Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cell-soluadheesiota on ensiarvoisen ja ylläpitämisestä monisoluisten rakenne ja signaalin lähetyksen solujen välillä. Iholla, häiriöitä desmosomien säännellyn solujen väliset yhteydet voivat johtaa Keratinisaatiohäiriöt ja hyperproliferatiivinen sairaus kuten syöpä. Viime aikoina olemme osoitti siirtogeenisiä hiiriä yli-ilmentävät desmogleiini 2 (Dsg2) orvaskedessä kehittyä liikakasvu. Sen jälkeen microarray ja geeni verkko analyysi, osoitamme, että Dsg2 aiheutti syvällisen muutoksen transcriptome keratinosyyttien

in vivo

ja muuttanut useita geenejä tärkeää epiteelin dysplasiaa lukien: kalsiumia sitovia proteiineja (S100A8 ja S100A9), jäsenet sykliini proteiinin perhe, ja kysteiini proteaasinestäjä kystatiini A (CSTA). CSTA on vapautettu useassa ihosyöpien, kuten levyepiteelikarsinoomien (SCC) ja toiminnan menetys mutaatioiden johtaa väistyvä ihon hauraus häiriöt. Microarray tulokset vahvistettiin qPCR, immunoblottauksella, ja immunohistokemia. CSTA havaittiin korkealla tasolla koko vastasyntyneen hiiren orvaskeden mutta laski rajusti kehitys- ja havaittiin pääasiassa eriytetty kerroksiin. Ihmisen keratinosyyttien, knockdovvn Dsg2 siRNA tai shRNA pienentää CSTA ilme. Lisäksi siRNA knockdovvn CSTA johti sytoplasman lokalisointia Dsg2, levoton sytokeratiinista 14 värjäystä ja kevyemmästä desmoplakin vastauksena mekaaninen venytys. Molemmat Knockdown joko Dsg2 tai CSTA aiheuttama menetys soluadheesion on dispaasi perustuva määritys ja vaikutus oli synergistinen. Meidän havainnot tässä tarjoavat uudenlaisen polun CSTA sääntelyn joihin Dsg2 ja mahdollinen ylikuuluminen välillä Dsg2 ja CSTA joka moduloi soluadheesiota. Nämä tulokset edelleen tukevat viimeaikaiset ihmisen geneettinen havaintoja, toimintakyvyn menetystä mutaatioita CSTA geenissä johtaa ihon hauraus heikentyneen solujen soluadheesiota: peittyvästi-resessiivinen eksfoliatiivista suomutauti tai raajojen ihon hilseily oireyhtymä.

Citation: Gupta A, Nitoiu D, Brennan-Crispi D, Addya S, Riobo NA, Kelsell DP, et ai. (2015) Cell Cycle- ja syöpään liittyvän geenin Networks Aktivoituvat Dsg2: Todisteita kystatiini liberalisointidummy ja mahdollinen rooli solu-Adhesion. PLoS ONE 10 (3): e0120091. doi: 10,1371 /journal.pone.0120091

Academic Toimittaja: Johanna M. Brandner, University Hospital Hamburg-Eppendorf, SAKSA

vastaanotettu: 05 syyskuu 2014; Hyväksytty: 2. helmikuuta 2015 Julkaistu 18 maaliskuuta 2015

Copyright: © 2015 Gupta et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja. Microarray tiedot toimitettiin Gene Expression Omnibus (Liittymisnumero: GSE62814).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Institutes of Health (Mahoney, R01AR056067; Riobo, RO1 GM088256). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

desmosomit ovat suuria tarttuvuuden rakenteita lokalisoitu solu-solu-rajojen epiteelisolujen, joissa soluliman plakkia komponentteja, mukaan lukien plakin (desmoplakin) ja keratiini perheet, koota kanssa armadillo (plakoglobin ja plakophilins) ja kadheriinin (desmogleiineiksi ja desmocollins) proteiini perheiden [1,2]. Nämä tarttuvuus rakenteet ovat välttämättömiä paitsi ylläpitämiseksi solujen rakenteen ja eheyden, mutta myös kudosten kehitystä ja monogeneesin. Mutaatiot sisällä Desmosomi ovat perimmäinen syy monien ihon hauraus häiriöt tai ilman sydämen poikkeavuuksia [3]. Lisäksi desmosomeja toimivat myös ”signalointi keskusten” aktiivisesti moduloinnissa useita tärkeitä reittejä, kuten Wnt /β-kateniinin ja T-solu tekijä /imukudoksen tehostajana tekijä [4]. Asennus näyttö tukee niiden osallistumista moduloimaan solujen kohtaloa ja selviytymistä. Desmosomiproteiinien voi aktivoida solunsisäisen signaloinnin modulaation kautta ilmentymisen tasoja ja malleja, jotka molemmat voivat dramaattisesti muuttaa adheesiota ja solun lisääntymistä [5,6]. Vuonna interfollicular orvaskeden, Dsg2 normaalisti ekspressoituu hyvin alhaisella tasolla ja rajoitettu proliferatiivinen tyvisolukerroksessa. Viime aikoina olemme kehittäneet siirtogeenisen hiiren mallia yliekspressoivat desmogleiini 2 (Dsg2) ihossa [5]. Olemme todenneet, että ektooppinen ilmentyminen Dsg2 aktivoi useiden kasvua ja selviytymistä polkuja, jotka voivat edistää syövän kehittymistä ja etenemistä. Vaikka Inv-Dsg2 transgeenisissä hiirissä kehittyi precancerous papilloomat ja ne olivat herkempiä kemiallisesti indusoidun karsinogeneesin, mekanismi, jonka Dsg2 indusoi näitä muutoksia on edelleen epäselvä. Olemme hiljattain osoitti, että Dsg2 assosioituu caveolin-1 tarjoaa säätelevä mekanismi solusignaalivälitysteitä ja moduloimalla solun pinnalla esittelyä, jotka molemmat voivat edistää pahanlaatuisiksi ja syövän etenemistä [7]. Tässä raportissa, pyrimme liittyvien geenien tunnistamiseen hyperproliferatiivisia fenotyyppi vertaamalla ilmaus profiilia Inv-Dsg2 siirtogeenisiä hiiriä, joiden cDNA villityypin hiiriä kontrollina kautta mikrosiruanalyysi.

Tarkemmin, löysimme Dsg2 liittyi säätelyyn kystatiini A (CSTA, hiiri Csta1-3), jota kutsutaan myös stefin A happo kysteiini proteaasinestäjä, keratolinin tai ”epidermaalinen SH-proteaasinestäjä”, jäsen tyypin 1 kysteiini-proteaasinestäjien [ ,,,0],8-11]. CSTA ilmentyy pääasiallisesti epiteelin ja imukudoksen missä se suojelee proteolyyttinen prosessointi soluliman ja solun tukirangan proteiinit estämällä katepsiinit, papaiiniryhmän kaltainen, lysozomal kysteiiniproteaasit [12-14]. sen vuoksi ei ole yllättävää, että CSTA on lukuisia biologisia toimintoja, kuten bakteriostaattinen rooli suojella kudoksia kysteiiniproteaasien, jotka on tuotettu patogeenien [15]. Kun iho, CSTA alun perin tunnistettu sarveistuneen solukuoren ja ehdotetaan rooli sulkutoiminnan kohdistaminen pölypunkkien proteaasit [16]. Viime aikoina havaitsimme, että mutaatiot

CSTA

geeni ovat taustalla geneettinen syy ihon hauraus nimitystä hilseilevä suomutauti heikentyneeseen solu-soluadheesion alemmissa kerroksissa orvaskeden [17]. Lisäksi väistyvä CSTA mutaatiot voivat liittyä raajojen kuorinta ihosairaus [18,19]. Tässä kuvaamme useita tutkimuksia tutkivat Dsg2 ja CSTA in keratinosyyttien tarttuvuus.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki eläinkokeet hyväksyi eettinen komitea, joka toimii alle Thomas Jefferson University Internal Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) hyväksyttyjen käytäntöjen (642B ja 642D).

Generation of Inv-Dsg2 siirtogeenisiä hiiriä

aiemmin perustettu siirtogeenisiä hiiriä, jotka ekspressoivat Dsg2 että erottavat orvaskeden valvonnassa ja involukriinin (Inv) promoottori (Inv-Dsg2) [5]. Lyhyesti, hiiren

Dsg2

.

Flag

cDNA subkloonattiin pH3700-PL2 emovektori epitoopin

Ei

restriktiokohta alavirtaan involukriinin promoottorin. Genotyyppaus ja karakterisointi hiiret aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti [5]. Villityypin ohjaus ja Inv-Dsg2 siirtogeenittömien poikasten noin 6 viikkoa vanhoja, käytettiin näihin tutkimuksiin.

Microarray-analyysi

Hiiren ihon kudoksia, tallennetaan RNAlater (Qiagen, Valencia, CA), jauhettiin kuolevainen ja survin ja homogenoitiin Dounce- homogenisaattorissa. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja RNeasy (Qiagen) mukaan valmistajan protokollia. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) syntetisoitiin 2 ug: RNA: sta käyttäen heksa-satunnaisia ​​alukkeita ja M-MLV käänteistranskriptaasia (SuperScriptIII System, Invitrogen). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 5 ug kokonais-RNA: ta (2 villityypin ja 2 siirtogeenisten näytteiden) käänteistranskriptiolla ja käytetään tuottamaan biotiini-leimattu cRNA by

in vitro

transkription. Mikrosiruissa Sitten käsitellään käyttäen streptavidiini-Alexa 647 konjugaattia. Hybridisaation jälkeen pestään diat skannattiin hankkimaan fluoresoivat signaalit kunkin täplän kanssa ScanArray XL-5000 confocal skanneri (PerkinElmer, Boston, MA). Määrällisesti fluoresenssivoimakkuudet jokaisen paikalla array, 16-bittisiä kuvia, analysoitiin Quant Array 3.0 ohjelmisto (PerkinElmer). Sen jälkeen kuvankäsittely, tiedot analysoitiin GeneSpring 11,5 ohjelmisto (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Tausta-arvot perustuvat signaalin intensiteettiä ympärille paikalla vähennettiin, ja tulokset normalisoitiin quantile normalisoinnin ja käyttämällä lähtötilanteen muutos mediaani kaikista näytteistä. Microarray tiedot toimitettiin Gene Expression Omnibus (Liittymisnumero: GSE62814).

Volcano tontteja käytettiin tunnistamaan ilmentyvät eri geenien (suurempi tai yhtä suuri kuin 2-kertaiseksi ja tilastollinen merkitys p 0,05) Studentin

t

-testi (parittomia) ja ilman useita testaus korjauksia. Differentiaalisesti ilmaisi geeni lista ladattiin Ingenuity Pathway Analysis (IPA 9.0) ohjelmisto verkkoanalyysissa.

RT-PCR ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysi

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

,

Csta2l1

, ja

Csta3

cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA: sta käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Eksoni-kattavat qPCR alukkeet suunniteltiin seuraavasti:

Dsg2

, eteenpäin 5′- GAG GAA TTG AGT GCA GCA CAT AC-3 ’, käänteinen 5’-CTT GCT TCC ACC GTC AAG G;

Csta1

: eteenpäin 5′-TGC TAA CAA GGT CAG ACC TCA G-3 ’, käänteinen 5′-CCA TGG TTT TGT CAG TCT GGT-3’;

Csta2

: eteenpäin 5′- TGA ATG TAG GAC GTG GTT GC-3 ’, käänteinen 5′-GGG ATC AGG TCA AGT TGG AA-3’,

Csta2l1

: eteenpäin 5′ TGT CTT AAG TGG TAT TTC CAG TGA AAA CGA C-3 ’, käänteinen 5′- CAT CTC TTT ACA ATG GGG GGG GG-3’;

Csta3

: eteenpäin 5′- GCC CAT CAA TGA GTC AAG AAA-3 ’, käänteinen 5′-GGC CTC TGA AGA CTT TCA TGT G-3’ ja sisäisen valvonnan

GAPDH

: eteenpäin 5′-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GAG CGA-3 ’, käänteinen 5′-TCC ACC CTT CAA GTG GGC CCC-3’. cDNA: t monistettiin PCR: llä, joka sisälsi 1 yksikön Taq DNA-polymeraasia (Qiagen), 200 uM dNTP: itä, 1 yksikkö Q liuosta, 0,5 uM alukkeita. Monistaminen kunkin cDNA oli ensimmäinen denaturaatiovaiheen 94

° C: ssa 3 min ja 35 sykliä denaturointi 94

° C 30 sekuntia, pariutuminen 58

° C 1 min ja laajennus 72

° C: ssa 1 min, jota seurasi viimeinen sykli 72 ° C

° C: ssa 7 min.

Gene ekspressiotasoja analysoitiin qRT-PCR-analyysi käyttäen 1 ui cDNA ja SsoFast EvaGreen Supermixiä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) standardin mukaisesti vahvistus pöytäkirja ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems).

GAPDH

ilmaisua käytettiin normalisoimiseksi tietoja. Alukesekvenssejä käytetään qRT-PCR

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

,

Csta2l1

, ja

Csta3

ovat sisälly edellä.

immunohistokemia ja Immunoblottausmääritys

Ellei toisin mainita, kaikki kemikaalit olivat joko Sigma (St. Louis, MO) tai Fisher (Waltham, MA). Histologiaa varten, ihon fiksoitiin yön yli huoneenlämpötilassa 10% formaliiniliuokseen. Kudokset upotettiin parafiiniin, leikattiin (4 pm), asetettiin lasilevyille, ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Immunovärjäystä, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudokset kuumennettiin 60 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja parafiini ksyleenillä (3 kertaa), 100% EtOH: lla (2 kertaa), 95% EtOH: lla (2 kertaa), 75% EtOH, 50% EtOH, ja H

2O [20]. Antigeenejä noutaa microwaving Tris-EDTA-puskuria (10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA-liuosta, 0,05% Tween 20, pH 9,0). Kudokset blokattiin sitten estopuskuriin (5% normaalia vuohen seerumia, 1% BSA, 0,1% Ttriton X-100 PBS: ssä) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT) ja sitten inkuboitiin kystatiini vasta-aineen (1:50, AB4065, Millipore , Temecula, CA), Dsg2 Ab10 (1: 10000) ja Flag M2 (1: 500, Sigma) estopuskurissa, yön yli 4

° C. Kudokset pestiin PBS: ssä (2 kertaa) ja inkuboitiin Alexa Fluor anti-Rabbit 488 IgG ja anti-hiiri-594 IgG: tä (1: 400; Molecular Probes, Oregon) 1 h, RT pimeässä. Tumat värjättiin DAPI (1: 1000, Sigma) 1 min huoneenlämpötilassa pimeässä seurasi pesu PBS: llä.

Western blotit, ihon kudokset flash jäädytettiin nestetypessä, jauhettiin kuolevainen ja survin ja homogenisoitiin RIPA-puskurissa (50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoksikolaattia, 0,1% SDS: ää, proteaasi-inhibiittori (PI) cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, iN), 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail (Fisher). Proteiinipitoisuus määritettiin (Pierce BCA kit, Pierce Biotech, Rockford, IL) ja immunoblottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21], jossa ~ 20 ug proteiinia kussakin vyöhykkeessä ratkaistu yli 4-20% SDS-PAGE: lla (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat: Flag M2 (1: 2000, Sigma), Actin (1: 5000; Calbiochem, San Diego, CA); Kystatiini A (1: 1000, Millipore, Temecula, CA), ihmisen Dsg2 (1: 100; monoklonaalinen Ab 10D2), DSP I /II (1: 250, Clone 5-11F, [22]), vinkuliinin (1: 1000; Abcam, Cambridge, UK). signaalit havaittiin lisäämällä sekundäärinen vasta-aine HRP-konjugoituna (1: 5000; Jackson Labs, Bar Harbor, ME), visualisoitiin kemiluminesenssin (ECL; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Vaihtoehtoisesti signaalit havaittiin käyttäen vuohen anti-hiiri-IR-Dye 800 CW (1: 20000, LI-COR Cat. 926-32210) tai vuohen anti-kani-IR Dye 800 CW (1: 20000, LI-COR Cat. 926 -32211) ja analysoidaan edelleen ja kvantifioidaan Odyssey IR kuvantamisjärjestelmä (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Western-blotit analysoitiin kemiluminesenssi kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmiston kehittänyt National Institutes of Health (verkkosivusto: https://rsbweb.nig.gov/ij/). Tilastollinen analyysi tutkittiin käyttämällä Studentin

t

testi

p

arvo 0,05 pidettiin merkittävinä (*

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001), jolloin määrälliset mittaukset kolmen erillisen kokeen normalisoituivat Actin latauskontrollina.

Soluviljely ja siRNA knockdovvn

Dsg2

ja

CSTA

A431 (epidermoidikarsinooma American Type Culture Collection, Bethesda, MD) soluja ylläpidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (P /S). A431-soluja kasvatettiin ~ 60%: n konfluenssiin 6-kuoppaisille viljelylevyille, seerumia 4 tuntia 0,5% FBS: ää ja 1% P /S ennen inkubointia 100 nM sekoitetun siRNA ohjaus (D-001810-10, Dharmacon, Thermo Scientific, Lafayette, CO) tai yhdistettyjä siRNA osoitteeseen

Dsg2

(L-011645-00, Dharmacon) ja

csta

(L-010020-00, Dharmacon) käyttäen Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja Opti-MEM-elatusainetta (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Solut palautui normaaliksi keskipitkällä jälkeen 18 tunnin ja inkuboitiin 72 tunnin ajan. Solut hajotettiin 9 M Urea valmistetaan sitten Western blot -analyysiin, kuten edellä on kuvattu. HaCaT-soluja käsiteltiin siRNA käänteisellä transfektiolla kohti valmistajan ohjeiden Lipofektamiinia RNAiMAX. Immunofluoresenssi-, viljellyt solut kiinnitettiin MeOH -20 ° C: ssa 10 min ja tehtiin läpäiseviksi 1% TX-100: ssa 5 min. Sen jälkeen kun epäspesifiset blokeerattiin, soluja inkuboitiin vasta-aineen 10D2 ja Dsg2 tai CSTA-vasta-aine (katso edellä).

Joissakin kokeissa solut, joita käsiteltiin scrRNA tai

CSTA

siRNA ympättiin Bioflex 6-kuoppaisilla levyillä, jotka sisältävät joustavan kumikalvo päällystetty pronectin (Flexplates, FlexCell International, Hillsborough, NC, USA). Solut kasvatettiin ~ 80% konfluenssiin, ja yksisolukerrokset korosti mekaanisesti FlexCell FX-4000 Tension System (FlexCell International, Hillsborough, NC, USA) kuten aikaisemmin on kuvattu yksityiskohtaisesti, [17] (Blaydon et al., 2011). Solut venytetty 0-4 tuntia, ja sitten kiinnittää ja värjätä Dsg2 (1: 500, Rabbit Ab10; [23]) ja keratiini 14 (1: 100; Clone LL001; Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Solut myös hajotettiin Laemmli-puskurissa Western-blottauksella.

knockdovvn Dsg2 tekijänä shRNA

A431-solut stabiilisti transfektoitu pSuper Retro-puro vektori, jossa tietyn shRNA kohdistaminen nukleotidin GFP (shGFP) tai Dsg2 (shDsg2) perustettiin kuten aikaisemmin on kuvattu yksityiskohtaisesti [24]. Lyhyesti, kaksi oligot ( ’5-GAT CCC CGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT TCA AGA GAT TCT TGG ACA GAT CCT CTC TTT TT-3’ ja ’5-AGC TTA AAA AGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT CTC TTG AAT TCT TGG ACA GAT CCT CTC GGG-3 ’) syntetisoitiin, hehkutettu, ja ligoitiin pSuper Retro-puro (Oligo-Engine, Seattle, WA). Retrovirus tuotanto ja infektio suoritettiin Phoenix soluissa. Transfektoidut A431-solut ylläpidettiin DMEM täydennetty 10% FBS ja puromysiinin (2 ug /ml).

Dispaasi-pohjainen soluhajotusprosessin määrityksessä

vaikutusten arvioimiseksi kystatiini A ja Dsg2 solujen tarttuvuus, Mock ja shDsg2 A431-solut maljattiin kuuden hyvin viljelymaljoihin tiheydellä 2 x 10

5 solua /kuoppa ja sitten käsiteltiin 50 nM salattu siRNA valvontaa tai siRNA osoitteeseen

csta

kuvatulla edellä. Sen jälkeen, kun 72 tunnin ajan, solut pestiin Hankin tasapainotetulla suolaliuoksella ja inkuboitiin dispaasi (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) 5 minuuttia. Nostettavan solulevyt alistettiin dispaasi-pohjainen dissosiaatio pipetoimalla viisi kertaa käyttäen 1 ml: n pipetillä. Solufragmentit kiinnitettiin 3% formaliiniliuokseen ja värjättiin kristallivioletilla. Kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa. Toteamme tässä, että nämä kokeet suoritettiin lisäämättä ylimääräistä kalsiumia.

Tulokset

mikrosiruanalyysi verrataan villin tyypin ja Inv-Dsg2 siirtogeenisen hiiren ihon

Olemme hiljattain osoitti, että yliekspressio Dsg2 valvonnassa ja involukriinin promoottorin ihon siirtogeenisiä hiiriä (Inv-Dsg2) johti liikakasvu on orvaskeden ja parannettu herkkyys syöpäkasvainten [5]. Lisäksi Inv-Dsg2 siirtogeenisiä hiiriä myös kehittäneet hyvänlaatuinen papillomas ja olivat herkempiä kemiallisesti indusoidun kaksivaiheinen ihon syövän synnyn. Nämä havainnot sai meidät suorittaa vertailun geenin ilmentymisen profiilien välillä Inv-Dsg2 siirtogeenisten ja kontrollihiiriin. Välttämiseksi tausta vaihtelut ja muunnelmat, meidän Dsg2 siirtogeenisiä hiiriä risteytettiin takaisin vähintään 5 sukupolville C57BL6 tausta. Päätimme käyttää koko paksuudeltaan ihon jotta voidaan havainnoida muutoksia geenien ilmentyminen dermis, jotka ovat saattaneet käyttöön päällä oleva iho. Siten takaisin ihoa littermates 6 viikon kuluttua syntymästä käytettiin.

H 0,05, näkyy punaisena, Fig. 1 B). Nämä 492 geenit moduloitu vastauksena Dsg2 analysoitiin edelleen nerokkuutta Analysis Program (Qiagen), joka kuvaa top 5 geeni verkkojen mukaan niiden verran merkitystä verkoston piiriin molekyylit meidän aineisto (S2 taulukko). Tämä analyysi paljasti vahvan yhdessä Cell Cycle (S2A Fig.) Ja Cancer asetuksen väyliä (S2B Fig.). Huomattava määrä osallistuvien geenien eri vaiheissa solukierron säätelyssä oli voimistunut (punainen) vastauksena Dsg2 (ja edelleen yhteenveto S3 taulukko). Samoin monet geenit kasvaimien syntyyn liittyvien Myös yläreguloituja vastauksena Dsg2 lukien Mitoosi Checkpoint proteiinikinaasi (

BUB1

) (S1 taulukko) ja distaalisen-vähemmän 4-homeobox (

DLX4

) ja syöpäalttiutta proteiini (

BRCA1

) (S2B Fig.). Mielenkiintoista on kuitenkin, kaksi jäsentä forkhead perheen transkriptiotekijöiden,

FOXC1

(-9,0-kertainen) ja

FOXC2

(-11,7 kertainen), oli vaimentua siinä Inv-Dsg2 siirtogeenisiä hiiriä. FOXC2 erityisesti indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja sillä on merkitystä silmäluomen sulkeminen [26,27]. Knockdovvn FOXC2 ilmaisun rintasyöpäsoluissa kumoaa metastasoituneeseen potentiaalia [28], syytetään sen rooli syövän kehittymisessä. Rooli FOXC2 ihon homeostaasiin ja syövän kehitystä ei ole tiedossa.

(A) Kokonais-RNA eristettiin ihon 2 villityypin ja 2 Inv-Dsg2 siirtogeenisiä hiiriä, käänteistranskriptio, biotiinileimattua ja pantiin hiiren cDNA microarray. Dendogram (lämpö kartta) osoittaa, että 492 geenit olivat joko säädelty (punainen /oranssi) tai alassäädetty (sininen /vihreä) siirtogeenisissä (T1 ja T2) ja valvonta (W1 ja W2) hiirillä. (B) Volcano juoni näyttää log2 (fold muutos) x-akselilla vastaan-log 10 (p-arvo) y-akselilla. Kohdat, joiden kertamuutosta alle 2 (log2 = 1) ne on merkitty harmaalla. Pystysuorat vihreät viivat rajaamaan jossa kertainen muutos on yhtä kuin 2 (oikea rivi) tai yhtä suuri-2 (vasen rivi). Vaakasuora vihreä viiva rajataan jossa p-arvo on 0,05, pistein viivan yläpuolelle, jossa on p 0,05 pistettä viivan alapuolella, jossa on p 0,05. Kuvattu punaisella ovat geenejä, jotka ilmentävät enemmän kuin 2-kertaiseksi muutoksen p 0,05 transgeenisissä orvaskeden kontrolliin verrattuna. Nuolet osoittavat kiinnostuksen kohteena olevia geenejä. (C) Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi osoittaa keskimäärin 34,33 ± 1,32 kertainen nousu Dsg2 RNA ilmentymisen Inv-Dsg2 siirtogeenisten (Tg) verrattuna villityypin (WT). Lisäksi RNA lauseke siirtogeenisiä kontrolliin verrattuna olivat:

Csta1

, 113,24 ± 2,23;

Csta2

, 1227,04 ± 1,26;

Csta2l1

, 1,11 ± 0,47;

Csta3

, 26.97 ± 0,44 (Bar = keskiarvo ± sd, (* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001; Opiskelijan

t

testi).

taulukossa 2 luetellaan kymmenen geenit, jotka moduloidaan vastauksena Dsg2. Tämä luettelo koostuu koodaavat proteiineja tuumorigeneesiin kuten L-treoniini dehydrogenaasin (

TDH

, 39,2 kertainen ) ja runsaasti kysteiiniä eritysproteiinia (

CRISP3

, 8,8-kertainen). yllättävin havainto oli tehostettu ilmentyminen CSTA (

Csta1

, 18,4-kertainen;

Csta2

, 5,7-kertainen, ja

Csta3

, 12,4-kertainen) ja useat jäsenet S100 perheen kalsiumia sitovia proteiineja (

S100A8

, 7,9-kertainen;

S100A9

, 4,1-kertainen, ja

S100A4

, 2,3-kertainen) (Fig. 1 B, taulukko 3). S100A8 ja S100A9 proteiinit muodostavat kompleksin tunnetaan kalprotektiinin, jolla on antimikrobista toimintaa ja on esitetty suojata epiteelisoluihin vastaan ​​patogeenien [29]. lisäksi geeni-ilmentymisen neljä jäsentä sykliiniperheen proteiinien lisääntyivät myös, mukaan lukien sykliini A2 (

Ccna2

, 5,8-kertainen), sykliini B2 (

Ccnb2

, 5,4-kertainen), sykliini B1 (

CCNB1

, 4,6-kertainen), ja sykliini E1 (

Ccne1

, 2,6-kertainen), kun taas ilmaus yksi jäsen, sykliini A1 (

Ccna1

, -2.0 taita ) havaittiin vähentynyt (taulukko 3). Sykliiniperheen proteiinien säätelee sykliiniriippuvaisten kinaasien ja ohjaa etenemistä solujen solusyklin läpi [30]. Tämä havainto on johdonmukainen aiempien tulokset osoittavat, että Dsg2 tehostaa solujen lisääntymistä. CSTA on osoitettu olevan anti-apoptoottista aktiivisuutta [31] määrä lisääntyy useissa epiteeli- johdettu maligniteetteja, mukaan lukien SCC [32], ja se on mutatoitunut perinnöllinen solu-solu-adheesio on viallinen epidermaalinen häiriöt [17-19]. Lisäksi CSTA estää katepsiinit [33,34], jotka myös vapautettiin ihosyöpää [35-37]. Näistä syistä olemme keskittyneet jäljellä olevan tutkimuksen CSTA. Toiminnallinen merkitys S100 ja sykliini proteiineja tarkastellaan yksityiskohtaisesti tulevassa tutkimuksessa.

Vahvistus Dsg2-modulaatio CSTA ilmaisun

microarray tulokset vahvistettiin tutkimalla ekspressiota hiiren CSTA mRNA: ta (1, 2, 2L1 ja 3) RT-PCR: llä (S3 kuvassa.) ja reaaliaikainen qPCR (Fig. 1 C). Ensimmäinen, kokonais-RNA eristettiin ihon kahden yksittäisen edustajan villityypin ja Inv-Dsg2 siirtogeenisiä hiiriä, cDNA muodostettiin ja käytettiin templaattina PCR vahvistaa säätelyä

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

, ja

Csta3

siirtogeenisissä verrattuna kontrollihiiriin (S3 kuvassa.). Ei muutosta RNA ilmentyminen havaittiin

Csta2l1

ja

GAPDH

. Csta2l1 on erittäin ilmentyy sikiön maksassa, luuytimen ja pernan ja sitä käytettiin tässä negatiivisena kontrollina ihon [38]. RT-PCR-data edelleen vahvistanut reaaliaikaisen qPCR käyttäen ihobiopsioista 3 villin tyypin ja 3 siirtogeenisiä hiiriä (Kuva. 1 C). Jälleen säätely ylöspäin

Dsg2

(34,33 ± 1,32) havaittiin ihon siirtogeenisiä hiiriä verrattuna ihon kontrollieläimistä. Reaaliaikaisen qPCR, havaitsimme lisääntyminen

Csta1

(113,24 ± 2,23),

Csta2

(1227,04 ± 1,39), ja

Csta3

(26,97 ± 0,44) , mutta ei

Csta2l1

(1,11 ± 0,47). Lukuun ottamatta

Csta2l1

, kaikki muutokset siirtogeenisten verrattuna kontrolliin näytteet olivat tilastollisesti merkitseviä. Mielenkiintoista, kertaluokkamuutos ero saadaan reaaliaikaista qPCR oli merkittävästi erilainen kuin saadaan mikrosiruanalyysillä. Tämä ei ole epätavallista, ja on havaittu muissa järjestelmissä [39]. Yhteenvetona, qPCR-analyysi vahvisti microarray tietoja, jotka osoittavat, että ektooppinen ekspressio Dsg2 orvaskeden aiheutti lisääntymisen RNA ilmentyminen hiiren

CSTA

perheen proteiineja, ja että tämä lisääntynyt ilmentyminen säätelee yliekspressio Dsg2 ihossa.

Seuraavaksi, ihon lysaatit vastasyntyneen ja aikuisen valvontaa hiiriä (n = 3 kutakin) immunoblotattiin varten csta paljastava korkealla tasolla vastasyntyneen iho, mutta laski rajusti vuonna aikuisten ihoa (Fig. 2A), jotka vahvistavat aiempien havaintojen [40]. Mielenkiintoista, havaitsimme sekä soluliman ja tuman värjäytymisen varten csta vastasyntyneillä hiiren ihon immunofluoresenssilla (Fig. 2B). Ei ole merkittävää eroa csta tason välillä havaittiin villityypin ja Inv-Dsg2 siirtogeenisiä vastasyntyneen hiiriä (ei kuvassa). Koska csta oli alhainen iholla aikuisten hiirten, ektooppinen ilmaus Dsg2 paranee dramaattisesti csta tasolla (Fig. 2C). Flag-vasta-aineen havaittiin Flag-merkityn Dsg2 proteiinia siirtogeenisen, mutta ei villityypin hiirissä (Fig. 2C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin käyttämällä Dsg2 spesifistä vasta-ainetta 10D2, jotka osoittavat, että ektooppinen ekspressio Dsg2 pintasuoniin orvaskeden ei muuttanut endogeenisen Dsg2 tasolla (tuloksia ei ole esitetty). Luonteen vuoksi vasta-aineiden, emme voineet tehdä yhteistyötä immuunivärjäykseen Dsg2 ja csta. Kuitenkin olosuhteet optimoitiin immunostain varten Flag-merkityn Dsg2 (anti-Flag-vasta-aineita) ja CSTA (Fig. 2D). Vuonna Dsg2 Tg iho, csta ilmentyi soluissa riippumatta ilmentymistä, mikä viittaa ei-itsenäinen vaikutus. Värjäys CSTA havaittiin myös korneosyytit villityypin hiirissä ja kasvoivat siirtogeenisiä hiiriä (Fig. 2D). Vaikka csta ei havaittu Western blot käyttämällä yhteensä iho lysaatit, emme voi sulkea pois, että Sarveistuneiden kirjekuoreen, csta voi olla erittäin ristisilloitettu ja siten kestävät lyysi SDS /DTT hajotuspuskuria.

(A ) Western blot-analyysi ihon lysaatit 3 vastasyntyneen ja 3 aikuisten C57BL6 hiirillä osoittaa korkea ilmentyminen csta vastasyntyneiden mutta lähes huomaamaton aikuisten ihoa. Aktiini käytettiin verrokkina yhdenvertaista lastaus. (B) immunofluoresenssivärjäyksellä vahvistaa Western blotting tulokset osoittavat korkeaa csta vastasyntyneiden villityypin hiiren ihon. Laajentunut kuva upotettavat näkyy sytoplasman sekä tumavärjäystä varten csta. (C) Western analyysi Dsg2 ja csta aikuisilla villityypin ja Inv-Dsg2 siirtogeenisen hiiren ihoa. Tulokset osoittivat ilmentymistä Flag-merkityn Dsg2 ja csta transgeenisissä mutta ei villityypin hiirillä. Actin osoitti yhtä suuri kuormitus. (D) Immunofluoresenssi suoritettiin aikuisen ihon villityypin ja siirtogeenisiä hiiriä paljastava kohonneeseen CSTA siirtogeenisissä iholle. Tumat counter-värjättiin DAPI (sininen).

Toisin kuin ihmisten kanssa vain yksi

CSTA

geeni, on useita

csta

geenien hiirillä [41 ]. Vaikka mikrosiruanalyysi havaittu kolme

Csta1

,

Csta2

ja

Csta3

, se on tuntematon, joka isoformia ilmentyy hiiren ihon. Lisäksi ei tiedetä mikä hiiri csta tunnistaa kaupallisesti saatavilla vasta vuodesta epitoopit niitä ei ole kartoitettu. Olemme kuitenkin spekuloida, että vasta-aineet voivat tunnistaa kaikki Cstas korkeiden sekvenssihomologia ihmisen ja hiiren välillä ja eri hiiren isoformeja.

Dsg2 moduloi CSTA ilmaisu

Voit selvittää Dsg2 säätelee ihmisen CSTA keratinosyyteissä, A431-soluja käsiteltiin siRNA spesifisiä Dsg2 (siDsg2), CSTA (siCSTA) tai salattu RNA (scrRNA). Kolme päivää transfektion jälkeen, jossa scrRNA ja siCSTA, Western blot-analyysi osoitti, että pudotus on CSTA ei vaikuttanut ekspressioon Dsg2 (S4 kuvassa.).