Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on yleisin kiinteä maligniteetti miesten, 32000 kuolemantapausta vuosittain. Piperiiniä, suuri alkaloidi ainesosa mustapippuria, on aiemmin raportoitu olevan syövän vastaista aktiivisuutta in erilaisissa syöpäsolun linjat. Vaikutus piperine eturauhassyöpää vastaan ​​ei tällä hetkellä tiedetä. Näin ollen tässä tutkimuksessa selvitimme anti-kasvain mekanismit piperidiini androgeenista riippuvainen ja androgeenin riippumattoman eturauhassyövän soluissa. Tässä osoitamme, että piperine inhiboivat LNCaP, PC-3, 22RV1 ja DU-145-syöpäsolujen annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi anneksiini V värjäys osoitti, että piperine indusoi apoptoosin hormoni eturauhassyöpää syöpäsolujen (LNCaP). Käyttämällä globaali n vapautumisen määritystä osoitamme, että piperidiini-aiheuttaman apoptoosin johti kaspaasin aktivaatio LNCaP ja PC-3-solut. Lisäksi tutkimukset paljastivat, että piperine käsittely johti kaspaasi-3 ja lohkaisu PARP-1-proteiinien LNCaP, PC-3 ja DU-145-syöpäsolujen. Piperiiniä hoito rikkoi myös androgeenireseptorin (AR) ilmentyminen LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa. Hakijan arvioinnit osoittavat lisäksi, että on olemassa merkittävä väheneminen prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot seuraavat piperine hoidon LNCaP. NF-kB ja STAT-3 transkriptiotekijöiden on aiemmin osoitettu olevan merkitystä angiogeneesissä ja hyökkäys syöpäsolujen. Mielenkiintoista, hoito LNCaP, PC-3 ja DU-145 eturauhassyövän solut piperine vähensivät ilmentyminen fosforyloidun STAT-3 ja Nuclear tekijä-KB (NF-kB) transkriptiotekijöitä. Nämä tulokset korreloivat tulosten kanssa Boyden kammion määrityksen, jossa piperine vähensi solujen migraation LNCaP-ja PC-3-soluja. Lopuksi käy ilmi, että piperine hoito vähensi androgeeniriippuvaista ja androgeenin riippumaton kasvaimen kasvua nude-hiirissä malli ksenotransplantaatio eturauhasen syöpäsoluja. Yhdessä nämä tulokset tukevat lisätutkimuksia piperine mahdollisena terapeuttisena aineena eturauhassyövän hoitoon.

Citation: Samykutty A, Shetty AV, Dakshinamoorthy G, Bartik MM, Johnson GL, Webb B, et ai . (2013) Piperine, bioaktiivinen komponentti Pepper Spice kiinnostavuus terapeuttinen Vaikutukset androgeeniriippuvaisessa ja androgeeniriippumattomaksi syöpäsolujen. PLoS ONE 8 (6): e65889. doi: 10,1371 /journal.pone.0065889

Editor: Bart O. Williams, Van Andelin Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 marraskuu 2012; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2013; Julkaistu: 18 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Samykutty et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ilmoittavat, että Mary Margaret Bartik ja Gary Johnson työskentelevät kanssa Immunochemistry Technologies, LLC, Bloomington, MN, ja Brian Webb työskentelee klo Thermo Fisher Scientific, Rockford , IL. Lisäksi kirjoittajat toteavat, että tämä ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Länsi-miehet joutuvat yhä syövän ja syöpään liittyvät kuolemantapausta vuosittain. Tilastot osoittavat, että eturauhasen syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten keskuudessa Yhdysvalloissa. Mukaan viimeaikaisten arvioiden Yhdysvalloissa, 217730 ihmiset saavat vasta diagnosoitu eturauhasen syöpä ja 32050 miestä kuolee tähän sairauteen vuonna 2010 [1]. Eturauhassyöpä aluksi alkaa olevan hormoni riippuvainen mutta taudin edetessä se siirtyy olevaksi hormoni riippumaton ja kestävät liittyvä hormoni hoitoon. Tällä hetkellä saatavissa hoitovaihtoehdot kuten kemoterapia, sädehoito, leikkaus tai hormonihoito ovat tyydyttäviä [2]. Luonnontuotteet, kasveista tai mikro-organismeista, on tullut keskeinen lähde syöpälääkkeiden, jossa huomattava määrä olevien lääkkeiden ollessa joko luonnollisia tai johdettuja luonnontuotteista. Siksi on olemassa suurta kiinnostusta tunnistamisessa luonnollisten yhdisteiden eturauhassyövän hoitoon. Todisteet on kasautunut, että yhdisteet kasviperäisiä (phytochemical) kohdistamaan syöpälääkkeen vaikutuksia vähemmän myrkyllisyys [3]. Mustapippuri, suola vuosituhansien on laajasti käytössä eri elintarvikevalmisteet kaikkialla maailmassa. Yhdysvalloissa yksin, keskimääräinen päivittäinen saanti mustapippuria on arvioitu 359 mg. Piperine osuus 5% ja 9% mustapippuria sisältöä, mikä päivittäinen saanti on noin 60-110 uM [4]. Piperine (trans-trans-isomeerin 1-piperoyl piperidiini) on aktiivinen periaate ja tärkein ainesosa mustapippuria käytetään perinteisen lääketieteen Intiassa [5]. Potentiaalia piperidiini, kuten syövän vastaisen aineen on aiemmin osoitettu. Piperine esti kiinteän tuumorin kehitystä hiirillä indusoidaan DLA (Dalton Lympoma Askitesta) soluihin ja pidentää elinikää hiirillä Ehrlich askites kasvain [6]. Piperiiniä on myös osoitettu olevan anti-hyökkäys aktiivisuus B16F-10-melanoomasolujen [7]. Soluja suojaava vaikutus piperine B (α) -p (bentsopyreenin) aiheuttama kokeellinen keuhkosyöpä on onnistuneesti tutkittu hiirillä ja päätellä, että piperine voisi käyttää sen chemopreventive vaikutuksensa modu- lipidiperoksidaatiossa ja kohensi antioksidantti puolustusjärjestelmää [8]. Mielenkiintoista, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että piperine voi estää rintasyövän kohdistamalla syöpä kantasolu uusimista ominaisuuksia [9].

Huolimatta laajaa käyttöä ja sen kyky estää useita syöpätyyppejä, tiedetään vain vähän myönteisiä vaikutuksia of piperine eturauhassyöpää vastaan. Makhov ja työtovereiden [4] aiemmin osoittanut, että yhteis-dosetakselista ja piperine aikaan voimakkaampaa antituumoriteholla in ksenograftimallia ihmisen kastraation vastustuskykyisten eturauhassyövän estämällä CYP3A4: ää aktiivisuuden. Tähän mennessä ei kuitenkaan muut tutkimukset ovat ominaista suora syöpää ehkäisevistä vaikutuksista piperine eturauhassyöpäsoluissa huolimatta todettu lisäävän kemoterapeuttisen Doketakselin mahdollista vastaan ​​eturauhasen kasvaimia [4]. Siksi tavoitteena on selvittää anti-eturauhasen syöpä toimintaa piperine sekä määrittää taustalla molekyylitason mekanismeja sen toimintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Eläinkokeet suoritettiin tässä tutkimuksessa suuntaviivojen mukaisesti asettaa hoitoon ja koe-eläinten käyttöä ja sääntöjen muotoiltu alla eläinsuojelulaissa Yhdysvaltain maatalousministeriön (USDA). Protokolla hyväksyttiin IACUC komitean University of Illinois, College of Medicine at Rockford ja eläinkokeista suoritetaan laitos akkreditoitu AAALAC ja USDA.

Kemikaalit ja reagenssit

vasikan sikiöseerumia (FCS), RPMI-1640 ja Minimum Essential Medium (MEM) saatiin American Type Cell Culture (ATCC), Manassas, VA, USA. Piperiiniä ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Solunelinkykyisyysmäärityksen pakki ostettiin Dojindo Molecular Technologies Inc., Gaithersburg, MD. Anneksiini V-FITC apoptoosin havaitsemisen Kit saatiin MBL kansainvälinen, Woburn, MA.

Solulinjat ja soluviljelmä

LNCaP, DU-145, 22RV1 ja PC-3-solulinjojen saatiin American Type Cell Culture (ATCC), Manassas, VA, USA, ja soluja viljeltiin RPMI-10% FCS ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Kaikkien kokeissa 1 x 10

5 solua /ml kylvettiin ja kasvatettiin 24 tuntia ennen kokeellista hoitoja. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ympäristöön.

solunelinkykyisyysmääritys

LNCaP, 22RV1, DU-145 ja PC-3-solut ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille ja niitä inkuboitiin kunnes solujen kiinni kuoppiin. Kaikki solut käsiteltiin sitten ja inkuboitiin eri pitoisuuksia piperidiini (5-200 uM) 24, 48 ja 72 tuntia. Elinvoimaisten solujen määritettiin käyttämällä solujen laskenta kit-8 (CCK-8) Dojindo Molecular Technologies. 10 ui CCK-8 liuokseen lisättiin piperiinin käsitelty tävää inkuboitiin 3 tunnin ajan. Optinen tiheys mitattiin 450 nm: ssä käyttäen BIO-RAD mikrolevylukijalla malli 680.

Caspase aktivaatiomääritys

LNCaP-ja PC-3-solut ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille ja niitä viljeltiin, kunnes he saavuttivat 50% konfluenssin. Eturauhassyövän solut käsiteltiin sitten ja inkuboitiin eri pitoisuuksia piperidiini (50-200 uM) 24, 48 ja 72 tuntia vastaavasti. Kukin levy inkuboitiin sitten 2 ui fluoresoivasti leimattua kaspaasi koetin (NIR-FLIVO 747 In Vivo Apoptosis Tracer, Immunochemistry Technologies, LLC, Bloomington, MN) 15 minuuttia. Solut pestiin 100 ui 1 x PBS: ää poistamiseksi kaspaasisubstraatin. Tämän jälkeen 100 ui 1 x PBS: ää lisättiin 24 tunnin levylle ja 100 ui täydellistä alustaa lisättiin 48 h ja 72 h levyille solut eivät kuivu ennen lukea. Levyt luettiin käyttäen LI-COR Odyssey koneen V3.0 havaita globaalin kaspaasin aktivaation.

anneksiini V-FITC-värjäys apoptoosia havaita

LNCaP-soluja viljeltiin 8-kammion kudosviljelmässä dia RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja gentamysiiniä, kunnes solut kiinnittyivät kuoppiin. Soluja käsiteltiin sitten ja inkuboitiin eri pitoisuuksia piperidiini (60 uM ja 75 uM) 24 tunnin ajan. Sitten väliaine poistettiin kuopista ja käyttää myöhemmin PSA-määrityksessä. Apoptoosi määritettiin käyttämällä anneksiini V-FITC apoptoosin havaitseminen pakki MBL International. Solut värjättiin lisäämällä 500 ui: aan sitoutumispuskuria, 5 ui anneksiini, ja 5 ui PI kuhunkin kuoppaan ja inkuboimalla pimeässä huoneenlämpötilassa 5-10 minuutin ajan. Sitovaa puskuria, anneksiini ja PI poistettiin sitten kuopista yhdessä kammion. 2-3 tippaa 1 x PBS lisättiin kunkin osan dian ja katettu. Sitten levy analysoitiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia.

PSA-määritys

PSA-määritys suoritettiin käyttäen supernatantit kerätään LNCaP-soluja käsiteltiin piperidiini (5-150 uM). Prostataspesifisen antigeenin erityksen (ng /ml) määritettiin käyttämällä ihmisen eturauhasen-antigeenin ELISA Kit ostetaan Abnova.

Western blot-analyysi

LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin 60 uM ja 75 uM piperidiini vastaavasti ja DU145-soluja käsiteltiin 160 uM 24 tuntia. Lisäksi LNCaP-soluja käsiteltiin myös 25 uM piperidiini määrittää alhaisen annoksen vaikutuksia. Käsittelyn jälkeen solut hajotettiin näytteen liuottavan puskuriin ja altistettiin SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosakalvolle Western blot-analyysi. Sen jälkeen vasta-aineita käytettiin immunoblottauksella. Anti-NF-kB (MBL International Inc.), anti-kaspaasi-3 (eBioscience), anti-PARP-1 (SantaCruz Biotechnology), anti-STAT-3 ja anti-fosfo STAT-3 (Cell Signaling Technologies), anti- PSA (Thermo Fisher), anti-androgeenireseptorin (Sigma Aldrich) ja anti β-Actin-peroksidaasi (Sigma Aldrich), vasta-aineita käytetään valmistajan suosittelemia laimennoksia. Solut käsiteltiin 0,1% DMSO liuotinta toimivat vertailuryhmänä.

Boyden kammion määritys

LNCaP ja PC-3-solut ympättiin TRANSWELL® (Corning) kammio, käsitelty ja inkuboitiin piperine pitoisuuksien 60 uM ja 75 uM: ssa 24 tuntia. Solut poistettiin sitten kalvon yläosaan pipetillä ja jäljellä olevat solut poistettiin käyttäen Q-kärki. HEMA 3 värjäys asettaa Fisher Scientific käytettiin korjata ja värjää solujen. Tämän jälkeen kukin kalvo huuhdeltiin vedellä ja mahdollisesti jäljellä oleva tahra poistettiin päällekkäin kalvosta käyttäen Q-kärki. Kalvot analysoitiin solujen vaeltamiseen valomikroskoopilla (Nikon).

Eläimet

6 viikon ikäisten urospuolisten nude-hiirelle painoltaan noin 20 grammaa pidettiin eläinten Facility University of Illinois at Rockford College of Medicine. Kaikki koetoimenpiteet käytetään eläimiä hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea University of Illinois at Rockford College of Medicine. LNCaP (5 x 10

6) ja DU145 (1 x 10

6) solut suspendoidaan yhtä suureen tilavuuteen Matrigel injektoitiin ihon alle kylkeen alueille nude-hiiret ja kasvainten annettiin kasvaa. Kun kasvain saavutti 50 mm

3 kooltaan, hiiriä käsiteltiin päivittäin piperine (100 mg /kg) homogeenisesti valmistettua kasviöljyä suonensisäistä ruiskua 1 kuukausi. Kontrolliryhmä injektoitiin kasviöljyä yksin. Vaikutukset piperidiini eturauhasen kasvaimen kasvua nude-hiirissä testattiin myös letkulla suun kautta anto, kuten aikaisemmin on kuvattu [10]. Sillä letkulla tutkimus, LNCaP-soluja (7 x 10

6) suspendend in matrigeeliä ihonalaisesti istutettu nude-hiiriin. Seuraavat 24 tunnin aikana implantoinnin jälkeen LNCaP-soluja, hiiriä käsiteltiin päivittäin piperidiini (10 mg /kg kehon paino), joka valmistettiin PBS: ään letkulla suun kautta. Kontrollieläimet saivat pelkkää PBS: ää letkuruokinnalla hoitoon. Seuraavat 1 kuukausi hoidon jälkeen hiiret tapettiin hiilidioksidi-inhalaatiolla, jota seuraa veren päästämisen ja kasvaimet leikattiin irti ja mitattiin massan ja tilavuuden. Kasvaintilavuudet laskettiin kaavalla: [Volume = 0,5 x (leveys)

2 x pituus. Edellä

in vivo

kokeessa oli yhdenmukaiset ARRIVE ohjeiden [11].

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism 5 -ohjelmaa. Data verrattiin käyttäen Studentin t-testiä. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Piperine estää proliferaatiota ja indusoi kuolema sekä androgeeniriippuvaisessa (AD) LNCaP ja androgeeniriippumattomaksi (AI) DU145, 22RV1, PC-3 solujen vitro

ensin määritetään anti-proliferatiiviset vaikutukset piperidiini ihmisen eturauhasen karsinoomasoluja, mukaan lukien androgeenien herkkiä (LNCaP) (kuvio 1A) ja androgeenien epäherkkä (PC-3, 22Rv1, DU-145-solut: Kuva 1B- 1D). Soluja käsiteltiin (5-200 uM) piperidiini 24, 48, 72 tuntia. Hoito LNCaP (AD) ja PC-3 (AI) soluja piperine johti huomattavaan vähenemiseen leviämiseen tai elinkelpoisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla IC-50-arvot 60 uM ja 75 uM, arvioituna MTT. Mikäli 22Rv1 ja DU-145 eturauhassyövän solut, piperine hoito oli korkeampi IC-50-arvot 110 uM ja 160 uM. Näin ollen, piperine näyttää olevan pystyy kohdistamaan ero sytotoksisten vaikutusten riippuen eturauhasen syöpäsolujen kanssa androgeeniriippuvaisessa syöpäsolujen (LNCaP) on kaikkein herkin yksi. IC50-arvot saatiin tämän solunelinkykyisyysmääritys tuloksia käytettiin vaikutusten arvioimiseksi piperiinin eturauhasen syöpäsolujen myöhemmissä kokeissa.

Piperine inhiboi soluproliferaatiota LNCaP, PC-3, 22RV1 ja DU-145, jossa on IC50 noin 60 uM, 75 uM, 110 uM ja 160 uM kunkin eturauhasen syöpäsoluja. Tulokset osoittivat, että piperine esti lisääntymistä sekä androgeeniriippuvaisessa (LNCaP) ja androgeeniriippumattomaksi johdettujen syöpäsolujen (PC-3, 22Rv1 ja DU145) on ajasta ja annoksesta riippuvaisella tavalla. Data esitetään edustaa yksi kolmesta vastaavia kokeiluja.

Piperine hoito vähentää prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot LNCaP

PSA kultakantaan merkki käytetään diagnosointiin ja seurantaan hoidon tehokkuuden eturauhassyövän. Alkuperäiset tutkimuksemme osoittivat, että AR-positiivisten LNCaP solut olivat herkkiä piperine hoitoon. Piperiiniä käsittely 75 uM inhiboi merkittävästi eritystä PSA lähelle normaalia tasoa (4,244 ng /ml) verrattuna hoitamattomiin LNCaP-soluja (41,24 ng /ml) (kuvio 2). Mielenkiintoista, piperine pienellä annoksella on 25 uM 60 uM oli myös merkittävä vaikutus PSA eritystä LNCaP.

PSA määrityksen tulokset osoittivat, että piperine on annoksesta riippuvainen vaikutus eritykseen PSA (myötävirtaan kohde AR) LNCaP-soluissa. * P 0,05 verrattuna ohjata LNCaP.

Piperine indusoi apoptoosia PCa soluissa: anneksiini V FITC värjäys analyysi ja kaspaasin aktivaatio määritys

onko väheneminen leviämisen ja solujen elinkelpoisuuden eturauhasen syöpäsolujen piperidiini oli mukana apoptoosin induktion, LNCaP-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla piperidiini ja apoptoottisten solujen määrässä arvioitiin käyttämällä anneksiini V- apoptotis detektioreagenssipakkaus kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. LNCaP-soluja käsiteltiin 60 uM tai 75 uM piperine 24 tuntia ja värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla visualisoida soluja fluoresenssimikroskoopilla. Fluoresoiva mikroskooppinen analyysi osoitti, että LNCaP-solut, joita käsiteltiin piperidiini johti lisääntyneeseen apoptoottisten solujen määrässä verrattuna ohjata LNCaP-soluja (kuvio 3) annoksesta riippuvalla tavalla (60 uM ja 75 uM vastaavasti). Edellä esitetyn perusteella tulokset jota määritetty pitoisuus piperiinin on soluproliferaation inhibointi ja apoptoosin induktion, valitsimme piperidiini pitoisuus 60 uM edelleen mekanistinen tutkimuksia, joilla LNCaP-solut.

anneksiini-V- FITC värjäys LNCaP osoittaa, että solut käsiteltiin piperine olivat positiivisia anneksiini V: n sitoutumisen kuin ilmeistä fluoresenssin signaalia. Nuoli osoittaa solut positiivisia anneksiini-V värjäystä. Apoptoottiset solut kvantitoitiin lukumäärän perusteella positiivisten solujen anneksiini-V-värjäyksellä verrattuna kokonais-solujen läsnä jokaisessa kentässä. Tulokset osoittavat, että lisäämällä pitoisuudet piperiinin lisännyt apoptoosia, kuten on esitetty taulukossa 1 kuviossa 3. Edustavia tuloksia yksi kolmesta riippumaton arviointi.

Lisäksi anneksiini-V-värjäyksellä, me analysoitiin apoptoosin LNCaP ja PC-3-soluista Global: n vapautumisen määrityksellä. Caspase on arvokas ja luotettava merkkiaine apoptoosin. Siksi analysoidaan sen aktivoinnin LNCaP ja PC-3 PCa solulinjoissa hoidon jälkeen piperine globaalin kaspaasin aktivaatio määritys käyttäen fluoresoivasti leimattua poly-kaspaasi anturi (kuva 4). Soluja inkuboitiin 50-200 uM piperidiini eri ajankohtina (24, 48, 72 tuntia). Sekä LNCaP ja PC-3-solut käsiteltiin piperine lisännyt: n vapautumisen. Kasvu kaspaasin aktivaatio LNCaP-soluissa oli annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla kun taas PC-3 osoitti aina korkeat kaspaasin aktivaation sekä pitoisuuden ja kaikkina ajankohtina paitsi 48 tuntia, jossa kaspaasi aktivointi tuntui tai vähennä uudelleen. Tämä voi johtua eri herkkyydet solu eri ajankohtina. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että piperidiini-indusoitua apoptoosia sekä LNCaP-ja PC-3-solujen kautta kaspaasi aktivaation.

NIR-FLIVO 747-konjugoidun poly-kaspaasi koetin, joka on solun läpäisevä fluoresoiva ilmaisin aktiivinen caspases, käytettiin onko piperine aktivoi kaspaasi eturauhasen syöpäsoluja. LNCaP ja PC-3-solulinjojen käsiteltiin piperine ja sitten testataan kaspaasi aktivointia. Tulokset osoittivat, että piperine indusoi maailmanlaajuinen kaspaasin aktivaation molemmissa LNCaP (A) ja PC-3-solut (B), kuten jo 24 tuntia. Kokeet toistettiin neljä kertaa ja saatu samanlaisia ​​tuloksia, kuten tässä edustava.

Western blotting-analyysi: Piperine käsittely aktivoi ekspressiota kaspaasi-3 ja pilkkoo PARP-1

aktivaatio executioner kaspaasien, eli kaspaasi-3, johtaa katkeamiseen laaja kirjo solukohteeseen proteiinien, mukaan lukien poly (ADP-riboosi) polymeraasin pilkkoutuminen-1 (PARP-1), joka johtaa solun kuolemaan [13]. Niinpä määritettiin vaikutus piperiinin on kaspaasi-3 ja Poly (ADP) riboosia Polymerase. Immunoblot-analyysi LNCaP (kuvio 5A ja kuvio 5C) ja DU-145, PC-3-solut (kuvio 5B), käsiteltiin piperidiini johti kasvuun pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP-1 verrattuna solut, joita käsiteltiin pelkästään DMSO: lla . Nämä tulokset olivat yhdenmukaiset maailmanlaajuisen kaspaasin aktivaatio, että havaitsimme, ennen (kuvio 4).

(a) Western blot-analyysi osoitti, että 60 uM piperidiini estää ilmentymisen AR, STAT-3: n ja NF-kB transkription tekijöitä LNCaP samalla aktivoivat apoptoottisia signaaleja (kaspaasi-3 ja PARP-1 aktivointi). (B). Western blot-analyysi osoitti, että 160 uM ja 75 uM piperine hoito estää ilmentymistä STAT-3 ja NF-kB transkriptiotekijöitä DU-145 ja PC-3-solujen aktivoimalla apoptoottiset markkerit (kaspaasi-3 ja PARP-1 aktivointi). C) Immunoblot tulokset osoittivat thatpiperine alemmilla annoksella 25 uM inhiboi myös ilmaus AR, STAT-3 ja NF-kB transkriptiotekijöitä LNCaP lisäksi vähen- tämisessä PSA ilme. Muutokset proteiinien ekspression on merkitty + tai – merkki. LNCaP, DU-145 ja PC-3-solut käsiteltiin 0,1% DMSO yksin toimivat kontrolleina (ctrl) tässä kokeessa.

Piperine hoito alas säätelee ilmentymistä androgeenireseptorin (AR), NF kB ja fosforyloitu STAT-3

NF-kB ja STAT-3 (fosforyloitu muoto STAT-3) transkriptiotekijöitä ja androgeenireseptorin (AR) on ratkaiseva rooli solujen lisääntymistä, anti-apoptoosin, angiogeneesi ja invaasio eturauhasen syöpäsoluja. Immunoblot-analyysi LNCaP (kuvio 5A) soluja käsiteltiin 60 uM piperidiini osoitti ilmentyminen vähenee NF-kB ja STAT-3 (fosforyloitua muotoa STAT-3) transkriptiotekijöiden ja vaimennussäätely androgeenireseptorin (AR) näissä soluissa. Mielenkiintoista, alhaisempi pitoisuus (25 uM) piperine hoito vähensi myös ilmaisua fosforyloidun STAT-3, NF-kB ja PSA-tasot LNCaP-soluissa (kuvio 5C). Tuloksemme osoittivat myös, että DU-145 ja PC-3 PCa (kuvio 5B) käsiteltyjä soluja 160 uM ja 75 uM piperine annoksesta myös johti downregulation NF-kB ja fosforyloitu STAT-3 ekspressiotasot, mikä korostaa anti- syöpä vaikutukset piperine eturauhasen syöpäsoluja.

Piperine hoito vähentää solujen vaeltamiseen in vitro

Piperine hoito vähensi solujen migraation LNCaP ja PC-3-solut, mikä viittaa siihen, että piperine on anti-muuttavien vaikutusten eturauhassyövässä (kuvio 6).

Boyden kammion määritys osoittaa, että valvonta LNCaP ja PC-3 syöpäsolujen on suurempi määrä siirtynyt solujen taas LNCaP-ja PC-3 näytettä käsiteltiin 60 uM ja 75 uM piperine näyttää vähemmän siirtynyt solujen TRANSWELL® kammioissa. Nuoli osoittaa siirtynyt soluja. Estyminen solumigraation viittaa siihen, että piperine voi olla anti-muuttavien ominaisuuksia eturauhassyövässä. Data on esitetty tässä edustaa yksi kolmesta saatu samanlaisia ​​tuloksia.

Piperine antoa estää kasvaimen kasvua ihmisen eturauhassyövän solu ksenograftit istutettiin immuunipuutteisilla hiirillä

vieressä pyrittiin määrittämään antituumorivaikutuksen vaikutukset piperine

in vivo

käyttäen ksenograftimallia nude-hiirissä. Kuten tuloksista käy ilmi, hoito piperine vähensi merkittävästi kasvaimen kasvua nude-hiirissä istutettiin LNCaP-solujen 72% [kasvaimen tilavuus (p 0,01) ja kasvaimen massa (p 0,01)] (kuvio 7A 7B) ja hoito piperine myös vähensi kasvaimen kasvua nude-hiirissä istutettu DU-145-soluissa 41% [kasvaimen tilavuus (p 0,05) ja kasvaimen massa (p 0,05)] (Kuva 7C ​​ 7D). Tärkeää on, piperine (10 mg /kg) annettiin nude-hiirissä letkuruokinnalla hoito esti myös tuumorin kasvua LNCaP-solujen 38% [kasvaimen tilavuus (p 0,05) ja kasvaimen massa (p 0,05)] (kuvio 8A 8B ) kantavassa väheneminen kasvaimen massan ja tilavuuden piperine käsitelty ryhmät olivat merkittäviä. Näiden tulosten pohjalta, piperine näyttää olevan tuumoria tukahduttavan vaikutuksia sekä androgeeniriippuvaisessa ja androgeenista riippumaton eturauhassyöpä solut

in vivo

.

Piperine estää niiden kasvun LNCaP ja DU-145 peräisin tuumoriksenografteja nude-hiirissä mallissa. Kasvaimen tilavuus (mm

3) ja painot (g) on ​​piperiinin käsitellyn ja hallita käsittelemättömiä paljaisiin hiiriin mitattiin osoitetut päivinä. Kuusi riippumatonta kasvaimet kerättiin Piperiini käsitelty LNCaP, DU-145 ja ohjata paljaisiin hiiriin vastaavasti. Tulokset (A-D) osoittivat, että piperine injektio vähensi kasvaimen tilavuutta ja tuumorin paino sekä androgeeniriippuvaisessa ja androgeenin riippumaton peräisin syöpäsolujen istutettiin nude-hiirissä. * P 0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

Piperine annetaan nude-hiiriin (n = 6) annoksella 10 mg /kg letkun kautta antoa inhiboi merkittävästi ksenografti kasvua LNCaP kasvainten verrattuna nude -hiiriä (n = 6) annetaan pelkkää PBS: ää kontrolliryhmään. Hoidon päätyttyä, kasvainten kerätään nude-hiirissä mitattiin kasvainten ja kasvaimen paino. Tulokset (A B) osoitti, että piperine vähensi merkitsevästi sekä kasvainten ja kasvaimen paino LNCaP johdettujen eturauhassyövän solut nude-hiirissä. * P 0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

Keskustelu

Viimeaikaiset Arvioiden sukupuolen suhteen paljasti, että määrä miehiä ikävälillä 15 ja 65 olivat valtavasti lisääntynyt joka oli suora vaikutus määrä eturauhassyöpäpotilaalla [14]. Erilaisia ​​fyysisiä ja geneettisesti niihin liittyvät tekijät vaikuttavat etenemistä eturauhassyöpää. Toiveena eturauhassyövän hoitoon ”luonnollisten” dieettivalmisteiden tunnetaan myös phytochemicals on tullut aktiivinen tutkimusalue. Piperine on yksi tällainen lupaava yhdiste täysin läsnä pippuri mauste [15]. Toistaiseksi ei ole olemassa tutkimusta, jossa arvioidaan välitön terapeuttinen vaikutus piperine eturauhassyövän ja vain harvat tutkimukset ovat osoittaneet sen potentiaalia muissa syövissä [16], [17], [18], [19], [20]. Siksi esillä olevassa tutkimuksessa olemme pyrkineet tehon arvioimiseksi piperiini kuin solunsalpaajaksi vastaan ​​sekä androgeeniriippuvaisessa ja riippumattoman eturauhassyövän solulinjoissa ja tutkia molekyylitason mekanismeja vastuussa sen anti-proliferatiivista toimintaa. Syövän vastaisen vaikutuksen piperidiini äskettäin osoitettu paksusuolen syöpäsoluissa [21]. Tässä tutkimuksessa piperine näkyy suuntauksena anti-leviämisen paksusuolen syöpäsoluissa 24 tuntia ja huomattavan määrän Solujen proliferaation estyminen oli raportoitu 48 ja 72 tuntia vastaavasti [21]. Toisessa tutkimuksessa piperine osoitettiin tehokkaasti estää bentso (α) pyreenin aiheuttaman keuhkotulehduksen syövän syntymistä albinohiirten suojaamalla proteiinien vaurioita ja myös tukahduttamalla soluproliferaatiota [8]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, antiproliferatiivinen aktiivisuus näytteillä piperidiini androgeenista riippuvainen (AD) LNCaP ja androgeenien riippumaton (AI) PC-3, DU-145 ja 22RV1 PCa solut

in vitro

annoksesta riippuvaisella tavalla. Tutkimuksemme tuloksia ilmeni, että LNCaP solut olivat herkempiä piperine käsittely ja sen jälkeen PC-3, 22RV1 ja DU-145-soluissa viittaa siihen, että piperine säädöksiä eri tavoin riippuen eturauhassyövän solulinjaa.

vankka anti proliferatiivisen vaikutuksen kohdistamaa piperidiini sekä androgeeniriippuvaisessa ja androgeenin riippumattoman eturauhassyövän soluissa voidaan pitää edullista eturauhassyövän hoitoon. Alkuvaiheen eturauhassyöpä riippuu androgeenien kasvua ja selviytymistä, ja androgeeniablaatio hoito aiheuttaa niiden taantua [22]. Syöpiä, jotka eivät ole parannettavissa hormonihoidon lopulta androgeeniriippumattomaksi, tekee antiandrogeeninen hoito tehoton [22], [23]. Lisäksi meidän tutkimukset paljasti myös, että piperine indusoi apoptoosin eturauhassyövän soluissa, kuten käy ilmi anneksiini-V immunofluoresenssivärjäyksen tutkimuksissa.

potentiaali piperidiini edistää apoptoosia tukee edelleen sen kykyyn parantaa kaspaasi aktivointi sekä androgeeniriippuvaisissa ja androgeeni-riippumaton eturauhasen syöpäsoluja. Tehokas terapeuttinen aine on paitsi rajoittaa lisääntymistä vaan myös kyetä aktivoimaan ohjelmoitua solukuolemaa sekä AD ja AI syöpäsolujen [24], [25]. Ottaen huomioon, että piperiinin tehokkaasti inhiboivat syöpäsolujen ja indusoi apoptoosin, piperine voi olla lupaava anti-eturauhassyövän aine, joka ansaitsee lisätutkimuksia kuten chemopreventive tai kemoterapeuttisen aineen. Kaspaasit, osallisena apoptoosin, yleensä luokitellaan aloitteentekijöitä ja pyövelit solukuoleman [26]. Tässä tutkimuksessa todettiin, että oli nopeaa kasvua globaalissa kaspaasiaktiivisuus aikaansaama piperine LNCaP eturauhasen syöpäsoluja. Kaspaasi-3-on kriittinen ja syöttämällä liittyvät entsyymi, joka suorittaa apoptoosin eturauhassyövän soluissa [27]. Tulokset esitetään tässä tutkimuksessa vahvistaa, että piperine hoito aktivoitu kaspaasi-3 eturauhasen syöpäsoluja. Tämä vahvistettiin meidän tutkimusten havaitsimme pilkkominen PARP-1 [28] vuonna piperine käsitelty eturauhasen syöpäsoluja. Määritellä tarkemmin molekyylitason mekanismia, jolla Piperiini indusoi apoptoosia, STAT-3 keskeinen anti-apopoptic eloonjäämistekijä eturauhassyöpäsoluissa arvioitiin. STAT-3: lla on tärkeä rooli syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota monissa syöpätyypit, kuten virtsarakon, munasarja-, ja aivot [29], [30], [31]. Eturauhasen syöpä, STAT-3 aktivaation on todettu liittyvän imusolmuke ja luun etäpesäkkeitä [32]. Niistä STAT perheen transkriptio proteiinien inhibitio fosforyloidun STAT-3 on määritetty kriittiseksi kohteena solukuoleman tehostetun apoptoosin PCa soluissa [33], [34], [35], [36]. Näin ollen, esillä olevassa tutkimuksessa voidaan väittää, että piperine voi indusoida apoptoosia estämällä aktivaation fosforyloidun STAT-3: n LNCaP, DU145 ja PC-3-soluja, jotka puolestaan ​​voivat estää eloonjäämistä ja kasvua eturauhasen syöpäsoluja.

estämisen lisäksi STAT-3, tuloksemme osoittivat, että piperine myös kohdennettua ilmentymisen tumatekijä-kB (NF-kB) transkriptiotekijän ja androgeenireseptorin (AR). NF-kB on merkittäviä rooleja valvonnassa solun kasvun, erilaistumisen, apoptoosin ja etäpesäkkeitä [37], [38], [39]. Tämänhetkinen näyttö tästä nykyisestä tutkimuksesta käy, että monet syöpälääkkeen vaikutuksia piperine voidaan säädellä joko suoraan tai epäsuorasti NF-kB. Tuloksemme viittaavat siihen, että NF-kB on alaspäin säännellään LNCaP, PC-3 ja DU-145 PCa soluissa. Samoin androgeenireseptoria (AR) oli alaspäin säännelty LNCaP. Alas sääntely AR oli yhdenmukainen samanaikainen väheneminen PSA ilmaisun LNCaP käsitelty piperine. Se, että androgeeniriippuvaisessa eturauhassyövän solut ovat herkempiä piperine hoito voisi johtua alas säätely AR joka on kriittinen selviytymisen androgeeniriippuvaista eturauhassyövän solut, kuten LNCaP-solut, jotka käytimme tässä tutkimuksessa.