Krooninen sairaus

tiivistelmä

biomarkkereiden löytö käyttämällä massaspektrometriaa (MS) on viime aikoina lisääntynyt merkittävästi sovelluksissa, lähinnä nopeasti etenevä alalla metabolomiikka. Instrumental ja tietojen käsittelyyn kehittyminen on mahdollistanut kohdistamattomia aineenvaihduntatuotteen analyysit samanaikaisesti kuulustella useita biokemiallisia reittejä valaista taudin fenotyypit ja terapeuttisia mekanismeja. Vaikka useimmat MS-pohjainen metabolomic lähestymistavat ovat yhdessä nestekromatografialla, muutaman viime aikoina julkaistuissa tutkimuksissa käytetty matriisin laserdesorptio (MALDI), mikä mahdollistaa nopean ja suoran näytteen analyysi pienellä näytteen valmistelua. Me ja muut ovat ilmoittaneet, että prostaglandiini E

3 (PGE

3), on johdettu COX-2 aineenvaihduntaa omega-3-rasvahapot eikosapentaeenihappo (EPA), inhiboivat ihmisen keuhko-, paksusuoli- ja haimasyöpä solut. Kuitenkin miten PGE

3 aineenvaihduntaa säädellään syöpäsoluissa, erityisesti ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin, ei täysin ymmärretä. Täällä käytetty menestyksekkäästi MALDI erojen tunnistamiseksi lipidiaineenvaihdunnan kahden ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat, A549 ja H596, jotka voivat edistää niiden ero vaste EPA hoitoon. Analyysi MALDI-MS osoitti, että taso EPA sisällytetty fosfolipidit H596-soluissa oli 4 kertaa suurempi kuin A549-soluja. Kiinnostavaa, H596-solut tuottivat paljon vähemmän PGE

3 kuin A549-soluja, vaikka ilmentymisen COX-2 oli samanlainen näissä kahdessa solulinjassa. Tämä näyttää johtuvan suhteellisesti vähemmän ilmaus sytosolin fosfolipaasi

2 (CPLA ​​

2) in H596-soluissa kuin A549-solut. Lisäksi MALDI-MS lähestymistapaa käytettiin menestyksekkäästi kasvainten kudosuutenäytteitä päässä K-ras siirtogeenisiä hiirimallissa keuhkosyöpään parantaa ymmärrystämme vaikutusmekanismi EPA

in vivo

mallissa. Nämä tulokset korostavat hyödyllisyys yhdistämällä metabolomiikan työnkulun MALDI-MS tunnistaa biomarkkerit, jotka voivat säädellä aineenvaihduntaa omega-3-rasvahappoja ja lopulta vaikuttaa niiden terapeuttista potentiaalia.

Citation: Pirman DA, Efuet E, Ding XP, Pan Y, Tan L, Fischer SM, et al. (2013) Muutokset Cancer Cell Metabolism paljasti Suora Sample Analysis MALDI massaspektrometria. PLoS ONE 8 (4): e61379. doi: 10,1371 /journal.pone.0061379

Editor: Julio Francisco Turrens, University of South Alabama, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 marraskuu 2012; Hyväksytty: 08 maaliskuu 2013; Julkaistu: 26 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Pirman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health apurahan CA144053-01A1. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka paljon vaivaa on omistettu genomista profilointi johtaa tunnistamiseen tiettyjen geenin osien syövän, tietoa metabolomiikka ja lipidomics syöpäsoluissa tai kudoksia on rajallinen. Vaikka metabolomiikka ja lipidomics aiheuttaa teknisten haasteiden kannalta instrumentin valmiudet, toistettavuus, ja tietojen käsittelyyn, nämä alat osoittavat erittäin lupaavilta tarjota kattava yleiskatsaus syöpäsolun aineenvaihduntaa, mikä johtaa uusiin ja mahdollisesti yksilöllisiä hoitoja.

Viimeaikaiset edistysaskeleet matriisissa laserdesorptio /(MALDI) massaspektrometrialla (MS), [1] – [7] ovat lisänneet MALDI: n hyödyllisyys useilla eri uusia sovelluksia. Kehittyneiden kaupallisesti saatavilla instrumentointi, mukaan lukien MALDI kytketty lineaarisen ioniloukku Orbitrap väline tai quadrupolimassaspektrometria-aika-of-lennon (QTOF) massaspektrometrit ovat mahdollistaneet onnistuneen sukupolven massaspektrit alemman massan vaihteluvälit ( 1000 daltonia), mikä mahdollistaa MALDI-MS profilointi metaboliiteiksi mukaanlukien lipidejä, eivät yleensä yhteistä MALDI instrumentointi takia matriisivaikutuksista ja lähde pirstoutumisen [7] – [9]. Nämä edistysaskeleet MS ja ionisaatiota instrumentointi ovat muuttaneet MALDI-MS osaksi lukuisia uusia tutkimusalueita, kuten lipidomics [7], [10] – [12], peptidi [2], huumeiden [13] – [16], ja metaboliitin [17 ] analysoidaan suoraan biologisista näytteistä, kuten kudoksista.

MALDI-MS on hiljattain käytetty menestyksekkäästi suoraan analysoida biologisia näytteitä yhdistää tilastotietoja käsittelyyn. Näitä lähestymistapoja voidaan käyttää erottamaan kudostyypeistä tai tunnistaa säädellään eri tavalla aineenvaihdunnan reittejä. Esimerkiksi sisäiset kirurgiset koettimet kehitetään Balgo,

et al

., Jossa kudos näytteitä aikana poistettu kirurgisella, analysoitiin MS, voidaan sitten luokitella kanssa tilasto-ohjelmalla [18]. Tämä lähestymistapa on mahdollistanut nopean, puolueeton syrjintä sairaiden ja terveen kudoksen ja voitaisiin mahdollisesti käyttää korvaamaan perinteinen histologinen luokitus kirurgisissa kasvaimen kirurgisen poiston. Äskettäin, MALDI-MS on myös käytetty luokitella kasvaimen laadut sekä kasvaimen alkuperän, vaikka ei intrasurgically [5], [19] – [21]. Nämä äskettäin julkaissut tutkimukset osoittavat käytön lisäämisen MALDI-MS suoraan kudoksen analyysi luonnehtia kudoksiin perusteella niiden metaboliitin, lipidien, peptidi, ja proteiiniprofiileja.

Nykyisessä tutkimuksessa käytimme MALDI kytketty QTOF massaspektrometri nopeasti kuulusteluun kaksi NSCLC solulinjojen paljastaa eroja solujen aineenvaihduntaa kalaöljyn johdettu, poly-tyydyttymättömien rasvahappojen (PUFA) eikosapentaeenihappo (EPA). Olemme myös sovitettu tekniikka suoraan analysoida ja luonnehtivat kudosten lipidiaineenvaihdunnan EPA EPA-käsiteltyjen K-ras siirtogeenisen hiiren keuhkokasvaimia sekä nestekromatografia yhdistettynä tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS) ja MALDI-MS tarkistaa

in vitro

MALDI dataa täydentävä lähestymistapa.

Lukuisat prekliiniset tutkimukset ovat tukeneet käsitystä, että kalaöljyn johdettu omega-3-rasvahappoja EPA ja dokosaheksaeenihappoa (DHA) on kyky estää syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio erilaisissa kasvaimen tyypit, mukaan lukien NSCLC [22]. Me ja muut tutkijat ovat raportoineet, että tehokkuus EPA voitaisiin välittyvän sen cyclooxygenase (COX) metaboliitti prostaglandiini E

3 (PGE

3) ihmisen keuhko-, paksusuoli-, ja haiman syöpäsoluja [23] – [25 ]. Toisin kuin DHA, EPA voi myös toimia substraattina COX, erityisesti COX-2, mikä johtaa kasvuun PGE

3 verrattuna arakidonihappoa (AA), joka aiheuttaa proinflammatoristen metaboliitin prostaglandiini E

2 (PGE

2) (Fig. 1) [22]. Korkea COX-2: n aktiivisuuden, ja näin PGE

2, tiedetään liittyvän lisääntyneeseen soluproliferaatioon ja etäpesäkkeiden mahdollisuus kasvaimissa [26] – [28]. EPA on aiemmin osoitettu olevan tehokas alentamaan A549-solujen lisääntymisen lisäämällä tuotantoa PGE

3 ja siten, lisäämällä PGE

3 /PGE

2-suhde [22]. Kuitenkin miten muut tekijät, jotka liittyvät prostaglandiinisynteesin vaikuttavat syövän vaikutusta EPA NSCLC soluissa ei ole täysin selvitetty.

Tässä käyttäen MALDI-MS kahdella NSCLC solulinjoja, jotka ilmentävät samalla tasolla COX-2, me onnistuneesti tunnistaa eroja solujen aineenvaihduntaan EPA. Tällä tekniikalla, pystyimme suoraan ja nopeasti (analyysi aika 30 sekuntia) kuulustella ero aineenvaihduntaa, erityisesti rasva-aineenvaihdunnan, kussakin solulinjassa toistettavalla tavalla. Eri EPA-johdettu rasva-aineenvaihduntaan havaittiin myös keuhkojen kasvain kudoksissa johdettu

K-ras

mutantti hiiri. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet onnistuneen proteiinin profilointi ihmisen keuhkosyövän alatyyppejä käyttäen MALDI-MS [29], mutta tässä osoitti potentiaalia MALDI ei vain erotteleva syövän alatyyppejä niiden erilliset lipidiprofiilit mutta myös seurata biologista hoidon tehokkuus tunnistamalla riittävän biomarkkereita. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti suoraan analysoida syöpäsolujen MALDI-MS, paljastaa eroja solujen aineenvaihduntaan, joka voisi olla kriittinen EPA-esiin syövänvastainen toimintaa NSCLC soluissa.

Methods

Solulinjat

ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) A549 ja H596-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. A549 ja H596-soluja viljeltiin rutiininomaisesti DMEM /F12-(Invitrogen, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 5% ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), vastaavasti, ja penisilliini -Streptomycin 100 x Solution ja 2 mM L-glutamiinia GIBCO (Invitrogen).

immunoblottauksella

Western blot, solujen 70%: n konfluenssiin pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) , trypsinoitiin ja solujen pelletit kerättiin. Pelletti pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä ja tuloksena oleva pelletti suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (Invitrogen), sonikoitiin heti tai säilytettiin -80 ° C: ssa. Solulysaatit sonikoitiin jäillä 3 minuutin ajan (Misonix Sonicator 3000, Farmingdale, NY, USA), ja sentrifugoitiin 14000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiini kvantitoitiin kautta BioRad DC-proteiinin määritys (BioRad Inc., Hercules, CA). Yhtäläinen proteiinia (50 ug) erotettiin 7% (CPLA ​​

2) ja 10% (COX-2) SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin sitten päälle polyvinylideenidifluoridi kalvoja, standardimenetelmien mukaisesti. Jälkeen 2 tunnin inkuboinnin 5% rasvatonta kuivamaitoa estopuskuria valmistettiin Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa 0,1% Tween 20 (TBST), kalvot tutkittiin CPLA

2 primaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) tai COX-2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) 1:1000 laimennus 2 tuntia, pestiin TBST: ssä, inkuboitiin toisen vasta-aineita 1 tunnin ajan, sen jälkeen 3 x 10 min pestään kunkin TBST: ssä. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin kautta chemiluminesence käyttämällä ECL + havaitseminen kit ja hyper-kalvo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Yhtä suuri kuormitus näytteiden kuvattu Western-blottauksella läsnäolon β-aktiini.

CPLA

2: n aktiivisuuden määritys

aktiivisuus CPLA

2 määritettiin käyttämällä CPLA

2 iinianalyysikitissä (Cayman Chemical Company). Lyhyesti, A549 ja H596 (5 x 10

6) soluja siirrostettiin 100 mm: n annoksia ja niiden annettiin kasvaa yön yli saavuttaa -70% konfluenssin. Solut pestiin kaksi kertaa kylmällä puskurilla (50 mM Hepes, pH 7,4; 1 mM EDTA), kaavittiin solun nostin (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) ja siirrettiin Eppendorf-putkeen jäähän. Seuraavat ultraäänellä 3 minuuttia, lysaatit sentrifugoitiin 14000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti poistettiin ja pitoisuus proteiinien määritettiin Bio-Rad DC-proteiinin määritystä. Toimintaa varten määrityksessä, tilavuus vastaa 1 ug proteiinia on käytetty. Absorbanssi luettiin 414 nm: ssä Spectra Max M5 levylukijaa (Molecular Devices Corp., Sunnyville, CA, USA). CPLA

2 aktiivisuus ilmaistiin umol /min /ml määritettynä esitettyä kaavaa valmistajan protokollan.

K-ras siirtogeenisen hiiren

Kaikki eläinkokeet oli hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitea The University of Texas MD Anderson Cancer Center. Arvioida rasva-aineenvaihduntaan EPA hiiren keuhkojen kudoksiin, viiden viikon ikäisiä

K-rasLA

C57BL6 /129 /sv F1 mutanttihiirissä käytettiin spontaani keuhkojen kasvain malli ja syötetään ruokavaliota, joka sisälsi soijaöljyä tai EPA (1% ja 2%) 9 viikkoa. Lopussa yhdeksännen viikon, hiiret tapettiin, keuhkojen kudokset poistettiin, flash-jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka MALDI-MS: llä.

Analyysi MALDI- MS

Solut (1 x 10

6) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja kasvatettiin yön yli. Sitten soluja käsiteltiin EPA (25, 50, tai 100 uM), seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi 1% BSA: ssa 24 tunnin ajan. Lopussa itämisaika, ehjät solut kerättiin trypsinoimalla, sentrifugoitiin 3000 rpm: llä 2 minuutin ajan 4 ° C: ssa, pestiin PBS: ssä, ja solupelletti suspendoitiin uudelleen 20 ul: aan PBS: ää. Solut joko säilytettiin -80 ° C: ssa tai prosessoitiin välittömästi MALDI-MS-analyysiä varten.

MALDI-MS-analyysi solut, solujen pelletit sulatettiin ja 1 ui suspensiota täpläksi polylysiini-pinnoitettu lasilevyllä (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) käytettiin MALDI tavoite. MALDI-MS-analyysit kudosnäytteitä, 10-30 mg kudosta homogenoitiin 500 ui PBS: ää käyttäen Precellys kudoshomogenisaattorilla (Bertin Technologies, Pariisi, Ranska). Määräosa 1 ui homogenaattia täpläksi polylysiini-pinnoitettu lasi dia. Solususpensiot ja Kudoshomogenaattia kuivattiin tyhjiöeksikaattorissa huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Dihydroksibentsoehappo (DHB) (20 mg /ml), kloroformi /etanoli (09:01;

v /v

) levitettiin näytteisiin spray-pinnoite kautta Meinhard sumutinta (Meinhard, Golden, CO, USA). Kloroformi /etanoli seoksen annettiin nopeasti kidemuodostusta solujen päälle estäen samalla yhdistämistä matriisin liuotinta. Massaspektrit kerättiin Waters Synapt G1 QTOF massaspektrometriä (Milford, MA, USA). Lipidien tunnistaminen, tarkka massa ja MALDI-MS /MS-tiedot koottiin Thermo Scientific MALDI LTQ Orbitrap massaspektrometriin (San Jose, CA, USA).

LC-MS /MS

prostaglandiinit E

2 ja E

3 (PGE

2 ja PGE

3), uutettiin mukaan aiemmin julkaistu menetelmän Yang

et al

. [30], [31]. Lyhyesti, määräosa 0,5 ml PBS-puskuria lisättiin jäädytetyn kudoksen tai solun pellettejä, ja sen jälkeen homogenoimalla 1,5 ml: n putkille keraaminen helmiä käyttäen Precellys kudoshomogenisaattorilla (Bertin Technologies) ja 400 ui alikvootteja käytettiin prostaglandiini uuttamalla. Kaikki louhinta menettelyt suoritettiin alla minimaalinen valossa. Sitten näytteet liuotetaan 100 ul: aan metanolia /0,1% etikkahappoa (50:50,

v /v

) ennen analysointia LC-MS /MS [31].

solunulkoisen tasot PGE

2 ja PGE

3 A549 ja H596-soluja uutetaan Yang

et al

[22]. PGE

2 ja PGE

3 kvantitoitiin LC-MS /MS käyttäen Agilent 6460 kolmoiskvadrupolisen (QQQ) massaspektrometrillä (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) varustettuna Agilent HP 1200 binääristä pumppu HPLC sisääntulo (Agilent). PGE

2 ja PGE

3 erotettiin käyttäen 2 × 100 mm Kinetex 3 μ C18 analyyttiseen kolonniin (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Liikkuva faasi koostui 0,1% muurahaishappoa, ja asetonitriili, jossa oli 0,1% muurahaishappoa. Pylvään lämpötila pidettiin 40 ° C: ssa, ja näytteitä pidettiin 4 ° C: ssa analyysin aikana. Yksittäiset analyyttien todettiin käyttäen sähkösumutusionisaatiota ja useita reaktionseuraamista, ja seuraavat

m /z

siirtymiä seurattiin negatiivinen ionisaatio tilassa:

m /z

351 → 271 PGE

2,

m /z

349 → 269 PGE

3, ja

m /z

355 → 275 PGE

2-d

4. Tasot PGE

2 ja PGE

3 kvantitoitiin käyttäen aitoja standardikäyriä ja normalisoitiin joko solujen lukumäärä (solunsisäinen tai solunulkoinen) tai proteiinin määrä määritettiin Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad).

tilastollinen

Jokainen biologinen kaksoiskappaleanalyysiä huomattiin kahdesti ja analysoitiin kahdesti MALDI-MS ja kokeet toistettiin kolme kertaa. Viedään spektriä kustakin ryhmästä ladattu osaksi Metaboanalyst online-ohjelmisto (Metaboanalysis 2,0, Saatavilla: https://www.metaboanalyst.ca/. Accessed toukokuu 2012) [32], [33]. Tämä online-ohjelmisto tarjoaa valikoiman tilastollisia työkaluja monimutkaisten spektrien ja tunnistaa merkittävästi muuttuvat

m /z

arvoja. Pääkomponenttianalyysi (PCA), osittainen pienimmän neliösumman syrjiä analyysi, t-testejä, ja varianssianalyysi käytettiin analysoimaan tuloksena MS-tiedot sekä muutosten tunnistamiseksi huiput ja onko solutyyppejä tai kudoksia voidaan syrjiä toisistaan . Merkittävästi erilaiset piirteet sitten verrattiin sekä Human Metabolomi Databankin (HMDB; Saatavilla: https://www.hmdb.ca. Accessed toukokuu 2012) ja METLIN (Saatavilla: https://metlin.scripps.edu/. pääsee toukokuu 2012) tietokanta yhdisteiden ominaispiirteet.

tulokset

EPA aineenvaihdunta on differentiaalisesti säännelty NSCLC A549 ja H596-solujen

Kuten kerroimme aiemmin, anti-proliferatiivista vaikutusta EPA ihmisen NSCLC-soluja välittyvät niiden ilmentyminen COX-2 ja muodostumista antiproliferatiivisia metaboliitin PGE

3 [22]. Kuitenkin, kun käsitellään kaksi NSCLC A549 ja H596-solujen kanssa EPA EPA inhiboivat A549-solut (IC

50 6,25 uM) tehokkaammin kuin se teki H596 soluja (IC

50 50 uM) ( kuva 2A), vaikka nämä kaksi solulinjaa osoitti samanlaista COX-2: n ilmentymisen (kuva 2B). Rajaamiseksi mekanismeja, jotka välittävät ero vaikutuksia pani EPA hoito, arvioimme eri massaspektridatan profiilit näistä solulinjoista käyttämällä MALDI-MS seuraa PCA analyysi (Fig. 3). Aluksi tämä analyysi oli yksinkertaisesti käytetään määrittämään, onko kerätty MS spektri voidaan todellakin käyttää erottelemaan solutyypin ja käsitelty versus käsittelemättömien näytteiden. Merkittävästi muuttuvat huiput tunnistetaan p-arvojen 0,05 tutkittiin ja tunnistaminen yrittivät myös PC lipidejä käsitellään tarkemmin. MALDI-MS-spektrit käsittelemättömän A549 ja H596-solut osoittivat hyvin samankaltaisia ​​metabolinen /lipidomic allekirjoitukset (Fig. S1A ja S1B) lukuunottamatta muutamia pieniä muutoksia signaalin intensiteetti ja näin ollen ole eriytetty PCA-analyysi, EPA-käsiteltyjen A549 ja H596-solut erosivat olennaisesti niiden metabolinen /lipidomic profiileja (Fig. 4). Sen jälkeen EPA hoito, metaboliitin kuviota kaksi solulinjat helposti erotetaan tarkkailemalla uusia ja säädelty huiput, mikä viittaa siihen, että solun aineenvaihduntaan EPA näissä kahdessa solulinjassa säädellään eri tavalla (Kuva. S1C ja S1D).

(A). Anti-proliferatiivista vaikutusta EPA ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549 ja H596-soluja (B). Altistuminen A549 solujen EPA 72 tuntia tuotti kymmenen kertaa voimakkaampi soluproliferaation inhibointi A549-soluissa kuin siinä, H596-soluissa.

Solut olivat käsittelemättömiä (A) ja käsiteltiin 50 uM EPA ( B). Hoitamaton A549 ja H596-soluissa oli samanlainen massaspektrit (A). Kuitenkin post-EPA hoito johti eriytetympiä metabolinen kuvio näiden kahden solulinjoista (B). Tiedot edustavat kahden biologisen rinnakkaisena toistettujen mittausten. Keskimäärin 25 massaspektrit kerättiin ja oli keskimäärin kunkin solun paikalla. Aikaa kunkin analyysi oli alle minuutin. Tiedot edusti kolmen jäljitellä kokeissa.

merkittävää kasvua on havaittu

m /z

802,5, joka vastaa PC (36:5) rasvahappo. MS /MS vahvisti, että PC (16:0 /20:5) oli osa havaittu

m /z

arvo (tuloksia ei ole esitetty). Spectra esitetty (C) ja (D), joka vastaa A549-soluja rivi käsittelemättömiä ja EPA käsitelty; vastaavasti myös osoittaa kasvua

m /z

802,5 hoidon jälkeen EPA. Kasvu oli kuitenkin huomattavasti pienempi kuin kasvu havaittiin H596 solulinjan.

Korkeampi EPA sisällyttäminen fosfatidyylikoliini (PC) in H596 kuin A549-soluja

Lisäksi tarkastus kerättyjen spektrien tarjoaa käsityksen säädellään eri tavalla EPA aineenvaihdunta näissä kahdessa erityisesti solulinjoissa kuvassa. 4. piikit näkyvät tässä kuvassa edustavat lipidilajien sekä vaihteleva asyyli-ketjun pituudet ja eriasteisia tyydyttymättömyyttä. Esimerkiksi

m /z

804,5 edustaa sodiated PC sisältää kahta asyyli-ketjua yhteensä 36 hiiltä ja 4 kaksoissidosta (36:4). Aiemmin julkaistut tulokset, kohtuullinen oletus voidaan tehdä, että yksi asyyli-ketju sisältää 16 hiiltä nolla kaksoissidosta ja joka toisen ketjun sisältää 20 hiiltä ja neljä kaksoissidosta (AA-osa) [7]. Yleisimmin tyydyttymättömän osuuden miehittää SN2 kantaa fosfoglyseroli- selkäranka; kuitenkin, kuten lipidien hajoamista ja uudistaminen on jatkuvasti muuttumassa, rakenteet muuttuvat jatkuvasti, joten absoluuttinen lipidejä rakennemäärityksiä vaikea kulloinkin. Kuva. 4B osoittaa myös viisi-kertainen

m /z

802,5, [M + Na]

+ PC in H596-soluissa hoidon jälkeen EPA verrattuna solujen vehikkeliä yksinään. Edelleen MALDI-MS /MS-analyysi tunnistaa tämä massa todellakin muodostua PC todennäköisimmin peräisin EPA PC (36:5) (Fig. S2). Havaittu korkeampi PC (36:5) johtuu sisällyttäminen EPA-rasvahapon PC, mahdollisesti SN2. Vertailun vuoksi samanlainen aineenvaihduntatuotteen A549-solut (Fig. 4C ja 4D) esittää vain marginaalinen kasvu

m /z

802,5. Siksi nämä erot solujen aineenvaihduntaan voidaan nimenomaan korreloida H596 soluja kun EPA hoitoa. Vertailu käsittelemättömien solujen spektrit PC (36:4) intensiteetit molemmissa solulinjoissa johti samanlaisia ​​arvoja, mikä osoittaa nämä kaksi solulinjaa samanlainen kyky muodostaa tällaisia ​​PC lajeja. Tämä tulos viittaa siihen, että A549 ja H596-solut eroavat minimaalisesti biosynteesissä PC, mutta voisi olla erilaisia ​​kykyjä säädellä hyödyntämiseen EPA PC.

tuottaa vertailukelpoisia arvioita kahden solulinjoista ja ottaa huomioon mahdolliset MALDI signaalin intensiteetin vaihtelut, jokainen rasvahappo PC (

m /z

802 ja 804) normalisoitiin signaalin voimakkuuden PC pääryhmän (

m /z

184), joka pääasiassa lomakkeet lähde pirstoutuminen. Olettaen, että koko tietokoneen sisältöä kahden solulinjojen on samanlainen, tämä ioni toimii sopivan normalisoi ioni, koska sitä voidaan käyttää edustamaan koko PC lajeja. Tämä lähestymistapa rajoittui PC lajien kanssa 16:0 asyyli-ketju on SN1 asemassa ja PUFA substituutio SN2 yksinkertaisuuden vertailun. Samanlaisia ​​laskelmia voidaan tehdä lisäämällä SN1 asyyli-ketjun pituus. Laskelmista, merkittävän kasvun PC (36:5) ja PC (36:4) havaitaan H596-soluissa hoidon jälkeen EPA (taulukko 1). Kasvu PC (36:5) voidaan katsoa muodostumista PC lajien EPA osalla lisätään SN2 PC ryhmiä. Kasvu PC (36:4) on osoitus siirrytty AA pääsemästä COX-2 polku kohti tuota EPA. Lisääntyminen sekä PC laji on myös havaittu A549-solulinja; mutta tämä vaikutus ei ole niin suurta kuin että havaittu H596 solulinjassa.

H596 syntyy alhaisempi PGE

3 kuin teki A549

Koska MALDI- MS tiedot viittaavat siihen, että EPA oli ensisijaisesti havaittu fosfolipidin muodossa H596-soluissa, mutta ei A549-soluja ja nämä molemmat solut ovat samanlaisia ​​fosfolipidin biosynteettisiä ominaisuudet, nykyinen hypoteesi on, että saattaa olla eroja joko ekspressiota tai aktiivisuutta fosfolipaasi

2 (CPLA ​​

2), entsyymiä, joka vapauttaa rasvahappoja SN2 glyserolirungon. Tämä muutos saattaa johtaa erilaisiin kyvyt H596 ja A549-solut muodostavat PGE

3 päälle alustalle saatavuudesta, mikä rajoittaa antiproliferatiivisia vaikutuksia EPA on H596-soluissa.

Ensimmäinen vertasi solunsisäinen ja solunulkoisia pitoisuuksia PGE

3 H596 ja A549-soluja käsiteltiin EPA (50 uM). Kuten on esitetty kuviossa. 5, solunsisäinen taso PGE

3 oli lähes kahdesta neljään kertaa suurempi, tuolloin osoittaa enintään 20 tuntia A549-soluissa kuin H596-soluissa, kun taas suurempi määrä solunulkoisen PGE

3 oli havaitaan A549-soluja kuin H596-soluissa jälkeen 4 tuntia hoidon. Edelleen testata hypoteesia, päätimme proteiini taso CPLA

2 sekä sen toimintaa näissä soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 6., proteiinin ilmentyminen CPLA

2 oli selvästi suurempi A549-soluja kuin H596-soluissa (kuvio. 6A). Samoin aktiivisuus CPLA

2 oli 4 kertaa suurempi A549-soluja kuin H596-soluissa (kuvio. 6B). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että vapauttaminen EPA H596 soluja EPA-yhdistetty PC oli paljon vähemmän kuin A549-soluja johtuen vähäisestä ilmentymisen ja aktiivisuuden CPLA

2 H596-soluissa, tukee oletusta, että EPA aineenvaihduntaa säädellään eri tavalla , ehdottivat MALDI-MS-analyysi.

(A) soluja käsiteltiin EPA eri aikoina kuten ja ehjät solut kerättiin trypsinoimalla ja alistettiin analyysi LC-MS /MS: llä. Solunsisäisiä tasoja PGE

3 A549-solut olivat vähintään kaksi korkeampi kuin H596-soluissa. (B) Solujen elatusaineet kerättiin eri aikoina osoittamalla tavalla ja suoritettiin kiinteän faasin uuttaminen. Solunulkoisia pitoisuuksia PGE

3 analysoitiin LC-MS /MS. Tiedot edustavat kaksi erillistä kokeissa.

(A) proteiini ilmentymistä cPLA2 A549 ja H596 solujen määritettiin Western blotting; (B) aktiivisuus cPLA2 A549 ja H596-soluja mitattiin kuten aiemmin on kuvattu. Sekä proteiinin taso ja aktiivisuus cPLA2 olivat merkittävästi pienemmät H596-soluissa verrattuna A549-solut.

EPA muuttunut Rasva-aineenvaihdunnan K-ras hiiren keuhkojen tuumorikudoksista

Voit selvittää MALDI-MS voitaisiin käyttää tarkkailla muutosten kudosmetabolian

in vivo

, kun ravinnon kulutus EPA, suoritettiin myös keuhkojen kudosuutenäytteitä geneettisistä K-ras mutanttihiirien. Massaspektrit kerätään suoraan keuhkokudoksesta aina

m /z

800-840 on esitetty kuviossa. 7. Valitse kudoksen suoran analyysin MALDI, vaikutus kunkin ruokavalio voidaan havaita lipidiprofiilit kasvain. Ruokinnan jälkeen EPA (Fig. 7A), vastaava PC lajien kanssa EPA (

m /z

802 ja 830) asyyli-ryhmä oli voimistunut verrattuna, että soija ruokavalio ryhmä. Kiehtovan suhde PGE

3 yli PGE

2 kasvoi merkittävästi 0,011 ± 0,004 kudosten soijaa syötettyä hiiriin 0,063 ± 0,03 (1% EPA) ja 0,42 ± 0,11 (2% EPA) keuhkojen kudoksia peräisin hiiristä ruokittu EPA (Fig. 7B). Havainto EPA sisällyttäminen PC lajit korreloivat hyvin suhdetta PGE

3 /PGE

2 havaitaan samasta kudosnäytteistä LC-MS /MS, mikä viittaa siihen, että EPA johti kasvaimen siirtyminen aineenvaihduntaa tuottaa proliferatiivinen metaboliitin PGE

2 antiproliferatiivisia metaboliitin PGE

3 kautta COX-2-reitin.

A). MALDI massaspektrit kerätään suoraan kasvainkudoksessa solulysaateista K-ras-mutantti keuhko- kasvainten, joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin EPA. Havaitut muutokset lipidi- katabolian AA-EPA boxed, osoittavat merkittäviä muutoksia kasvaimen aineenvaihduntaan. B). Suhde PGE

3 /PGE

2 uutettu kasvainkudoksen johdettu K-ras siirtogeenisen hiiren mallia. PGE

2 ja PGE

3 kvantitoitiin LC-MS /MS. Nämä tiedot vastaavat kasvain aineenvaihdunta siirtyminen tuottaa AA johdettu PGE

2 PGE

3 EPA siten nostattamaan antiproliferatiivinen vaikutus.

Keskustelu

Ensimmäinen tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko ero vasteen NSCLC solulinjojen EPA hoito voitiin mitata suoraan analyysi MALDI-MS. Vaikka tilastolliset välineet palveluksessa ei syrjitä suoraan kahden solulinjoista ennen hoitoa, voisimme menestyksekkäästi erottamaan solulinjoista perustuu niiden massaspektrit profiileja seuraava EPA hoitoa. Nämä tiedot ovat johtaneet lisääntyneeseen tietoa biologisista mekanismi vastaa H596 solujen suhteellisesti pienempi herkkyys EPA hoitoon kuin A549-solut, vaikka ilmaus COX-2-proteiini oli samanlainen molemmissa solulinjoissa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti suoraan analysoida syöpäsolujen MALDI-MS, paljastaa eroja solujen aineenvaihduntaan, joka voisi olla indeksi EPA-esiin syövänvastainen toimintaa NSCLC soluissa. Tämä yksinkertainen MALDI-MS lähestymistapa mahdollisti kuulusteluun lipidin signalointipolkujen toimivien NSCLC solulinjoissa.

Käyttäessäsi MALDI-MS ilman analyyttinen erottaminen on lukuisia haittoja, kuten ioni tukahduttaminen, MALDI matrix-häiritsevien ionien, ja kyvyttömyys erottaa isobaaristen endogeenisen lajeja, tekniikka on edelleen suuri potentiaali kykynsä suorien mittausten biologisista näytteistä. Tämä on esimerkkinä viimeaikainen kasvu MALDI kuvantamisen MS sovelluksiin [34]. Edelleen edistysaskeleista suoraa biologista analyysiä MS tekniikoilla, kuten matriisi-vapaa ionisaation tekniikoita tai ilmakehän desorption tekniikoilla, mahdollistaa suuremman leveys metabolomic ja lipidomic kattavuutta.

Nämä tekniikat voivat olla erityisen hyödyllistä, kun yhdistetään klassisen määrällinen kohdennettuja metabolomic lähestymistapoja. Kuten raportoitu täällä, käyttäen MALDI-MS tutkimaan eroja lipidiaineenvaihdunnan käsittelyn jälkeen solut EPA on johtanut mahdollisen luonnehdinta fenotyyppiä NSCLC A549 ja H596-soluissa. Lisäksi samanlainen metabolinen muutos H596 ja A549-soluja havaittiin myös soluissa hoidetaan arakidonihapon, eli huippu intensiteetti PC (36:4), AA-sisällytetty PC, oli suurempi H596-soluissa kuin A549-soluja (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että ero metabolisen kuviot syntyy soluja ei alustaan ​​riippuvaisia, vaan todennäköisesti oli riippuvainen fenotyypin näiden kahden solulinjan. MALDI-MS tuloksia oikeaksi edelleen kuulusteluun COX-2-reitin ja sen EPA metaboliitin PGE

3 kvantitatiivisin LC-MS /MS. Koska rasvahapot, kuten EPA tai AA, täytyy vapautua fosfolipidien kalvon CPLA

2, jotta ne voidaan hyödyntää COX tai lipoksigenaasit, nämä tiedot viittaavat siihen, että CPLA

2 säädellään eri tavalla näissä kahdessa NSCLC solua. Todellakin, havaitsimme sekä pienempi ilmentyminen ja toiminta CPLA

2 H596 kuin A549-solut. Tällä hetkellä arvioidaan, onko CPLA

2 on kriittinen EPA-herättivät antiproliferatiivinen aktiivisuus kautta COX-2 metaboliitin PGE

3 NSCLC soluissa.

Tilastollinen työkaluihin ohjaavat meitä kohdella eri näiden solulinjojen ja auttoi meitä tunnistamaan erilainen aineenvaihduntatuotteiden hoitoryhmien välillä. PCA ja syrjiä analyysi (tuloksia ei esitetty) käytettiin alustavana työkalu yksinkertaisesti tunnistaa eroja massaspektrit solujen tai kudosten kanssa tai ilman hoitoa EPA. Pystyimme tunnistamaan joitakin ominaisuuksia, jotka vastaavat näitä eroja, mutta suora massaspektridatan tulkinta lopulta hyödyntää.