Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Radiotaajuisen terminen ablaatio (RFA) maksan ja munuaisten kasvaimet voidaan liittää ei- haluttu tuumorigeneesiä jäljellä, hoitamaton kasvain. Täällä tutkimme käyttöä misellin kapseloitu siRNA tukahduttaa IL-6-välitteinen paikallisia ja systeemisiä sivuvaikutuksia on RFA.

Methods

Vertasimme standardoituja maksan tai munuaisten RFA (laparotomy, 1 cm aktiivinen kärki 70 ± 2 ° C: ssa 5 min) ja sham menettelyt ilman ja hallinnon 150nm miselli-nanohiukkasten (MNP) anti-IL6 siRNA (DOPE-PEI konjugaatit, yksi IP-annos 15 min jälkeisen RFA, C57BI hiiri : 3.5 ug /100 ml, Fisher 344 rotta: 20 ug /200 ui), RFA /salattu siRNA, ja RFA /tyhjät MNPS. Tulosmittareita olivat: paikallinen periablational soluinfiltraatiota (α-SMA + tähtisolut), alueellinen hepatosyyttien lisääntymistä, seerumin /kudos IL-6: n ja VEGF tasoja 6-72hr, ja kaukainen kasvaimen kasvu, kasvaimen leviämisen (Ki-67) ja microvascular tiheys ( MVD, CD34) in ihonalaisen R3230 ja MATBIII rinnan adenokarsinooma mallit 7 päivää.

tulokset

maksa RFA, adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA vähensi RFA-indusoimaa kasvua kudoksessa IL-6 tasoa , α-SMA + stellate infiltraatiota, ja alueelliset maksasolujen proliferaation lähtötasoon (p 0,04, kaikki vertailut). Lisäksi adjuvantti MNP anti-IL6- siRNA tukahdutetaan lisääntynyt etäinen kasvaimen kasvua ja Ki-67 havaittiin R3230 ja MATBIII kasvaimia post maksan RFA (p 0,01). Anti-IL6 siRNA vähensi myös RFA aiheuttama nousu VEGF ja kasvaimen MVD (p 0,01). Samoin munuaisten RFA aiheuttama seerumin IL-6 tasoa ja etäinen R3230 kasvaimen kasvua suppressoitiin anti-IL6 siRNA (p 0,01).

Johtopäätökset

adjuvantti nanohiukkasten kapseloitu siRNA vastaan IL-6 voidaan käyttää moduloimaan paikallisia ja alueellisia vaikutuksia maksan RFA estää mahdollisten ei-toivottujen pro-kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle maksan tai munuaisten RFA kaukana kasvain.

Citation: Ahmed M, Kumar G, Navarro G, Wang Y, Gourevitch S, Moussa MH, et al. (2015) Systeeminen siRNA Nanoparticle-Based Drugs Yhdistettynä Radiotaajuisen ablaatio Cancer Therapy. PLoS ONE 10 (7): e0128910. doi: 10,1371 /journal.pone.0128910

Editor: Yi-Hsiang Huang, National Yang-Ming University, Taiwan

vastaanotettu: 19 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 01 toukokuu 2015; Julkaistu: 08 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Ahmed et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat käsikirjoituksen.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta National Cancer Institute (CCNE 1U54CA151881-01 VPT, SNG, MA, TL), Radiological Society of North America Research and Education Foundation (RSD1215, MA), Harvard Medical Faculty Lääkärit tiedekunnan Radiology Foundation (MA), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SF8841, EG), Israelin Center of Excellence I-CORE (EG), ja Israel Science Foundation (EG, SNG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on ollut paljon viime aikoina kiinnostusta käyttää RNA-interferenssin ( ’posttranskriptionaalisen geenien) ja erityisesti pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA) syövän hoitomuotoja. Tämä on suurelta osin keskitytty joko moduloimalla solun vasteita parantaa tehokkuutta ensisijaisen farmakologisen /onkologisesta hoitojen [1,2], augmenting kasvaimen vastaisen immuniteetin valikoivasti knockdovvn immuunivasteen tukahduttamaan proteiineja, tai kemoterapia-herkistymistä kautta vaiennettu kasvutekijän reseptorin geenien [3-6]. Rajoitusten voittamiseksi toimitusta vapaasti siRNA

in vivo

järjestelmissä, siRNA: t ovat yleisesti annettavien käyttämällä nanohiukkasten kantajia (kuten liposomit, misellit, tai sidottu hiukkaset) maksimoida olennaisesti

passiivinen

kudos toimitus (vaikkakin suurempina pitoisuuksina) ensimmäisiin elimiin ja tavoite kasvaimia [7-11]. Silti, vaikka apunaan nanocarrier toimitus, haasteita sisäisen kasvaimen ja kohdennettua lääkeannostelun jatkuvat [1,3]. Lisäksi harvat tutkimuksissa on käytetty apuaine siRNA yhdessä ei-farmakologinen paradigmoja, kuten moduloiva kudoksen tai fysiologisten vasteiden jälkeen kirurgisten, interventionaalisen tai sädehoidot.

kuvaohjatut terminen kudoksen ablaatio käyttäen radiotaajuus, mikroaaltouuni, tai laser energiaa luoda paikallisia korkeassa lämpötilassa (60-100 ° C) lämmitys ympärille perkutaanisesti sijoitettu asetin on nyt laajassa kliinisessä käytössä hoitoon polttoväli kasvaimia maksassa, keuhko-, munuais-, ja luun ( 100000 tapausta /vuosi maailmanlaajuisesti) [ ,,,0],12]. Onnistunut täydellinen kasvaimen ablaatio vaatii myös sisällyttämistä 5-10 mm: n reuna normaalin parenchyma kuin ”ablatiivi marginaali” varmistaa täydellisen hävittämisen kasvain [13]. Yrittäessään varmistaa täydellisyys kohtelu, olemme osoittaneet, että anto edes yhden annoksen lääkettä ladattu nanohiukkasten kemoterapiaa samanaikaisesti RF ablaatio voi johtaa nousu paikallisissa periablational lääkeannostelun (jopa 10-kertainen), jossa tuloksena lisääntynyt kasvain tuhoaminen, lisääntynyt eläin päätepisteen säilymiseen, ja suurempia määriä kasvain tuhoa potilailla, joiden maksan kasvaimia [14-16]. Viime aikoina olemme edelleen onnistuneesti velkarahalla tämän parannetun polttovälin toimitus kohdistaa tiettyihin RFA aiheuttama kudoksen vasteet (kuten lisääntynyt tunkeutumiseen DNA tai tukahduttamaan HSP tuotanto) [16,17].

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että osa- tappava alempi kudos lämmitin (40-47 ° C) noin ablaatiovyöhykkeelle houkuttelee useita toissijaisia ​​kudosreaktioita [18], mukaan lukien lisääntynyt inflammatoristen sytokiinien (kuten IL-6 ja IL-10) [19] ja kasvutekijän (kuten HGF, HIF-1α, ja VEGF) [20-22] tuotanto; soluttautuminen raadonsyöjä ja immunogeenisiä soluja osaksi periablational kudokseen [23]; ja hypertermia aiheuttama verisuonten läpäisevyyden lisääntymistä ja endoteelin leakiness [24]. Erityisesti viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyt seerumin interleukiini-6 tuotannon jälkeen terminen ablaatio normaali maksan (simuloi kliininen päätepiste ablatoi- koko maksakasvain ja sen ”ablatiivi marginaali” normaali ympäröivän maksa) on keskeinen tekijä periablational soluttautumisen tulehdus- ja immunogeenisiä soluja, kuten makrofagit ja α-sileän lihaksen aktiini (SMA) positiiviset maksan tähtisolut [23,25]. Nämä puolestaan ​​voivat tuottaa lisäaktivaatiota loppupään pro-kasvun reittejä kuten sytokiinien HGF /c-Met-reitin, ja lisääntynyt maksasolujen proliferaation hoitamattomilla maksa-prosesseja, jotka ovat merkittävästi pienentyneet IL-6 hiirten [25]. Koska onnistunut täydellisesti kasvaimen ablaatio vaatii myös sisällyttämistä 5-10 mm: n reuna normaalin parenchyma kuin ”ablatiivi marginaali” varmistaa täydellisen hävittämisen kasvain [13], tutkimalla näitä toissijaisia ​​systeemisiä vaikutuksia radiotaajuusablaation normaalissa elinkudoshomogenaa- on välttämätöntä . Tarve lisätutkimuksia tukevat viimeaikaiset kokeelliset tutkimukset osoittamalla, ”off-tavoite” stimulaation kaukaisten kasvaimen kasvun jälkeen terminen ablaatio maksan ja munuaisten kudosten ja kliiniset tutkimukset viittaavat siihen, esiintyi enemmän uusia HCC jälkeen maksan radiotaajuusablaation (lähestyy 80 % 5 vuotta) verrattuna vertailevan un saaneista kirroosipotilailla (22-50%) [26-29]. Täällä me rakentaa meidän aikaisempaa kokemusta käyttämällä nanohiukkasten välittämä lääkeaineen ensisijaisesti suunnattu periablational vanteen tutkia, polymeerisiä miselli-nanohiukkasten (MNPS) ladattu anti-IL6 siRNA voidaan tukahduttaa lämmön ablaation aiheuttama IL-6-tuotannon IL-6-välitteinen periablational infiltraatiota, maksasolujen proliferaation käsittelemättömän maksassa, ja IL-6-välitteinen alavirtaan RF-ablaation aiheuttama stimulaatio kaukana kasvaimen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausuman

Kaikki eläinkokeet suoritettiin hyväksyntää Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional animal Care ja käyttää komitean ja Hadassah Hebrew University Medical School Institutional animal Care eettisen komitean.

eläinmallit

kaikki kokeet ja menettelyt, anestesia indusoitiin IP injektio seosta ketamiinia (50 mg /kg, Ketaject, Phoenix Pharmaceutical, St. Joseph, MO) ja ksylatsiinilla (5 mg /kg, Bayer, Shawnee Mission, KS). Eläimet lopetettiin yliannoksella hiilidioksidia käyttäen Smartbox CO

2 Chamber System (EZ järjestelmissä, Palmer, PA) ja sen jälkeen sydänpunktiolla.

Kokeet suoritettiin normaaleissa C57BI hiirillä (40 ± 10 g), tai kaksi rinnan adenokarsinooma solulinjoja (R3230 tai MATBIII) ihonalaisesti naisten Fisher 344 rotat (150 ± 20 g; 14-16viikko vanhoja, Charles River, Wilmington, MA) [30]. R3230 rinnan adenokarsinooma kasvain linja on hyvin tunnettu line että olemme käyttäneet jo yli 10 vuotta [30]. MATBIII kasvain linja saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Kasvain istutusta, arviointi ja valmistelu tekniikoita suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, yksi kasvain istutettiin jokaisen eläimen hitaasti ruiskuttamalla 0,3-0,4 ml kasvain suspension utarerasvaa pad kunkin eläimen kautta 18-neula. Kasvaimet mitattiin joka 1-2d kunnes ne saavuttivat 6-7 mm jolloin ne olivat mukana tutkimuksessa.

soveltaminen radiotaajuusablaation

Sarka monopolar RFA sovellettiin käyttämällä 500 kHz: RFA-generaattori (malli 3E, Radionics, Burlington, MA), kuten on aiemmin kuvattu [30]. Lyhyesti, kohde-elin paljastui kautta laparotomiaa käyttäen subcostal (maksa) tai sivusuunnassa (munuainen) viillon steriileissä olosuhteissa samalla kun eläin nukutettiin. 1 cm kärki on 21 G sähköeristystä elektrodi (SMK elektrodi; Cosman Medical Inc., Burlington, MA) asetettiin maksan tai munuaisten. Eläinten hoidettiin terminen ablaatio, radiotaajuusenergian haettiin 5 min generaattorin teho titrataan ylläpitämiseksi nimetyn kärjen lämpötilan (70 ± 2 ° C). Tämä standardoitu menetelmä RF hakemus on osoitettu aiemmin saada toistettavia hyytymisen määriä käytön yhteydessä tämä tavanomainen RFA järjestelmä [30,31]. Viimeistele RF-piiri, eläin pantiin standardoituun metallisen maadoitus (Radionics). Eläinten käsiteltiin joko näennäistä tai ainetta yksin, elektrodi on sijoitettu, mutta mitään energiaa annettiin.

Nanoparticle siRNA formulaatio

Kaikki materiaalit ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), ellei toisin mainita. Haaroittunut polyetyleeni-imiini (PEI), jonka molekyylipaino on 1,8 kDa ostettiin Polysciences, Inc. (Warrington, PA). 1,2-disrearoyl-sn-glysero-3-fosfoetanoliamiini-N- [metoksi (polyetyleeniglykoli) -2000] (PEG-PE 2kDa) ja 1,2-dioleoyyli-sn-glysero-3-fosfoetanoliamiini-N- (glutaryyli ) (glutaryyli-PE) ostettiin Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Nukleaasitonta vettä (ostettu Qiageniltä, ​​Germantown, MD). Kaikki siRNA-dupleksit ovat Dharmacon (Lafayette, CO). Syntetisoitu sekvenssit siRNA kohdistaminen IL-6 olivat: 5′-AGUCGGAGGCUUAAUUACAdTdT-3 ’(sense), 5′-CAGGAAAUUUGCCUAUUGAdTdT-3′ (sense) ja 5’-UAAGGACCAAGACCAUCCAdTdT-3 ’(sense) [32,33]. Sekoituskoodin siRNA: ta käytettiin negatiivisena kontrollina. Sekvenssi kuin kohdistaminen ohjaus siRNA oli 5’-AGUACUGCUUACGAUACGGdTdT-3 ’(sense) [34].

miselli-nanohiukkasten valittiin toimituksen ajoneuvon perustuvat aiemmin osoittaviin hyödyllistä ajallinen toimitus kinetiikka (6 -12hr) ja suurempi interstitiaalinen tunkeutuminen kudoksiin ympäröivä ablaatiovyöhykkeelle [35]. Olemme rakennettu miselli-nanohiukkasten (MNPS), joka perustuu fosfolipidi modifioitu-polyeteeni-imiini konjugaatteja (DOPE-PEI). DOPE-PEI-konjugaattia ja DOPE-PEI /siRNA-kompleksit valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [34]. Olemme aiemmin osoittaneet, että DOPE-PEI konjugaattien perustuen pienimolekyylipainoisen PEI itse koottu sisällä misellirakenteita että kondensoitu siRNA, osoitti korkea transfektiotehokkuutta ja oli parempi toksisuusprofiili kuin PEI 25 kDa ja Lipofectamine (yleisesti käytetty DNA /siRNA transfektioreagensseilla) [11]. Me sisällytetty PEG-PE harjoittajat saavuttaa paremman suorituskyvyn

in vivo

. Hydrofobinen välistä vuorovaikutusta lipidiosia on DOPE-PEI ja ne, PEG-PE johtanut niiden itsensä kokoonpano miselli-hiukkasia, joiden keskimääräinen koko on 150 nm ja tuottaa steerinen stabilointi komplekseja muodostamalla suojaavan esteen ja edistää lisääntynyt vakaus

in vivo

. DOPE-PEI /siRNA kompleksit valmistettiin sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet DOPE-PEI siRNA-IL-6 (ekvimolaarinen pooli 3 sekvenssit) tai ryntäily siRNA lopulliseen N /P-suhde oli 16. siRNA liuos siirrettiin polymeeriliuos, sekoitettiin pipetoimalla voimakkaasti ja inkuboitiin 15 min. Polymeeri /siRNA-suhde ilmaistiin typpi /fosfaatti (N /P) suhteen, ja lasketaan olettaen, että 43 g /mol vastaa kutakin toistuva yksikkö PEI, joka sisältää yhden amiinin ja 316 g /mol vastaa kutakin toistuva yksikkö siRNA, joka sisälsi yksi fosfaatti. Sitten aikaisemmin Kuiva-lipidikalvon PEG-PE hydrattiin komplekseja ja annettiin seisoa huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan ajoittain ravistellen PEG-PE2kDa: DOPE-PEI painosuhde oli 2: 1 [36]. Tyhjät formulaatiot valmistettiin nesteytystä elokuvan polymeeriliuoksen vain. Kukin hiiri sai annoksen 3,5 ug siRNA: n lopullisessa formulaatiossa tilavuuteen 100 ui. Kukin rotta sai annoksen 20 ug siRNA: n lopullisessa formulaatiossa tilavuus oli 200 ui. Kukin annos annettiin injektiona vatsaonteloon (IP) valituissa ajankohtina edellä esitetyllä tavalla.

Kasvain korjuu

Eläimet uhrattiin määrättyinä aikoina edellä kuvatut käyttäen hiilidioksidia eutanasiaa. Kohdekudoksen (ensisijaisesta ablaation, käsittelemättömän maksalohko, tai kaukana kasvain) kerättiin talteen, ja leikattiin kohtisuoraan suuntaan elektrodin asennuksen [17,30]. Distant kasvaimet kerättiin myös ja leikattuna. Kaikki näytteet kiinnitettiin 10% formaliinilla yön yli 4 ° C: ssa, upotettiin parafiiniin, ja leikattiin, jonka paksuus on 5 um. Kudokset värjättiin H p = 0,04 vs. RFA yksin, p = 0,46 vs. huijausta). Maksan RFA /MNP salattu siRNA lisääntynyt Kudosten paikallisen IL-6 tasoa (1924 ± 141pg /ml; p 0,001 vs. huijausta, p = 0,01 vs. RFA yksin, p = 0,001 vs. RFA /anti-IL6 siRNA). Tissue IL-6 tasoa jälkeen MNP anti-IL6 siRNA huijausta hoito oli 1,110 ± 42pg /ml, ja sen jälkeen RFA /tyhjä harjoittaja on 1783 ± 125pg /ml.

(A) Maksa ELISA kvantifiointia IL-6 tasot 12h hoidon jälkeen (keskiarvo ± keskihajonta). C57BI hiiret satunnaistettiin saamaan huijausta hoitoa, maksan radiotaajuusablaation, maksa RFA /IP MNP anti-IL6 siRNA, MNP anti-IL6 siRNA yksin, RFA /MNP salattu siRNA, tai RFA /tyhjät operaattorin (n = 5-6 ryhmää kohden) . Maksa RFA lisääntynyt paikallinen 12h maksan IL-6 tasot (1463 ± 108 pg /ml), joka vaimentaa adjuvantin IP MNP anti-IL6 siRNA (1139 ± 159 pg /ml, p = 0,04). Lisäksi adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA annetaan 15 minuutin kuluttua maksan terminen ablaatio (D, E) C57BL hiiret tukahdutti periablational soluttautuminen α-SMA positiivinen myofibroblasteja verrattuna maksan terminen ablaatio yksin (B) tai RFA yhdistettynä salattu siRNA (C) (F, keskiarvo ± keskihajonta, p 0,01).

Kuten raportoitu aiemmin [23], standardoitu RF terminen ablaatio normaali maksan johti soluttautumista periablational vanteen by α-SMA-positiivisia aktivoitunut myofibroblasteja (tunnetaan myös maksan tähtisolut, surrogaattimarkkerina monimutkainen periablational soluinfiltraatiota, joka tapahtuu sen jälkeen, kun terminen ablaatio) on 4 päivää käsittelyn jälkeen (60,1 ± 26,3% positiivisia soluja /HPF sisällä vanteen, kuvio 1B-1E). Adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA vähensi merkittävästi α-SMA positiivinen periablational soluinfiltraatiota verrattuna muihin hoitoryhmissä (31,7 ± 14,3% positiivisia soluja /hpf vs. RF yksin: 60,1 ± 26,3%, RF /salattu siRNA: 72,9 ± 33,0%; p 0,001). Ei havaittu eroja maksasoluviljelmissä leviämisen kaukainen, käsittelemätön maksalohko for RFA /MNP salattu siRNA (28,1 ± 16,7% /HPF) verrattuna radiotaajuusablaation yksinään (p = 0,12) tai RFA /MNP anti-IL6 siRNA (p = 0,15 ) [Kuva 2A-2D].

adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA annetaan 15 minuutin kuluttua maksan terminen ablaatio (C) C57BL hiiret (n = 5-6 eläintä /arm) tukahdutetaan maksasolujen proliferaation kaukaisessa, hoitamaton maksalohko (jossa CDC47 värjäys, keskiarvo ± keskihajonta) verrattuna maksan terminen ablaatio yksin (A, D, p 0,01). Maksan terminen ablaatio yhdistettynä MNP salattu siRNA ei ollut merkittävästi erilainen kuin joko lämpö- ablaatio yksin tai ablaatio yhdistettynä MNP anti-IL6 siRNA (B, D).

Nanoparticle anti-IL6 siRNA estää termisen ablation- aiheuttama stimulaatio kaukaisten R3230 kasvaimen kasvua ja seerumin IL-6 tasoa jälkeen radiotaajuusablaatiolle normaalin maksaparenkyymi

määrittämiseksi vaikutus kaukainen kasvaimen kasvua simuloida yhteisen tilan etäispesäkkeitä, käytimme ihonalaisen rintatuumorista malli (R3230), jossa maksan radiotaajuusablaation on liittynyt kaukaisiin kasvaimen kasvua [26]. Täällä, seuraavat hoitohaaran verrattiin (n = 6-7 eläintä /arm): maksan RF terminen ablaatio yksin, huijausta menettely, RFA /MNP anti-IL6 siRNA (20 mcg siRNA, IP toimitus), RFA /MNP salattu siRNA , MNP anti-IL6 siRNA yksin, RFA /tyhjä ajoneuvo. Vaikutus näistä kuudesta hoitohaaran kaukana ihonalainen kasvaimen kasvua arvioitiin. Kaikki kasvaimet kasvoivat samassa suhteessa yli 5d ennen satunnaistamista eri hoitoryhmissä. Terminen ablaatio normaali maksan lisääntynyt kaukana R3230 kasvaimen kasvun 7d hoidon jälkeen verrattuna sham /kontrollikäsittely (p 0,001; kuvio 3A, taulukko 1). Adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA tukahdutetaan terminen ablaatio aiheuttama vaikutuksia kaukaisessa R3230 kasvaimen kasvua siten, että keskimääräinen kasvaimen kokoisista 7d yhdistelmähoidolla oli pienempi kuin joko huijausta (ei-ablaatio) ja maksan RFA yksin ryhmissä (p = 0,02 vs . huijausta, p 0,001 vs. maksan RFA yksin kuvio 3A, taulukko 1). Maksan radiotaajuusablaation yhdistettynä MNP salattu siRNA tuloksena oli suurin kaukainen kasvaimen halkaisija 7d verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmissä (19,3 ± 1,7 mm, p 0,03 kaikille vertailuissa).

(A) Ihonalainen R3230 istutettujen kasvaimien Fisher 344 rotilla samanlaisia ​​kasvulukuja satunnaistettiin päivänä 0 yhdelle kuudesta eri hoitoryhmissä (n = 6-7 eläintä /arm). Maksan terminen ablaatio yksin tai yhdistettynä joko tyhjiä kantajan tai MNP muokkaamalla siRNA aiheutti huomattavasti enemmän kasvaimen kasvua ja muutosta halkaisija (5d ennen 7d käsittelyn jälkeen) verrattuna sham hoitoon (p 0,01 kaikille vertailuissa, keskiarvo ± keskihajonta kaikille numeroista). Adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA yhdistettynä terminen ablaatio johti kaukaisessa kasvaimen kasvu ja osan halkaisija, joka oli alhaisin kaikista hoitoryhmissä (p 0,01 kaikille vertailut). (B) adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA yhdistettynä maksan terminen ablaatio vähensi myös etäinen kasvainten lisääntymistä (Ki-67) laparotomiakontrolleihin tasolle verrattuna maksan terminen ablaatio yksin tai yhdistettynä tyhjiä kantajan tai MNP salattu siRNA (p 0,01 asianmukaisia ​​vertailuja) . (C) Maksan terminen ablaatio yksin tai MNP salattu siRNA seerumin IL-6 tasolle 6hr verrattuna vale menettelyyn (n = 3-4 eläintä /ryhmässä, p 0,02). Tämä vaikutus suppressoitiin adjuvanttia MNP anti-IL6 siRNA (p = 0,03 vs. RF maksan yksin). (D) Vertailu vaikutuksen siRNA annon ajoitus osoitti, että adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA annettuna päivänä 0 johti alimpaan jälkikäsittely kasvaimen kasvua ja päätepisteen läpimitta (n = 3-4 eläintä /ryhmässä, p 0,05 kaikki vertailut). Adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA annettiin 3d ablaation jälkeistä vähensi päätepisteen halkaisija verrattuna maksan ablaatio yksin, mutta oli silti merkittävästi suurempi, että joko näennäistä tai yhdistetyn päivän 0 hoitoa (p 0,05 vertailut).

kasvaimen proliferatiivinen indeksi (Ki-67) kaukaisessa R3230 ihonalainen kasvain mitattiin kaikille hoitohaarassa [Kuva 3B, taulukko 1]. Maksan terminen ablaatio lisääntynyt kaukainen kasvaimen proliferaatiota 7d verrattuna vale menettelyyn (p = 0,001). Yhdistelmä adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA ja maksan terminen ablaatio vähensi kaukainen kasvainten lisääntymistä (p = 0,045 vs. huijausta, p 0,001 vs. maksan RFA yksin). Terminen ablaatio yhdistettynä joko tyhjiä kantajan tai MNP salattu siRNA lisännyt kaukaisessa kasvaimen prolilferation (p 0,04 verrattuna sham hoitoon). Ei ollut eroa näennäistä hoitoon ja MNP anti-IL6 siRNA yksin varret (p = 0,59).

Seuraavaksi, seerumin IL-6-tasot määritettiin kvantitatiivisesti ELISA: lla on 6 h hoidon jälkeen jokaisen kuuden varsien (n = 3-4 eläintä /arm) määrittää vaikutus apuaineen MNP anti-IL6 siRNA on ablaation aiheuttama systeeminen IL-6 tasoa. Tämä ajankohta valittiin seerumin IL-6 tasoa huipussaan 6hr tässä mallissa jälkeisen maksan RFA. Seerumin IL-6 pitoisuudet olivat nousseet poltettu maksan ablaatio (266 ± 9pg /ml) verrattuna sham hoitoon (199 ± 18pg /ml, p = 0,005) [Kuva 3C]. Lisääminen MNP anti-IL6 siRNA pienentää seerumin IL6 tasolle 6hr (229 ± 16pg /ml) verrattuna RFA yksinään (p = 0,03) tai RFA /MNP salattu siRNA (298 ± 18pg /ml, p = 0,02). RFA /tyhjät kantaja myös kohonnut seerumin IL6 tasolle 6h samanlainen RFA yksin (298 ± 18pg /ml, p = 0,57).

Lisäksi ajoitus siRNA hallinnon verrattiin, ja MNP anti-IL6 siRNA antaa heti jälkeen maksan RFA (päivä 0) johti täydellinen poistaminen RFA aiheuttaman kasvaimen kasvua verrattuna hallinnon myöhemmin piste (3d) jälkeen maksan RFA (päivä 0 vs. päivä 3, p 0,02) [kuvio 3D, taulukko 1] . Samoin maksan RFA /nano anti-IL6 siRNA päivänä 0, kasvain proliferatiivinen indeksi 7d oli merkittävästi pienempi kuin 3. päivä annon (p = 0,001).

Nanoparticle anti-IL6 siRNA estää maksan ablaatio indusoimaan kaukainen kasvaimen kasvua väheneminen VEGF-välitteistä kasvaimen angiogeneesin

Periablational maksakudosta VEGF nostettiin jälkeen terminen ablaatio huippuunsa 72 tuntia. Täällä kudos VEGF tasot periablational vanteen verrattiin käyttämällä ELISA klo 72 tuntia käsittelyn jälkeen seuraaville käsivarret maksan RF terminen ablaatio yksin, huijausta menettely, RFA /MNP anti-IL6 siRNA (20g siRNA, IP toimitus), RFA /MNP salattu siRNA, MNP anti-IL6 siRNA yksin, RFA /tyhjänä (n = 3-4 eläintä /arm). Maksan ablaatio lisääntynyt periablational kudosten VEGF tasot verrattuna näennäistä hoitoa 72 tuntia (2359 ± 233pg /ml vs. 1429 ± 83pg /ml, p = 0,002) [Kuva 4A]. Adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA maksan VEGF tasot jälkeen terminen ablaatio (1799 ± 71pg /ml, p = 0,02 vs. ablaatio). Maksan ablaatio yhdistettynä adjuvanttiin salattu siRNA johti samankaltaisiin maksan VEGF tasot verrattuna RFA yksinään (2229 ± 42pg /ml, verrattuna RFA yksin: p = 0,51; vs. sham: p = 0,001). Eroa ei havaittu termisen ablaatio yhdistettynä tyhjän operaattorin verrattuna muihin hoitoryhmissä (1804 ± 370pg /ml; vs. RFA yksin: p = 0,09; vs. huijausta: p = 0,16). MNP anti-IL6 siRNA yksinään ei ollut suurempi maksakudosta VEGF tasot verrattuna sham (2234 ± 195pg /ml, p = 0,002).

(A) Tissue VEGF (Y-akseli

2, tumma harmaa pylväät) on periablational ympäröivään kudokseen ablaatiovyöhykkeelle oli määrällisesti 72 tuntia erilaisten käsittelyjen jälkeen (keskiarvo ± keskihajonta, n = 3-4 eläintä /arm). Maksan terminen ablaatio lisääntynyt periablational VEGF tasot, jotka sitten tukahdutetaan adjuvanttia MNP anti-IL6 siRNA (p 0,05 vertailut). (BE) Samoin maksan terminen ablaatio lisännyt mikrovaskulaarinen tiheys /angiogeneesin (immunohistokemia CD34 A: Y-akseli

1, vaaleanharmaa pylväät) kaukaisilla ihonalainen R3230 kasvain, joka oli myös tukahdutettiin adjuvantti anti-IL6 siRNA ( n = 6-7 eläintä /arm).

mikrovaskulaarisia tiheys (käyttäen CD34-värjäys) verrattiin sitten kaukaisessa ihonalainen kasvaimissa kullekin kuudesta hoitohaaran at 7d jälkikäsittely [Kuva 4B-4E , Pöytä 1]. Maksan terminen ablaatio lisääntynyt kaukainen kasvain mikrovaskulaarinen tiheys 7d verrattuna vale menettelyyn (p = 0,003). Yhdistelmä adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA ja maksan terminen ablaatio vähensi kaukainen kasvain mikrovaskulaarinen tiheys (p = 0,01 vs. maksan RFA yksin). Terminen ablaatio yhdistettynä joko tyhjiä kantajan tai salattu siRNA lisännyt kaukaisessa kasvaimen mikrovaskulaarinen tiheys (p 0,003 verrattuna näennäistä hoitoon). Ei ollut eroa huijausta kohtelu ja MNP anti-IL6 siRNA yksin käsivarret (p = 0,46). Nämä havainnot viittaavat siihen, että estämällä maksan ablaation aiheuttama kaukainen kasvaimen kasvua adjuvantti anti-IL6 siRNA välittyy tukahduttaminen loppupään VEGF tuotantoa ja kaukana kasvaimen angiogeneesiä.

Nanoparticle anti-IL6 siRNA estää kaukainen kasvaimen kasvua jälkeen radiotaajuusablaation toisessa ensisijainen elin päällä (normaali munuainen) B

kasvaimen kasvua tutkimuksia, munuaisten RF terminen ablaatio yksin, huijausta menettely, RFA /MNP anti-IL6 siRNA (20g siRNA, IP toimitus), ja MNP anti- IL6 siRNA yksinään verrattiin (n = 6-7 eläintä /arm). Samoin radiotaajuusablaatiolle normaali munuaisten lisääntynyt kaukainen R3230 kasvaimen kasvua verrattuna näennäistä hoitoa, joka oli myös tukahdutettiin yhden annoksen adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA (annettiin päivänä 0) [kuvio 5A, taulukko 1]. Kasvain proliferatiivinen indeksi ja mikrovaskulaarisen tiheys yhdistelmä nanohiukkasten anti-IL6 ja sham aseiden vastasivat toisiaan ja pienempi kuin ryhmässä, jota käsiteltiin radiotaajuusablaatiolle normaalin munuaisen yksin [Kuva 5B, taulukko 1].

(A ) Ihonalainen R3230 istutettujen kasvaimien Fisher 344 rotilla samanlaisia ​​kasvulukuja satunnaistettiin päivänä 0 yhdelle neljästä eri hoitoryhmissä (n = 6-7 eläintä /arm). Terminen ablaatio normaalin munuaisen pelkällä huomattavasti enemmän kasvaimen kasvua ja muutosta halkaisija (5d ennen 7d käsittelyn jälkeen) verrattuna sham hoitoon tai MNP anti-IL6 siRNA yksinään (p 0,01 kaikille vertailuissa, keskiarvo ± keskihajonta kaikki tiedot ). MNP anti-IL6 siRNA yhdistettynä terminen ablaatio vähensi kaukainen kasvaimen kasvu ja päätepisteen halkaisija lähtötasolle huijausta tasolle. (B) adjuvantti MNP anti-IL6 siRNA yhdistettynä munuaisten terminen ablaatio vähensi myös etäinen kasvainten lisääntymistä (Ki-67) ja mikrovaskulaarinen tiheys (CD34) lähtötasolle verrattuna munuaisten terminen ablaatio yksin (p 0,01 asianmukaisia ​​vertailuja).