Krooninen sairaus

tiivistelmä

Klotho tunnistettiin ensimmäisen kerran vuonna 1997 ja on pidetty anti-aging-geenin. Kehittyvät näyttö osoittaa, että klotho on läheinen suhde syöpiä, kuten keuhkosyöpä, rintasyöpä, jne, estämällä lisääntymistä ja edistää apoptoosia syöpäsolujen. Sisplatiini on yleisimmin käytetty huume ensilinjan kemoterapiaa. Kuitenkin kasvu sisplatiini-resistenttien syöpäsolujen on tullut merkittävä este kliinisen hoidon syöpiä. Tutkimuksessamme olemme ensimmäistä kertaa osoittaneet, että klotho voisi lieventää vastus keuhkosyöpä sisplatiinin kemoterapiaan ja apoptoosin resistenttien solujen klotho yli-ilmentyminen oli merkittävästi lisääntynyt. Kuitenkin klotho pudotus solut osoitti parannettu kestävyys kemoterapiaa. Tarkempi analyysi osoitti, että esto PI3K /Akt-reitin erityisiä estäjä (LY294002) vaimensi edistävää vaikutusta syövän kasvua seuraavien häiritsee klotho shRNA. Lisäksi olemme osoittaneet, että klotho moduloitu vastus sisplatiiniin vierassiirrännänmallissa nude hiirimallissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että klotho voisi parantaa vastustuskykyä keuhkosyövän soluja kemoterapiaa ja voi toimia mahdollisena kohteena olevan geenin keuhkosyöpien terapiassa resistentti sisplatiinia kemoterapiaan.

Citation: Wang Y, Chen L, Huang G, hän D, hän J, Xu W, et al. (2013) Klotho herkistää ihmisen keuhkosyövän solulinjassa Sisplatiini kautta PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 8 (2): e57391. doi: 10,1371 /journal.pone.0057391

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 24 tammikuu 2013; Julkaistu: 21 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Natural Science Foundation of China (nro 30971320). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus 75-85% keuhkosyöpää ja kemoterapia on tärkeä rooli hoidossa keuhkosyövän [1]. Sisplatiini on yleisimmin käytetty huume ensilinjan kemoterapiaa. Sisplatiini voi aktivoida useita signalointireittejä, joihin kuuluvat myös ATR, p53, p73, ja MAPK, ja aktivoi apoptoosin [2], [3]. Sen sytotoksisuus johtuu muodostumista DNA additiotuotteiden, jotka aiheuttavat yksilöiden välisiä ja lohkon ristisilloitukseen joka estää DNA: n replikaatiota. Kuitenkin vastus keuhkosyöpään kemoterapia on ollut merkittävä tekijä, joka vaikuttaa terapeuttisen tehokkuuden hoidettaessa keuhkosyöpää. Siten on välttämätöntä kehittää strategioita parantaa vastustuskykyä ihmisen keuhkosyöpään Platin kemoterapiaan. Taustalla oleva mekanismi vastus syöpäsolujen kemoterapia on monimutkainen ja siihen liittyy aktivointi PI3K /Akt (tunnetaan myös PI3K /PKB) reitin menetys p53-toiminto, yli-ilmentyminen HER-2 /neu, ja anti-apoptoottiset Bcl -2, ja vaarantaa kaspaasin aktivaatio [2], [3]. Näin ollen, syvästi tutkia taustalla oleva mekanismi vastus syöpäsolujen kemoterapia on suuri kliininen merkitys syövän hoidossa.

Klotho on äskettäin löydetty anti-aging-geenin ja alun perin tunnistettu klotho homotsygoottista mutanttihiirissä ( kl – /-), joka oli ihmisen kaltainen ikääntymiseen liittyvä oireyhtymä ja kehittää useita häiriöitä, kuten hypogonadismi, ektooppinen kalkkeutuminen, osteoporoosi, ihon atrofia, ja keuhkolaajentuma [4]. Kuitenkin hiirten klotho yli-ilmentyminen on laajennettu käyttöikä, joka on 30% pidempi miehillä ja 20% pidempi naisilla [5]. Klotho geeni koodaa single-pass-tyypin 1 kalvonläpäisevä tai eritetyn muodon klotho proteiinin vaihtoehtoisen Silmukointi [6]. Klotho on osoitettu olevan estävää vaikutusta insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1 (IGF-1) reitin sekä ihmisen eläimet syöpäsoluja ja haiman syöpäsoluissa [7], [8]. Aikaisemmat Tutkimuksessa todettiin myös tämä ilmiö ihmisen keuhkosyövän soluja (A549-solut), joissa klotho myös siirrettävä proapoptoottinen vaikutus kautta Bax /Bcl-2-reitin [9]. PI3K /Akt-reitti on yksi tärkeä alas-virtoja IGF-1-reitin, ja lukuisat tutkimukset ovat vahvistaneet sen rooli apoptoosin syöpäsoluissa [10] – [12], ja se voisi sensitisize nämä syöpäsolut sisplatiinia.

tässä tutkimuksessa, teimme olettamuk- klotho voi estää PI3K /Akt-reitillä ja edelleen lievittämään vastus keuhkosyövän soluja sisplatiinin ja se voi toimia voimakas ehdokas geeniterapian keuhkosyöpään.

materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Nanjing Medical University (Luvan numero: 2120474). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjaa (A549) saatiin American Type Culture Collection (ATCC). H460-solujen ja sisplatiini kestävä A549 ja H460 (A549DDP ja H460DDP) solut ystävällisesti antamat professori Zhou Shanghaissa Keuhkojen sairaalassa. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI 1640: ssä (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Life Technologies, Inc.), 100 U /ml penisilliiniä, 100 U /ml streptomysiiniä, 2 mM glutamiini kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa. Ylläpitää lääkeresistenssi, A549 /DDP ja H460 /DDP soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, joka sisälsi 2 ug /ml DDP ja sitten DDP RPMI 1640 kaksi päivää ennen kokeita. A549DDP solut oli 80% konfluenssiin transfektoitiin pCMV6-MYC-KL ja sen erityisiä shRNAs läsnä ollessa lipofektamiini 2000 (Invitrogen). ShRNAs olivat seuraavat:

sh-1: CCTAAGCTCTCACTGGATCAATCCTCGAA;

sh-2: CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT;

sh-3: GGTCACTCACTACCGCTTCTCCATCTCGT;

SH- 4: GTTACAGCATCAGGCGTGGACTCTTCTAT;

Kaikki plasmidit hankittiin Origene (Rockville, MD, USA).

MTT-määritys

puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC50) A549DDP ja A549-soluja määritettiin MTT: tä (3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) määritystä (Sigma). Syövän solut ympättiin 96-kuoppalevyille (1 x 10

4 solua per kuoppa), ja sitä käsiteltiin sisplatiinin eri pitoisuuksina 48 tuntia. Inkuboinnin jälkeen väliaine korvattiin 50 ui MTT-reagenssia (2 mg /ml), minkä jälkeen inkuboitiin edelleen atmosfäärissä, 5% CO

2 37 ° C: ssa 2 tuntia. Sitten alustat poistettiin ja dimetyylisulfoksidi (DMSO) (150 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Optinen tiheys (OD) kuhunkin kuoppaan mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa 560 nm: ssä.

morfologinen tutkimus

Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen soluja käsiteltiin 80 uM (IC50 A549DDP) sisplatiinia 8 tunnin ajan, ja 60 uM H460DDP, ja sitten pestiin kerran fosfaattipuskurisuolaliuoksessa (PBS), minkä jälkeen kiinnittäminen kylmässä methonal: asetonia (1: 1) 5 min. Pesun jälkeen kolmesti PBS: llä 5 minuutin ajan, näitä soluja käsiteltiin 4 ug /ml 4 ’, 6-diamidine-2’-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI) (Sigma) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut tutkittiin fluoresenssimikroskopialla. Solut valittiin satunnaisesti tutkittavaksi suurella suurennuksella (x 400) ja valokuvattiin. Sekä normaalit solut (iso ydin-, hajonta ja homogeeninen fluoresenssi) ja apoptoottisten solujen (ydin- kutistuminen ja hyperchromatic tumat) laskettiin kunkin kentän.

Virtaussytometria

Solut kerättiin ja varovasti eriteltyjä kohteeseen yksisolususpensio. Värjäys tehtiin mukaan valmistajan protokollaa. Määrä indusoiman apoptoosin syöpälääkkeiden hoito analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-FITC /PI-kittiä (BD Biosciences, San Diego, CA) seuraten valmistajan ohjeita.

Reaaliaikainen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin soluista, joissa TRIzol reagenssia (Invitrogen, San Diego, CA) valmistajan ohjeiden ja kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 260 nm: ssä. Geeniekspressioiden havaittiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (qRT-PCR) käyttäen standardi SYBR Green RT-PCR-kittiä (Takara, Dalian, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. CDNA syntetisoitiin käyttäen RevertAid Ensimmäisen Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Vilna, Liettua) mukaan valmistajan ohjeiden. Alukesekvenssit suunniteltiin Origene Technologies, Inc. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat:

klotho

sense: 5′-GCTCTCAAAGCCCACATACTG -3 ’;

antisense: 5′ -GCAGCATAACGATAGAGGCC -3 ’;

β-aktiini

sense: 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′;

antisense: 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 ’;

PCR-olosuhteet koostuivat ennalta denaturointi 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä denaturointi 94 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekuntia ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 min.

Western blot -määritys

24 h ja 48 h transfektion jälkeen solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja proteiinit uutettiin soluista hajottamalla solut RIPA-puskurissa (150 mM NaCl, 1% [v /v] NP-40, 0,5% [w /v] natriumdeoksikolaatti, 0,1% [w /v] natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 50 mM Tris-HCI [ ,,,0],pH 8], 10 mM EDTA, ja 1 mM PMSF [Sigma]) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja sen jälkeen sentrifugoimalla 15 minuuttia 12000 g. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-pakkausta (Pierce) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten, 60 ug proteiinia ladattiin 10% (w /v) SDS-polyakryyliamidigeelillä, elektroforeesi ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore Corporation Billerica, MA 01821), joka tämän jälkeen estettiin 2 h huoneen lämpötilassa, jossa esto puskuria (TBS, joka sisälsi 0,1% [v /v] Tween 20 [Sigma] ja 5% [paino /tilavuus] maitojauhetta). Primaaristen vasta-aineiden (sovelletaan 1 h huoneen lämpötilassa, tai yön yli 4 ° C) olivat: anti-fosfo-akt, anti-akt, (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), anti-Bax, anti-klotho ja anti-GAPDH (Santa Cruz). Vasta-aineet laimennettiin 1: 1000, lukuun ottamatta anti-GAPDH-vasta-ainetta (1: 500). Sen jälkeen kalvoja inkuboitiin 2 h HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) (hevonen anti-hiiri tai vuohen anti-kani, 1: 20000). Visualisointi tehtiin käyttämällä ECL kit, ja signaalit kvantitoitiin skannausdensitometrialla.

transduktio lentivirustartunnat

lentivirusvektoreita ilmentävät lyhyt hiusneula-RNA: iden (shRNAs) onnistuneesti rakennettiin Origene (Rockville , MD, USA), kuten aiemmin on kuvattu. Tehokkaasti rakennettu klotho-shRNA oligonukleotidisekvenssien olivat seuraavat, sense: 5′-

CGCGTCCCC

CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT

TCAAGAGAGGTCAATCCAGGAAAGCAGTTGCCTCAGTTTTTGGAAAT

-3′.

The sekvenssit insertoitiin

mul

I ja

CLA

I entsyymi kohtiin pLVTHM vektorin, vastaavasti. Rekombinaation reaktiossa käyttäen pCMV-dR8.74 ja pCMV-VSV-G-vektoreita (

Addgene

, Cambridge, MA), lentivirusvektori-DNA: ita ja pakkaus vektorit transfektoitiin sitten 293T-soluihin. 48 h jälkeen transfektion, supernatantit sisältävät lentivirukset kerättiin, sentrifugoitiin 1800 g: ssä 10 minuutin ajan, ja suodatetaan 0,45 um: n poly (vinylideenidifluoridin) Durapore-kalvon (Millipore, Billerica, MA, USA) poistaa kaikki tarttumattomat pakkaus soluja. Resistenttejä keuhkosyövän solulinjassa (A549DDP) infektoitiin lentivirus. Sitten infektoidut solut valitaan puromysiini (0,4 ug /ml) ja 14 päivää. A549DDP solut infektoitu lentiviruksen välittämää shRNA kohdistaminen klotho (sh-klotho) tai lentivirusta välittämää shRNA (ryntäily) nimettiin A549DDP-lenti-sh-2 tai A549DDP-Lenti-ryntäily, vastaavasti.

In vivo kokeet nude-hiirissä

in vivo kokeissa Mies atyymisissä nude-hiiriin (BALB /c nu /nu, neljän viikon ikäinen) käytettiin. Ne injektoitiin subkutaanisesti A549DDP-lenti-sh-2 tai A549DDP-sh-scramble soluissa. Kun kasvaimet mitataan keskimääräinen tilavuus 100 mm3, hiiret (6 ryhmää kohti), käsiteltiin sisplatiinin (3,5 mg /kg, 2 kertaa viikossa) tai PBS: ää 21 päivää. Kasvaimet mitattiin jarrusatulat. Kasvaintilavuudet lasketaan seuraavalla kaavalla: kasvaimen tilavuus (mm3) = 0,5 * pituus (mm) * leveys (mm) * leveys (mm).

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistiin keskiarvo ± keskihajonta (SD). Kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena. Vertailut tehtiin kaksisuuntaisella Studentin t-testillä tai ANOVA. Arvo

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Klotho ilmentyminen alassäädetty sisplatiini- resitant solujen

Vahvista vastus A549DDP ja H460DDP solujen MTT-määritystä tehtiin mitata IC50 A549-soluja ja A549DDP soluja. Tulokset osoittivat IC50 oli 17,7 ± 1,93 uM A549-soluja ja 86,6 ± 13,2 pM A549DDP soluissa, kun taas H460DDP ja sen emosolulinjan olivat 63,5 ± 3,8 ja 27,7 ± 2,0 vastaavasti (kuvio 1A). Ilmentyminen klotho määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä ja western blot-määrityksellä. Suhteellinen mRNA-tasolla ja klotho in A549DDP-soluissa oli noin 35% alhaisempi kuin A549-soluja (kuvio 1 B). Western blot-määritys oli sama suuntaus proteiinin ilmentymistä klotho molemmissa solulinjoissa (kuvio 1 C). Lisäksi tunnistimme ilmaus klotho ja IC50 muissa solulinjoissa, mukaan lukien H1299, PC-9, H1650 ja MCF-7 (kuvio 1C), ja olemme havainneet, että endogeeninen klotho ilmaisuja negatiivisesti liittyy sisplatiinin herkkyys (kuvio 1C) ja tilastollinen analyysi osoitti käänteinen suhde klotho ilmaisuja ja IC50. Niinpä arveltu, että siellä oli suhde klotho ilmaisun ja vastustuskykyä sisplatiinin ja klotho ilmaisun voisi edistää vastus.

V: Kaksi solulinjojen sisplatiinia osoitti eroa IC50. B: Kvantitatiivinen RT-PCR: n havaitsemiseksi klotho ilmentymisen A549-soluja ja A549DDP soluja. C: Western blot-analyysi klotho ilmentymisen paneelin keuhkosyövän solulinjat mukaan lukien kaksi sisplatiini resistenttejä variantteja ja rintasyövän solulinjan (MCF-7). Klotho ilmentyminen on suurempi vanhempien H460, ja A549-solulinjoissa, verrattuna sisplatiinin resistenttejä variantteja. Korkeampi Klotho ekspressiota havaittiin myös H1299, PC-9, H1650 ja MCF-7-solulinjoissa. GAPDH toimi sisäisenä viitteenä. Detektio suoritettiin kolmena kappaleena ja tiedot esitettiin keskiarvona ± SD (* P 0,05)

yli-ilmentyminen klotho voi estää Akt signaalireitin ja indusoida A549 /DDP soluja

roolin määrittämiseksi klotho, että sisplatiini-vastus sisplatiinin resistentit solut, ensin havaitaan p-AKT ilmentymisen A549, H460 ja niiden sisplatiini resistentit solut. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen fosforyloidun Akt oli pienentää merkittävästi A549 ja H460-soluissa (kuvio 2A). Sitten syöpäsoluja klotho yli-ilmentyminen valmistettiin. Kuten kuviossa 2C on esitetty, proteiini ilmauksia klotho molemmissa solulinjoissa lisääntyivät merkittävästi transfektion jälkeen. Vaikutus klotho yli-ilmentyminen on vastuksen A549 /DDP ja H460 /DDP soluja sisplatiinin määritettiin MTT: llä. Data on esitetty kuvassa 2B. Leviämisen transfektoitujen solujen klotho merkittävästi tukahdutti verrattuna kontrolliryhmään. Keskimääräinen IC50 oli pienempi klotho transfektoiduissa soluissa ymmärtää, että nämä solut olivat herkempiä sisplatiinia. Lisäksi ilmaisu fosforyloidun Akt negatiivisesti liittyvät klotho ilmentymisen, solujen klotho yli-ilmentyminen oli vähentynyt ilmentyminen fosforyloidun Akt verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 2C). Sitten, havaitsimme apoptoosin soluissa olevien klotho transfektiota. DAPI-värjäys on menetelmä apoptoosin havaitsemiseen. Apoptoottiset solut morfologisesti esittelee ominaisuuksia apoptoosin seuraavista DAPI värjäys: kirkas ydin- tiivistyminen ja perinuclear apoptoottisia kappaleita. Virtaussytometria on tekniikka laskentaa tutkimalla ja lajittelu mikroskooppiset hiukkaset juoksevan nesteen. Se mahdollistaa samanaikaisen moniparametrisissä analyysi fysikaalisten tai kemiallisten ominaisuuksien yksittäisten solujen läpi virtaavan elektroninen tunnistus laitetta, ja se on yleisesti käytetty havaitsemaan apoptoosia. Western blot määritys paljasti, että ilmaus Bax ja Bcl-2 oli samat trendit kuin virtaussytometrialla ja DAPI värjäytymistä (kuvio 2D). DAPI värjäys osoitti lukumäärä apoptoottisten solujen klotho yli-ilmentyminen oli kasvanut dramaattisesti verrattuna joilla on meneillään transfektiolla tyhjä plasmidi, mutta apoptoosin käsiteltyjen solujen tyhjä plasmidi oli verrattavissa kontrolliryhmän (kuvio 2E). Virtaussytometria analyysi osoitti, että apoptoosin A549DDP transfektoitujen solujen klotho oli 47%, kun taas H460DDP oli 19,8%, mikä tarkoittaa, että ne olivat herkkiä sisplatiinille verrattuna negatiivisiin kontrolleihin (kuvio 2F). Nämä havainnot ehdottivat, että klotho voisi lisätä herkkyyttä sisplatiinin resistenttien solujen sisplatiini nostamalla apoptoosin Akt riippuvaisella tavalla.

A, B: Western blot -määritys osoitti p-Akt ekspressio oli lisääntynyt merkittävästi soluissa vastustuskykyisiä sisplatiinille. C: MTT-analyysi osoitti suurta laskua IC50 klotho transfektoitujen solujen. D: Western blot -määritys osoitti kohonnut ilmentyminen klotho sisplatiinin resistentit solut. P-Akt ilmentyminen säädellä vähentävästi sisplatiinin resistenttien solujen jälkeen klotho transfektion. GAPDH toimi sisäisenä viitteenä. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tiedot esitetään keskiarvona ± SD (* P 0,05)

Lisäksi tutkimme fenotyypin lääkeaineen-resistenttien solujen ja kantasolujen, ja olemme havainneet, että ERCC1 oli alas-säädellä klotho transfektoiduissa soluissa, kun taas p-gp geeni liittyy lääkevuoto-, ja vaikutti eniten sisplatiinin vastus, ei vaikuttanut klotho (kuvio 2C). Nämä tulokset ymmärtää, että klotho voivat vaikuttaa korjaus solujen kautta ERCC1 muuttaa vastus syöpäsolujen sijaan lisätä energian riippuvainen ulosvirtaus hydrofobinen lääke.

Klotho pudotus inhiboi apoptoosia ja lisääntyneen resistenssin sisplatiinia A549 /DDP soluja

tutkimiseksi edelleen roolia klotho vastus solujen kemoterapiaa, klotho pudotus tehtiin A549DDP ja H460DDP soluja, joilla on erityisiä shRNAs. Neljä shRNAs suunniteltiin ja transfektoitiin A549DDP tai H460DDP soluja, kuten on kuvattu edellisessä tutkimuksessa, jossa tulokset osoittivat, että sh-2 osoitti parhaan häiriöitä tehokkuutta [9]. Tässä tutkimuksessa sh-2 käytettiin seuraavissa kokeissa. Kuten kuviossa 3B on esitetty, Western blot-määritys osoitti, että ekspressio klotho oli merkittävästi alas-säätelee noin 50% verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään molemmissa solulinjoissa. Tämän jälkeen olemme tutkineet vaikutusta klotho pudotus on herkkyys resistenttien solujen sisplatiiniin jossa MTT-määritystä käytettiin tutkimaan IC50 A549DDP ja H460DDP-soluissa (kuvio 3A). Tulokset osoittivat IC50 shRNA transfektoitujen solujen oli selvä kasvu IC50 verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään. Erityisesti A549DDP soluissa, keskimääräinen IC 50-transfektoitujen solujen shRNA oli 452,5 ± 20,69 uM (kuvio 3A).

V: ERCC1 ja p-gp-proteiinin tasot sisplatiinin resistentit solut tunnistettiin Western blot. B: A549DDP ja H460DDP solut transfektoitiin klotho erityisiä shRNA tai salattu RNA: ta negatiivisena kontrollina. MTT-analyysi osoitti lisääntynyttä IC50: llä transfektoitujen solujen shRNA. C: Western blot -määritys vahvisti klotho ilmentyminen alassäädetty soluissa transfektion jälkeen kanssa shRNA. D: p-Akt havaittiin myös Western blot-määrityksellä. Tulokset osoittivat p-Akt ilmentyminen säädelty merkittävästi seuraavien shRNA Transfektiomenetelmätapa. GAPDH toimi sisäisenä viitteenä. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tietojen wer esitetään keskiarvona ± SD (* P 0,05).

Lisäksi ilmaisu koko-Akt, fosfo-Akt (p-Akt), Bax ja Bcl -2 tutkittiin klotho shRNA transfektoiduissa soluissa. Western blot-määritys osoitti, että klotho pudotus johti merkittävään kasvuun ilmentymisen fosfo-Akt (kuvio 3C) ja BCL-2, mutta voimakas lasku ilmentymisen Bax (pro-apoptoottinen proteiini) (kuvio 2D). DAPI värjäys paljasti apoptoosin solujen meneillään shRNA transfektio heikkeni merkittävästi osoitettiin mikroskoopilla verrattuna soluihin sai transfektio scramble shRNA (kuvio 2E). Virtaussytometria osoitti, että apoptoosin soluissa oli 0,2% A549DDP ja 0,1% H460DDP verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu sekoituskoodin (kuvio 2F). Nämä havainnot osoittivat, että klotho alassäätöä vähensi apoptoosin kautta johtaa epätasapainoon ilmentyminen apoptoosin liittyvien proteiinien (Bax ja Bcl-2).

Lisääntynyt vastus seuraavat klotho alassäätöä lievitti Akt esto kanssa LY294002

edelleen tutkia, klotho voisi parantaa vastustuskykyä sisplatiinin resistenttien solujen cispaltin kautta säätelemällä p-Akt ilmentymisen, jotka on transfektoitu klotho erityisiä shRNA käsiteltiin 10 uM ja 40 uM LY294002, joka on phosphoinositide- 3 estäjä, valaista roolia Akt että lisääntyneen resistenssin kemoterapiaa seuraavat klotho knockdown. LY294002 inhiboi merkittävästi ekspressiota p-Akt on shRNA transfektoiduissa soluissa, erityisesti käsittelyn jälkeen 40 uM LY294002 (kuvio 4A), verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään. Sitten MTT-määritystä käytettiin määrittämään herkkyyttä näiden solujen sisplatiinia. Kuten on esitetty kuviossa 4B, IC50 A549DDP käsiteltyjen solujen LY294002 10 uM ja 40 uM oli 92,97 ± 10,04 uM ja 50,52 ± 5,63 uM, vastaavasti, jotka olivat selvästi pienempi kuin vertailuryhmässä (452,5 ± 20,69 uM; P 0,01), ja samat muutokset nähtiin H460DDP soluissa. Sen vuoksi, 40 uM LY294002 käytettiin seuraavissa kokeissa. Kuten kuviossa 2D, Bax, pro-apoptoottisen proteiinin, oli merkitsevästi säädelty soluissa meneillään LY294002 kohtelun kuin soluja ilman hoitoa PI3K /Akt estäjä. Päinvastoin, ilmaus bcl-2-oli merkittävästi alassäädetty jälkeen LY294002 hoidon. Lisäksi DAPI-värjäyksellä ja virtaussytometrialla (kuvio 2E, F) osoitti samat tulokset. Nämä havainnot ehdottivat, että klotho voisi lievittää vastus syöpäsolujen kemoterapeuttisia säätelemällä apoptoosin PI3K /Akt signaalireitin riippuvaisella tavalla.

: A549DDP ja H460DDP transfektoitujen solujen shRNA käsiteltiin LY294002 (10 ja 40 uM). Western blot määrityksessä osoitti, että LY294002 voisi merkittävästi alentaa p-Akt ilme, etenkin hoidon jälkeen 40 uM LY294002. B: transfektoidut solut shRNA käsiteltiin LY294002 eri pitoisuuksina, ja MTT-määritys suoritettiin mittaamaan IC50. C: Apoptosis liittyvät proteiinit, Bax ja Bcl-2, on havaittu. Tulokset osoittivat klotho yli-ilmentyminen voi lisätä Bax /Bcl-2-suhde, kun klotho knockdown vähensi sitä. LY294002 voisi kääntää laski suhde seuraavat shRNA transfektion. GAPDH toimi sisäisenä viitteenä. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja tiedot esitetään keskiarvona ± SD (* P 0,05, ** P 0,01).

Klotho Knockdown

in vivo

huomattavasti vastus keuhkosyövän solujen sisplatiini

Perustuu

in vitro

kokeilu klotho että sisplatiinin vastus keuhkosyövässä, me tarkemmin, onko klotho lauseke vaikuttaa cispaltin herkkyys

in vivo

, A549DDP-lenti-sh-2 ja A549DDP-lenti-scramble solua injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen nude-hiirten. Sisplatiini voi huomattavasti estää kasvaimen kasvua hiirissä, joihin injektoitiin A549DDP-lenti-sekoituskoodin soluja verrattuna fosfaattipuskuria ohjaus, kuitenkin, hiiriä, joihin injektoitiin A549DDP-lenti-sh-2-soluissa ei havaittu merkittävästi inhibitiota verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 5A) . Western blot osoittivat lisäksi, että ilmaus klotho in A549DDP-Lenti-sh-2 kiinteät kasvaimet oli heikko, kun se oli positiivinen ryntäily valvontaa kiinteä kasvain. Samanlaisia ​​tuloksia

in vitro

tutkimuksissa havaittiin ilmentymisen p-Akt (kuvio 5B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että klotho myötävaikuttaa sisplatiinin resistenssin keuhkosyöpäsoluissa vierassiirrekokeissa kasvainmuodosta, ja PI3K /Akt oli mukana menettelyssä.

V: apoptoosi Solujen analysoitiin virtaussytometrialla. B: Apoptosis solujen suoritettiin DAPI-värjäyksellä. Lyhennetty chromatin tutkittiin fluoresens- mikroskoopilla. C:

In vivo

chemoresistance määritys klotho pudotus soluja. Ksenograftin kasvaimen tilavuutta hiirillä sisplatiinia tai fysiologinen suolaliuos on esitetty. Kasvaimen tilavuus on esitetty keskiarvona ± SD. D: n ilmentyminen klotho ja p-Akt kasvainkudoksessa hiiristä.

Keskustelu

Vastus syöpäsolujen kemoterapia on ollut yksi suurimmista haasteista kliinisessä hoidossa syövät. Edellisessä tutkimuksessa, tulokset osoittivat, että uusi anti-aging geeni klotho oli ratkaiseva leviämisen ja apoptoosin keuhkosyövän soluja (A549-solut), pääasiassa estämällä IGF-1 /R-reitin [9]. Akt, joka on seriini /treoniini-kinaasi, on tärkeä rooli syövän synnyssä [13] – [15], ja muuttunut ilmentyminen Akt on havaittu useissa erilaisissa ihmisen syövissä [16] – [18]. Akt on myös keskeinen alavirran proteiini IGF-1 /R-reitin. Lisääntyvä todistusaineisto tukee tätä Akt on mukana vastus syöpäsolujen kemoterapiaa ja sädehoitoa [18], [19]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat havainneet, että inhibitio Akt aktivointi voi vähentää solujen eloonjäämistä ja parantaa sisplatiinin vastus [20], [21]. On todettu, että Akt osallistuu sisplatiinin kestävä useisiin syöpiin [22] – [24]. Kun aktivoitu PKB /Akt on fosforyloip ja aktiiveja kohdistaa proteiinien mukana monissa eri solun toimintoja, jotka kattavat solusyklin etenemistä, solujen eloonjäämistä, ribosomien biogeneesin, proteiini käännös ja solun liikkuvuus 25-27. Klotho löydettiin alunperin 1997 otaksuttu ikääntymiseen estävä geeni hiirissä että pidentää elinikää, kun yliekspressoidaan ja aiheutti ennenaikaista ikääntymistä oireyhtymä kun häiriintynyt [5]. Koska klotho voi estää IGF-1 /R-signalointireitin edellisessä tutkimuksessa, ja autofosforylaation IGF-1 R indusoi aktivointi Akt fosfory-, me arveltu, että klotho voisi lievittää vastus keuhkosyövän soluja (A549DDP ja H460DDP solut) terapeuttisia aineita, jossa Akt on tärkeä rooli.

esillä olevassa tutkimuksessa, sisplatiini resistenttejä NSCLC-soluja (A549DDP ja H460DDP soluja) ja sen vanhemman (A549 ja H460-solut) käytettiin kokeisiin. Ensinnäkin klotho ilmentyminen mitattiin molemmissa solulinjoissa, ja tulokset osoittivat klotho ilmentymistä sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoilla resistentit solut oli merkittävästi laskenut verrattuna kantasolujen (P 0,05). Ilmaisulla p-Akt että sisplatiinin resistentit solut oli merkittävästi suurempi kuin, että kantasoluja. Lisäksi korkea IC50 vähensi merkittävästi A549DDP ja H460DDP solujen jälkeen klotho säätelyä ylöspäin. Kuitenkin klotho alassäätöä transfektiolla erityisiä shRNA lisäsi vastustuskykyä sisplatiini, mukana lisääntyminen p-Akt ilme. Aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet Akt tärkeä proteiinin IGF-1 välitteistä solujen eloonjäänti [28]. Konstitutiivisesti, Akt aktivointi estää päässä soluväliaineen indusoiman apoptoosin [29]. On 2 päämekanismia lääkeresistenssin solut: ensimmäinen, erilaisia ​​muutoksia soluissa, jotka vaikuttavat kykyyn sytotoksisten lääkkeiden tappaa soluja, mukaan lukien muutokset solusyklin, parannettu DNA korjaukseen aktiivisuutta, viallisen apoptoosireittiä, muuttaa metaboloituvien lääkeaineiden, jne; Toinen, lisääntynyt energiariippuvainen ulosvirtaus hydrofobisten lääkeaineiden, edustaa yliekspressio perheen energiariippuvainen kuljettajat, kutsutaan ATP-sitova kasetti kuljettajat, kuten P-glykoproteiinin (P-gp) [30]. ERCC1 (Leikkauskorjauksessa rajat komplementaatioryhmä 1) on rajoittava tekijä nukleotidin Leikkauskorjauksessa, poistaa DNA additiotuotteet ja korjaukset DNA double-säikeen katkoksia [31], [32]. Korkea ERCC1 korreloivat vastustuskykyä sisplatiiniin kemoterapiaan potilailla, joilla on NSCLC [33], [34]. P-gp oli ensimmäinen löydetty ihmisen ABC transporter, ja sen koodaama MDR1 geeni [35]. P-gp on yksi kliinisesti merkittävä transmembraaninen kuljettajat ja tärkeä rooli lääkeresistenssin. Tunnistaa oleva mekanismi resistanssin solut, olemme edelleen tutkineet ERCC1 ja p-gp-proteiineja transfektoiduista soluista, ja olemme havainneet, että ERCC1 oli merkittävästi vähentynyt klotho transfektoiduissa soluissa verrattuna negatiivisiin kontrolleihin, mutta mitään merkittävää erot nähtiin ilmaus p-gp. Nämä havainnot osoittivat, että klotho vaikuttanut vastus keuhkosyövän soluja sisplatiinin, joka liittyy PI3K /Akt-signaloinnin kautta. Edelleen, klotho voi moduloida korjaava aktiivisuus DNA säätelyn kautta ERCC1, sitten muuttaa vastus syöpäsoluja. Esillä olevassa tutkimuksessa, syvästi roolin tutkimiseksi Akt vastus solujen, olemme huomanneet, että Akt inhibitio sen spesifinen estäjä (LY294002) vähensi kohonnut IC50 seuraavat klotho shRNA transfektion liittyy pelkistämällä p-Akt ilmentymistä. Tunnistaa tulokset

in vitro

, teimme

in vivo

kokeessa nude-hiirissä. Huomasimme, että vähentynyt tuumorin vastaista tehokkuutta

in vivo

liittyi estyminen klotho ilmaisun ja aktivoitua PI3K /Akt-reitin. Nämä tulokset vahvistivat, että klotho, anti-aging geeni, voisivat vähentää vastus A549DDP ja H460DDP sisplatiiniin estämällä Akt signaalireitin.

apoptoosin säätelyyn on monimutkainen ja useita geenejä ovat mukana tässä prosessissa, kuten Bax /bcl-2, solu-säätelevien proteiinien, jne [36]. Tutkimuksemme osoittivat suhde Bax /Bcl-2 on lisääntynyt dramaattisesti sen jälkeen, kun klotho yli-ilmentyminen sisplatiinin resistentit solut, kun taas klotho pudotus laski tämä suhde mukana inhibitio Akt signaalireitin. Tämä oli sopusoinnussa suuntaus p-Akt ilmaisun ja IC50. Olemme havainneet apoptoosin solujen, ja tuloksemme osoittivat klotho ollut keskeinen rooli apoptoosin kemoterapian resistenttien solujen: kasvu klotho ilmentyminen liittyy läheisesti enemmän apoptoottisia. Tulosten perusteella edellä, me spekuloida, että klotho avainasemassa säätelyssä Bax /Bcl-2-suhde, ja voi lievittää vastus A549DDP ja H460DDP solujen kemoterapia edistämällä apoptoosin. Vastus keuhkosyövän solut kemoterapeuttisia on liittyy alhainen klotho ilmaisua.