Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

aiemmin tunnistettu yhteisiä ilmentyvät eri (DE) geenien virtsarakon syöpä (BC). Tässä tutkimuksessa analysoimme perusteellisesti, ilmaus useita ryhmiä näistä DE geeneistä.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteet 30 ihmisen tasapainotusliivit ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa analysoitiin koko genomin cDNA mikrosirut, qRT-PCR ja Western blottauksella. Meidän huomio kiinnittyi solusyklin ohjaus ja DNA-vaurioiden korjaus geenejä, geenit liittyvät apoptoosin, signaalitransduktion, angiogeneesi, sekä solujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden. Neljä yleisesti saatavilla GEO Aineistot analysoitiin edelleen, ja ilmaisu data kiinnostavia geenejä (GOI-sekvenssiä) verrattiin tämän tutkimuksen. Suhde joukossa Intian tutkittiin myös. GO ja Kegg rakenteisen analyysi tehtiin tunnistaa mahdollisia rikastaminen geenien erityisiä biologisia teemoja.

Tulokset

valvomaton klusterin analyysi DNA-siru paljastivat selvän eron BC vs. vertailunäytteet sekä matala vs. korkea laatu kasvaimia. Geenit, joilla on vähintään 2-kertainen ero ilmentymisen BC kontrolleja, sekä ei-lihas- invasiivisia vs. lihasten invasiivisia kasvaimia ja matalissa vs. korkealaatuista kasvaimet, tunnistettiin ja paremmuusjärjestykseen. Erityistä huomiota kiinnitettiin muutoksiin osteopontiinissa (OPN, SPP1) ilmaus, koska sen useita biologisia toimintoja. Samoin geenit esillä yhtä suuri tai heikkoa ilmentymistä BC vs. säätimiä pisteytettiin. Merkittävät pareittain korrelaatiot geeniekspressiossa pisteytettiin. GO-analyysi paljasti monipintainen luonteen Gois sillä he osallistuvat erilaisia ​​mekanismeja, kuten solujen lisääntymisen, solukuoleman, aineenvaihdunta, solun muoto, ja solun tukirangan uudelleen organisointi. Kegg analyysi osoitti, että merkittävin polku oli, että virtsarakon syövän (p = 1,5 x 10

-31).

Johtopäätökset

Tämä työ lisätään nykyisen tietämyksen molekyylimerkkiaineet tunnistaminen BC. Tällaiset työt tulisi edetä, jotta saat paremman käsityksen taudin molekyylitason mekanismeja.

Citation: Zaravinos A, Lambrou GI, Volanis D, Delakas D, Spandidos DA (2011) valokeilassa ilmennetty eri geenien Virtsarakon syövän. PLoS ONE 6 (4): e18255. doi: 10,1371 /journal.pone.0018255

Editor: I. Kuningas Jordan, Georgia Institute of Technology, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 lokakuu 2010; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2011; Julkaistu: 05 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Zaravinos et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

virtsarakon syöpä (BC) on yleisin maligniteetti virtsateiden, aiheuttavat merkittäviä kuolleisuutta ja sairastavuutta maailmanlaajuisesti. Euroopassa arviolta 105000 uutta tapausta virtsarakon syöpä diagnosoidaan vuosittain, kun taas noin 30000 potilasta kuolee virtsarakon syöpään vuosittain [1]. Sen esiintyvyys suoraan kasvaa iän myötä, on harvinainen ennen 50 vuoden ikää, ja se on kolme-neljä kertaa yleisempää miehillä naisiin verrattuna. Lähes kaikki virtsarakon syövät ovat karsinoomat, jotka johtuvat siirtymäkauden epiteelissä. Käyttäytymistä siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) on erittäin monipuolinen ja määrittävät kaksi erillistä, mutta liittyvät prosessit: kasvaimen uusiutumisen ja etenemistä. Esittelystä, 75-85% kasvaimista rajoittuu mahalaukun tai hyökätä

lamina propria limakalvoja

. Loput läsnä hyökkäys lihaksiston kerroksen virtsarakon seinämän tai ulottuvat perivesical kudoksen vieressä elinten ja lantion seinään. Yli 60% pinnallinen kasvainten toistuu ainakin kerran ja edetä vähemmän eriytetty tai invasiivisia kasvainten kanssa huonompi ennuste on merkittävä osuus potilaista [2]. Hyödyllisin ennustetekijöiden parametrit ovat kasvaimen, vaihe, koko, ennen toistumisen määrä ja synkronisen läsnäolo CIS [3]. Kuitenkin ymmärtää paremmin luonnon historian TCC voidaan odottaa kun selvittäminen molekyylitason mekanismeja TCC.

aiemmin tunnistettu yhteisiä ilmentyvät eri (DE) geenien virtsan BC [4]. Esillä olevassa tutkimuksessa, kiinnostuksemme keskittyi analysointiin eri ryhmien DE geenejä, kuten geenit valvontaan osallistuvien solusyklin, DNA vahinkosaneeraus, apoptoosin, signaalitransduktion, transkriptiotekijät, angiogeneesi, soluproliferaation, invaasio ja etäpesäke. Selvitimme ilmaisun profiilin BC vs. tervettä kudosta, ei-lihas-invasiivisia (vaihe T1) vs. lihas-invasiivisen kasvaimet (vaihe T2-T4) ja matala vs. korkea laatu kasvaimia mikrosiruanalyysillä. Tuloksemme olivat vielä validoitu immunohistokemiallisesti, qPCR ja Western blotting. Lisäksi teimme GEO laskennallisen analyysin microarray data erotettavissa muista julkisesti saatavilla aineistoja, ja vertasi niitä tuloksemme.

Tuloksemme keskittynyt geenejä, jotka on merkittävä rooli tärkeimmissä soluprosesseihin ja osoitti suurta ero niiden ekspressiokuvioiden välillä BC ja kontrollinäytteiden. Geenit, joilla on vähintään 2-kertainen ero ilmentymisen BC kontrolleja, sekä ei-lihas-invasiivisia vs. lihas-invasiivisia kasvaimia ja matala vs. korkea laatu kasvaimet, tunnistettiin ja paremmuusjärjestykseen.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma ja kliinis tietojen

Pariksi kasvain ja normaali kudosnäytteitä peräkkäinen 30, joilla on vasta diagnosoitu tasapainotusliivit meneillään transuretraalisen virtsarakon tuumoriresektion laitoksella of Urology, ” Asklipieío ”General Hospital, Athens, hankittiin jälkeen määrä kudosta tarpeen rutiini patologian tutkimus oli poistettu (taulukko 1). Kaikki kasvain näytteet luokiteltiin ja luokitellaan samalla patologi. Syöpäpotilaat luokiteltiin vastaavasti lihakseen-invasiivisia (T2, T3 ja T4) ja ei-invasiivisia kasvaimet (Ta, T1, ja CIS). Vertailun vuoksi edellisten raporttien 1973 Maailman terveysjärjestö (WHO) pisteytysjärjestelmä [huono laatu (asteet 1-2) ja korkea laatu (arvosana 3)] käytettiin tässä tutkimuksessa, joka on edelleen yleisimmin käytetty järjestelmä huolimatta korvattu vuoden 2004 WHO /International Society of Urologiset patologia (ISUP) luokitusten [5]. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta mukana tässä tutkimuksessa. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea Kreetan yliopiston. Kelpoisuusvaatimukset olivat electively toistoleikattiin ensisijainen tasapainotusliivit ja saatavuus DNA normaalista ja kasvainkudoksen varten biomolekyylitason analyysejä. Hylkäämisperusteet olivat aiemmat kasvaimet ja kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta.

otettiin kudosnäytteet leikkauksen kasvain ja seuraavat kolme selvästi normaalia valittu sivustoja (kylmä cup koepaloja): posterior seinään, trigone, ja viereistä kasvain. Osia resektoidun normaali näytteet lähetettiin histopatologista analyysiä. Kasvain ja normaalit kudokset pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä, kuljetetaan ja säilytetään -80 ° C: ssa, kunnes DNA: n uuttaminen.

Potilaat, joilla on ei-lihas-invasiivisia tasapainotusliivit seurattiin määräajoin kystoskopialaitteita tutkimukset ja rakkoon hoito kuten. Potilaat, joilla on invasiivisia tasapainotusliivit tarjottiin radikaali cystectomy tai ilman systeemistä kemoterapiaa. Sen jälkeen keskimääräinen seuranta 24 ± 3 kuukautta, 8 (26,6%) potilaista oli toistuva kasvaimia. Vuonna Ta /T1 kasvaimien taajuus toistumisen oli 29,4% (5/17) verrattuna 23% (3/13) ja T2-T3 kasvaimia. Potilailla, joilla on ei-lihas-invasiivisia tasapainotusliivit, etenemistä oli 11,1% ja 22,2%-luokan 2 ja 3. asteen kasvaimet, vastaavasti. Kaikki toistuminen oli todistettu koepala.

immunohistokemia

§, 3 mm: n paksuinen, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudos leikattiin ja asetettiin dioja päällystetty 3-aminopropyltriethoxysilone. Dioja kuivattiin 56 ° C: ssa 1 tunnin ajan ennen immunohistokemiallista värjäystä. Kudosleikkeet parafiini ksyleenillä ennen rehydratoitu arvostellaan alkoholeja, ja endogeenisen peroksidaasin estettiin käsittelemällä 3% H

2O

2 huoneenlämpötilassa 15 min. Antigeeni peittymisen suoritettiin 30 min inkubaation 80 ° C: ssa 10 mM trinatriumsitraatti (pH 6,1). Immunovärjäys ja ilmoituksen tehtiin Dako automatisoida. Laseja inkuboitiin huoneenlämpötilassa ensisijainen polyklonaalisia vuohen vasta-aineita anti-ErbB2 (1:800, Dako), sykliini D1 (1:100, SP4, Epitomics), monoklonaalinen vasta-aine anti-p53 (1:250; E26; Epitomics) ja monoklonaalinen vasta-aine anti-Ki-67 (1:100, SP6, Epitomics). Epitoopit primaarista vasta-ainetta olivat paikallisia, jonka im- tekniikalla käyttäen sekundääristä vasta-ainetta avidiini-biotiini monimutkainen ja peroksidaasisubstraattia (Kit 5001, Dako), mukaisesti valmistajan protokollaa. Sitten leikkeitä käsiteltiin kromogeenina 30-30 diaminobenzidene tetrahydrochloride kohtien identifioimiseksi immunosaostus valomikroskoopilla. Lopuksi leikkeet pestiin, vastavärjättiin hematoksyliinillä ja asennettu alle peitinlasit. Ei spesifistä värjäytymistä ei havaittu, kun primaarinen vasta-aine jätettiin pois protokollan (negatiivinen kontrolli). Erityisyys Immunovärjäyksen oli lisäksi ohjataan samanaikaisesti värjäämällä rintasyövän näytteitä, joilla tiedetään ErbB2, sykliini D1, p53 ja Ki67 ekspressiokuvioiden. Kokenut patologi teki värjäytymisintensiteettiä neljällä tasolla (negatiivinen, heikko, kohtalainen ja vahva), kun otetaan huomioon sekä värin intensiteetin ja lukumäärä värjäytyneiden solujen. Lyhyesti, osuus pisteet edustaa arvioitu prosenttiosuus positiivisten värjättyjen kasvainsoluja (0 = 0%; 1 = 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33-66%; 5≥ 67%), ja intensiteetti pisteet edusti syvyyksiin kasvaimen solujen värjäytymisen (1 = heikosti positiivinen; 2 = kohtalaisen positiivinen; 3 = voimakkaasti positiivinen).

RNA puhdistus ja cDNA valmistelu

Olemme eristetty kokonais-RNA: Raaka Tuumorinäytteiden näytteitä teho homogenisaattoria ja TRIzol® reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), kuten aiemmin on kuvattu [6], [7]. Käytimme 2 pg kokonais-RNA: ta lähtömateriaalina cDNA valmistamiseksi. Suoritimme ensimmäisen ja toisen juosteen cDNA-synteesi käyttäen StrataScript Ensimmäisen Strand Synthesis System, kuten aiemmin on kuvattu [8].

mikrosiruanalyysi

Oligos microarray sirut (~57K geenit) olivat saatu GE Healthcare (IL) ja AppliedMicroarrays (MA) (CodeLink 57K Human Whole Genome). Hybridisaatio suoritettiin CodeLink RNA vahvistusta ja -leimauskitillä hyödyntäen Cy5 fluoresoiva väriaine. Objektilasit skannattiin microarray skanneri (ScanArray 4000XL). Kuvat otettiin generoidaan ScanArray mikrosiru hankinnan ohjelmistot (GSI Lumonics, USA). cRNA kolmesta kokeellisia asetelmia käytettiin yhden kokeissa sisäinen piikkejä verrokkeina. Kokeellinen asetelmia koostui 10 virtsan BC näytteitä eri histologialtaan (T1 /2-asteen 3, T1-luokan 1/2, T3-asteen 3) ja 5 kontrollinäytteitä. Skannatut kuvat jatkokäsitteli kanssa CodeLink Expression Analysis Software v5.0 Amersham Biosciences. Kokeellinen setup analysoitiin perustuu rakennekonseptiin kuten aiemmin on kuvattu [9], [10], [11]. Kaikki tuumorinäytteet verrataan keskiarvon kontrollinäytteistä. Taustakorjaus suoritettiin vähentämällä mediaani maailmanlaajuinen tausta mediaani paikallisen taustan signaalista intensiteettiä. Kynnys 2 asetettiin cut-off, mikä tarkoittaa, että paikka-intensiteetti ainakin yhden kanavan pitäisi olla kaksi kertaa niin paljon kuin taustalla. Microarray data normalisoitiin jakamalla paikalla intensiteettejä maailmanlaajuinen mediaani. Normalisoitu data poimittiin, esikäsiteltyjä ja lajitella Microsoft Excel. Array tiedot ovat saatavilla Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information) kanssa liittymiseen numerot GSM678186 kautta GSM678385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448). Lisäksi kukin geeni testattiin sen merkitys erilainen ekspressio käyttäen z-testi. Geenit katsottiin merkittävästi ilmentyvät eri, jos ne on saatu p-arvo 0,05. False Discovery laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [12], [13], [14]. Geenit edelleen luokitella käyttämällä kaksisuuntaista (geenien-vasten näytettä) keskiarvo-sidoksen hierarkkinen klusterointi kanssa euklidinen etäisyys käyttäen Genesis 1.7.2 ohjelmisto (Technische Universität-Graz, Itävalta) [15].

Reaaliaikainen PCR validointi

Tämä puhe tuotteet alistettiin reaaliaikaisia ​​PCR kanssa SYBR Green I käytettäessä Mx3000P ohjelmoitavan lämpösäätelijään laitetta (Stratagene, La Jolla, CA). Alukeparit suunniteltiin ulottumaan ainakin yksi introni välttämiseksi monistumisen kontaminoivan genomisen DNA: n kanssa cDNA. Niiden järjestys ja vastaavat PCR-tuotteen kokoa on lueteltu taulukossa S1. GAPDH ja ACTB-geenejä käytettiin sisäisen valvonnan [16].

Yksi mikrolitra cDNA: normaali tai TCC näytteet, vastaavasti, monistettiin PCR-reaktiossa 2x Brilliant SYBR® Green QPCR Master Mix (sisälsi 2,5 mM MgCl

2), 300 nM kutakin aluketta ja 30 uM Rox passiivinen viite väriainetta lopullisessa tilavuudessa 20 ui. Jälkeen alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, näytteet altistettiin 40 monistussykliä, joka käsittää denaturaatio 95 ° C: ssa 30 sekuntia, pariutuminen 60 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Monistaminen ja venymä vaiheet, jota seuraa sulatteen käyrä analyysi, jossa lämpötila nousi 55 ° C: sta 95 ° C: seen lineaarisella nopeudella 0,2 ° C /sek. Tietojen keruu tehtiin aikana sekä hehkutus ja laajennus, jossa on kaksi mittausta jokaisessa vaiheessa ja kaikkina aikoina sulaa käyräanalyysi. Tulosten todentamiseksi sulan käyräanalyysi, qPCR tuotteet analysoitiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä, värjättiin etidiumbromidilla ja kuvattiin UV-valossa transilluminaattoria (kuva S1). Kussakin qPCR reaktiossa kaksi negatiivista kontrollia sisällytettiin, jossa ei ole cDNA mallin ja yksi ilman käänteistranskriptiota hoitoa. Kaikki näytteet käsiteltiin kahtena kappaleena. Geenitranskriptiota tasot laskettiin käyttäen ΔΔCt menetelmällä, kuten aikaisemmin on kuvattu [17], [18].

Yhteensä proteiinin uutto ja Western blot-analyysi

jälkeen kun oli lisätty 250 ui jääkylmää GST Fish lyysipuskuria (10% glyseroli, 50 mM Tris (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1% (v /v) Nonidet P-40, 2 mM MgCI

2, ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche Diagnostics GmbH, Saksa), homogenisoitu kudosnäytteet sentrifugoitiin 14000 x g: ssä 15 min 4 ° C: ssa, liukenemattoman materiaalin poistamiseksi, ja supernatantti otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus kunkin näytteen määritettiin Bradfordin menetelmällä käyttäen proteiinimääritys värireagenssia (Bio-Rad, Hercules, CA). näytteet liuotettiin LDS näytepuskuriin (Invitrogen) ja kuumennettiin 70 ° C: ssa 7 min. Yhtä suuret määrät näytteitä (20-30 ug) suoritettiin elektroforeesi NuPAGE 4-12% bis-Tris geeli (Invitrogen) ja siirrettiin 0,45pm um nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad Laboratories, Inc.). kalvo upotettiin 5% rasvatonta maitoa tai BSA: ta, 0,1% Tween 20 ja liuotetaan Tris-puskuroitu suolaliuos estää epäspesifisen sitoutumisen. Membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavat primaaristen vasta-aineiden: hiiren polyklonaalisen anti-HRAS (laimennettu 1:1,000; Abnova, CA), hiiren monoklonaalinen anti-CDKN2A (laimennettu 1:500; Abnova, CA), hiiren monoklonaalinen anti -p53 (laimennettu 1:500; klooni DO-7; BD Transduction Laboratories), hiiren monoklonaalinen anti-VEGFA (laimennettu 1:500; Santa Cruz Biotechnology, CA), kanin polyklonaalinen anti-TGFp 1 (laimennettu 1:1000; Novus Biologicals, CO) ja hiiren monoklonaalinen anti-OPN (laimennettu 1:500; Santa Cruz Biotechnology, CA). Kalvot pestiin sitten ja niitä inkuboitiin 90 min. RT sekundaarisen vasta-aineen, joka sisälsi piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani tai anti-hiiri-IgG: tä (laimennettu 1:1,500; Santa Cruz Biotechnology). Western-blotit normalisoitiin käyttäen monoklonaalista anti-

β-aktiini-vasta-ainetta (laimennettu 1:5,000; Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Erityinen signaaleja visualisoitiin ECL-reagenssilla (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ), kun alttius ECL elokuva. Suhteellinen tiheys polypeptidin bändejä havaittu ECL elokuva määritettiin käyttämällä paikalla denso väline AlphaEaseFC ohjelmiston.

GEO Dataset laskennallisen analyysin

Computational analyysi tehtiin tutkia tarkemmin eroja OPN, VEGFA, TGFp 1, FGF2, EGFR, EGF, p14

ARF, p16

INK4a, p53, KRAS, HRAS, sääntelyviranomaisten, araF, BRAF, RAF1, RKIP, MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 ja CyclinD1 transkriptipitoisuuksissa eri virtsarakon syövän tyyppejä, sen metastasoitunut vastine ja suhteellinen normaalia kudosta. Neljä julkisesti saatavilla Gene Expression Omnibus (GEO) aineistot analysoitiin tästä syystä, jossa GEO sarja liittymisen numerot GSE89, GSE7476, GSE3167 ja GSE12630 [19], [20], [21]. Expression malleja geenien poimittiin normalisoitu aineistot ja ilmaistiin keskiarvona tasoja log

2 intensiteetti (taulukko S2).

Gene ontologia (GO) ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Kegg ) analyysi

Gene ontologia (GO) ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) rakenteisen analyysi tehtiin tunnistaa mahdollisia rikastaminen geenien erityisiä biologisia teemoja (https://www.genome.jp/kegg /pathway.html).

tilastollinen

Microarray data normalisoitiin maailmanlaajuinen mediaani paikalla intensiteettiä. Kukin geeni testattiin sen merkitys erilainen ekspressio käyttäen z-testi. GOI ilmentymistasot ensin arvioi yhden otoksen Kolmogorov-Smirnov Goodness-of-Fit testin, jotta voidaan määrittää, ovatko ne seuraa normaalijakaumaa kuvio. Ei-parametrinen Spearmanin käytettiin tutkimaan pareittaiset väliset korrelaatiot mRNA-tasoja ja niiden yhdessä jatkuvia muuttujia (ikä, tupakointi, kasvain vaihe /grade). Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin tutkimaan ilmentymistilanne geenien kanssa eri kliinis parametrit jälkeen kerrostumista. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioimaan eloonjäämiseen kuin ajan funktiona. Survival erot arvioitiin Log-rank (Mantel Cox) ja Gehan-Breslowin-Wilcoxonin testejä. Numeeriset arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD), ja mediaanit. Data erotetaan GEO tietokannat tilastollisesti verrattiin Mann-Whitneyn U-testi. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin 95%: n tasolla (p 0,05). Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL).

Tulokset

immunohistokemiallinen tulokset

Tuumorinäytteet värjättiin vasta-ErbB2, sykliini D1, p53 ja Ki-67 (kuvio 1). Mikäli läsnä, anti-ErbB2 värjäytymistä Tuumorinäytteissä on solukalvojen värjäytymistä, diffuusi että uroteeliin. Kaikki BC näytettä (100%) osoittivat kohtalaista /strong (++, +++) Immuunivärjäystä taas ei BC näyte ei osoittanut /heikkoa Immunovärjäyksen (0, +) ErbB2. Kynnysarvot korkean merkintöjä indeksit asetettiin Ki-67 ≥10% kasvain ytimiä ja p53 10 ja 20%. T1-luokan 1/2 kasvaimia osoitti heikkoa värjäytymistä anti-Ki-67 (7,5% ja 40%, tässä järjestyksessä), kun taas T1 /2-asteen 3 kasvaimia esiintyi voimakkain Immunovärjäyksen (+++, 70%). Samoin, T1-luokan 1/2 kasvaimet osoittivat heikkoa värjäytymistä anti-p53 (10% ja 35%, vastaavasti), kun taas T1 /2-asteen 3 kasvaimia esiintyi voimakkain immunovärjäyksellä (53-70%). Mitä sykliini D1, kaikki kasvaimet osoitti voimakasta värjäytymistä anti-sykliini D1, kun taas korkeamman asteen näytteillä suhteellisesti pienempi immunovärjäyksen. T1-luokan 1/2 kasvaimet, värjäys anti-sykliini D1 oli 80%; kun taas T1 /2-asteen 3 kasvaimia immunovärjäyty- oli 50%.

Kasvaimet värjättiin anti-cerbB2, anti-Ki67, anti-p53 ja anti-sykliini D1. H punainen ilmaisee lauseke korkeampi kuin mediaani (musta), ja vihreä tarkoittaa ilmaisu pienempi kuin mediaani. Värin voimakkuus ilmaisee asteen geenisäätelystä (A). Kertainen ekspression GOI-sekvenssiä suhteen kasvainhistologiaa, havaittuna microarray-analyysillä (B).

kertainen ekspression (keskiarvo ± SD) on GOI-sekvenssiä kussakin yksi kolmesta kasvaimen ryhmään verrattuna normaali kudos, kuten hankittu meidän mikrosiruanalyysillä, on esitetty (kuva S2).

tarkastusta mRNA: ta ja proteiinin ilmentymisen suhteen kliinis ominaisuudet

mRNA geenien ilmentymistä: VEGFA, araF, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, sääntelyviranomaisten, TGFp 1, AKT1, HRAS, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, TP53, CDKN2A (p14

ARF /p16

INK4a) , MMP9 määritettiin qPCR sekä virtsarakon syöpään ja normaalin kudoksen (taulukko S3). Sirontakaavioissa rakennettiin parempaa visualisointia geenien, jotka olivat sääteli ( 2-kertainen), alassäädetty ( 2-kertainen) tai yhtä ilmaistuna (2-kertainen ero kynnys) välillä BC ja valvontaa. Volcano tontteja graphing loki

2 kertainen muutos ilmaisun kunkin geenin välissä BC näytteiden vs. sen p-arvon t-testiä, muodostettiin myös (kuva 3).

musta viiva ilmaisee kertamuutoksia on 1. vaaleanpunainen viivat kynnys geeniekspressiossa kertamuutosta (2-kertainen ero). qPCR paljasti ylös- ja alas-geenien virtsarakon syöpään. Kokonais-RNA normaalista viereiseen kudokseen ja virtsarakon syöpään tunnettu tekninen kolmena rinnakkaisena, ja suhteellinen ekspressiotasot kunkin geenin kahden kudostyypeissä piirrettiin toisiaan pistekaavion. VEGFA, OPN, p14

INK4a, p6

CDKN2A, sääntelyviranomaisten ja TGFp 1 oli säädelty, kun taas FGF2 ja EGF olivat alassäädetty vähintään kaksinkertaiseksi (ulkopuolella violetti riviä). Geenit KRAS, MMP2, AKT1, p53, EGFR, MMP-9 ja HRAS näytteillä yhtäläinen ilmaisun välillä virtsarakon syövän ja normaalin kudoksen (A). Volcano Plot piirtää log

2 kertainen muutos ilmaisun kunkin geenin välissä BC näytteiden versus sen p-arvon t-testiä. Musta viiva osoittaa kertamuutoksia on 1. vaaleanpunainen viivat kynnys geeniekspressiossa kertamuutosta (2-kertainen ero). Sininen viiva ilmaisee kynnyksen p-arvo t-testi (0,01) (B).

geenit OPN, VEGFA, TGFp 1, p16

INK4a, p53, RKIP ja sääntelyviranomaisten ylittyivät huomattavasti ilmaistu BC vs. normaali kudos (p 0,001; t-testi) (kuvio S3A). Keskimääräinen mRNA: n ekspression arvojen BC ja normaalin kudoksen kunkin geenin on esitetty taulukossa 2.

mRNA: n ilmentymisen tasot geenien p14

ARF, AKT1, HRAS, araF, BRAF, RAF1 , MMP-9, EGFR ja KRAS, ei eronnut merkitsevästi BC ja ohjaus kudoksen (p 0,01, t-testi). Keskimääräinen mRNA: n ekspression arvojen BC ja normaalin kudoksen kunkin geenin, olivat seuraavat: p14

ARF, 0,0325 ± 0,0488 vs. 0,0100 ± 0,0118 (p = 0,1087); AKT1, 0,0321 ± 0,0230 vs. 0,0262 ± 0,0174 (p = 0,3632); HRAS, 0,0015 ± 0,0021 vs. 0,0015 ± 0,0021 (p = 0,9752); Araf, 0,9931 ± 0,0047 vs. 0,9942 ± 0,0040 (p = 0,5201); BRAF, 0,8933 ± 0,0657 vs. 0,9053 ± 0,0486 (p = 0,8999); RAF1, 0,9348 ± 0,0527 vs. 0,9419 ± 0,0293 (p = 0,6681); MMP-9, 0,0014 ± 0,0015 vs. 0,0023 ± 0,0054 (p = 0,1265); EGFR, 0,0078 ± 0,0073 vs. 0,0049 ± 0,0048 (p = 0,0948); KRAS, 0,0876 ± 0,0997 vs. 0,0773 ± 0,0900 (p = 0,4035; U-testi) (kuvio S3B).

EGF, FGF2 ja MMP2 osoittivat merkittävää ali-ilmentymistä BC vs. normaali kudos: EGF , 0,00004 ± 0,000047 vs. 0,000151 ± 0,000235 (p = 0,0017); FGF2, 0,0003 ± 0,0004 vs. 0,0023 ± 0,0019 (p 0,0001); MMP2, 0,0752 ± 0,0858 vs. 0,1341 ± 0,0834 (p = 0,0007, Mann-Whitney U-testi) (kuvio S3C).

mRNA geenien, että esillä yli-, yhtä suuri tai alle ilmaisun mukaan meidän qPCR analyysi tutkittiin myös suhteessa vaiheeseen /arvosana kasvaimia. Kaikki tilastollisesti merkitseviä eroja ilmentymisen kunkin geenin kesken kasvain ryhmien T2 /T3-asteen 3, T1-luokan 3 ja T1-luokan 2, on kuvattu kuviossa 4.

Ryhmät paria verrattiin tilastollisesti käyttämällä Mann -Whitney U-testi. Bars kuvaavat mediaaniarvot (A). Scatterplot kuvaavat mRNA-tasoja geenien, jotka olivat yhtä ilmaistiin kesken virtsarakon syöpien eri vaiheessa /laatu, ja normaali kudos. Ryhmät paria verrattiin tilastollisesti käyttäen Mann-Whitneyn U-testi. Bars kuvaavat mediaaniarvot (B). Scatterplot kuvaavat mRNA-tasoja geenien, jotka olivat alle ilmaistu eri virtsarakossa syövät eri vaiheessa /laatu, ja normaalissa kudoksessa. Ryhmä paria verrattiin tilastollisesti käyttäen Mann-Whitneyn U-testi. Bars kuvaavat mediaaniarvot (C).

ilmentyminen OPN (SPP1), TGFp 1, VEGFA, CDKN2A (p14

ARF /p16

INK4a), HRAS ja TP53, oli myös tarkastettava proteiini tasolla, densitometrisellä analyysi Länsi blotteja (kuvio 5). Normalisoidut proteiinin tasot BC vs. normaali kudos olivat seuraavat: OPN, 0,645 ± 0,287 vs. 0,261 ± 0,020 (p = 0,0286); TGFp 1, 0,837 ± 0,114 vs. 0,300 ± 0,195 (p = 0,0286); VEGFA, 0,678 ± 0,183 vs. 0,295 ± 0,133 (p = 0,05); CDKN2A, 0,687 ± 0,157 vs. 0,429 ± 0,088 (p = 0,0286); HRAS, 0,663 ± 0,258 vs. 0,420 ± 0,121 (p = 0,1143); p53, 0,760 ± 0,167 vs. 0,448 ± 0,295 (p = 0,2000; U-testi).

β-aktiini (43 kDa) käytettiin latauskontrollina.

korrelaatio mRNA /proteiinin ilmentymistä GOI-sekvenssiä ja eloonjäämisluvut virtsarakon syöpäpotilaiden

yhteensä 30 virtsarakon syövän tapausta tutkittiin yleistä eloonjäämisaste. Potilaat, joilla kasvain vaiheen 1 esitetään parempi kokonaiseloonjääminen verrattuna vaiheen 2 tai 3 [p = 0,0008, χ

2 = 14,32, Log-rank (Mantel Cox) testi; p = 0,0041, χ

2 = 8,260, Gehan-Breslowin-Wilcoxonin testi]. Lisäksi potilailla, joilla on asteen 2 kasvaimia osoitti parempaa eloonjäämisaste vs. ne Asteen 3 kasvainten [p = 0,0475, χ

2 = 6,094, Log-rank (Mantel Cox) testi].

Mediaani arvo MMP2 mRNA: n ilmentymisen virtsarakon syöpä näytteitä oli 0,038. Tapaukset jaettiin kahteen ryhmään, joissa ilmaisun ylä- ja alapuolella tämän mediaanin. Samoin jaoimme tapauksissa ryhmiin perustuu mediaanin arvot MMP-9 (0,0007), OPN (0,031), VEGFA (0,141), TGFp 1 (0,0001), FGF2 (0,0002), P14

ARF (0,011), p16

INK4a (0,013), p53 (0,013), AKT1 (0,025), EGFR (0,005), EGF (0.00002), HRAS (0,0011), KRAS (0,051), kansallisten sääntelyviranomaisten (0,024), araF (0,994), BRAF (0,916 ), RAF1 (0,956), RKIP (0,764) mRNA: n ilmentymisen (taulukko 2).

tapaukset, joiden kasvaimet osoitti vähäistä VEGFA ( mediaani, 0,141) ja EGFR ( mediaaniarvon, 0,0051 ) mRNA ilmaisu näytteille huonompi yleistä eloonjäämisaste kuin tapaukset ilmentävät lisääntynyt VEGFA ( mediaani, 0,141) ja EGFR ( mediaani, 0,0051) mRNA-tasot vastaavasti [varten VEGFA, p = 0,04; EGFR, p = 0,02; Log-rank (Mantel Cox) testi]. Potilaat, joilla on korkea TGFp 1, FGF2, p14

ARF, AKT1, RKIP, KRAS ja p53-mRNA-tasot osoitti myös parempaa kokonaiselinaika kuvio, mutta korrelaatio ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Kaplan-Meier -käyrät kaikille GOI-sekvenssiä on kuvattu kuviossa 6.

tapaukset, joiden kasvaimet osoitti vähäistä VEGFA ( mediaani, 0,141) ja EGFR ( mediaani, 0,0051) mRNA ilmaisun, näytteillä huonompi yleistä eloonjäämisluvut, kuin tapaukset ilmentävät lisääntynyt VEGFA ( mediaani, 0,141) ja EGFR ( mediaani, 0,0051) mRNA-tasot [varten VEGFA, p = 0,04; EGFR, p = 0,02; Log-rank (Mantel Cox) testi]. Erot selviytyminen arvioitiin käyttäen Log-rank (Mantel Cox) testi. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin 95%: n tasolla (p 0,05).

vertailu GEO Tietoaineistot

entisestään verrattuna meidän qPCR tulokset 4 julkisesti saatavilla BC mikrosirujen GEO aineistot: GSE89 by Dyrskjot et al. (2003) [19]; GSE7476 by Mengual et al. (2009) [21]; GSE3167 by Dyrskjot et al. (2004) [20] ja GSE12630 jonka Monzoniin et al. (2009) [22]. Kaikki tarkoittaa log

2 muuttaneet suhteet BC näytteiden vs. kontrollit esitetty taulukossa S2.

Dataset GSE12630 sisälsivät tietoja vain siirtymäkauden cell carcinoma virtsarakon ja metastasoituneen urothelial karsinooma. Koska tietoja ei ole normaalista kudoksesta olivat saatavilla tämän aineisto, poimimamme normaalia kudosta tietoja aineisto GSE89, ja lasketaan keskiarvo log

2 muuttaneet suhteet BC vs. näistä uuttaa tietoa, jota käytettiin verrokkeina (taulukko S2) .

Korrelaatioanalyysiä

selvitimme korrelaatio mRNA tasojen GOI-sekvenssiä BC sekä normaalia kudosta, suorittamalla Spearmanin testissä (taulukko S4). Choi et ai.