Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on aggressiivinen tauti, jossa synkkä ennuste. On ensiarvoisen tärkeää ymmärtää taustalla etiologinen mekanismeista ja tunnistaa uusia, johdonmukaista ja helposti hakea ennustavat tekijät tarkkuus terapiaa. TUSC3 (tuumorisuppressori ehdokas 3) tunnistettiin mahdollisen tuumorisuppressorigeeniä ja edellinen tutkimus osoitti TUSC3 on vähentynyt haimasyövän mRNA tasolla, mutta sen otaksuttu tuumorisuppressoriproteiinia toiminto vielä tarkastettava. Tässä tutkimuksessa, TUSC3 ilmentyminen havaittiin tukahdutetaan sekä mRNA: ta ja proteiinia tasot solulinjassa malleja sekä kliinisissä näytteissä; vähentynyt TUSC3 ilmentyminen liittyi korkeampi patologinen TNM lavastus ja huonompi tulos. Kolme paria solulinjoissa erilaisilla, NF-KB: n aktiivisuuden, TUSC3 ilmentyminen todettiin olevan käänteisesti korreloivan NF-KB: n aktiivisuutta. TUSC3-vaiennetaan haimasyöpä solulinja osoitti parannettu potentiaalia lisääntymisen, migraation ja invaasion. Eräässä potilaalle tehdä istutettu hiirimallissa, TUSC3 vaiennetaan solut osoittivat aggressiivisempi ilmiasuun enemmän maksan etäpesäke. Lopuksi nykyinen tutkimus osoittaa, että vähentynyt immunologinen TUSC3 värjäytyminen on tekijä ennustetekijöiden köyhien eloonjäämisen haiman syöpäpotilaiden ja laski TUSC3 edistää haimasyöpä solujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden. Käänteinen korrelaatio NF-KB: n aktiivisuutta ja TUSC3 ilmentyminen voi ehdottaa uutta asetusta malli tätä molekyyliä.

Citation: Fan X, Zhang X, Shen J, Zhao H, Yu X, Chen Y, et ai. (2016) Vähentynyt TUSC3 Edistää Haimasyöpä leviämisen, ja metastaasit. PLoS ONE 11 (2): e0149028. doi: 10,1371 /journal.pone.0149028

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 01 elokuu 2015; Hyväksytty 26. tammikuuta 2016 Julkaistu: 12 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Fan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Shanghai Municipal 415 komission terveys- ja perhesuunnittelu (Grant No.201440345 kohteeseen Xiaoqiang Fan) [https://www.wsjsw.gov.cn/WSJ /]. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on aggressiivinen tauti, jossa synkkä ennuste. Se on yhdeksäs yleisin syöpä maailmassa, mutta on neljäntenä syöpään liittyvien kuolemien [1], jossa on noin 227000 ihmistä kuolee tähän sairauteen vuosittain [2]. Kirurginen resektio on ainoa vaihtoehto parannuskeinoa. Kuitenkin suurin osa potilaista löydetään myöhemmin puutteessa erityisiä oireita, menettää mahdollisuuden parantava resektio. Jopa ne, jotka tehdään resektoimalla parantava Tarkoituksena yleensä relapsin kahden vuoden kuluessa [3]. Perinteiset kemoterapeuttiset aineet ja uudet molekyylikohteena lääkeaineilla on vähäinen vaikutus taudinkulku [4-6], ja vain hieman parantaa taudista vapaan eloonjäämisen adjuvanttihoitona asetus [3, 7]. Kerrostuminen potilaiden mukaan uusiutumisen riski auttaa maksimoimaan personointi intervention ja parantaa terapeuttista tehoa pienellä sivuvaikutuksia. Viime vuosina monet patologiset tekijät on perustettu ennustamiseen ennusteen kuten kasvaimen koko, kasvaimen, verisuonten invaasio, imusolmuke etäpesäke ja hermoa invaasio [8]. Systeeminen tulehduksellinen indeksi ja kiertävän kasvainmerkkiaineet kuten CA199 tutki myös niiden ennusteen arvioinnissa [9-12]. On myös joitakin molekyylimarkkereita, joiden tiedetään olevan ennustavia hoidon tehon ja pitkän aikavälin tulosten kuten Kras [13], EGFR, ja Her2 /neu et ai [14]. Ne ovat kuitenkin edelleen riittämättömiä potilaille konsultointi- ja yksilöllisen hoidon. On ensiarvoisen tärkeää ymmärtää mekanismit, jotka edistävät taudin etenemistä ja tunnistaa uusia, johdonmukaista ja helposti hakea ennustavat tekijät tarkkuus terapiaa.

TUSC3 (tuumorisuppressoriproteiinia ehdokas 3), oli identifioidaan potentiaaliseksi tuumorisuppressorigeenin aiemmin. Se sijaitsee kromosomi band 8p22, joka usein poistetaan useissa kasvaintyypeissä lukien eturauhassyöpä [15] ja haimasyövän [16-18]. Näin ollen, TUSC3 on tarkoitus olla kasvaimia estävä geeni. Se on homologi hiivan Ost3p alayksikköä oligosaccharyltransferase (OST) kompleksi, joka on integraalinen membraaniproteiini kompleksi, joka katalysoi N-kytketty glykosylaatio proteiinien endoplasmakalvostossa (ER) [19, 20]. Myöhemmin TUSC3 havaittiin myös olla mukana Magnesium liikenteen ja oksidoreduktaasi toimintaa [21]. Koska N-glykosylaatio on läsnä posttranslationaalinen muuttaminen eukaryoottisten proteiinien moduloimalla proteiinien taitto, suojelee heitä hajoamista, ja säätelevät niiden toimintaa sekä niiden immunogeenisyys, laskenut TUSC3 on tarkoitus osallisena syövän synnyssä kautta glykosylaatio [22]. Krainer ja hänen kollegansa testataan TUSC3 ilmentymisen 143 eturauhasessa käyttävillä potilailla kudos microarray, ja totesi, että 13,3% kudosnäytteiden osoittivat koruttomasti vähensi proteiinin ilmentymistä TUSC3, mutta seuranta kohortin ole osoittanut TUSC3 vaikutus etenemisestä vapaan tai yleistä selviytyminen [23]. Munasarjasyöpää, TUSC3 havaittiin myös olevan merkittävästi säädellä vähentävästi korkeamman asteen munasarjasyöpään yksilöt [24]. Lisäksi tutkimus osoitti sen alhainen ilmentyminen johtuu TUSC3 promoottori hypermetylaation ja metylaation tilan TUSC3 promoottori on merkittävä ja itsenäinen vaikutus ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika munasarjasyöpä potilaille [25]. Jo vuonna 2005, homotsygoottisia ja heterotsygoottinen poistamisen TUSC3 geeni löydettiin haimasyövän solulinjoissa ja yksilöt genomisen array perustuvat tutkimukset [16]. Kuitenkin sen otaksuttu tuumorisuppressoriproteiinia toiminto on ominaista tässä sairaudessa. Mikä on myös edelleen selvitettävä, onko sen ilmentyminen liittyy kliinis lavastus ja onko se kuljettaa ennustetyövälineenä arvo tälle syöpään kokonaisuuden.

Tavoitteena on tutkia, onko TUSC3 ilmentyminen liittyy haimasyöpä kliinis ja edustaa ennustetyövälineenä tekijä tämän syöpäsairautta ja edelleen luonnehtia toiminta molekyylin sairauden patogeneesiin käyttäen solulinjan malleja ja hiirimallissa.

Materiaalit Menetelmät

Potilaille Näytteitä

parafinoidut näytteitä 117 potilasta haimasyöpä (PC), joille tehtiin kirurginen resektio välillä tammikuuta 2002 ja joulukuun 2012 sairaalassamme haettiin. Näytteitä 69 miestä ja 48 naista, joiden keski-ikä oli 60,2 vuotta (vaihteluväli 42-71 vuotta; mediaani-ikä 61 vuotta) ei löytynyt. Mediaani seuranta-aika oli 19 kuukautta (vaihteluväli 1-69 kuukautta.) Tutkimuksessa noudatettiin eettiset ohjeet vuoden 1975 Helsingin julistuksen ja hyväksyi komitean etiikan Jimin Hospital, Shanghai, Kiina. Kaikki potilaat allekirjoittaneet kirjallisen tietoisen suostumuksen Tutkimuksen.

immunohistokemia

5 um paksuja kudosleikkeiden poistettiin parafiini kuumentamalla 60 ° C: ssa ja sen jälkeen niihin lisätään ksyleeniin ja arvostellaan alkoholeja. Antigeeni haku suoritettiin DEPP-9 epitoopin haku liuos, minkä jälkeen seuraa käsittely 0,3% H

2O

2 PBS: ssä (pH 7,4) sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Kun oli salvattu 10% sekundaarisen vasta-aineen vastaanottavan seerumissa 10 minuuttia, leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen (kanin polyklonaalinen ja TUSC3, laimennus 1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, UK) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Ensisijainen vasta-laimennokset tehtiin 10%: sekundaarinen vasta-isäntä seerumia. Osat, sen jälkeen 2 x PBS pesuja, inkuboitiin kunkin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita [biotinyloitua anti-kani-IgG: tä (BA-10000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA], joka oli laimennettu 1: 200 10% seerumia 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, jota seurasi 45 minuutin inkubaatio StreptABComplex /HRP (K0377 Dako, Glostrup, Tanska). Leikkeitä pestiin jälleen kaksi kertaa PBS: llä ja inkuboitiin Dako Liquid DAB + Alustan-Kromogeeni System (K3468), kunnes kehittämistä ruskea väri. Tätä seurasi counterstaining kanssa Meyerin hematoksyliinillä, kuivuminen, ja asennus käyttäen Eukitt keskipitkällä.

Dia värjättiin leikesarjojen ja tutkittiin 2 patologia. Intensiteetti värjäytyminen pisteytettiin seuraavasti: 0, negatiivinen; 1+, heikko värjäytyminen; 2+, kohtalainen värjäytyminen; 3+, vahva värjäytyminen. Semi-kvantitatiivisen analyysin, H-pisteet [26] käytettiin tässä tutkimuksessa. Lyhyesti, yli 500 kasvaimen solut laskettiin kussakin tapauksessa, ja H-pisteet tämän jälkeen tuotettu lisäämällä arvojen prosenttiosuuksien vahva värjäytyminen kerrottuna 3 plus prosenttiosuus kohtalainen värjäytyminen kerrottuna 2 plus prosenttiosuus heikkoa värjäytymistä kerrottuna 1. , jolloin mahdollinen valikoima 0-300. H-pisteet yli 100 pantiin merkille voimakkaaseen ilmentymiseen. Tutkimme myös TUSC3 ekspressiota imusolmuke (LN) etäpesäke 24 tapauksessa ja verrattiin TUSC3 ilmentymisen eroja primäärivamma ja imusolmuke etäpesäke. Ki 67 pisteytettiin tapaan prosentteina eli merkintöjä indeksi, riippumatta immunovärjäyty- intensiteetin.

Cell viljelyolosuhteet

Viisitoista ihmisen PC-solulinjojen ja yksi ikuisti ei-tuumorigeeniset haiman epiteelisolujen linja ( HPNE) valittiin tähän tutkimukseen. Kaikki solulinjat saatiin lahjana tri Paul J. Chiao laboratoriosta MD Anderson, Texas University. AsPC-1, AsPC-1 mu [27], MDA pan28, MDA p28 mu [28], BxPC-3, Colo357, L3.6pl, MiaPaca-2, PANC-1, PTAC43, PTAC50, PTAC53, PTAC66, ja Capan -1 Soluja kasvatettiin yhtenä kerroksena soluviljelmässä DMEM, joka sisälsi 4,5 mg /ml D-glukoosia ja L-glutamiinia, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. HPNE soluja kasvatettiin Medium D seoksen kanssa M3 keskipitkän ja DMEM, joka sisälsi yhden tilavuuden M3 Base F viljelyalustaan ​​(InCell Corp., San Antonio, USA), kolme osaa glukoosin DMEM: ää, 10% FBS, 5,5 mM glukoosi , 10 ng /ml EGF: ää, ja 50 mg /ml gentamysiiniä. 293T solulinjaa kasvatettiin täydellisessä DMEM. HPNE /Kras /p16shRNA ja HDPE /Kras /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA oli haimasyöpä solulinjoissa (lahja tohtori Paul J. Chiao laboratoriosta, The University of Texas MD Anderson Cancer Center) transfektoimalla asiaa plasmidin HPNE ja HDPE solu vastaavasti [29]. HDPE /Kras /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA soluja kasvatettiin keratinosyyttien seerumia.

Solujen lisääntyminen ja klonogeeninen määritys

solujen kasvukäyrän määrityksessä, solut maljattiin 24-kuoppaisille levyt (1 x 10

4 solua /kuoppa) kolmena kappaleena kasvatusliuoksessa. Solut laskettiin päivinä 1, 3 ja 5. Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± keskivirhe keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta. Testaamiseksi clonogenecity on TUSC3 vaiennettu PC soluja, trypaanisinieksluusiolla testattu elinkelpoisten TUSC3 pudotus solulinjat ja ryntäily ohjaus solut maljattiin (100 /kuoppa) kuuden kuoppalevylle ja sen jälkeen inkuboidaan noin 10-12 vuorokautta 37 ° C: ssa 5% CO

2/5% O

2/90% N

2-inkubaattorissa. Pesäkkeet värjättiin 2% kristalliviolettia. Edustava kenttä kullekin kokeelle oli valokuvattu 100 x suurennus. Vähintään kolme riippumatonta määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. Tietoja esitetään keskiarvo pesäkkeiden lukumäärä /per kenttä ± keskivirhe keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA uutettiin soluista soveltamalla TRIzol mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen). RNA laatu ja määrä mitattiin ND-2000 spektrofotometrillä (Nanodrop). cDNA syntetisoitiin käyttäen PrimeScript RT Master Mix (Bio-Rad). cDNA: ta (20 ng) suoritettiin reaaliaikainen PCR-suoritettiin SYBR reagenssien käyttäen IQ5 PCR -järjestelmää (Bio-Rad, Hercules, CA). β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan geenin. Spesifisiä alukkeita syntetisoitiin Sigma-Aldrich ja sekvenssit kuvataan seuraavasti: hTUSC3: eteenpäin aluke: 1275-AGACGGATAATTTGCCTAGTGGG-1297, käänteinen aluke: 1417-AGTGCCATGGTCCAAATCACA-1397. Juoni vertaa suhteellisen ilmentymistason mRNA useissa haimasyöpäkasvainsolulinjo- linjat verrattuna kuolemattomaksi ei-tuumorigeeniset haiman epiteelisolujen HPNE. Kukin koe suoritettiin kolme kertaa, ja jokaisella kerralla kolme toistoa.

Lentivirusvektorikonstruktit transduktion

knockdovvn TUSC3 haimasyövän solulinjassa Colo357 suoritettiin lentiviruksen toimitusta käyttämällä Plko.1 vektori, joka sisältää TUSC3 shRNA ( SKU: SR305331, Origene Technologies, CO. USA), ja HEK293T- pakkaus solulinjassa. Transdusoidut solut valittiin ja ylläpidettiin alustassa, joka sisälsi puromysiiniä (3ug /ml).

Matrigel määritys

50000 solua ympättiin kolmena rinnakkaisena päälle 24-kuoppalevyllä muokattu Boyden kammioiden (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Alempi kammio sisälsi 10% FCS /kasvualustaa kemoatrak-. Soluja inkuboitiin 18 tunnin ajan, värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin mikroskoopilla.

immunoblottauksella

solut lyysattiin RIPA-puskurilla, johon on lisätty täysin proteaasiestäjäseostabletit Tabletit (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa ) ja PhosSTOP fosfataasinestäjällä Cocktail Tabletit (Roche Diagnostics). Kun oli inkuboitu 10 minuuttia jäillä, solulysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 15000 rpm: ssä 10 minuuttia 4 ° C: ssa, ja proteiinikonsentraatio määritettiin Bradford-absorbanssilla määrityksellä (Sigma Aldrich). Yhtä suuret määrät proteiinia lysaatit (40 ug) erotettiin SDS-PAGE: ssa, siirrettiin PVDF-kalvoille (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK), inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineen ja piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundäärisiä vasta-aineita ja havaitaan tehostettu kemiluminesenssi tunnistusjärjestelmä (Pierce ECL Western blotting Substrate, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Sen jälkeen vasta-aineet ja laimennoksia käytettiin: p-aktiini (1: 500, sc-1616, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), TUSC3 (1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, UK).

Eläimet ja Orthotopic Istuttaminen haimasyöpäkasvainsoluissa

Balb /C nude-hiiriä hankittiin Kotieläintuotannon ala National Cancer Institute Frederick Cancer Research ja Development Center (Frederick, MD). Hiiret majoitettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa hyväksytyissä tiloissa American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care ja voimassa olevien määräysten ja standardien Yhdysvaltain Department of Agriculture, Yhdysvaltain Department of Health and Human Services, ja National Institutes of Health. Hiiriä käytettiin vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti, kun he olivat 8-12 viikkoa vanhoja.

tuottaa haiman kasvaimet, TUSC3 vaiennetaan PC-solut kerättiin subkonfluenteista viljelmät lyhyt altistus 0,25% trypsiiniä ja 0,02% EDTA: ta . Trypsinisaatiolla pysäytettiin, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, ja solut pestiin kerran seerumittomalla alustalla ja resuspendoitiin Hanksin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS). Vain suspensiot, joka koostuu yksittäisistä soluista, joissa on yli 90% elinkelpoisuus käytettiin injektioita. Yksi miljoonaa solua suspensoitiin 50 ui HBSS: ssä injektoitiin haima nude-hiirten, kuten aikaisemmin on kuvattu. Hiiret tapettiin sen jälkeen, kun 5 viikkoa injektion ja niille tehdään ruumiinavaus. Koko ja paino maksametastaaseihin tallennettiin.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset laskelmat suoritettiin käyttäen Graph Prism 5.0 ohjelmisto (San Diego, CA, USA). Cox regressio suoritettiin SPSS versio 19,0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Vertailu keinoja normaalijakaumaa data suoritettiin käyttäen Opiskelijan t-testin muuten nonparametric U-testi on sovellettu tai kuten. P-arvot yhtä suuri tai pienempi kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Kaikki pylväskaaviot on kuvattu käyttäen keskiarvot ja keskihajonnat virhejanoina, ellei toisin mainita.

Tulokset

TUSC3 ilmaisun kliinisissä näytteissä

immunohistokemiallisesti, TUSC3 puuttuu haiman strooman soluissa, mutta lähes kaikki haimatiehyt- epiteelisolujen, asinussolut ja saarekkeiden osoittivat immunoreaktiivisuus (kuvio 1A ja 1C). Olemme arvioineet korrelaatio ekspressiotietojen ja kliinisten parametrien, kuten potilaan ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, sijainti, luokka, primaarikasvaimen luokittelu (pT), imusolmuke etäpesäke (PN), kaukainen etäpesäke (pM). TUSC3 ilmentyminen havaittiin eriasteista haimakarsinooma- soluissa sytoplasmassa (kuvio 1 B ja 1 C). TUSC3 havaittiin 38/117 (32.48%) pT näytteet H-pisteet 83,42 ± 2,882, vuonna 14/58 (24,14%) pN näytteet H-pisteet 66,81 ± 4,265 ja 4/11 (36,36%) pM näytteistä H-pisteet 79,55 ± 7,818. Ilmaisu on TUSC3 on dramaattisesti vähentynyt metastaattisessa LNS verrattuna pariksi primaarikasvaimen näytettä (H-pisteet: p 0,001) (kuvio 1 D).

(A) TUSC3 ilmentymistä ei-neoplastisten haiman kudoksista (acinar , kanava ja luotoja). (B) TUSC3 ilmentyminen haiman syöpäsoluissa. (C) Alhainen TUSC3 ilmentyminen haimasyöpäsoluissa verrattuna saarekkeiden. (D) vertailu TUSC3 värjäyksen ensisijainen PC ja LN etäpesäkkeiden (pariksi t-testi, p 0,001, n = 58). Alkuperäinen suurennus × 200.

Vähentynyt TUSC3 ilmentyminen liittyy suurempi patologinen TNM lavastus ja huonon ennusteen

Kaiken 69 mies- ja 48 naispotilasta PC oli mukana tässä tutkimuksessa kohortissa. Keskimääräinen ikä diagnoosin oli 64,6 ± 10,3 vuotta. Eloonjäämismediaani oli 19 kuukautta (vaihteluväli: 3-78 kuukautta). Kasvain vaihe määritellään T

1 N

0 M

0 8 potilaalla (6,84%), T

2 N

0 M

0 20 potilaalla (17,09%), T

3 N

0 M

0 24 potilaalla (20.51%), T

1 N

1M

0 9 potilaalla (7,69%), T

2 N

1M

0 18 potilaalla (15,38%), T

3 N

1M

0 21 potilaalla (17,95%), T

4N

0 M

0 2 potilaalla (1,71 %), T

4N

1M

0 4 potilaalla (3,42%), T

2-3N

0 M

1 5 potilaalla (4,27%) ja T

1-4N

1M

1 6 potilasta (5,13%). 101 potilasta sai kemoterapiaa, mukaan lukien 75 potilasta, jotka saivat adjuvanttihoitoa, ja 26 potilasta, jotka saivat lievittävää kemoterapiaa. 11 maksan etäpesäkkeitä löydettiin käytön aikana, kaikki katseltavissa etäpesäkeleesioita poistettiin onnistuneesti.

suhde TUSC3 ekspressiotaso ja kliinis ominaisuudet potilailla, joilla on PC on esitetty taulukossa 1. Matala TUSC3 ilmentyminen liittyi suurempi kasvaimen kokoa (p = 0,039), korkeampi seerumin CA199 tasolla (p = 0,034), lisää imusuonten läpäisevyyden (p = 0,031), ja korkeampi Ki-67 merkintöjä indeksi (p 0,001).

tutkia, TUSC3 ekspressiotaso ja muut kliinispatologiset tekijät liittyvät kliininen tulos PC potilaiden, yhden ja usean Coxin suhteellisen vaaran malleja CSS (Cancer erityiset Survival) ja RFS (uusiutuu Free Survival) laskettiin. Niistä 117 potilasta, kuolema tapahtui vuonna 62 79 (78,5%) potilaista, joilla on alhainen TUSC3 proteiinin tason ja 22 38 (57,9%) potilailla, joilla on korkea TUSC3 ekspressiotaso (P 0,021). Kuvio 2A esittää Kaplan-Meier -käyrät CSS ja paljastaa, että alhainen TUSC3 taso on tekijä ennustava huonon ennusteen PC potilailla (p = 0,0416, log-rank-testi). Niistä 117 potilasta, toistuminen esiintyi 69 79 (87,3%) potilaista, joilla on alhainen TUSC3 proteiinin tason ja 24 38 (63,2%) potilailla, joilla on korkea TUSC3 ekspressiotaso (p 0,0001). Kuvio 2B esittää Kaplan-Meier -käyrät RFS ja paljastaa, että alhainen TUSC3 taso on tekijä ennustavia suurempi riski uusiutumisen PC potilailla (p = 0,0043, log-rank-testi).

immunohistokemiallinen värjäys TUSC3 on liittyvä kokonaiselossaolo (A) ja toistuminen elinaika (B) post parantava resektio haimasyövän.

univariate analyysi tunnistaa korkea kasvain vaiheessa (vaihe I + II vs. III vs IV P 0,001), korkea seerumin CA199 tason (CA199 300IU /ml vs. CA199≥00IU /ml, p = 0,034), ei kemoterapian (kemoterapia vs ei käsittelyä, p = 0,025), ja väheni TUSC3 ekspressiotason (p = 0,015) kuin huono ennustetekijöiden tekijöitä RFS tässä tutkimuksessa kohortissa. Ja nämä tekijät ovat myös ennakoivaa köyhien kokonaiselinaika tässä kohortissa. Sukupuoli, ikä diagnoosin ja kasvaimen eivät merkittävästi yhteydessä kliinisten tutkimusten tulosten kanssa (taulukko 2).

määrittämiseksi itsenäisen ennustetekijöiden arvo TUSC3 CSS ja RFS, Monimuuttuja-analyysissä käyttäen Coxin suhteellisen riskin malliin tehtiin. Vuonna Monimuuttuja-analyysissä, joka sisälsi ikä, kasvaimen, kasvain vaiheessa kemoterapian, seerumin CA199 taso ja TUSC3 ekspressiotaso tunnistimme kasvain vaiheessa kemoterapian, ja alhainen TUSC3 ekspressiotaso itsenäisinä ennustavat tekijät CSS ja RFS ( TUSC3 ilmaus RFS, p = 0,020; TUSC3 ilmaisu CSS, p = 0,027, taulukko 2).

TUSC3 ilmentyminen on vähentynyt haimasyövän solulinjoissa välitteinen NF-KB: n

karakterisoimiseksi

in vitro

funktiona TUSC3, me ensin tutkinut TUSC3 ilmentymistä eri haimasyövän solulinjoissa. Reaaliaikainen PCR paljasti TUSC3 väheni mRNA tasolla testatuista 11 haiman kasvainsolulinjoja (kuvio 3A). Western-blottaus osoitti, että se oli myös masentunut proteiinin tasolla näissä solulinjoissa (kuvio 3B).

TUSC3 on vähentynyt haimasyövän solulinjoissa sekä mRNA-tasolla (A) ja proteiini taso (B).

tutkitaan onko TUSC3 ilmentyminen korreloi NF-KB-aktiivisuutta, selvitimme TUSC3 ilmaisua sekä RNA tasolla ja proteiinin tason kolme paria haimasyövän solulinjoissa erilaisilla NF-KB: n aktiivisuutta. AsPC-1 mu on tytär solu valmistaa Paul J. Chiao ym transfektoimalla IκBαM (S32,36A) osaksi vanhempien haimasyövän solulinja AsPC-1, mikä johtaa tuumorisolun vastaamaan vähentynyttä NF-KB-aktiivisuus ja vähentynyt maksan etäpesäke potentiaalia [27]. Tämän parin solun malli, osoitettiin, että TUSC3 ilmentymistä AsPC-1 mu on suurempi kuin AsPC-1 (kuvio 4A), mikä viittaa siihen, että TUSC3 säätelee NF-KB: n aktiivisuutta. Sama ekspressiokuvio on löydetty toinen pari solulinjojen, MDA p28 ja MDA p28 mu (kuvio 4B). MDA P28 mu on tytär solulinja valmistetaan myös tohtori Paul J. Chiao laboratoriosta transfektoimalla IκBαM (S32, 36A) Iκ mu osaksi MDA p28 solulinjaan, tuloksena heikennettyjä NF-KB aktiivisuutta ja tukahdutetaan maksan etäpesäke (tietoja ei julkaista). TUSC3 ilmentyminen paranee MDA p28 mu verrattuna MDA P28. L3.6pl on tytär solulinja paljon enemmän mahdollisuuksia maksan etäpesäke peräkkäisinä injektioita vanhempien Colo357 nude-hiiriin. On osoitettu aikaisemmin, että L3.6pl osoittaa korkeampi NF-KB: n aktiivisuutta kuin Colo357 [30]. Ja mielenkiintoisesti, TUSC3 ilme on suurempi Colo357 kuin L3.6pl sekä mRNA ja proteiini tasolla (kuvio 4C). Kaikki nämä kolme paria solulinjojen näytti osoittavat samaa mallia TUSC3 ilmaisun merkitystä NF-KB: n toimintaa, joka merkitsee sitä, että TUSC3 korreloi negatiivisesti NF-KB: n aktiivisuutta.

(A) AsPC-1 ja AsPC -1 mU masentunut NF-KB: n aktiivisuutta. (B) MDA p28 ja MDA p28 MU masentunut NF-KB: n aktiivisuutta. (C) Colo357 ja tytär L3.6pl solulinja parannettu NF-KB: n aktiivisuutta. Kunkin kuva, vasen kuvaaja RT-PCR tulos, oikea kuvaaja Western blot varten TUSC3.

Vähentynyt TUSC3 edistää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion

Tutkia tuumoria tukahduttavan funktion of TUSC3, shRNAs suunniteltiin pudotus ilmentymistä TUSC3 in

in vitro

haimasyövän malli. Kuten emosolulinjassa on erittäin metastaattinen tytärsolu vertailukelpoisia NF-KB: n toimintaa, Colo357 valittiin seuraava koe. Sekä mRNA: ta ja proteiinia tasot havaittiin vahvistaa tehokkuutta hiljentäminen (kuvio 5A ja 5B). Olemme tutkineet vaikutus TUSC3 hiljentäminen soluproliferaatioon, pesäkkeiden muodostumista, muuttoliikkeen ja invaasio olosuhteissa. Erityisesti 72 tunnin viljelyn TUSC3 vaiennetaan solut saavuttanut merkittävän selviytymisen etu verrattuna kontrolleihin (Kuva 5C ja 5D). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011). Yhä suurempien pesäkkeiden muodostettu TUSC3 vaiennetaan kasvainsolujen (kuvio 5E ja 5F). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). Sitten Matrigel määrityksessä käytettiin vaikutusten analysoimiseksi TUSC3 Knockdown muuttoliikettä ja soluväliaineen (ECM) hyökkäys haiman syöpäsoluja. 10% FCS, kuten houkuttimena, TUSC3 vaiennetaan solut näytetä lisääntynyt liikkuvuus ja invasiivisuuden insertin kalvon, toisin kuin kontrolli-soluissa (kuvio 5G, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Sekoita p 0,0001 Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Sekoita p 0,0001; kuvio 5H ja 5I, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001)). Haavan paranemista määritys edelleen tuettava näitä tuloksia, mikä osoittaa lisääntynyt muutos ja siitä tehostettu sulkeminen epiteeliyksiker- solujen matalan seerumin olosuhteissa (5% FCS) 18 tunnin jälkeen (Kuva 5J).

(A, B ) TUSC3 on käytännössä tippuu alas in Colo357 solulinjoissa esitetty (A) RT-PCR ja (B) Western blot. (C, D) Proliferation on parannettu TUSC3 pudotus, solujen lukumäärä määrät ovat merkittävästi erilaiset 72 tuntia (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Sekoita p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Sekoita p = 0,0011) (D). (E, F) Colony Formation on parannettu TSUC3 taintumisen (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (G) Migration Test (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (H, I) Invasion Test (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (J) Haavan paranemista testi osoitti nopeampaa sulkeminen aukon TUSC3 vaiennetaan soluissa. Kaikki kokeet suoritettiin kolmeen kertaan edustaja luvut esitetään edellä.

Vähentynyt TUSC3 edistää maksan etäpesäke potilaalle tehdä istutettu hiirimallissa

edelleen tutkia vaikutusta TUSC3 PC etäpesäkkeitä, me pistetään TUSC3 vaiennetaan kasvainsoluja ortotooppisesti haima nude-hiirissä ja perustettu eläinmalleissa. Viisi viikkoa injektion jälkeen Colo357 shRNA2 ja Colo357 shRNA3 solut, kaikki hiiret sairastuivat ja tapettiin. Kuvista voidaan ilmeisesti nähdä maksan etäpesäkkeiden TUSC3 vaiennettu kasvain on suurempi kuin kontrolli yksi (kuvio 6A). Sitten maksametastaaseihin punnittiin ja verrattiin t-tekstin, Colo357 shRNA2 vs Colo357 Scramble (p = 0,0444), Colo357 shRNA3 vs Colo357 Scramble (p = 0,0443). Yhdessä TUSC3 vaiennetaan solut osoittivat aggressiivisempi ilmiasuun enemmän etäpesäkkeitä esiintyy maksassa jälkeen hiiret tapettiin. Suoritimme IHC sekä RT-PCR vertailla TUSC3 tasoa välillä ensisijainen pesäkkeet ja etäpesäkeleesioita päässä potilaalle tehdä pistetään malli näytteitä. Verrattuna näytteitä hiiriä, joihin injektoitiin TUSC3 sekoituskoodin solulinjat, jotka tulevat TUSC3 shRNA2 ja TUSC3 shRNA3 osoittavat vähentynyttä ilmentymistä tasoilla TUSC3 sekä IHC (S1 kuvio) ja mRNA-tasolla (S2 kuvassa).

(A) Gross ulkonäkö resektoitua maksan näytteitä hiiriä, joihin injektoitiin kaksi ryhmää TUSC3 vaiennettu PC (Colo357 shRNA2 ja Colo357 shRNA3) ja ohjaus (Colo357 Scramble). Suuret maksametastaaseista näkyvät ryhmässä Colo357 shRNA2 ja Colo357 shRNA3. (B) toinen maksametastaaseihin punnittiin ja verrattiin käyttäen t-testiä.

Keskustelu

Nykyinen tutkimus osoittaa, että TUSC3 ilmentyminen on vähentynyt haimasyövän ensisijainen yksilöitä ja sen alassäätöä on prognostisia huono pitkän aikavälin tulokseen.

In vitro

solulinjassa tutkimus ja

in vivo

eläinmallissa todistaa suorasti viittaa sen rooli tuumorisuppressorin funktion haimasyövän aloittamista ja etenemistä. Lisäksi tutkimuksessa paljastaa TUSC3 ilmentyminen väheni tiiviimmän NF-KB: n aktiivisuutta, mikä viittaa uusi asetus mallina molekyyli.

Vaikka on raportoitu, TUSC3 mRNA vähentynyt haimasyövän yksilöiden verrattuna viereisen non -cancerous kudosta, ja toistuvia menetys 8p22, joka sisältää TUSC3 geeni löytyy haimasyövän [17, 18], ei ole aikaisempaa tutkimusta ei ole koskaan havainnut TUSC3 ilmentymisen proteiinin tason tauti. Tämä on itse asiassa aivan välttämätöntä, koska proteiini on varsinainen toimeenpanija geenin ja geneettistä informaatiota. Tässä tutkimuksessa, emme ainoastaan ​​havaita TUSC3 mRNA käyttämällä solulinjoja, mutta myös havaita sen ilme on proteiini tasolla immunohistokemia kliinisissä näytteissä ja western blotting solulinjoissa. Tulokset ovat yhdenmukaisia ​​ja vahvisti, että TUSC3 on dramaattisesti masentunut haimasyövän, niin ensisijainen yksilöitä ja kasvainsolulinjoissa, sekä mRNA-tasolla ja proteiinin taso. Enemmän kiinnostavaa, TUSC3 oli käänteinen korrelaatio NF-KB-aktiivisuutta ainakin joissain haimasyöpäkasvainsolulinjo- linjojen ja on täysin samansuuntainen eriasteisia maligniteetti. IκBαM-transfektoiduissa AsPC-1 mu ja MDA p28 mu vähemmän pahanlaatuisia heikennetyillä NF-KB-aktiivisuutta, ja niiden TUSC3 ilmentyminen lisääntyy. On huomionarvoista, että tämä negatiivinen suhde esiintyy myös toinen pari solulinjojen, jonka tytär solulinja hankittiin kautta peräkkäisen injektioita emosolulinjassa nude-hiiriin sijaan transfektiolla manipulointi. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, TUSC3 ilmentymistä voidaan säädellä NF-KB: n aktiivisuutta, ainakin joissakin kasvainsolulinjoissa. Aiemmin TUSC3 alassäätöä on osoitettu vuoksi homotsygoottisia ja heterotsygoottinen poisto eturauhasen syöpä, promoottori hypermetylaation munasarjasyövän [25]. Vaikka sitä on usein poistetaan haimasyövän [16-18], tulokset viittaavat siihen, uudenlainen transkription säätelyyn tätä molekyyliä tämä syöpä kokonaisuuden. On mahdollista, että TUSC3 down-regulation mekanismit vaihtelevat eri kasvaintyypeissä. Esimerkiksi varhainen tutkimus osoitti TUSC3 ei hypermetyloitunut kolorektaalikarsinoomasta [31], mutta hypermetylaation on tärkeä mekanismi TUSC3 alassäätöä munasarjasyövän ja jopa kuljettaa ennusteen arvioinnissa [25]. On myös mahdollista, että TUSC3 ilmentymistä voidaan säädellä erilaisin keinoin jopa samassa kasvaimen tyypin mukaan eri potilailla tai solulinjoja. Se ei sulje pois muita mahdollisia mekanismi sääntelyn, kuten mikro-RNA-välitteisen hiljentäminen.