Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epidemiologinen yhdistyksen pään ja kaulan alueen syöpä kanssa nuuskan (ST) korostaa tarvetta purkaa molekyylitason mekanismeja osallisena syövän kehitykseen, ja tunnistaa farmakologisesti turvallisia aineita varhaisen hoitaa ja ehkäistä taudin uusiutumisen. Guggulsterone (GS), joka on BioSafe nutraceutical, estää PI3K /Akt-reitillä, joka on ratkaiseva rooli HNSCC kehittämisessä. Kuitenkin potentiaali GS tukahduttaa ST ja nikotiini (pääkomponentti ST) aiheuttama HNSCC edelleen tutkimatta. Oletimme GS voi kumota vaikutukset ST ja nikotiinin apoptoosin HNSCC soluissa, osittain aktivoituminen PI3K /Akt-reitin ja sen loppupään tavoitteet, Bax ja Bad.

Menetelmät ja tulokset

Tuloksemme osoittivat ST ja nikotiinin hoito johti aktivointi PI3K, PDK1, Akt, ja sen loppupään proteiineja – Raf, GSK3p ja PS6 samalla GS aiheutti ajasta riippuvainen aleneminen aktivoituminen PI3K /Akt-reitin. ST ja nikotiinikorvaushoitoon johti myös induktio Bad ja Bax fosforylaatio, lisäsi yhdistys Bad kanssa 14-3-3ζresulting sen sitomista sytoplasmassa pään ja kaulan alueen syöpä soluja, mikä estää sen pro-apoptoottisen funktion. Varsinkin GS esikäsittely esti ST /nikotiini indusoi aktivoituminen PI3K /Akt-reitin, ja esti Akt välittämän fosforylaation Bax ja Bad.

Johtopäätökset

Yhteenvetona GS hoitoon paitsi estyy leviämisen, mutta myös indusoi apoptoosia kumoamalla vaikutukset ST /nikotiinin PI3K /Akt-reitin pään ja kaulan syöpäsoluja. Nämä havainnot antavat perusteet suunniteltaessa tulevia tutkimuksia arvioimaan chemopreventive potentiaalia GS ST /nikotiini liittyy pään ja kaulan alueen syöpä.

Citation: Macha MA, Matta A, Chauhan SS, Siu KWM, Ralhan R (2011 ) guggulsterone tavoitteet nuuskan aiheuttama PI3K /Akt Pathway in pään ja kaulan alueen syövän solut. PLoS ONE 6 (2): e14728. doi: 10,1371 /journal.pone.0014728

Editor: Madhuri Kango-Singh, University of Dayton, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 14 joulukuu 2010; Julkaistu: 24 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Macha et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Muzafar . Macha on vastaanottaja Senior Research Fellowship neuvoston tieteellisen ja teollisen tutkimuksen (CSIR), New Delhi, Intia. Ajay Matta on vastaanottajaa MITACS Accelerate Fellowship, Ontario, Canada. Ranju Ralhan kiitollisena tunnustavat tukea Joseph ja Mildred Sonshine keskus pään ja kaulan alueen sairaudet, Alex ja Simona Shnaider laboratorio Molecular Oncology, Temmy Latner /Dynacare, ja Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Mount Sinai Hospital, University of Toronto . K.W. Michael Siu myöntää rahoitusta Ontario Institute for Cancer Research (OICR), ja infrastruktuurin tukea Ontario tutkimuksen ja kehittämisen Challenge Fund ja AB SCIEX. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on edelleen merkittävä syy sairastuvuutta ja kuolleisuutta maailmanlaajuisesti viiden vuoden pysyvyys hinnat noin 50%, varjostivat toistuvia tai muodostuminen toisen ensisijaisen kasvaimia (10-25% of tapauksissa) [1], [2]. Maailmanlaajuisesti käyttö tupakkatuotteiden on merkittävä riskitekijä, jossa nuuskan (ST) kulutus on sidoksissa korkea esiintyvyys HNSCC [3] – [5]. ST käytetään monenlaisen nimittäin naswar, gutkha, khaini (sekoitus ST kalkilla) ja on tai betel mälli, on luokiteltu ihmisille syöpää aiheuttaviksi International Agency of Research in Cancer (IARC) [6], [7] . Yhdistys tupakoinnin HNSCC tunnetaan hyvin, mutta yhteys ST käytön ja pään ja kaulan alueen syöpä on syntymässä. Tuoreessa raportissa, Stepanov

et al.

[8] tunnistettu 23 polysyklisiä aromaattisia hiilivetyjä (PAH) ST lisäksi nitrosamiinien ja nikotiinin raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa [7]. Nikotiini parantaa leviämisen, kiihdyttää kasvaimen kasvua ja estää apoptoosin tietyntyyppisten ihmisen syöpäsolujen linjat ja indusoi angiogeneesiä in vivo jatkuva aktivoituminen mitogeenisen reittejä [9] – [11]. Nikotiini on raportoitu estävän apoptoosia opioidien aiheuttamaa ja genotoksinen stressi indusoi etoposidi, sisplatiini, tai UV-säteilylle keuhkosyövän soluihin [12], [13]. Lisäksi nikotiini aktivoi PI3K /Akt-reitillä, ja estää pro-apoptoottisen toimintoja Bax ja Bad fosforylaation kautta [14], [15]. Nämä havainnot sai meidät tutkimaan, ST (khaini) indusoi PI3K /Akt-reitin aktivaatio pään ja kaulan syöpäsolut.

Lisäksi tunnistaminen farmakologisesti turvallisia kemopreventiivisiä aineita, jotka voivat tukahduttaa ST /nikotiini indusoi PI3K /Akt-reitin HNSCC on todennäköisesti mahdollista estää ST aiheuttamaa pään ja kaulan syövän syntymistä. Guggulsterone (GS), (4,17 (20) -pregnadien- 3,16-dioni), ainesosana Intian Ayurvedic lääkekasvina

commiphora Mukul

on BioSafe nutraceutical anti-neoplastisia ominaisuuksia [16] – [18]. GS on raportoitu aiheuttavan apoptoosia, tukahduttaa leviämisen, invaasio, angiogeneesi, etäpesäke ja kääntää lääkeresistenssi, joten se potentiaalinen täydentävä syöpälääkkeen [19] – [24]. GS sitoutuu farnesoid-X-reseptori ja sen on osoitettu moduloivan proteiinien ilmentymisen mukana apoptoosin (IAP1, XIAP, Bfl-1 /A1, Bcl-2, cFLIP, surviviini), solujen lisääntyminen (sykliini D1, c-Myc), angiogeneesin ja etäpesäkkeiden (MMP-9, COX-2, VEGF) [25]. Tämä sterolia kykenee sen biologisia vaikutuksia asetuksella transkriptiotekijöiden – tumatekijä kappa B (NFKB), STAT-3 ja C /EBP-alfa, ja steroidireseptorit – glukokortikoidireseptoreita ja androgeenireseptorin. Ryhmämme ja muut osoittivat äskettäin syövän vastaista aktiivisuutta GS HNSCC ja myeloomasolulinjoissa estämällä NFKB ja STAT3; myöhemmät tutkimukset raportoitu samanlaisia ​​vaikutuksia muissa syöpäsolulinjoissa ja eläinmalleissa paksusuolen ja ihosyövän [19], [24], [26].

Tässä tutkimuksessa selvitimme aktivoituminen PI3K /Akt-reitin pään ja kaulan syöpäsolut käsittelemällä ST /nikotiini ja sen inaktivaation GS. Edelleen me haastoi aktivointi Akt ja sen loppupään tavoitteet (PS6, GSK3p ja Raf), jonka ST /nikotiinia pään ja kaulan alueen syöpä soluja (SCC4) esikäsittelyssä GS.

Tulokset

vaikutus ST ja nikotiini aktivoi PI3K /Akt-reitin pään ja kaulan syöpäsolut

annoksesta ja kinetiikka ST ja nikotiini (riippuvuutta komponentti tupakka) hoidon pään ja kaulan alueen syöpä soluja (SCC4 ja HSC2 ), määritettiin MTT-määrityksellä (kuvio 1A ja 1 B). Vastaavia kinetiikan havaittiin molemmissa solulinjoissa ja tuloksia SCC4 solut on esitetty kuviossa 1. Altistuminen ST ja nikotiini lisäsi solujen proliferaatiota sekä pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja annoksesta riippuvaisella tavalla optimaalisella annoksella 20 ug /ml ST ja 10pM nikotiini. Näitä optimaalisia annoksia on käytetty kaikissa seuraavissa kokeissa. Vaikutuksen tutkimiseksi ST tai nikotiinin Akt väylän HNSCC soluissa, sekä SCC4 ja HSC2 soluja käsiteltiin 20 ug /ml ST tai nikotiinia (10 gM) ja eri aikavälein tai pitää käsittelemättöminä, ja Akt aktivointi (Akt fosforylaation Ser-473 ja Ser-309) määritettiin proteiiniuutoksia western blottauksella. Sekä ST ja nikotiinin nopeasti kasvanut Akt-fosforylaation vaikuttamatta koko Akt tasot sekä HSC2 ja SCC4 soluja (kuvio 2A ja 2B vastaavasti). Nämä tutkimukset osoittavat, että ST ja nikotiini aktivoi Akt annoksilla, jotka voivat olla fysiologisesti relevantti. Lisäksi meidän western blot-analyysi osoitti sekä ST ja nikotiinin indusoimaa ajasta riippuva nousu fosforylaatioon sekä ylävirran kinaasien, PI3K ja PDK1, sekä alavirran tavoitteet, Raf, GSK3p ja PS6 in SCC4 soluissa (kuvio 2A ja 2B ), joka heijasti alkaa nopeasti kasvanut Akt fosforylaation. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin molemmissa solulinjoissa (SCC4 ja HSC2) vuoksi, tietoja vain SCC4-solujen on osoitettu tässä.

Soluja käsiteltiin (A) ST (1-500 ug /ml), ( B) nikotiini (1-100 uM) 24-96 tuntia. Kuvio esittää keskiarvo kolmesta kokeesta tehdään itsenäisesti.

SCC4-soluja (2-3 x 10

6) käsiteltiin (A) ST (20 ug /ml) tai (B) nikotiini ( 10 uM), ja osoitetun aikavälein ja koko-solu-uutteet valmistettiin. Koko-solu-uutteita (60 ug proteiinia), erotettiin 10% SDS-PAGE, ne siirrettiin sähkön avulla PVDF-kalvolle ja ei-spesifinen sitoutuminen blokattiin 5% rasvatonta maitoa yön yli. Proteiinin ilmentyminen määritettiin testauksella fosfospesifisiä vasta-aineita Pakt (thr-309), Pakt (ser-473). pGSKβ3, pRaf, pPDK1 ja Akt käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin menetelmällä. Western blotting for α-tubuliinin tehtiin näyttämään yhtä suuri Proteiinilisäyksen.

vaikutus guggulsterone on ST ja nikotiinin aiheuttama aktivoituminen PI3K /Akt-reitin

Sekä ST ja nikotiinin aiheuttama stimulaatio Akt-reitin siksi tutkimme vaikutus GS ST ja nikotiinin aiheuttama aktivaatio Akt-reitin. SCC4 soluja käsiteltiin GS (50 uM) ja eri aikavälein ja niiden proteiinipitoisuus uutteet testattiin Akt aktivointia. Kuten kuviossa 3A on esitetty, GS esti aktivoinnin Akt, ylävirran kinaasien PI3K, PDK1, sekä alavirran proteiinit, Raf, GSK3p, ja PS6. Annos standardointi PI3K /Akt-inhibiittori, LY294002, toteutettiin käsittelemällä SCC4 solujen eri pitoisuuksilla inhibiittorin (0,5-10 uM) 1 tunti. Kuten on esitetty kuviossa 3B, LY294002 (10 uM) esti täydellisesti ekspression aktivoitua Akt; kun taas mitään vaikutusta ei havaittu koko Akt ekspressiotasot. SCC4 soluja esikäsiteltiin GS 4 h tai LY294002 (10 uM) 60 minuutin ajan, minkä jälkeen ST (20 ug /ml) 6 tuntia tai nikotiinia (10 gM) 4 tuntia. Tulokset osoittavat, että GS sekä LY294002 estetty ST ja nikotiinin aiheuttaman Akt-reitin aktivaatio (kuvio 3C), mutta mitään vaikutusta ei havaittu ilmentymistä koko Akt ja GSK3p näinä ajankohtina,.

SCC4 soluja ( 2-3 x 10

6) käsiteltiin (A) GS (50 uM) varten osoitetun aikavälein ja /tai (B) LY294002 pitoisuus vaihtelee 1 h. (C) SCC4 soluja (2-3 x 10

6) esi-käsiteltiin 50 uM GS: ssa 4 tuntia tai LY294002 (10 uM) 1 tunti ja stimuloitiin ST (20 ug /ml) 6 tuntia tai nikotiinia (10 gM) 4 tuntia. Kuusikymmentä mikrogrammaa proteiinien koko-solu-uutteet eroteltiin 10% SDS-PAGE, ne siirrettiin sähkön avulla PVDF-kalvolle ja sen jälkeen salvattiin 5% rasvatonta maitoa yön yli. Proteiinin ilmentyminen määritettiin tutkimalla spesifisten vasta-aineiden avulla parantaa kemiluminesenssin menetelmää.

guggulsterone ja PI3K-spesifinen estäjä LY294002 lohko ST ja nikotiinin aiheuttama Bad ja Bax fosforylaatio

Sekä ST ja nikotiini voimakkaasti stimuloi seriinifosforyloinnin Bax ja Bad ajassa riippuvaisella tavalla (kuvio 4A ja 4B), jolloin kumota niiden pro-apoptoottisen funktion. Osoittamaan toiminnallista roolia Akt kuin fysiologinen ST ja nikotiinin aktivoitu Bax ja Bad kinaasi, LY294002, PI3K spesifinen estäjä, joka voi estää PI3K /Akt-signalointireitin, on käytetty. SCC4 soluja esikäsiteltiin LY294002 (10 uM) 60 minuutin ajan tai 50 uM GS 4 h ja sen jälkeen ST (20 ug /ml) 6 tuntia tai nikotiinia (10 gM) 4 tuntia. GS sekä LY294002 tukossa ST ja nikotiinin aiheuttama Bax ja Bad fosforylaatiota (kuvio 4A ja 4B). Ei vaikutusta ekspression koko Bad: n ja Bax havaittiin näissä ajankohtina. Nämä havainnot viittaavat siihen, että inhibitio ST ja nikotiinin indusoimaa Bax ja Bad fosforylaatio GS voi palauttaa pro-apoptoottisen funktion näiden molekyylien.

SCC4-soluja (2-3 x 10

6) käsiteltiin ( A) ST (20 ug /ml) tai (B) Nikotiini (10 uM) ja osoitettujen aikavälein. SCC4 soluja esikäsiteltiin LY294002 (10 uM) 60 minuutin ajan, tai 50 uM GS 4 h, jonka jälkeen ST (20 ug /ml) 4 tunnin ajan, tai nikotiinia (10 gM) 4 tuntia, ja koko -solujen uutteet valmistettiin. Kuusikymmentä mikrogrammaa proteiinien koko-solu-uutteet eroteltiin 10% SDS-PAGE, ne siirrettiin sähkön avulla PVDF-kalvolle ja sen jälkeen salvattiin 5% rasvatonta maitoa yön yli. Proteiinin ilmentyminen määritettiin käyttäen parannettu kemiluminesenssin menetelmää ja tutkittiin vasta-aineiden varalta pBAD ja PBAX. Blotit riisuttu ja uudelleenseulottiin varten Bax ja Bad proteiineja.

Akt on yhteistyössä paikallistaa Bax sytoplasmassa

arvioimiseksi mahdollinen suora rooli Akt kuin fysiologisen Bax kinaasi, sub-solujen jakautumista Akt ja Bax arvioitiin immunofluoresenssivärjäyksen. Bax oli ensisijaisesti yhteistyössä paikallistaa Akt sytoplasmassa SCC4 soluja (kuvio 5A) viittaa siihen, että molemmat ST ja nikotiini aktivoitu Akt on potentiaalia suoraan fosfory- ja inaktivoida Bax in SCC4 soluissa.

fosforylaatio Bax ja Bad tulokset säilyttäminen näiden proteiinien sytosoliin ja epäonnistuminen kohdistaa mitokondriot

tulokset osoittivat, että ST ja nikotiini voi aiheuttaa Bax (Ser-184) ja Bad (ser-136) fosforylaation ja fosforylaatio näillä paikoilla johtanut inaktivointi pro-apoptoottisen funktion Bax ja Bad. On tunnettua, että pro-apoptoottinen aktiivisuus Bax ja Bad on riippuvainen sen soluliman tai mitokondrion lokalisointi. Testata, fosforylaatioon Bax ja Bad vaikutukset sen osa-sijainnista solussa, SCC4 soluja pidettiin käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin GS (50 uM) 4 h, ST (20 ug /ml) 6 tuntia ja nikotiinia (10 gM) 4 h. Sub-solu Fraktioinnit suoritettiin eristää mitokondrioita ja sytosolin kuten kohdassa materiaalia ja menetelmiä. Käsittelemättömästä SCC4 soluja, suurin osa Bax ja Bad havaittiin sytosoliin, ja vain pieni määrä näitä proteiineja, on lokalisoitu mitokondrioissa (kuvio 5B). GS käsitellyissä soluissa suurin osa näiden proteiinien havaittiin mitokondriofraktiosta. Sen sijaan, sekä ST ja nikotiinin käsiteltyjä soluja, Bax ja Bad oli todettu pääasiassa sytosoliin (kuvio 5B).

On huomattava, että esikäsittely SCC4 solujen GS (50 uM) 4 tuntia, minkä jälkeen ST: (20 ug /ml) käsittely 6 h tai nikotiinia (10 gM) 4 tuntia, osoitti muutosta sijaintia Bax ja Bad ja suurin osa näiden proteiinien havaittiin mitokondriofraktiosta (kuvio 5B). Vahvista puhtauden subsellulaarisen saatujen fraktioiden, sukkinaattidehydrogenaasi, proteiini yksinomaan mitokondriot, arvioitiin western-blottauksella. Sukkinaattidehydrogenaasi, havaittiin ainoastaan ​​mitokondriofraktiosta eikä sytosolissa (kuvio 5B), mikä vahvistaa puhtaus mitokondrioiden ja solulimafraktiot. β-aktiini käytettiin ohjaus tasapuolisen Proteiinilisäyksen kaikissa kaistoilla.

SCC4 soluja (5 x 10

3) maljattiin coverslip ja inkuboitiin hiiren vasta ihmisen Bax ja kanin vasta-aine ihmisen AKT-vasta-aineita. Alexa flour®594 konjugoitua anti-kani (punainen) ja fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoitu (vihreä) ja anti-hiiri-vasta-aineita käytettiin visualisoimaan Akt (punainen) ja Bax (vihreä) lokalisointi kaavoja käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Panel (i) DAPI värjättiin ydinten sinisellä; (Ii) sytoplasmista ekspressiota Bax; (Iii) sytoplasmista ekspressiota Akt-proteiinia; ja (iv) yhdistyivät mikrovalokuva (ii) ja (iii) osoittaa kolokalisaation Bax ja Akt. (B) fosforylaatio Bax at (Ser-184) ja Bad (Ser-136) johtaa säilyttäminen Bax ja Bad sytosoliin. SCC4 soluja pidettiin käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 50 uM GS 4 h, ST (20 ug /ml) 6 tuntia, 10 uM nikotiinin 4 tuntia. SCC4 soluja esi-käsiteltiin 50 uM GS 4 h, jonka jälkeen ST 6 h tai nikotiinia 4 tuntia. Sytoplasminen (C) ja mitokondrio (M) uutteet valmistettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät ja erotettiin 10% SDS-PAGE. Sitten proteiinit sähkölaitteita siirrettiin PVDF-kalvolle, jota seuraa estämällä 5% rasvatonta maitoa yhdessä yössä. Blotteja inkuboitiin erityisten vasta-aineiden Bax ja Bad. Proteiinin ilmentyminen määritettiin käyttäen parannettu kemiluminesenssin menetelmällä. Puhtaus subsellulaarisista saatujen fraktioiden määritettiin käyttäen western blot varten mitokondrion proteiinia, sukkinaattidehydrogenaasi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

ST ja nikotiinin aiheuttama Bad fosforylaatio parantaa vuorovaikutusta 14-3-3ζ

Bad fosforylaatio (ser-136) edistää sen translokaatiota alkaen mitokondrioita sytosoliin ja vuorovaikutus tukirakenteen proteiinin 14-3-3. Sen arvioimiseksi, ST tai nikotiini vaikuttaa Bad yhdistys, SCC4 soluja käsiteltiin ST (20 ug /ml) tai nikotiinia (10 gM) ja eri aikavälein. Co-immunosaostus 14-3-3ζ ja Bad osoitti ajasta riippuva kasvu sidottu pBAD vuonna immunokompleksien (IP) on 14-3-3ζ osoittaa yhdistyksen välillä 14-3-3ζ ja pBAD (kuvio 6A ja 6B), hoidon jossa ST ja nikotiinia vastaavasti. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin käänteinen immunosaostusmääritykset, western-blottaus tehtiin 14-3-3ζ in immunokompleksien saatiin käyttäen pBAD spesifistä vasta-ainetta, joka vahvistaa vuorovaikutus 14-3-3ζ kanssa pBAD (kuvio 6A ja 6B). Nämä tulokset viittaavat siihen, ST ja nikotiinin indusoimaa Bad fosforylaatio johtaa metalli-ionikomplekseja Bad sytoplasmassa, toiminnallisesti estää sen pro-apoptoottisen funktion.

SCC4 käsiteltiin (A) ST (20 ug /ml) tai (B) nikotiinia (10 gM) ja eri aikavälein ja immunosaostusmääritykset suoritettiin käyttäen kokosolulysaateista ja analysoitiin western-blottauksella, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. 14-3-3ζ immunosaostettiin käyttäen spesifistä vasta-ainetta ja sitoutuneen pBAD proteiini kerasaostuvat 14-3-3ζ määritettiin Western blot -analyysillä. Käänteinen immunosaostusmäärityksissä suoritettiin joka pBAD immunosaostettiin, jota seurasi western blotting-analyysi 14-3-3ζ käyttämällä spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​tämän proteiinin. (C) Kuva esittää hypoteettinen malli eston ST /nikotiinin aiheuttama aktivoituminen PI3K /Akt-reitin GS. Tuloksemme osoittivat hoidon ST ja /tai nikotiini aktivoi Akt (fosforyloitu Ser-473 ja Ser-309) johtaen fosforylaatioon sen loppupään tavoitteiden Raf, GSK3p, ja PS6, kun taas GS hoito estää aktivoinnin Akt-reitin. Mielenkiintoista, esikäsittely pään ja kaulan alueen syöpä solujen GS estää aktivoinnin Akt ja sen loppupään tavoitteet (Raf, GSK3p, ja PS6) altistumisesta ST /nikotiinia. GS esikäsittely myös vapauttaa Bad alkaen estovaikutuksen 14-3-3ζ, aktivoiden sisäsyntyisyyteen apoptoosin. Siten tuloksemme osoittivat GS potentiaalisena terapeuttisena aineena ST aiheuttama pään ja kaulan syövän syntymistä.

Keskustelu

Tupakka eri muodoissa on yksi tärkeimmistä etiologiset tekijät kehityksen ja etenemisen HNSCC. Poikkeava geenien ilmentymisen osallistuvat solujen kasvuun, eloonjäämisessä, angiogeneesissä, invaasio ja etäpesäkkeiden ST liittyy pään ja kaulan syövän syntymistä on raportoitu ryhmämme ym [27] – [31]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, aktivointi Akt in HNSCC soluissa, joita käsiteltiin ST /nikotiini, osoittaa jatkuva fosforylaatio Akt seriinin 473 ja treoniinin 308, sekä sen alavirran substraattien (PS6, GSK3p, pRaf), on ajasta riippuva tavalla. Sekä ST ja nikotiini myös indusoi fosforylaation ylävirran kinaasia PDK1 (Ser241) ja p85-alayksikön toisen ylävirtaan kinaasi, PI3K on SCC4 soluissa. Nämä havainnot tukevat aiemmat raportit osoittavat aktivoituminen PI3K /Akt viljellyissä aivokuoren neuronien normaalin ihmisen keuhkoputken ja pienten hengitysteiden epiteelisolujen vastauksena nikotiinikorvaushoitoon [11], [32] – [34]. Lisäksi osoitimme sekä ST ja nikotiinin aktivoitu Akt, indusoi Bad (Ser136) ja Bax fosforylaatio (Ser184) johtaen sytoplasman säilyttäminen näiden proteiinien. Kuitenkin hoito LY294002, PI3K /Akt-inhibiittori, esti voimakkaasti ST ja nikotiinin indusoimaa fosforylaatiota Bad (Ser-136) ja Bax (Ser-184), joka johtaa mitokondrioiden relocalization näiden proteiinien edelleen vahvistaa havaintomme, että ST ja nikotiinin indusoimaa fosforylaatiota Bad (Ser-136) ja Bax (Ser-184) aktivoimalla PI3K /Akt. Mielenkiintoista, sekä ST ja nikotiinin aiheuttama fosforylaatiota Bad (Ser-136) in SCC4 soluissa lisäsi yhdessä 14-3-3ζ joka käy ilmi yhteistyössä IP määrityksiä. Tämä johtaa sitomisen Bad sytoplasmassa, estäen siten sisäisen reaktiotien apoptoosin. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, fosforylaatio joko Ser112 tai Ser136 helpottaa kompleksin muodostumista välillä Bad ja 14-3-3s sytosoliin, estää niiden vuorovaikutus Bcl2 /Bcl-xl mitokondrioissa [35], [36].

Viime aikoina olemme osoittaneet yliekspressio PI syntaasin PI3-K ja sykliini D1 ST käsiteltyjen solujen suun haavaumia ja suun syöpä [37]. Lisäksi analysoidaan kliinisissä näytteissä suun leukoplakic vaurioita ilman dysplasia, jossa dysplasia ja suun okasolusyöpää (OSCCs) Annoimme ensimmäiset todisteet lisääntyneen ilmentymisen PI syntaasin alkuvaiheessa suun precancer ja syövän ja sen korrelaatio kasvaimen erilaistamattomuuden ja tupakka kulutus [37]. Täällä me laajennettiin nämä havainnot osoittaa GS voi estää induktio PI3K /Akt mukaan ST ja nikotiini.

Niinpä estämällä induktio Akt aktiivisuuden ST tupakan komponenttien saattaa olla arvokas lähestymistapa vaikutusten lieventämiseksi tupakkaa kuluttajat vaarassa kehittämiseen HNSCC, ja /tai HNSCC potilailla, jotka jatkavat tupakointia tai käytä ST tuotteita. Tässä suhteessa, havaitsimme, että GS tukahdutti fosforylaatiota Akt (Ser473 ja Thr308), PDK1 (Ser241) ja p85-alayksikön PI3K, mikä johtaa vähentyneeseen fosforylaatiota GSK3p, pRaf, PS6, loppupään tavoitteet Akt. Erityisesti tutkimuksemme osoitti, että GS paitsi esti konstitutiivisen PI3K /Akt-reitin, mutta sen esikäsittely kumotaan sekä ST ja nikotiinin aiheuttama aktivoituminen PI3K /Akt-reitin. ST ja nikotiini kumottu pro-apoptoottinen vaikutus Bax /Bad fosforylaatio ja pidättävää sytoplasmassa, mutta GS esikäsittely esti vaikutusta ST ja nikotiinin, kohdistaminen Bax ja Bad mitokondriot, aiheuttamaan apoptoosin. Kuitenkin vaikutus GS ei ole erityinen ja rajoitettu pään ja kaulan alueen syöpä soluja vain. Me ja muut ovat osoittaneet, että anti-syöpä vaikutuksia GS eri syöpäsolutyyppien nimittäin, pään ja kaulan; leukemia, multippeli myelooma, keuhkosyöpä, melanooma, munasarjasyöpä, gut johdettu adenokarsinooma, paksusuolen ja peräsuolen, paksusuoli-, iho-, eturauhas-, ruokatorven, ja rintojen [19], [21] – [24], [38] – [43].

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoitti, että molemmat ST ja nikotiinin edistää selviytymistä ihmisen pään ja kaulan syöpäsolut SCC4, inaktivoimalla proapoptoottisten toimintoja Bax ja Bad kautta fosforylaation ja metalleja sitovia näiden proteiinien sytoplasmassa. GS paitsi estää konstitutiivisesti aktiivinen PI3K /Akt-reitin, mutta myös estää ST ja nikotiinin aiheuttama aktivaatio tämän reitin ja edistää apoptoosia signaalit näissä soluissa (kuvio 6c). Siten GS voidaan tutkimaan, chemopreventive aineena ST aiheuttama pään ja kaulan syövän syntymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

z-guggulsterone (GS), 3 – (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), propidiumjodidia (PI) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine Bax (sc-7480); kanin polyklonaalinen vasta-aine 14-3-3ζ (sc-1019), pPI3K p85-vasta-ainetta (Tyr-508, sc-12929R) ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA Rabbit monoklonaalinen vasta-aine fosfo-Akt (Ser 473, cat-9271), fosfo-Akt (Thr 308, cat-9275), Akt (cat-9272), fosfori-GSK-3β (Ser 9, cat-9336), fosfori -Raf (Ser 259, cat-9421), fosfori-PDK1 (Ser 241, cat-3061), PI3-kinaasin estäjä LY294002 (cat-9901) olivat kaikki ostettiin Cell Signaling Technology. Sillä kolokalisaation tutkimuksia, vuohen anti-kani Alexa Fluor® 594 (Cat no A-11012) hankittiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Vuohen anti-hiiri-FITC: tä (Cat no. F2012) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Proteiini A-Sepharose-helmet saatiin GE Healthcare Biosciences, (Uppsala, Ruotsi).

Soluviljely

Ihmisen pään ja kaulan levyepiteelikarsinoomasolu linjat, SCC4 saatiin American Type Culture Collection ( ATCC) ja HSC2 (JCRB0622) saatiin Health Science Research Resources Bank (HSRRB), Japani [44], [45]. Molemmat pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja tunnetaan satamaan mutantti p53. SCC4 soluilla on pistemutaatio kodonissa 51 CCC TCC ja HSC2 solut on mutaatio intronin 6 [44], [45]. HSC-2-solut Harbor mutatoitunut PIK3CA (H1047R) [46]. Sekä pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja (SCC4 ja HSC2) kasvatettiin yksikerrosviljelmissä Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma, St. Louis, MO) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Sigma), 1 mM L-glutamiinia, 1X natriumpyruvaattia, 1 x vitamiineja, 1 mM vähintään essential medium (MEM), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä kosteutetussa inkubaattorissa (5% hiilidioksidi, 95% ilmaa) 37 ° C: ssa kuten aiemmin on kuvattu [47].

valmistaminen savuton tupakka Pura (ST) B

Yleisesti käytetty tuotemerkin cured (Khaini) hankittiin paikallisilta markkinoilta. 25 g tupakkaa oli hienoksi jauhettua ja homogenisoitiin 225 ml: aan tislattua vettä. Seosta sekoitettiin magneettisekoittajalla kaksi tuntia ja sitten sen annettiin seistä 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sen jälkeen supernatantti kerättiin, kun oli sentrifugoitu 5000 g: ssa 20 minuuttia. Uute steriloitiin viemällä se 0,22 um: n suodattimen ja säilytettiin 4 ° C: ssa kunnes käyttöä. Lopullinen pitoisuus tupakan vesiuute arvioitiin olevan 2,7 g% [48].

Sytotoksisuusmääritys

Pään ja kaulan alueen syöpä soluja (5 x 10

3 /kuoppa) maljattiin 96-kuoppalevylle 24 tunnin ajan. Soluja inkuboitiin kolmena rinnakkaisena läsnä ollessa väliaineessa, joka sisältää ST /nikotiinia tai 0,02% DMSO: ta, joka toimi ajoneuvon ohjaus lopullisessa tilavuudessa 100 ui 24-96 tuntia 37 ° C: ssa. Solukuolema mitattiin lisäämällä 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) 37 ° C: ssa 3-4 tuntia. Formatsaanikitei- kiteet liuotettiin 100 ul: aan dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja optinen tiheys (OD) mitattiin aallonpituudella 570 nm. Prosenttiosuus solukuolema laskettiin erikseen kullekin annokselle seuraavasti: (OD

control-OD

käsitelty /OD

ohjaus) x 100, kuten aiemmin on kuvattu [49].

Western blotting ja Co-immunosaostus (Co-IP) määritys

Co-immunosaostus (Co-IP) määritykset ja WB suoritettiin kuten kuvataan meille aiemmin [39]. Kokosolulysaateista valmistettiin GS (50 uM) tai nikotiinia (10 gM) käsiteltiin SCC4 solujen ja proteiinin konsentraatio määritettiin käyttämällä Bradford-reagenssia (Sigma) ja yhtä suuret määrät proteiineja (50 ug /kaista) erotettiin 12%: isella (SDS) -polyacrylamide geeli. Sitten proteiinit sähkölaitteita siirretään polyvinylidenedifluoride (PVDF) membraanille. Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS, 0,1 M, pH = 7,4), blotteja inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden kohti valmistajan suosittelemaa menetelmää 4 ° C: ssa yön yli. Proteiini runsaasti α-tubuliinin (Santa Cruz Biotechnology, CA) toimi kontrollina Proteiinilisäyksen kussakin vyöhykkeessä. Membraanit inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla, (DAKO Cytomation, Glostrup, Tanska), laimennettuna sopiva laimennus 1% BSA: ta, 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Jokaisen vaiheen jälkeen, blotit pestiin kolme kertaa Tween (0,1%) – Tris-puskurilla suolaliuokseen (TTBS). Proteiinivyöhykkeet havainnut parannettu kemiluminesenssin menetelmällä (ECL, Santa Cruz Biotechnology, CA) on XO-MAT elokuva. Co-IP määritykset suoritettiin aiemmin kuvatulla.

Sub-solu fraktiointi: eristäminen sytoplasmassa mitokondrioita

Pään ja kaulan alueen syöpä soluja (2 x 10

7) hoidettiin, kerättiin ja pestiin kerran kylmällä 1X PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen isotonisessa mitokondrion puskurissa (210 mM mannitoli, 70 mM sakkaroosi, 1 mM EGTA, 10 mM Hepes, pH 7,5, 0,1% BSA), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen. Uudelleensuspendoituja soluja homogenisoidaan polytronilla homogenisaattorilla toimii neljä murtuu 10 s kukin arvo 5 ja sitten sentrifugoitiin 2000 g: ssa 3 minuutin ajan tumien pelletoimiseksi ja ehjä soluja. Supernatantti sentrifugoitiin 13000 g: ssä 10 min pelletoimiseksi mitokondriot, kuten on kuvattu [50]. Supernatantti sentrifugoitiin edelleen 15000 g pelletoimiseksi valoa kalvoja. Saatu supernatantti sisälsi solulimafraktiot. Mitokondriot pestiin mitokondrioiden puskurilla kaksi kertaa, suspendoitiin uudelleen 1% Nonidet P-40 hajotuspuskuria, ravistettiin 60 min, ja sitten sentrifugoitiin 13000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti, joka sisälsi mitokondrion proteiinit kerättiin. Proteiinia (100 ug) kustakin fraktiosta suoritettiin 12% SDS-PAGE: lla ja analysoitiin Western blot -analyysillä käyttämällä anti-sytokromi c: vasta-aine. Puhtaus jakeet varmistettiin arvioimalla lokalisaatio murto-spesifisten proteiinien lukien sukkinaattidehydrogenaasi varten mitokondrioita.

Co-lokalisointi tutkimuksia Akt ja Bax suun syöpäsoluissa konfokaali laser scan mikroskoopilla

pään ja kaulan alueen syöpäsoluja, SCC4 ja HSC2, kasvatettiin peitinlaseilla DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää 37 ° C: ssa ja käsitellään konfokaali laser scan mikroskoopilla, kuten on kuvattu meidän aiemmin [51]. Solut huuhdeltiin Dulbeccon PBS: ää (DPBS), kiinnitettiin metanolissa 5 minuutin ajan -20 ° C: ssa ja inkuboitiin erityisiä primaarisilla vasta-aineilla, hiiren monoklonaalinen anti-Bax ja kanin monoklonaalista anti-Akt-vasta-ainetta, inkuboitiin kuten cocktail 4 ° C: ssa yön yli . Huuhtelun jälkeen fosfaattipuskurissa saline- 0,1% Tween (PBST, 1X) peitinlevyjä inkuboitiin anti-hiiri-FITC-konjugoitu /anti-kani-Alexa flour®594 konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta 45 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Peitelaseja pestiin ja vastavärjättiin DAPI 30 sekuntia. Hiiren vasta-aine ihmisen Bax, kanin vasta-aine ihmisen Akt ja fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoidulla anti-hiiri (vihreä) tai rodamiini-konjugoidun anti-kani (punainen) sekundaariset vasta-aineet käytetään niin, että solut voidaan värjätä samanaikaisesti ilman ristireaktion . Negatiivisissa vertailuissa, ensisijainen vasta-aineet korvattu ei-immuuni-hiiri-IgG saman isotyypin spesifisyyden varmistamiseksi (tuloksia ei ole esitetty). Tämän jälkeen leikkeet huuhdeltiin ja asentaa fluoresenssi kiinnitysväliaine ja tutkittiin Lieca TCS SP2 CLSM (CLSM).