Krooninen sairaus

tiivistelmä

lisääntynyt ilmentyminen angiotensiini II tyypin 2 reseptorin (AT2R) indusoi apoptoosia useissa tuumorisolulinjoissa, joko angiotensiini II riippuvaisen tai angiotensiini II-riippumaton sääntely, mutta sen molekyylitason mekanismi pysyy huonosti. Täällä käytetään PCR-Array analyysi määrittää geenin ja microRNA ilmentymisen profiilit ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa transdusoitu AT2R rekombinantti adenovirus. Tuloksemme osoittivat, että AT2R yli ilmaisu johtaa säätely ylöspäin 6 apoptoosin liittyvien geenien (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2), 2 sytokiinigeenien (IL6- ja IL8) ja 1 microRNA, ja alassäätöä 1 apoptoosin liittyvän geenin TNFSF10 ja 2 sytokiinigeenien (BMP6, BMP7) transdusoiduissa DU145 soluissa. HRK otettiin esimerkiksi säädelty geeni AT2R Transdusoimattomia PC-3-solujen reaaliaikaisella RT-PCR. Seuraavaksi käytimme siRNA hiljentää ylös geenien edelleen määrittää niiden roolit AT2R yli-ilmentymisen välittämän apoptoosin. Tulokset osoittivat downregulation Gadd45a vähensi apoptoottisten vaikutus -30% vuonna DU145-soluissa, downregulation HRK vähentää AT2R-välitteistä apoptoosia yli 50% PC-3-soluja, kun taas downregulation TRAIL-R2 parannettu AT2R-välitteisen apoptoosin yli 4 kertaa DU145 soluissa. Huomasimme myös, että vaikutukset AT2R välittämää apoptoosia aiheuttama downregulation Gadd45a, TRAIL-R2 ja HRK olivat riippumattomia aktivoitumiseen p38 MAPK, p44 /42 MAPK ja p53. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että TRAIL-R2, Gadd45a ja HRK voivat olla uusia kohdegeenien lisätutkimuksia mekanismin AT2R-välitteistä apoptoosia eturauhassyöpäsoluissa.

Citation: Pei N, Jie F, Luo J, Wan R, Zhang Y, Chen X, et al. (2014) geeniekspressioprofilointi Associated angiotensiini II tyypin 2 -reseptorin indusoiman apoptoosin in Human eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 9 (3): e92253. doi: 10,1371 /journal.pone.0092253

Editor: Gangjian Qin, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 joulukuu 2013; Hyväksytty: 19 helmikuu 2014; Julkaistu: 21 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Pei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China Grant 81072113 (HL), National 863 korkea Technique kehittämishankkeet Kiinan Grant 2012AA02A403 (HL), valtion Key Laboratory of taudinaiheuttajien ja Biosecurity Program SKLPBS1103 (HL), sekä palkintoja 2011A091000022, 2010B060500001 , 2011B060300028 ja 2011B060300014 jotta WG Kiinan hallituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä Pohjois-Amerikan miehillä ja on toiseksi suurin syy syövän sairastuvuutta ja kuolleisuutta Yhdysvalloissa [1], vaikka sen ennuste on parantunut, koska edistysaskeleita diagnostisia ja kirurgisia menetelmiä . Tähän mennessä erilaisia ​​hoitoja potilaille, joilla on hormonien tulenkestävä syöpä on tutkittu, mutta mitään tehokasta hoitoa ole raportoitu. Siksi uusi hoitomuoto strategioita eturauhassyövän kiireellisesti.

angiotensiini II (Ang II) on avainefektori on reniini-angiotensiini-järjestelmän. Ang II on kaksi reseptoreihin: Ang II tyypin 1 ja tyypin 2 reseptorien (AT2R) [2]. AT2R, toinen merkittävä-isoformi, on ensisijaisesti ilmaistaan ​​mesenchyme sikiön ja rajoitetussa määrin aikuisen kudoksissa [3]. Se on hyvin osoitettu, että lisääntyneen ilmentymisen AT2R indusoi apoptoosin useissa solulinjoissa, kuten feokromosytooma, fibroblastit, sileät lihassolut, ja endoteelisolujen kautta joko Ang II-riippuvainen tai Ang II-riippumaton sääntely [4] – [11]. Meidän aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että AT2R yli ilmentyminen merkitsevästi aiheuttaman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa [12]. Tuore tutkimus osoittaa, että henkitorven of nanohiukkasten perustuvan hoidon kanssa AT2R geenin vaimenee keuhkosyöpää kasvua, ja vaikutus on parempi kuin TRAIL [13]. Vaikka menestys rajattu fysiologinen rooli, molekyyli- ja solutason toimet AT2R-välittäjänä apoptoosin jäävät määrittämättä. Täällä, käytimme reaaliaikainen PCR erilaisia ​​analyysi profiloida useita geenejä ja MikroRNA mukana AT2R aiheuttaman apoptoosin eturauhassyövän solulinjoissa.

Tässä raportissa joukossa geenejä, jotka voivat liittyä vuonna apoptoosireitin, on 7 apoptoosin liittyvän geenin, 4 sytokiinien ja 1 microRNA ilmaisuja muutettiin vuonna AT2R yli ilmaisi syöpäsolujen verrattuna kontrolli. AT2R aiheuttama apoptoosin DU145 soluissa tehostui, kun TRAIL-R2, joka pudotettiin. Kuitenkin apoptoottinen vaikutukset välittyvät AT2R vähenivät DU145 soluihin Gadd45a hiljennettiin. Mielenkiintoista on, että kun HRK on vaiennettu, indusoiman apoptoosin AT2R pienennettiin PC-3-soluja. Tutkimuksemme osoitti myös, että vaikutukset AT2R välittämää apoptoosia aiheuttama alas-säätely TRAIL-R2 ja HRK olivat riippumattomia aktivoitumiseen p38 MAPK, p44 /42 MAPK ja p53. Tutkimuksemme pitäisi edistää tunnistamisen AT2R tunnistava tekijät osallinen apoptoottisen reitin eturauhassyöpäsoluissa, ja auttaa meitä ymmärtämään AT2R perustuva apoptoosin paremmin tarjoamalla otaksuttu kohdegeenien jatkotutkimuksiin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa (PC-3 ja DU145-solut) saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). PC-3-soluja viljeltiin F-12-väliaineessa, ja DU145-soluja viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää alle 5,0% CO

2. Seerumit ja media ostettiin Invitrogen ja American Type Culture Collection.

rekombinanttiadenoviruspartikkeleiden rakentaminen ja valmistaminen

Rekombinantti-adenovirusvektoreita konstruoitiin, valmistettiin ja titrattiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [14]: adenovirusvektori joka sisältää tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin geeni ohjaa sytomegaloviruksen promoottori (Ad-CMV-EGFP), ja adenovirusvektori, joka sisältää genomisen AT2R (G-AT2R) DNA intronit 1 ja 2, ja koodaavan alueen ja tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin geenin ohjaa sytomegaloviruksen promoottorit (Ad-G-AT2R-EGFP).

Cell hoito

virustransduktio, eturauhassyövän solut (4 x 10

5) ympättiin kuuden hyvin Corning kudosviljelmässä levyt. Seuraavana päivänä solut transdusoitiin Ad-G-AT2R-EGFP tai kontrollivektori Ad-CMV-EGFP ja solumorfologian muutosten havaittiin käyttäen Olympus BX41 fluoresenssimikroskoopilla. Transdusoimattomia soluja käytettiin 24-48 tuntia myöhemmin, riippuu kunkin protokollan.

Sirna (siRNA) tutkimukset, DU145 ja PC-3-solut transfektoitiin joko TRAIL-R2, GADD45A, TP53BP2, HRK tai ohjaus siRNA käyttäen lipofektamiinireagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa. Kaikki siRNA: t hankittiin Qiagen. Nämä hoidot seurasi 24 tuntia myöhemmin transduktiolla Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /solu), ja sitten, 48 h myöhemmin, apoptoottisten solujen määrässä tai apoptoosiin liittyvien geenien /proteiinien tutkittiin.

RNA: n eristäminen ja Real-Time RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käsiteltiin DU145 ja PC3-soluista käyttäen RNeasy Mini-Kit (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristetty RNA tehtiin DNaasi I (OMEGA Biotek, Norcross, USA) käsittely poistaa genomista DNA. RNA-pitoisuus määritettiin ND-1000 Spektrofotometri (Nanodrop, Rockland, DE, USA), ja RNA puhtaus varmistettiin 260/280 optisen tiheyden arvo 1,8-2,0. RNA-näytteet arvioitiin hajoamista tila agaroosigeelielektroforeesilla. Eristetty RNA muutettiin sitten cDNA: Oligo-dT ja PrimeScript käänteistranskriptaasia (TAKARA, Dalian, Kiina) Regents. Fluoresoiva kvantitatiivinen PCR suoritettiin lämpö-pyöräily ehto: 95 ° C 30 s, mitä seurasi 40 sykliä, 5s 95 ° C: ssa ja 34s 60 ° C: ssa. Näytteet analysoitiin ABI 7500 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems) ja alistettiin vertaileva △△ C

T -menetelmä käyttämällä ihmisen GAPDH sisäisenä standardina. Reaaliaikainen PCR-tuotteiden (8 ui) ladattiin 2,5% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia.

Apoptotic geeniekspressioanalyysissä käyttäminen Real-Time PCR Array

Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin RT

2 First Strand kit (C-03) mukaisesti säädetyn pöytäkirjan valmistajan (SABiosciences, Frederick, MD, USA) kantavassa cDNA näytteet seulottiin sitten ilmaus 84 keskeisten geenien apoptoosin avulla ihmisen Apoptosis RT

2 Profiler PCR Array (PAH-012A; Superarray, Frederick, MD, USA) ABI 7500 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), mukaan valmistajan protokollia. Saada tilastollisesti tietoja analysoitiin ohjaus ja koenäytteiden kussakin kaksi aikavälein kolmena kappaleena. Ilmaisut kohdegeenien mitattiin suhteessa keskimääräisen kynnyksen syklin (C

T) arvoja viidestä eri calibrator geenit (B2M, GAPDH, HPRT1, RPL13A ja ACTB). Tulokset ilmaistiin suhteellisena kertainen muutos geenin ilmentymisen AT2R suoritetaan ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. Geenit suhteellisen kertamuutoksia yli ± 2 katsottiin ylös- tai alaspäin säädeltyjä ilme. Geenit, jotka saatiin p-arvo 0,05 katsottiin näyttää tilastollista merkitystä tutkimuksessa.

Human Sytokiinit Analysis käyttäen reaaliaikaista PCR Array ja Real-Time RT-PCR

cDNA näytteitä myös seulottiin ekspression 84 reittiin keskittynyt sytokiinien ja avulla RT

2 Profiler PCR Array Human yhteisen sytokiinien (PAH-021A; Superarray, Frederick, MD, USA) ABI 7500 reaaliaikainen PCR järjestelmä (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), valmistajan mukaan protokollia. Kokeet suoritettiin kerran välillä Ad-G-AT2R-EGFP-transdusoidut solut ja Ad-CMV-EGFP aiheuttama solujen seuloa sytokiinien yleisesti.

Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin vahvistamaan ilmaisua profilointia. Geenit valittiin perustuen niiden fysiologisia rooleja ja missä määrin ne säätelevät yliekspressio AT2R. Oligonukleotidialukkeet ja Taqman spesifisiä Bcl-2, IL6 ja IL8 saatiin Applied Biosystems. Eristäminen kokonais-RNA tehtiin kuten edellä on kuvattu. Puhdistettu RNA (25 ng) käytettiin tehdä RT-PCR Applied Biosystems Prism 7000 Sequence Detection System, jossa käytetään One-Step RT-PCR Master Mix reagenssit. Expression of housekeeping-geeni GAPDH normalisointiin käytettiin mRNA: n ilmentymisen. Kvantitointi ja analyysi geenin ilmentyminen määritettiin käyttäen vertailevaan syklin kynnys (C

T) menetelmä, Applied Biosystems User Bulletin # 2. Alukkeita käytetään havaitsemaan tasolle muiden sytokiinien on esitetty taulukossa 1 ja reaaliaikaisen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Esiseos Ex Taq (TAKARA) Regents kuten edellä on kuvattu.

Human MikroRNA Analyysi käyttäminen Real-Time PCR Array ja Real-Time RT-PCR

kvantitoimiseksi miRNA ilmaisua, kokonais-RNA uutettiin Ad-G-AT2R-EGFP Transdusoimattomia ja Ad-CMV-EGFP aiheuttama solujen RNeasy Mini-Kit (Invitrogen ). Eristetty kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen OneStep PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Takara, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. CDNA näytteet seulottiin ilmentymisen 88-reittiin keskittynyt miRNA miScript miRNA PCR Array Human Cancer PathwayFinder (MIHS-102Z, Frederick, MD, USA) ABI 7500 reaaliaikainen PCR-järjestelmää.

MikroRNA analysoitiin edelleen perustuu niiden mahdollisesta roolista syövässä ja ilmaisua, joita on huomattavasti säännelty miRNA PCR Array järjestelmään. Tämä raja valittiin vähentää geenien toimivampi numeron ja keskittyä niihin geenejä joiden ilmentyminen oli muuttunut merkittävästi. Käyttämällä näitä kriteerejä, pystyimme kaventaa keskitymme 14 seuraavaa miRNA: HSA-miR-let7c; HSA-miR-let7e; HSA-miR-21; HSA-miR-125; HSA-miR-126; HSA-miR-146; HSA-miR-150; HSA-miR-182; HSA-miR-183; HSA-miR-193; HSA-miR-767; HSA-miR-149; HSA-miR-100; HSA-miR-32. Suhteellinen ilmentyminen laskettiin kautta vertailevan syklin kynnys (C

T), jossa käytetään ilmaisua U6 pienten ydinaseiden RNA ohjearvon. Uni-miR qPCR Primer sisällytettiin kit. Määrä miRNA seurattiin SYBR Esisekoite Ex Taq II (Perfect Real Time) (Takara, Japani). PCR-olosuhteet olivat 30 s 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s.

Apoptosis arviointi

määrä vihreää fluoresoivat solut, jotka osoittavat apoptoottinen kaltainen morfologia aiheuttama AT2R välittämää apoptoosia transfektoimalla siRNA arvioitiin laskemalla solut 10 satunnaista kenttää per hyvin. Counts tehtiin yksittäisen joka oli sokaissut kuin hoitoon.

Western Blot analyysi

Western immunoblot ajettiin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Ensisijainen vasta-aineet ja niiden lähteet olivat seuraavat. Anti-yhteensä p38 MAPK, anti-kokonais-p53, anti-kokonais-p44 /42 MAPK: n, anti-fosforyloitu p44 /42 (pp44 /42) MAPK, ja anti-fosforyloitu p53 (pp53) olivat Cell Signaling Technology. Anti-fosforyloitua p38 (pp38) MAPK oli Milliporesta. Anti-β-aktiini ja toisen vasta-piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua anti-kani-IgG ja anti-kani-IgG olivat Sigma-Aldrich. Anti-vuohi-IgG oli Santa Cruz Biotechnology.

Tilastollinen analyysi

Kaikissa kokeissa virustransduktio tehtiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolmasti. Tiedot esitetään keskiarvona ± standardipoikkeama (SD) 3-5 itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 13.0 ohjelmistolla. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen T-testiä, kun vain 2 ryhmää verrattiin, ja ANOVA, kun 3 tai useampia ryhmiä verrattiin. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Adenoviraaliset välittämää ilmentäminen AT2R eturauhassyöpäsoluissa

Meidän olevassa tutkimuksessa, DU145 solut infektoitu Ad-G- AT2R-EGFP (100 IFU /solu, 2 päivää) oli suuri määrä apoptoottisten solujen kontrolliin verrattuna vektorin (Fig. 1A, B, C, D), joka noudattaa edellisessä raportissa [12]. Seuraavaksi reaaliaikaista PCR: ää käytettiin määrittämään suhteellinen ilmentyminen AT2R. Tuloksemme osoittivat, että AT2R on yliekspressoituvat merkittävästi Ad-G-AT2R-EGFP-transdusoitujen DU145 tai PC-3-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (taulukko 2 ja kuvio. 1E, F).

DU145-soluja transdusoitu Ad-G-AT2R-EGFP (B ja D) ja Ad-CMV-EGFP (A ja C) (100 IFU /solu) ja 2 päivää, ja solujen morfologia tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla. Mittaviivat 50 um. Kokonais-RNA uutettiin transdusoitujen DU145-soluja ja AT2Rs havaittiin reaaliaikainen RT-PCR: llä. Etidiumbromidilla-värjätyissä geeleissä osoittavat AT2R (E) ja GAPDH (F) transkriptien transdusoidut solut. M, DL 2000 DNA Maker (Takara); 1, 3, 5, 7, 9: transdu- 10, 20, 50, 100, 200 IFU /solu erikseen Ad-G-AT2R-EGFP; 2, 4, 6, 8, 10: transdu- 10, 20, 50, 100, 200 IFU /solu erikseen Ad-CMV-EGFP.

TRAIL-R2 ja Gadd45a myötävaikuttaa ja AT2R-indusoitu apoptoosi DU145 solut

PCR Array-analyysi suoritettiin sen määrittämiseksi, molekyyli vaikutuksia AT2R ilmentymisen DU145-soluissa. Niistä 84 geenit edustettuina Human Apoptosis RT

2 Profiler PCR Array profiilit, ilmaus tasot 6 geenien (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2) kasvoi säädelty ja yksi geeni (TNFSF10) oli säädellä vähentävästi DU145 soluissa transdusoitiin Ad-G-AT2R-EGFP (taulukko 3, Fig. 2). Nämä differentiaalisesti ilmentyvien geenien voidaan kohdentaa koodaaviin geeneihin tuumorinekroositekijä (TNF) ligandin perhe (TNFSF10), TNF-reseptoriperheen (TNFRSF10B), Bcl-2-perheen (BAG3, BNIP1, HRK) sekä tuumoriproteiinia p53 sitova proteiini 2 (TP53BP2) ja kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurioita indusoituvat, alfa (Gadd45a). Mielenkiintoista, Bcl-2 ei säännelty merkittävästi PCR Array analyysiin. Reaaliaikainen PCR käytettiin lisäksi pätevyyttä sen ilmaisua. Tuloksemme osoittivat, että ei ollut merkittävää muutosta Bcl-2: n ilmentymisen Ad-G-AT2R-EGFP transdusoimattomien DU145 soluissa verrattuna Ad-CMV-EGFP-transdusoidut solut (Fig. 3).

käsitellyt solut Ad-CMV-EGFP (200ifu /solu) käytettiin kontrollina.

DU145-solut transdusoitiin joko Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) tai Ad-CMV-EGFP (EGFP ) ja 2d 200 IFU /solu. Nämä hoidot seurasi koko RNA: n eristys ja sitten reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi käyttäen spesifisiä oligonukleotidialukkeita ja Taqman. Kaikki tiedot normalisoitiin nykytasoon GAPDH mRNA: n ilmentymisen samassa näytteessä. Sarakkeet, keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta.

siRNA häiriöitä tekniikkaa käytettiin edelleen merkityksen määrittämiseksi neljän up-geenien, mukaan lukien TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 ja HRK, vuonna AT2R indusoimaan apoptoosin transdusoiduissa DU145 soluissa. Transfektoimalla nämä siRNA: iden osaksi DU145 soluihin vähentäneet mRNA: n ilmentymisen (Fig. 4A). Hoito DU145 solujen Gadd45a siRNA vähensi apoptoottisten vaikutus noin 30%, kun taas TP53BP2 siRNA ja HRK siRNA eivät aiheuttaneet merkittävää eroa AT2R välittämän apoptoosin kuin verrokeilla. Mielenkiintoista, hoito DU145 solujen TRAIL-2 siRNA lisäsi merkittävästi AT2R indusoiman apoptoosin yli 4 kertaa verrattuna ohjaus siRNA transfektoidut solut (Fig. 4B). Lisäksi lisääntynyt apoptoosi ei johtunut suoraa vaikutusta TRAIL-R2 siRNA, koska TRAIL-R2 siRNA yksinään ei aiheuttanut apoptoottinen tuloksia (tuloksia ei ole esitetty).

DU145 solut transfektoitiin TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 tai HRK siRNA (20 nmol /l) tai ohjaamaan siRNA (20 nmol /l), minkä jälkeen transduktion Ad-G-AT2R-EGFP (100 IFU /solu) 2 d. (A) siRNA välittämää-lasku mRNA ilmaisun transdusoiduissa DU145 soluissa; (B) vihreitä fluoresoivia soluja, joilla apoptoottinen morfologia, joka laskettiin 10 kenttää per hyvin .. sarakkeet, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SE. *, P 0,05.

Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että indusoiman apoptoosin AT2R yli-ilmentyminen on osittain riippuvainen Gadd45a on DU145-soluissa. TRAIL-R2 voi olla negatiivinen säädin AT2R aiheuttaman apoptoosin DU145 soluissa.

HRK edistää AT2R indusoiman apoptoosin in PC-3 solujen

Kun otetaan huomioon voimistunut geenien tuottamat yliekspressio AT2R in DU145 soluissa, me seuraavaksi tutkitaan vaikutuksia AT2R ilmentymisen vaikutus geenien PC-3-solujen reaaliaikaisella RT-PCR. Osoitimme, että ekspressiotasot HRK (pro-apoptoottinen geeni) lisättiin PC-3-solujen annoksesta riippuvaisella tavalla ja saavutti erittäin korkealla tasolla 100ifu /solu (kuvio. 5A).

A, HRK mRNA ilmaisun PC3-soluissa transdusoitiin ilmoitetun annoksilla. B ja C, PC3-soluja käsiteltiin 20 nmol /l HRK siRNA tai valvoa siRNA ja Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /solu), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät minkä jälkeen 48 tuntia myöhemmin reaaliaikaisella RT-PCR-analyysi (B) joko HRK mRNA: n tai arviointiin solujen apoptoottisen kaltainen morfologia (C). Sarakkeet, keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta kussakin tapauksessa; baareja, SE. *, P 0,05 verrokkiin nähden soluihin.

tutkia roolia HRK vuonna AT2R aiheuttaman apoptoosin PC3-soluissa, HRK siRNA transdusoitiin PC-3-solujen laskevan HRK ilmaisu (kuvio . 5B). Tulos osoitti downregulation HRK PC-3-solujen vähensi AT2R aiheuttaman apoptoosin ~45% (Kuva. 5C).

osallistumista Gadd45a, TRAIL-R2 ja HRK in AT2R indusoiman apoptoosin Independent p38 MAPK, p44 /42 MAPK ja p53

Tutkimme lisäksi loppupään signalointireitille aiheuttama AT2R yli-ilmentyminen solun apoptoosin. Edellisessä tutkimus osoitti, että lisääntynyt ilmentyminen AT2R apoptoosia aktivoimalla p38 MAPK-reitin [14]. Mutta esillä olevassa tutkimuksessa, aktivointi p38 MAPK, p53 ja p44 /42MAPK ei havaittu alas-säätely Gadd45a ja TRAIL-R2 välittämä AT2R aiheuttaman apoptoosin DU145 soluissa (kuvio. 6A, 6B, 6C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös PC3-soluissa (kuvio. 7A, 7B, 7C). Nämä osoittavat, että osallistuminen Gadd45a, TRAIL-R2 ja HRK in AT2R-välitteistä apoptoosia oli riippumaton aktivaatioon p38 MAPK, p53 ja p44 /42 MAPK.

DU145-solut transfektoitiin TRAIL-R2 siRNA

(kaista 1),

Gadd45a

siRNA (kaista 2) B, TP53BP2 siRNA

(kaista 3) B, HRK siRNA

(kaista 4) B, ohjaus

siRNA (kaista 5) B tai mock

(kaista 6) B seurasi 24 tuntia myöhemmin transduktiolla Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /solu). 2 d kuluttua inkubaation jälkeen solut kerättiin ja alistettiin Western blot analyysit (edustavat kolmea erilaista koetta). (A) ekspressiotasoja kaikista p44 /42, pp44 /42 ja β-aktiini-proteiinin bändejä. (B) ekspressiotasot yhteensä p38, pp38 ja β-aktiini-proteiinin bändejä. (C) ekspressiotasot yhteensä p53, pp53 ja β-aktiini-proteiinin bändejä.

PC-3-solut transfektoitiin HRK siRNA

(Lane1) B, ohjaus

siRNA (Lane2) B tai mock

(kaista 3) B seurasi 24 tuntia myöhemmin transduktiolla Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /solu). 2 d kuluttua inkubaation jälkeen solut kerättiin ja alistettiin Western blot analyysit (edustavat kolmea erilaista koetta). (A) ekspressiotasoja kaikista p44 /42, pp44 /42 andβ-aktiini-proteiinin bändejä. (B) ekspressiotasot yhteensä p38, pp38 andβ-aktiini proteiinijuovat. (C) ekspressiotasoja kaikista p53, pp53 ja β-aktiini-proteiinin bändejä.

Sytokiinit ja MikroRNA Expression Validation

ylös ja alas-säädellä sytokiinien ja MikroRNA seulottiin Real- PCR Array transdusoiduissa DU145 soluissa (kuvio 8A, 9A). Reaaliaikainen RT-PCR avulla varmistetaan sytokiinien ja microRNA ilmaisun profilointi tuottama AT2R yli-ilmentymisen DU145 soluissa. Geenit ja MikroRNA valittiin perustuu niiden ilmentyminen muuttuu, jotka on saatu PCR erilaisia ​​analyysi, ja fysiologisia rooleja apoptoosiin ja leviämistä. MRNA-tasot on IL8 ja IL6 lisättiin enemmän kuin 2 kertaa, ja 40% vastaavasti DU145 transdusoitujen solujen Ad-G-AT2R-EGFP verrattuna Ad-CMV-EGFP-transdusoidut solut (Fig. 8B C), kun taas BMP6 ( kuva 8D), BMP7 (kuva 8E) pieneni 50% ja 45% vastaavasti ja ilmaisun BMP1, BMP4, BMP8B, TGFB1, TGFB2 ja TGFB3 (Fig.8F, 8G, 8H, 8J) eivät muuttuneet merkitsevästi . Mitä MikroRNA, tulos osoitti, että microRNA 150 korotettiin yli 5 kertaa DU145 soluissa transdusoitiin Ad-G-AT2R-EGFP verrattuna Ad-CMV-EGFP-transdusoidut solut, kun taas muut MikroRNA eivät muuttuneet merkitsevästi (Fig. 9B). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​meidän miScript miRNA PCR Array tiedot.

DU145 soluja transdusoitiin joko Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) tai Ad-CMV-EGFP (EGFP) 2 vuorokauden ajan lämpötilassa 200 IFU /solu. Muita ryhmiä soluja mock transduktion. A. Ylös ja alas-säädellä sytokiinien seulottiin Reaaliaikainen PCR Array DU145 soluissa. Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi joko IL8 (B), IL6 (C), BMP6 (D), BMP7 (E), BMP1 (F), BMP4 (G), BMP8B (H), TGFB1 (J), TGFB2 (J) ja TGFB3 (J). Kaikki tiedot normalisoitiin nykytasoon GAPDH mRNA: n ilmentymisen samassa näytteessä. Sarakkeet, keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta; baareja, SE. *, P 0.05.

DU145 soluja transdusoitiin joko Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) tai Ad-CMV-EGFP (EGFP) 2 vuorokauden ajan lämpötilassa 200 IFU /solu. Nämä hoidot seurasi eristäminen mRNA ja sitten reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi valituista microRNA. Kaikki tiedot normalisoitiin vastaan ​​tasoilla U6 ilmaisu samassa näytteessä. Sarakkeet, keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta; baareja, SE. *, P 0,05 versus Ad-CMV-EGFP transduktoitu-. A. Ylös ja alas-säädellä MikroRNA seulottiin Reaaliaikainen PCR Array DU145 soluissa. B. validointi mikroRNA ilmaisua käyttäen Reaaliaikainen PCR.

Keskustelu

Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa selkeästi arvioida apoptoosin liittyvän geenin, sytokiinien geenin ja microRNA ilmentymisen profiilit liittyvät AT2R indusoiman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa. Se on myös ensimmäinen tutkimus raportoimaan suoraan valikoiva vaikutuksia Gadd45a, TRAIL-R2 ja HRK sen indusoiman apoptoosin yli-ilmentyminen AT2R vuonna DU145 tai PC-3-solut. Nämä tulokset antavat tärkeää tietoa kohti parempaa ymmärtämistä molekyylitason mekanismin AT2R-välitteistä apoptoosia eturauhassyöpäsoluissa.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että pakotetaan-ilmentyminen AT2R aiheutti merkittäviä muutoksia suuri määrä geeni ja microRNA ilmaisuja avulla PCR Array analyysiä. Seuraavaksi olemme osoittaneet, että TRAIL-R2 ja Gadd45a ovat mukana indusoiman apoptoosin AT2R on DU145-soluissa ja HRK tärkeä rooli in AT2R-välitteistä apoptoosia in PC-3-soluja. Lopuksi, TRAIL-R2, Gadd45a ja HRK sidokset indusoiman apoptoosin AT2R olivat riippumattomia aktivoitumiseen p38 MAPK, p44 /42 MAPK ja p53 eturauhassyövän solulinjoissa.

Gadd45a oli säädellään ylöspäin AT2R-yliekspressoitu DU145 solujen tämänhetkiseen tutkimuksessa. Gadd45a, p53-säännelty ja DNA-vaurioita-geenin, on jäsen Gadd45 geenien perhe, jotka tunnetaan jännityksen antureita, joka moduloi solujen vastauksena erilaisiin stressiä, mukaan lukien genotoksinen ja onkogeenisten stressiä [16] – [ ,,,0],19]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että Gadd45a estää kasvaimen angiogeneesiä kautta tukkeutumisen mTOR /STAT3-reitin [20]. Gadd45a on transkription kohde kasvainten p53 ja BRCA1, joiden toiminnan menetys avainasemassa syövän kehittymisessä [21]. Lisäksi Zerbini L, et al [22] ovat osoittaneet, että JunD, Gadd45a ja Gadd45g terapeuttisina kohteina eturauhasen Caner. Yhdenmukainen tämän tutkimuksen, meidän tiedot osoittivat, että AT2R-välitteistä apoptoosia oli osittain riippuvainen Gadd45a in DU145-soluissa.

Tässä esitetyt tiedot osoittavat, että TRAIL-R2 on mukana AT2R-välitteisen apoptoosin DU145-soluja. Suuri määrä todisteita osoittaa, että TRAIL, apoptoosin indusoiva ligandi, laukaisee apoptoosin useissa syöpäsolulinjoissa ilman toksisuutta normaaleille soluille [23]. TRAIL on vähintään neljä solun pinnan reseptoreihin, ja se indusoi apoptoosia kahden läheisesti liittyvät reseptorit, TRAIL-R1 ja TRAIL-R2 [24]. TRAIL-R1 ja TRAIL-R2 indusoi FADD riippuvaisen apoptoosin ja aktivoimaan NF-kappaB reitin [25]. Membraaniin sitoutunut TRAIL /sen reseptoreita konstitutiivisesti suurina määrinä primaarinen ja metastaattinen karsinoomia lähes kaikilla potilailla [26]. Tutkimuksemme tässä esitetyt osoitti, että TNFSF10 (TRAIL) on alassäädetty taas TRAIL-R2 oli säädellään ylöspäin AT2R-yli-ilmennetään DU145 soluissa. Mielenkiintoista, downregulation TRAIL-R2 tehostaa merkittävästi apoptoottisten aiheutuvaa AT2R yli-ilmentymisen. Tuloksemme osoittivat myös, että apoptoosin oli havaittavissa kun TRAIL-R2, joka pudotettiin vain. Näin ollen meidän kokeet viittaavat siihen, että TRAIL ja TRAIL-R2 voi olla negatiivinen sääntelyviranomaisten AT2R-välitteistä apoptoosia in DU145-soluissa, ja yhdistetyt käsittely AT2R yli-ilmentymisen ja TRAIL-R2 downregulation voisi olla lupaava uusi geeniterapian ihmisen eturauhassyöpää.

Jotkut kasvainsolut ovat vastustuskykyisiä TRAIL-indusoitua sytotoksisuutta, vaikka TRAIL on raportoitu indusoivan apoptoosia eri kasvainsolutyypit [27], [28]. Epäonnistuminen apoptoosiin on liitetty vastus syöpäsolujen TRAIL valvontaa ja näin ollen kasvainten kehittymiseen. Molekyyli- determinantit TRAIL-indusoitua apoptoosia ei ole kattavasti tutkittu ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. LNCaP ja DU145 eturauhassyövän solut ovat resistenttejä TRAIL-indusoitua apoptoosia ja TRAIL oli vähemmän aktiivinen heitä vastaan ​​vertaa PC-3 eturauhasen syöpäsolujen [29], [30]. Herkkyys TRAIL-indusoitua apoptoosia voidaan korreloi suhteellisia ilmauksia TRAIL-R1 ja TRAIL-R2 versus DcR1 ja DcR2 tai solunsisäisiä tasoja Flame-1 [31], [32]. Kuitenkin verrattuna LNCaP-solut, jotka on pienin herkkyys TRAIL-indusoitua apoptoosia, erittäin herkkiä PC-3-solut näytetään sama tai pienempi proteiinin tasoja TRAIL-R1 ja TRAIL-R2 ja suurempi DcR2 [30]. On myös havaittu, että ekspressio TRAIL-R1 ja TRAIL-R2 TRAIL-herkkien MCF10A solulinja ei poikkea resistenttejä solulinjoja, esim., 184B5 [33]. Tämän vuoksi on epätodennäköistä, että herkkyys TRAIL: n indusoiman apoptoosin on täysin kontrolloida suhteelliset määrät TRAIL-R1 ja TRAIL-R2. Se ehdottaa, että muut tekijät tai muut mekanismit voivat olla tärkeitä säätelijöitä herkkyyttä TRAIL: n indusoiman apoptoosin näissä syöpäsoluissa. Luultavasti tässä tutkimuksessa TRAIL-R2 negatiivisesti säätelevä AT2R välittämää apoptoosia DU145 soluissa auttaa meitä tutkimaan mekanismeja herkkyys TRAIL: n indusoiman apoptoosin erilaisissa soluissa.

Erittäin tuoreen havainto, että TRAIL-R2, ajatus vain toimi, kun stimuloidaan TRAIL solun pinnan, täyttää erillisen funktion tumaan, jossa se edistää soluproliferaatiota TRAIL-riippumattomalla tavalla viittaa tietyn, proliferaatiota liittyvä toiminto ydin- TRAIL-R2 [34]. Nuclear TRAIL-R2 estää kypsymisen mikroRNA let-7 haimasyövän solulinjoissa ja lisää niiden leviäminen. Haimakasvaimesta näytteet on kohonnut ydin- TRAIL-R2, joka korreloi huonon lopputuloksen kanssa potilaista [34]. Nämä havainnot osoittavat, että tumassa, kuolemareseptorien voivat toimia kasvaimen promoottorit ja ehkä terapeuttisina kohteina, ja ihminen auttaa meitä edelleen tutkittiin suhdetta AT2R ja TRAIL-R2.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että HRK (pro -apoptotic BH3-only Bcl-2-perheen jäsen, Harakiri) on pro-apoptoottisen geenin useita soluja [35] – [41]. HRK inaktivaatio liittyy alhainen apoptoottisten indeksi toissijainen glioblastomas [42]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että HRK oli säädellään ylöspäin AT2R-yli-ilmennetään DU145 ja PC-3-solut, ja kun HRK hiljennettiin, AT2R välittämän apoptoosin vähensi merkittävästi PC-3, mutta ei DU145 soluja. Nämä tiedot osoittavat, että indusoiman apoptoosin AT2R yli-ilmentyminen on ainakin osittain riippuvainen HRK PC-3-soluja. On myös osoitettu, että ekspressiotasot HRK nostettiin PC-3-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Yhdessä meidän Tulokset osoittivat, että indusoiman apoptoosin yli-ilmentyminen AT2R voi olla riippuvainen HRK pro-apoptoottisen reitin PC-3-soluja. On kuitenkin olemassa joitakin avoimia kysymyksiä, kuten mekanismi apoptoottisen reitin välillä AT2R kohteeseen HRK ei ollut esitetty ja onko HRK voisi käynnistää apoptoosin muita eturauhasen syöpäsoluja.

Aikaisemmat kokeet osoittavat että AT2R indusoiman apoptoosin on ligandi (Ang II) riippumaton, välittämän p38 MAPK ja kaspaasi-3, ja sitä esiintyy kautta ulkoisen solukuoleman signalointireitin [12].