistä MMP MMP-2 ja MMP-9 ovat keskeisiä entsyymejä alentava tyypin IV kollageenin ja edistää prosessia etäpesäkkeiden [21], [22]. MMP-2 ja MMP-9 voivat myös pilkkomaan tyypin I kollageenin [23], [24], pääkomponenttina, joka muodostaa ristikon rakenne strooman [25]. Aktivoituminen näiden entsyymien on liittynyt yhä tuumorimetastaasit, mikä viittaa keskeinen toiminnallista roolia näiden proteaasien metastaattisen prosessin [26]. Proteolyyttisen hajoamisen strooman microenvironment on ratkaiseva rooli hyökkäystä. Hankkia yksityiskohtaista tietoa syöpäsolujen invaasion strooman, tyypin I kollageenia käytetään Boyden kammiossa invaasiomääritys tässä tutkimuksessa.

Lisäksi proteolyyttinen hajoaminen ECM tuumorimetastaasissa voidaan säädellä muiden proteiinien, kuten solunulkoista induktori matriksimetalloproteinaasi (EMMPRIN) ja kudosten estäjä metalloproteinaasien (TIMP). EMMPRIN on monitoiminen glykoproteiini, joka voi muuttaa kasvain microenvironment aktivoimalla tiiniproteinaasit asiakkuutta angiogeenisten tekijöiden kasvain- ja stroomasoluissa. EMMPRIN pystyy säätelemään MMP ja olla mukana hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden prosessit eturauhassyöpäsolujen [27]. Toiminta eniten MMP säännellään TIMP. Tasapaino MMP ja TIMP tasoilla on tärkeä tekijä verkon proteolyyttinen aktiivisuus [28].

mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) reitin on tiedetty osallistua erilaisiin signa- että on tärkeä sääntelyn rooli solujen kasvua, apoptoosin, erilaistumista ja etäpesäkkeiden [29]. Monipuolinen MAPK jäsenet aktivoituvat vasteena erilaisiin solunulkoisen ärsykkeisiin ja on erilaiset loppupään tavoitteet, mikä puolestaan ​​edistää solujen vaeltamiseen, proteinaasi-induktio, ja angiogeneesi, tapahtumia, jotka ovat välttämättömiä etäpesäke [30]. Solunulkoisen signaalin säännellään kinaasia (ERK1 /2) ja c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK), kaksi suurta nisäkkäiden MAP-kinaasien, ovat sekaantuneet solujen vaeltamiseen ja proteinaasi-induktio, tapahtumia, jotka ovat välttämättömiä etäpesäke [30]. ERK1 /2 ja JNK on keskeinen rooli säätelyssä ilmentymisen MMP [20]. Inhibitio MAPK-reitin saattaa olla mahdollisuus estää angiogeneesiä, leviämisen, invaasio ja metastaasi monenlaisia ​​kasvaimia [31], [32], [33]. Etäpesäke säätelee myös PI3K /Akt-signalointireitin, joka on mukana monissa solun toiminnoissa kuten solujen eloonjäämistä, solujen tarttuvuuden ja etäpesäkkeiden [34], [35]. Esto MAPK ja PI3K /Akt reittejä voi olla mahdollista estää syöpäsolujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden [31], [33]. Lisäksi PI3K /Akt ja MAPK signalointireitteihin keskeinen rooli säätelyssä ilmaus MMP mukaan transkriptiotekijöitä, kuten NF-KB [34], [36], [37]. NF-KB pysyy inaktiivisessa muodossa sytoplasmassa estävän kutsuttujen proteiinien estäjät KB (lKB). Vastauksena aktivointisignaalin, NF-KB vapautuu IκBα ja translokoituu sytoplasmasta tumaan, jossa se sitoutuu sukulais sekvenssit promoottorialueella useita kohdegeenien ja sen jälkeen helpottaa solujen lisääntymisen, angiogeneesin ja metastaasin. Siten estää PI3K /Akt ja MAPK reitit sekä NF-KB tarjoavat potentiaalisia kasvaimen hoitostrategioita.

Vaikka diosgenin on sekaantunut uutena multitarget perustuvaa chemopreventive aineena useita syöpäsoluja, rooli diosgenin vastaan ​​kasvaimen etäpesäke ja angiogeneesiä on vielä epäselvä. Tavoitteena tätä työtä on tutkia estäviä vaikutuksia ja molekyylitason mekanismeja diosgenin on etäpesäkkeitä. Koska ihmisen eturauhassyöpä PC-3 solujen esittelee erittäin invasiivinen ja metastaattinen aktiivisuus ja on käytetty tutkia biokemiallisia muutoksia kehittyneen eturauhassyövän soluissa ja arvioidaan niiden vastauksena kemoterapeuttiset aineet [38], PC-3 solujen käytettiin esillä kokeet .

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja Cell Culture

diosgenin, dimetyylisulfoksidi (DMSO), Tris-HCl, EDTA, SDS, fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), Nonidet P -40, deoksikoolihappo ja natriumortovanadaattia, ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Proteiinimääritys kit saatiin Bio-Rad Labs (Hercules, CA). Jauhettu Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM) hankittiin Gibco /BRL (Gaithersburg, MD). Kokonais-RNA liuuttovälinepakkausta ja PCR kit olivat Viogene (Sunnyvale, CA). Vasta-aineet ERK, JNK, Akt, NF-KB (p65), C23 ja fosforyloitu proteiinit ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet PI3K ja fosforyloitu PI3K ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Ihmisen eturauhassyöpä solulinjoissa PC-3 ja saatiin BCRC (elintarvike- tutkimuksen ja kehityksen instituutti, Taiwan). Soluja pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, ja inkuboitiin 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC), toimitti ystävällisesti Dr. Hua-Lin Wu [39], eristettiin ihmisen napanuoran laskimot, kuten aikaisemmin on kuvattu [39], ja viljeltiin 0,1% gelatiinilla päällystetyille ruokia ja ylläpidetään M199 täydennetty 16% FBS, endoteelisolukasvua täydentää ja hepariinisulfaatti (Upstate Biotechnology). HUVEC välillä kohdat 2 ja 6 käytettiin kaikissa kokeissa. Sillä diosgenin hoitoon, diosgenin liuotettiin etanoliin ja laimennettiin elatusaineeseen (lopullinen etanolipitoisuus oli alle 0,2%).

solunelinkykyisyysmääritys

Testi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],40]. Lyhyesti, solut ympättiin 96-kuoppalevylle ja käsiteltiin diosgeniiniä kolmena kappaleena. Sen jälkeen, kun 24 ja 48 tunnin inkuboinnin jälkeen elatusaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 0,5 mg /ml MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia]. Kun 4 tuntia, supernatantit poistettiin, ja tuloksena MTT formatsaaniksi liuotettiin DMSO: hon ja mitattiin spektrofotometrisesti 570 nm: ssä.

Wound Healing Migration Pitoisuus

Testi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [41] . PC-3-solut maljattiin 12-kuoppalevylle ja kasvoi yhtymäkohta. Yksikerroksiset Sitten viljelmä kaavi-haavoittui steriilillä mikropipetin kärki luoda denuded alue (aukko) on vakio leveys. Poistamisen jälkeen solujäte PBS: llä, solut altistettiin eri pitoisuuksia diosgenin jälkeen 24 tuntia. PC-3-solut muuttivat haavoittuneita alueelle havaittiin Olympus CK-2 käänteismikroskooppi ja valokuvattiin (100-kertainen suurennus). Haava-alue mitattiin ohjelman Image J (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Prosenttiosuus haavan arvioitiin seuraavalla kaavalla: haavan sulkeminen% = [1- (haava-alueella T

t /haavan alueella T

0) x 100%, jossa T

t on ajan kuluttua loukkaantumisesta ja T

0 on aika heti haavoittaen.

Boyden jaosto invaasiomääritys

Boyden kammion invaasiomääritys toteutettiin kuten aikaisemmin [41]. Lyhyesti, polykarbonaattisuodatin (8 um huokoskoko) oli ennalta päällystetty tyypin I kollageenia (10 ug /ml). Sen jälkeen, kun on käsitelty diosgenin 24 tuntia, soluja (1 x 10

4 solua /kuoppa) lisättiin ylempään kammioon seerumia. Täydellinen väliaine (joka sisälsi 10% FBS: ää) pantiin alempaan kammioon, kuten kemoattraktantti. Kammio inkuboitiin 6 tuntia 37 ° C: ssa. Lopussa inkuboinnin solujen yläpinnan kalvo poistettiin varovasti pumpulipuikolla ja solut, jotka tunkeutuivat alapintaan kalvon kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 5% Giemsa liuosta. Tunkeutuneet solujen alapinnalla kalvosuodattimeen pisteytettiin viidestä satunnaisesti kentiltä mikroskoopilla (200-kertainen suurennus).

Putken muodostumisen määritys

putken muodostumiseen määritys suoritettiin, kuten on kuvattu. Lyhyesti, 15-kuoppaisille μ-diat (ibidi, Saksa) päällystettiin 10 ul: Matrigel, jonka annettiin kiinteytyä 37 ° C: ssa. Arvioida vaikutuksen diosgenin, PC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla diosgenin 24 tuntia ja väliaine kerättiin ja alistettiin putken muodostumiseen määrityksessä. HUVEC ympättiin Matrigel ja viljeltiin väliaine PC-3-solujen 6 tunnin ajan. Oheinen verkostot täydellinen putkien laskettiin ja valokuvattiin käännettyä mikroskooppia. Putkimainen pituudet soluja mitattiin käyttäen ohjelmaa Image J.

RNA uuttaminen ja Käänteinen transkriptio-PCR ja määrälliset Real-Time PCR

Kokonais-RNA uuttamalla käyttäen kokonais-RNA mukainen pakkaus valmistajan ohjeita. Kokonais-RNA (1 ug) kustakin näytteestä oli asetettu käänteistranskriptio oligo (dT) alukkeita PCR kit mukaan valmistajan ohjeiden. Syntetisoitu cDNA: ta käytettiin PCR-monistuksella seuraavia alukkeita [41]: MMP-9, 5′-gcacgacgtcttccagtacc-3 ’(For), 5′-tcaactcactccgggaactc-3′ (Rev); MMP-2, 5’-ggactatgaccgggataagaaatatg-3 ’(For), 5′-gggcaccttctgaatttcca-3′ (Rev); β-aktiini: 5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ’(For), 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’ (Rev). cDNA: t monistettiin 35 syklin ajan, ja kukin PCR-reaktio-olosuhteissa oli seuraava: valmistelu vaihe 94 ° C: ssa 5 min, denaturointivaihe 94 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, pariutumisvaiheen 56 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja polymerointi 72 ° C: ° C: ssa 30 sekunnin ajan. PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. MRNA ilmaisuja MMP-2, -9, -7, EMMPRIN ja TIMP-1, -2 määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä, joka suoritetaan StepOne järjestelmään (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Lyhyesti, kukin vahvistus seos (50 ui) sisältää 10 ng cDNA: ta ja 25 ui SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 2 min, 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C: ssa 45 s. Aluke sekvenssit β-aktiini, MMP-2, MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1, TIMP-2 ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on johdettavissa PrimerBank ja lueteltu taulukossa 1. PCR-tulokset olivat johdetaan vertaileva C

T -menetelmä.

Analyysi MMP-2 ja MMP-9 toiminta gelatiinitsymografialla

toiminta MMP-2 ja MMP-9 oli määritettiin gelatiinitsymografialla kuten aiemmin on kuvattu [41]. Lyhyesti, subkonfluenteista PC-3-soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa, jossa eri pitoisuuksia diosgenin 24 tuntia. Esikäsitelty väliaine sitten talteen ja konsentroidaan ultra-suodattamalla sentrifugoimalla. Näyte (20 ug) sekoitettiin latauspuskurilla ja altistettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelissä, joka sisälsi 0,1% gelatiinia. Elektroforeesi suoritettiin 100 V: ssa 3 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Geelit pestiin sitten pesupuskurilla (2,5% Triton X-100 dd H

2O) huoneenlämpötilassa SDS: n poistamiseksi, mitä seurasi inkubointi 37 ° C: ssa reaktiopuskuria (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM CaCl

2, 0,02% NaN

3). 16 tunnin kuluttua, geelit värjättiin Coomassie blue R-250 (0,125% Coomassie Blue R-250, 50% metanolia, 10% etikkahappoa) 1 h ja väri poistettiin värinpoistoliuos (20% metanolia, 10% etikkahappoa, 70% DDH

2O), kunnes kirkas bändit olivat visualisoitu.

Nuclear Protein Extraction

tumaproteiinien valmistettiin aikaisemmin kuvatulla [41]. Lyhyesti, solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl

2, 10 mM KCI, 0,05% NP-40, 0,5 mM DTT: tä ja 0,5 mM PMSF). Tumat sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 3000 rpm: llä 4 ° C: ssa. Sitten pelletti suspendoitiin uudelleen tumauutteesta puskurissa (20 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl

2, 420 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF ja 25% glyseroli) ja inkuboitiin 30 min jäällä. Kun toinen sentrifugointi 14000 rpm: ssä 10 min, supernatantti, joka sisältää ydin- proteiinin siirrettiin esijäähdytetty mikrosentrifugiputkeen. Uutteet säilytettiin -80 ° C: ssa.

Western Blot

Kun hoidetaan diosgenin, PC-3-solut pestiin kahdesti PBS: llä ja käsiteltiin uuttopuskuria (50 mM Tris-CI , pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, ja 0,5% deoksikolihappo). Solu-uutteet kerättiin ja sentrifugoitiin 10000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit kerättiin solulysaateista. Solulysaatit altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Millipore, Bedford, MA). Membraanit blokattiin 5% (w /v) rasvatonta maitoa PBS: ssa, joka sisälsi 0,1% Tween-20, ja sitten blotattiin primaarisen vasta-aineen. Sen jälkeen kalvoja inkuboitiin sopivan sekundäärisen vasta-aineen (piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri- tai anti-kani-IgG). Immunoaktiivisuus havaitut proteiinit sitten paljasti tehostetun kemiluminesenssin.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta. Tilastollinen merkitsevyys analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA: lla. Jos merkittävyys havaittiin, Dunnettin post-hoc-testiä käytettiin määrittämään eroa hoitoryhmien ja käsittelemätön ryhmä, jossa arvot

p

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

sytotoksinen vaikutus diosgenin PC-3 soluja

ensimmäinen selvitetty sytotoksista vaikutusta diosgenin eturauhasen syöpäsolujen PC-3 (Fig. 1). Olemme osoittaneet, että käsitelty of diosgenin at pitoisuus alle 20 uM 24 tai 48 tuntia ei vaikuttanut elinkelpoisuutta PC-3 solujen merkittävästi. Elinkelpoisuus PC-3 solujen väheni merkittävästi diosgenin 30 uM. Tulokset osoittivat, että käsittely diosgenin annoksilla enintään 20 uM 24 ja 48 tuntia ei aiheuttanut sytotoksisuutta PC-3-soluja.

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla diosgenin 24 tunnin ja 48 tunnin . Solujen elävyys esitetään keskiarvo ± S.D. neljästä itsenäisestä kokeesta.

*** p

0,001 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

diosgenin Estää Migration in PC-3 solujen

Koska korkeamman pitoisuuden diosgenin oli myrkyllinen , tutkimme estävää vaikutusta diosgenin muuttoliikettä ja hyökkäys PC-3-soluissa käyttäen myrkyttömiä annoksia. Inkuboinnin jälkeen eri pitoisuuksilla diosgenin 24 tuntia, diosgenin tukahdutti migraatio PC-3-solujen paljaaksi vyöhykkeen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2, A ja B). Nämä tulokset osoittivat, että diosgenin esti motiliteettia PC-3-soluissa merkittävästi.

yksisolukerrokset kaavittiin steriilillä mikropipetin kärjen ja soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla diosgenin 24 tuntia. (A) Solut muuttivat haavoittuneita alueelle valokuvattiin (100-kertainen suurennus). (B) Haava-alue soluviljelmiä määrällisesti neljällä Kunkin käsittelyn, ja tietoja, jotka on laskettu kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen.

* p

0,05,

** p

0,01, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

diosgenin Estää Invasion PC-3-solujen

Valaistaan ​​estävän vaikutuksen diosgenin on hyökkäyksen PC-3-solujen poikki soluväliaineen, solut tunkeutuu läpi tyypin I kollageenipäällysteisiin polykarbonaatti suodatin Boyden kammiossa analysoitiin. Tulokset osoittivat, että diosgenin tukahdutti hyökkäys PC-3-solujen poikki tyypin I kollageeni-käsitelty suodatin annoksesta riippuvalla tavalla. Hoito diosgenin 10 ja 20 uM esti 22% ja 40% solun invaasiota, vastaavasti (Fig. 3, A ja B). Tulokset osoittivat, että diosgenin inhiboi merkittävästi hyökkäyksen PC-3-soluja.

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla diosgenin 24 tuntia ja solujen invaasiota-määritys suoritettiin. (EN) tunkeutuneet Solut valokuvattiin (200-kertainen suurennus). (B) toinen tunkeutuneet PC-3-solut laskettiin viidessä satunnaisesti kentät kunkin hoidon, ja tietoja, jotka on laskettu kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen.

* p

0,05,

** p

0,01, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

diosgenin Estää aktivointi ja MMP-2 ja MMP-9: n PC-3-solujen

Koska aktivointi MMP on ratkaisevan tärkeää ECM hajoamista, jota tarvitaan solujen invaasiota, vaikutus diosgenin aktivoinnista MMP tutkittiin. Sen jälkeen, kun PC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla diosgenin 24 tuntia seerumittomassa väliaineessa, esikäsitelty väliaine otettiin talteen, konsentroitiin ja analysoitiin MMP aktiivisuuden gelatiinitsymografialla. Tulokset osoittivat, että MMP-9: n ja MMP-2 toiminnasta olivat merkittävästi pienentyneet 20 uM diosgenin (Fig. 4A). Olemme lisäksi osoittaneet, että diosgenin tukahdutti MMP-9: n ja MMP-2: n mRNA ja proteiini määritettiin RT-PCR: llä ja Western blotting, vastaavasti (Fig. 4, B ja C). Tulokset osoittivat, että sekä entsyymin toimintaa ja ilmauksia MMP-9: n ja MMP-2 inhiboi diosgenin.

(A) PC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla diosgenin 24 tuntia ja toimintaa MMP -9: n ja MMP-2 määritettiin gelatiinitsymografialla. Ilmaukset MMP-9: n ja MMP-2: n mRNA (B) ja proteiini (C) analysoitiin RT-PCR: llä ja Western blot, vastaavasti. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (D) MMP-2, -9, -7, EMMPRIN ja TIMP-1, -2-mRNA: n ilmaistiin keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen.

* p

0,05,

** p

0,01, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

diosgenin Estää mRNA Expression of MMP-2, MMP -9, MMP-7 ja solun indusoija matriksimetalloproteinaasi (EMMPRIN), kun taas indusoi TIMP-2 Expression

selventämiseksi vaikutus diosgenin ilmentymiseen liittyvien geenien ECM hajoamista, mRNA-tasot MMP-2: MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1 ja TIMP-2 analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset osoittivat, että diosgenin inhiboi mRNA MMP-2, MMP-9, MMP-7, ja EMMPRIN annoksesta riippuvalla tavalla. Diosgenin myös kohonnut ilmentyminen TIMP-2, jonka tiedetään estävän proteolyyttisen potentiaalin MMP (Fig. 4D). Tulokset viittasivat siihen, että diosgenin saattaa vaikuttaa geenien mukana proteolyyttistä aktivoitumista.

diosgenin esti PC-3 solun indusoiman ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) putken muodostumiseen

Tube muodostumista endoteelisolujen on yksi keskeinen vaiheet angiogeneesiin, syöpään liittyvien etenemisen ja etäpesäkkeiden. Jotta tutkia estävää vaikutusta diosgenin PC-3 solujen angiogeneesissä, suoritimme in vitro-putken muodostumiseen HUVEC ehdollistuneesta keskipitkän PC-3-solut. HUVEC kasvatettiin Matrigelillä käsiteltiin elatusaine PC-3-solut, joita käsiteltiin diosgenin 24 tunnin ajan, ja putken muodostumiseen arvioitiin. Tulokset osoittivat, elatusaineen PC-3-solujen indusoiman putken muodostumiseen HUVEC, ja väliaine soluista alttiiksi diosgenin tukahdutti putken muodostumiseen HUVEC annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5, A ja B). Tulokset viittasivat siihen, että diosgenin saattaisi tukahduttaa PC-3 solujen indusoimaa angiogeneesiä in vitro. Koska PC-3-solut indusoivat angiogeneesiä kautta ilmentävät angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF, me arvioida, onko diosgenin estää VEGF: n ilmentymistä PC-3-solut. Tulokset osoittivat, että mRNA VEGF: n ilmentymistä PC-3-solut oli merkittävästi vähentynyt diosgenin annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5C). Meidän tiedot osoittivat, että diosgenin estävät PC-3-solujen indusoimaa angiogeneesiä estämällä VEGF: n ilmentymistä.

(A) HUVEC ympättiin Matrigel ja inkuboitiin kunnostettua alustaa PC-3-solut, joita käsiteltiin diosgenin 24 tuntia. 6 tunnin kuluttua, suljettu verkot täydellinen putkien kuvattiin (100-kertainen suurennus). (B) putkimaisen pituudet soluja mitattiin käyttäen Image J ohjelmisto. (C) mRNA VEGF: n ilmentyminen määritettiin ja esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen.

* p

0,05,

** p

0,01, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

diosgenin Antimikrobiainetta fosforylaatiota PI3K, Akt, ERK ja JNK

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että signalointi proteiineja kuten PI3K, Akt ja MAPK jäsenet osallistuvat ilmaus MMP ja houkutella etäpesäke [30], [34], [35]. Vaikutukset diosgenin on fosforyloidun asemasta PI3K, Akt, ERK1 /2, JNK1 /2 ja p38 PC-3-solut tutkittiin. Tiedot osoittivat, että diosgenin vähensi fosforylaatiota PI3K ja Akt annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Fig. 6, A ja B). Lisäksi diosgenin tukahdutti fosforylaatiota ERK1 /2 ja JNK1 /2 annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, vaikka se ei muuttanut fosforylaatiota p38 (Fig. 7, A ja B).

PC-3-soluja käsiteltiin eri annoksilla diosgenin 24 h (A) tai 20 uM diosgenin 3, 6, 12, 18 ja 24 h (B). Fosforylaatio PI3K ja Akt määritettiin SDS-PAGE: lla ja Western-blottauksella. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

PC-3-soluja käsiteltiin eri annoksilla diosgenin 24 h (A) tai 20 uM diosgenin 3, 6, 12, 18 ja 24 h (B). Fosforylaatio ERK1 /2, JNK1 /2: n ja p38 määritettiin SDS-PAGE: lla ja Western-blottauksella. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

edelleen tutkia, inhibition soluinvaasion ja MMP-2/9 ilmentyminen oli eston kautta ERK1 /2, JNK1 /2 ja PI3K signalointi polkuja, PC-3-soluja käsiteltiin PI3K-estäjä (LY294002; 20 uM), ERK-inhibiittoria (U0126, 20 uM) ja JNK-inhibiittori (SP600125; 20 uM) 24 tunnin ajan. Tulokset osoittivat, että hoito LY294002, U0126 ja SP600125 vähentää solujen invaasiota ja MMP-2/9 ilmentymisen merkittävästi (Fig. 8, A ja B), mikä viittaa siihen, että inhibitio soluinvaasion ja MMP-2/9 ilmentymisen diosgenin voi osittain tapahtua kautta tukahduttaa PI3K, ERK ja JNK polkuja.

(A) Soluja käsiteltiin LY294002, U0126 ja SP600125 24 tuntia ja solun invasiivisia kykyjä suoritettiin Boyden kammion invaasiomääritys. (B) ekspressio MMP-2, -9 mRNA määritettiin ja ilmaistiin keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen.

** p

0,01,

*** p

0,001, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

diosgenin Downregulates ydinalan sisältö NF KB: n PC-3 soluja

tutkimiseksi estävä vaikutus diosgenin aktiivisuuteen NF-KB: n, määrä IκBα että sytosolin tiivisteet ja NF-KB: n solussa tumauutteita mitattiin Western-blottauksella. Data osoitti, että diosgenin-käsitelty PC-3-solut osoittivat kasvua sytosoliproteiiniin tason IκBα ja lasku ydin- proteiinin taso NF-KB: n (Fig. 9). Tulokset osallisena että diosgenin esti merkittävästi NF-KB: n aktiivisuutta.

PC-3-soluja käsiteltiin eri annoksilla diosgenin 24 tuntia. (EN) sytosolin ja ydinvoima uutteet valmistettiin ja analysoitiin IκBα hajoamista ja NF-KB: n p65 translokaatio. β-aktiinin ja C23 käytettiin soluliman ja tumaproteiini kuormituksen valvonta, vastaavasti. (B) Määritetty tasot IκBα ja NF-KB kvantitoitiin densitometrinen analyysi. Densitometrinen Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen.

* p

0,05,

** p

0,01,

*** p

0,001, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

keskustelu

diosgenin on osoitettu olevan anti-karsinogeenisia mahdollisuuksia, kuten estämällä solujen kasvua ja apoptoosin indusoiva eri syöpäsolulinjoissa [5], [6], [7], [8] [9], [10]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme edellyttäen todisteita, jotka diosgenin kykeni estämään etäpesäkkeiden

in vitro

, kuten muuttoliikkeen ja hyökkäys ihmisen eturauhassyövän PC-3-solut, mikä viittaa siihen, että diosgenin saattavat hallussaan antimetastaattisia potentiaalia.

osoittaneet, että diosgenin tukahdutti leviämisen PC-3-solujen merkittävästi pitoisuus 30 uM. Kun PC-3-soluja käsiteltiin diosgenin ei-toksisilla annoksilla (alle 20 uM), muuttoliikkeen ja invaasio estyi. Nämä tulokset merkitsi, että estäviä vaikutuksia diosgenin PC-3 solumigraation ja invaasiota eivät johtuneet solumyrkkyvaikutuksessa.

Cancer etäpesäke edellyttää muuttoa syöpäsoluja. Aikana solujen vaeltamiseen, Perisellulaarinen proteolyysiä ECM on tärkeä solujen pullistuma. Proteolyyttinen hajoaminen ECM välittämän solunulkoiset proteaasit, kuten MMP, vaaditaan eturauhassyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Heistä MMP-2, MMP-9: n ja MMP-7 on kriittinen rooli eturauhassyövän etenemiseen. MMP-2 ja MMP-9 liittyy eturauhasen syövän etenemisessä [42], [43]. MMP-2 ja MMP-9 ilmentyminen estää metastaattista potentiaalia eturauhassyövän [32], [44]. MMP-7 proteolyyttinen aktiivisuus erilaisia ​​ECM substraatteja, mukaan lukien kollageeneja, proteoglykaaneja, elastiinia, laminiini, fibronektiini, ja kaseiini. MMP-7 on myös tuottanut useita pahanlaatuisten syöpäsolujen kuten eturauhas-, mahan, pään ja kaulan, keuhko-, hepatosellulaarinen, ja peräsuolen karsinoomat [45], [46]. Yliekspressio MMP-7 edistää hyökkäystä eturauhassyöpäsolujen [47]. Lisäksi, EMMPRIN kykenee säätelemään MMP ja osallistua ja metastaasit prosesseja eturauhassyöpäsolujen [27]. Esto EMMPRIN ilmaisun vähentää kasvainsolun invaasiota ihmisen eturauhasen syöpäsolu [48]. TIMP, säädin MMP, ovat myös mukana syövän etenemiseen, invaasio, etäpesäke ja angiogeneesiä [49], [50]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että diosgenin esti muuttoliike ja hyökkäys PC-3-solut.

Vastaa