Krooninen sairaus

tiivistelmä

SRC, joka tunnetaan myös proto-onkogeenin c-Src, on ei-reseptori tyrosiini kinaasi, jolla on tärkeä rooli syövän etenemisen edistämällä eloonjäämisessä, angiogeneesissä, leviämisen ja invaasion polkuja. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että SRC proteiini tasot johdonmukaisesti yläreguloituja keuhkosyöpää kudoksissa, mutta SRC mRNA-tasot vaihtelivat satunnaisesti, mikä viittaa siihen, että transkription jälkeinen mekanismi oli mukana SRC sääntelyä. Koska MikroRNA (miRNA) ovat voimakkaita posttranskriptionaalisen sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen, käytimme bioinformatiikan analyysejä etsiä miRNA jotka mahdollisesti kohdistuvat SRC. Havaitsimme kohdistusmenetelmän sivustoja miR-203 3′-alue (3′-UTR) SRC. Sitten kokeellisesti validoitu miR-203 suorana säätelijänä SRC käytetään transfektion ja Lusiferaasimäärityksiä ja osoittivat, että miR-203 esti SRC ilmaisun ja siten laukaisi tukahduttaminen SRC /Ras /ERK-reitin. Lopuksi osoitimme, että tukahduttaminen SRC by miR-203 tukahdutti proliferaatio ja migraatio sekä edistänyt apoptoosin keuhkosyövän soluja. Yhteenvetona, tämä tutkimus tarjoaa ensimmäisen vihjeitä rooli miR-203 tuumorisuppressori keuhkosyöpäsoluissa inhibition kautta SRC käännöksen.

Citation: Wang N, Liang H, Zhou Y, Wang C Zhang S, Pan Y, et ai. (2014) miR-203 estää leviämisen ja Migration ja edistää apoptoosin Lung syöpäsolujen Targeting SRC. PLoS ONE 9 (8): e105570. doi: 10,1371 /journal.pone.0105570

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 7 huhtikuuta, 2014; Hyväksytty: 21 heinäkuu 2014; Julkaistu: 20 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta National Basic Research Program of China (973 Program) (nro 2014CB542300), National Natural Science Foundation Kiinassa (nro 81101330, 31271378, ja 81250044), Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (nro BK2011013 ja BK2012014), ja tutkimuksen Special Fund for Public Welfare Industry of Health (nro 201302018). Tätä työtä tukee myös ohjelman New Century Excellent Talents yliopiston alkaen opetusministeriön, Kiina (NCET-12-0261). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa noin 80% kaikista tapauksista [1]. Suurin keuhkosyövässä (56%) diagnosoidaan kaukana vaiheessa, koska varhainen taudin on yleensä oireeton; vain 15% tapauksista diagnosoidaan paikallisessa vaiheessa [2]. Itse asiassa potilailla, joilla on keuhkosyöpä esiintyy usein kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden ennen diagnoosia, mikä tekee nykyiset hoidot, mukaan lukien kirurgia, sädehoito ja kemoterapia, tehottomia. Yleinen 5-vuoden pysyvyys ei-pienisoluinen keuhkosyöpä on erittäin alhainen (17,1%). Siksi opiskelu molekyylitasolla keuhkosyöpään on ratkaisevan tärkeää suunniteltaessa uusia terapeuttisia aineita, jotka parantavat eloonjääneitä.

Kun merkittävä kehitys ymmärrystämme tuumoribiologiassa, avain signalointi reittejä mukana välittämässä keuhkosyövän kasvua ja etenemistä on tunnistettu [3]. Hallitseva onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille patogeneesiin liittyvien keuhkosyöpään ovat herättäneet huomattavaa kiinnostusta, ja niiden keskeinen roolit ja olennainen panos misbehavior syöpäsolujen tullut selväksi [4]. Nämä geenit tarjoavat uusia tavoitteita biologisia hoitoja. Yksi tällainen tavoite on SRC (tunnetaan myös c-Src), proto-onkogeeni, joka koodaa tyrosiinikinaasi, joka on usein yli-ilmentynyt ja aktivoitu monia syöpätyyppejä, mukaan lukien keuhkosyöpä, [5], [6]. Molekyylitasolla perusteella, SRC säätelee useita signalointikaskadien liittyy kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen, kuten polttoväli adheesiokinaasi (FAK) reitin, epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) koulutusjakson, ja Ras /ERK-reitin [7]. Niinpä SRC toimii onkogeenin suosia solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion erilaisten syöpäsolujen [8], [9]. Huolimatta näistä viimeaikainen edistys ymmärrystämme tärkeät roolit SRC kasvainten synnyssä, tarkkaa molekyylitason mekanismi, jonka avulla SRC myötävaikuttaa keuhkosyöpä etenemistä vielä täysin selvitetty.

luokka pieniä, ei-koodaus, single -stranded RNA: t tunnetaan MikroRNA (miRNA) on osoitettu olevan osallisena syövän. miRNA sitoutuvat kohde-mRNA: ta täydentävien alueiden niiden 3′-alueet (3′-UTR), jolloin ilmentymisen estämiseksi kohdegeenin on posttranskriptionaalisella tasolla [10], [11]. Tällä mekanismilla, miRNA säädellä erilaisia ​​biologisia prosesseja, myös solujen jakautumista ja erilaistumista, muuttoliike, apoptoosin, kehitys, ja aineenvaihdunta [10]. Toisaalta, toimintahäiriö miRNA on osallisena useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä, ja miRNA voi toimia sekä onkogeenien ja tuumorisuppressoreita aikana karsinogeneesin [12], [13]. Esimerkiksi alhainen ilmentyminen let-7a ja korkea ilmentyminen miR-17-92 klusterin liittyy huono kliinistä tulosta keuhkosyövän [14], [15]. Lisäksi todettiin, että miR-31 voisi suoraan tukahduttaa tuumorisuppressoreilla LATS2 ja PPP2R2A ihmisen keuhkosyövän [16]. Nämä havainnot korostavat tarvetta perusteellisen etsiä miRNA jotka poikkeavasti ilmaistiin keuhko syövän synnyn sekä tarve intensiivinen tutkimus niiden merkitys tuumoribiologiassa.

Vaikka vapauttaminen miRNA ja SRC pelata tärkeä rooli keuhkojen syövän synnyn välillä ei SRC ja miRNA keuhkosyövässä on raportoitu. Tässä tutkimuksessa olemme ennusti, että SRC on tavoite miR-203. Mittaamisen jälkeen ekspressiotasot miR-203 ja SRC ihmisen keuhkosyövän kudosten ja pariksi noncancerous kudosnäytteet, olemme havainneet käänteinen korrelaatio miR-203 ja SRC-proteiinin tasoja. Lisäksi olemme kokeellisesti vahvisti suora esto SRC käännös miR-203 käyttämällä solujen transfektio ja Lusiferaasimäärityksiä. Lopuksi osoitimme että miR-203 esti SRC ilmaisun ja siten laukaisi tukahduttaminen loppupään signalointi polkuja SRC, kuten SRC /Ras /ERK-reitin, joka lopulta tukahdutti proliferaatio ja migraatio sekä edistänyt apoptoosin keuhkosyövän soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja ihmisen kudoksia

ihmisen keuhkosyöpä solulinjat A549, HCC827, ja H1975, ja ihmisen normaali keuhkojen fibroblastisolulinjassa HLF ostettiin Shanghai Institute of Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). A549, HCC827, ja H1975-soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (GIBCO, CA, USA), ja HLF soluja viljeltiin F12K täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (GIBCO) ja 2,5 g /l NaHCO

3. Kaikki soluja inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa vedellä kyllästettyä ilmakehässä. Keuhkojen kasvaimet ja pariksi viereisistä normaaleista kudoksista saatiin potilailta, joille suoritetaan kirurgisen klo Affiliated Gulou sairaala Nanjing University (Nanjing, Kiina). Sitten kasvaimen jaksossa kalvot alistettiin immunohistokemiallinen analyysi SRC (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki potilaat tai heidän huoltajiensa jos kirjallisen suostumuksen, ja eettinen komitea Nanjing University hyväksytty kaikilla tässä tutkimuksessa. Kudosfragmentit jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä leikkauksen aikana ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kliiniset piirteet potilaista on lueteltu taulukossa S1 File S1.

RNA: n eristys ja kvantitatiivinen RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin viljellystä solujen ja ihmisen kudoksissa käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen , Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määrityksiä määrittää miRNA suoritettiin käyttäen Taqman-miRNA-koettimia (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttämällä AMV-käänteistranskriptaasia (TaKaRa, Dalian, Kiina) ja varsi-silmukka-RT-aluketta (Applied Biosystems). Reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 16 ° C 30 min, 42 ° C: ssa 30 min, ja 85 ° C: ssa 5 min. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen TaqMan PCR kit Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaktioita inkuboitiin 96-kuoppaisilla optinen levy 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Reaktion jälkeen syklin kynnys (C

T) tiedot määritettiin käyttämällä kiinteitä kynnys asetukset, ja keskimääräinen C

T on kolmena PCR: istä määritettiin. Vertaileva C

T menetelmää käytettiin vertaamaan kunkin ehdon valvontaa. Suhteellisten tasojen miRNA soluissa ja kudoksissa normalisoitiin U6. Määrä miRNA suhteessa sisäisen valvonnan U6 laskettiin 2

-ΔΔCT yhtälö, jossa ΔΔC

T = (C

T miRNA – C

T U6)

tavoite – (C

T miRNA – C

T U6)

valvontaa. Määrällisesti SRC mRNA, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen oligo-dT: ja Thermoscript (TaKaRa) reaktiossa, joka suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 42 ° C: ssa 60 min ja 70 ° C: ssa 10 minuutin ajan . Seuraavaksi reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen RT tuotteen, SYBER Green Dye (Invitrogen) ja spesifisiä alukkeita SRC ja GAPDH. Sekvenssit alukkeet olivat seuraavat: SRC (sense): 5′-CATCCAAGCCTCAGACCCA-3 ’; SRC (antisense): 5’-TGACACCACGGCATA Cagc-3 ’; GAPDH (sense): 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ’; ja GAPDH (antisense): 5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ’. Reaktioita inkuboitiin 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 30 s. Kun reaktiot olivat täydellisiä, C

T arvot määritettiin asettamalla kiinteän kynnyksen. Suhteellinen määrä SRC mRNA normalisoitiin GAPDH.

yli-ilmentyminen ja pudotus on miR-203

Synteettinen pre-miR-203, anti-miR-203 ja sekoitetun negatiivisen kontrollin RNA: t hankittiin Ambion (Austin, TX, USA). Kaikki solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tai 60 mm: n annoksia, ja solut transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seuraavana päivänä, kun solut olivat noin 70% konfluentteja. Jokaisessa hyvin, yhtä suuria määriä valmiiksi miR-203, anti-miR-203 tai sekoitetun negatiivisen kontrollin RNA käytettiin. Solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen ja kvantitatiivinen RT-PCR: llä ja Western blottauksella.

lusiferaasireporttiterilla määritys

testaamiseksi suoraan sitoutumisen miR-203 kohdegeeniin SRC, lusiferaasireport- määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Koko 3′-alueen (3′-UTR), ihmisen SRC monistettiin käyttäen PCR: llä ihmisen genomi-DNA: ta templaattina. PCR-tuotteet insertoitiin p-MIR-reportteriplasmidilla (Ambion), ja insertio vahvistettiin oikeiksi sekvensoimalla. Testata sitoutumisen spesifisyys, sekvenssit, jotka vuorovaikutuksessa miR-203 siementen sekvenssin mutatoitiin (välillä AUUUCA ja UAAAGU), ja mutantti-SRC 3′-UTR insertoitiin vastaava lusiferaasireportterigeenin. Lusiferaasin toimittaja määrityksiä, A549-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä, ja kukin kuoppa transfektoitiin 1 ug: tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidi, 1 ug β-galaktosidaasin (β-gal) ekspressioplasmidin (Ambion), ja yhtä suuret määrät (100 pmol) ennalta miR-203, anti-miR-203 tai salattu negatiivinen kontrolli-RNA käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Β-gal-plasmidia käytettiin transfektion ohjaus. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut analysoitiin käyttäen Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA).

Plasmidi rakentaminen ja siRNA häiriöitä määrityksessä

siRNA-sekvenssin kohdistaminen ihmisen SRC cDNA suunniteltiin ja syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina). SiRNA-sekvenssi oli 5′-CACUACAAGAUCCGGAAAC-3 ’. Salatun siRNA sisällytettiin negatiivisena kontrollina. Nisäkkään ilmentämisplasmidi, joka koodaa ihmisen SRC avoin lukukehys (Preceiver-M02-SRC) hankittiin GeneCopoeia (Germantown, MD, USA). Tyhjä plasmidi toimi negatiivisena kontrollina. SRC ekspressiovektoriin ja SRC siRNA transfektoitiin A549-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA ja proteiini eristettiin 24 tuntia transfektion jälkeen. SRC mRNA ja proteiini ekspressiotasot arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä ja Western blottauksella.

Proteiinin uutto ja Western blotting

Kaikki solut huuhdeltiin PBS: llä (pH 7,4) ja lyysattiin RIPA Lysis puskuria (Beyotime, Kiina) on täydennetty proteaasi ja fosfataasilla Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific 78440) jäillä 30 minuutin ajan. Kudosnäytteet jäädytettiin kiinteä nestemäisellä typellä, jauhaa jauheeksi ja lyysattiin RIPA-lyysipuskuria, joka sisältää proteaasi ja fosfataasinestäjällä Cocktail jäissä 30 min. Tarvittaessa ultraäänitutki- käyttää helpottamaan hajoamiseen. Solulysaateista tai kudoshomogenaatteja sentrifugoitiin 10 min (12000 g, 4 ° C). Supernatantti kerättiin, ja proteiinikonsentraatio laskettiin käyttäen Pierce BCA-proteiinin iinianalyysikitissä (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteiini tasot analysoitiin western blotteja vastaavilla vasta-aineilla. Proteiini tasot normalisoitiin luotaa saman blotit kanssa GAPDH vasta-aineella. Vasta-aineet hankittiin seuraavista lähteistä: anti-c-Src (B-12) (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK1 /2 (pT202 /pY204) (BD Biosciences 612359, USA), anti-ERK1 (BD Biosciences 610031, USA), anti-PKCalpha (H-7) (sc-8393, Santa Cruz Biotechnology) ja anti-GAPDH (sc-365062, Santa Cruz Biotechnology). Ras aktiivisuutta havaittiin käyttäen Ras Aktivointi Assay Kit Upstate-Millipore (17-218). Proteiinivyöhykkeet analysoitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa.

solunelinkykyisyysmääritys

arvioimiseksi solujen elinkykyä, A549-soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyillä tiheydellä 5 x 10

3 solua per kuoppa 100 ui viljelyalustaa. Soluproliferaatioon-indeksi mitattiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) (Sigma, USA), joka suoritettiin 12, 24, 36, ja 48 h transfektion jälkeen mukaan valmistajan ohjeiden.

Cell migraatiokokeessa

migraatio kyky A549-soluja oli transfektoitu miR-203 matkivat tai SRC yliekspressio plasmidi testattiin Transwell Boyden Chamber (6,5 -mm, Costar, USA). Polykarbonaatti kalvoja (8- um huokoskoko) pohjassa ylemmän osastoon siirtoaltaat päällystettiin 1% ihmisen fibronektiiniä (R ja liitteenä ja kelluvat solut kerättiin sitten. Virtaussytometria-analyysi apoptoottisten solujen suoritettiin käyttämällä anneksiini V-FITC /PI-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (BD Biosciences, CA, USA). Sen jälkeen, kun oli pesty kylmällä PBS: llä, solut suspendoitiin uudelleen sitomispuskuriin (100 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, ja 25 mM CaCl

2), mitä seurasi värjäys anneksiini V-FITC /PI huoneenlämpötilassa pimeässä 15 min. Apoptoottisia soluja arvioitiin sitten portittamisella PI ja anneksiini V-positiivisia soluja on fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) -virtaussytometriä (BD Biosciences, San Jose, CA). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kuvat Western blotting edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. Kvantitatiivinen RT-PCR, lusiferaasireportterigeenin määritys, ja solujen elinkyky ja apoptoosin määritykset suoritettiin kolmena kappaleena, ja jokainen koe toistettiin useita kertoja. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SE vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä p 0,05 käyttämällä Studentin t-testiä.

Tulokset

lisääntymisen merkkejä SRC proteiinia, mutta ei mRNA, keuhkosyövän kudoksissa

ensimmäinen tutkittu SRC ilmentymisen avulla sekä immunohistokemiallista analyysiä ja immunoblot-analyysi ihmisen keuhkosyövän kudosten ja vastaavien noncancerous kudoksia. Olemme havainneet, että SRC-proteiinin tasot olivat huomattavasti korkeammat keuhkosyöpä kudoksissa (kuvio 1, A-C). Vaikka SRC proteiinin johdonmukaisesti yläreguloituja keuhkosyöpä kudoksissa, SRC mRNA-tasot eivät eronneet merkittävästi toisistaan ​​syöpä ja noncancerous kudoksiin (kuvio 1 D). Lisäksi huomasimme, että SRC proteiini taso oli korkeampi ihmisen keuhkojen A549-solujen verrattuna normaalissa keuhkojen fibroblastien HLF soluja (kuvio S1, A ja B File S1), mutta SRC mRNA taso oli sama näissä kahdessa solulinjassa (Kuva S1C File S1). Tämä epäsuhta proteiini ja mRNA SRC ilmentyminen keuhkosyövässä viittaa vahvasti siihen, että transkription jälkeinen mekanismi osallistuu SRC asetuksessa.

(A) edustaja kuva immunohistokemiallinen analyysi SRC ilmentymisen keuhkosyöpä (CL) ja normaali viereinen kudos (NL) näytteitä. (B ja C) Western blot analyysi ekspressiotasot SRC proteiinin kuusi paria CL ja NL näytteitä. B: edustava kuva; C: kvantitatiivinen analyysi. (D) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suhteellisten ekspressiotasojen SRC-mRNA: n kuusi paria CL ja NL näytteitä. * P 0,05; ** P 0,01.

tunnistaminen säilyneitä miR-203 kohdesivustot sisällä 3′-UTR SRC

Yksi tärkeä tila posttranskriptionaalisella sääntely on tukahduttaminen mRNA transkriptien miRNA. miRNA ovat siis todennäköisesti pelata biologisesti relevantti säätelijänä SRC ilmentyminen keuhkosyövässä. Kolme algoritmit, kuten TargetScan [18], Miranda [19], ja PicTar [20], käytettiin yhdessä tunnistaa mahdolliset miRNA joka voi kohdistaa SRC. Käyttämällä näitä lähestymistapoja miR-203 tunnistettiin ehdolle sääntelyn miRNA SRC. Ennustettu vuorovaikutus miR-203 ja kohde-sivustoja SRC 3′-UTR on esitetty kuvassa 2A. Neljä mahdollista miR-203 kohdesivustot löytyivät 3′-UTR SRC mRNA-sekvenssin. Pienin vapaa energia-arvot näiden hybridien olivat -16,9, -20,1, -15,8, ja -18,9 kcal /mol, vastaavasti, jotka ovat hyvin erilaisia ​​aitoja miRNA-kohde paria. Lisäksi täydellinen emäspariutumisessa välillä ilmennyt siemenen alueen (ydin sekvenssi, joka käsittää ensimmäisen 2-8 emästä kypsä miRNA) ja sukulais tavoitteita. Lisäksi miR-203 sitovia sekvenssejä SRC 3′-UTR ovat hyvin konservoituneita lajien välillä.

(A) Kaavamainen kuvaus hypoteettisen dupleksit muodostuu vuorovaikutuksesta sitoutumiskohdat SRC 3′ UTR (ylhäällä) ja miR-203 (pohja). Ennustettu vapaa energia-arvo kunkin hybridi on merkitty. Siemen tunnistuskohdat on merkitty, ja kaikki nukleotidit näillä alueilla ovat hyvin konservoituneita lajien välillä, mukaan lukien ihmisen, hiiren ja rotan. (B) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi ekspressiotasot miR-203 (siinä muodossa miRNA /U6-suhde) on kuusi paria CL ja NL näytteitä. (C) Pearsonin korrelaatio sirontakuvaajaan n kertainen muutos tasojen miR-203 ja SRC proteiinia ihmisen keuhkosyövän kudoksia. (D) Pearsonin korrelaatio sirontakuvaajaan n kertainen muutos tasojen miR-203 ja SRC mRNA ihmisen keuhkosyövän kudoksia. * P 0,05; ** P 0,01.

Detection of käänteinen korrelaatio miR-203 ja SRC tasot keuhkosyöpää kudosnäytteistä

miRNA yleisesti ajatellaan olevan ilmentymisen malleja, jotka ovat vastakkaisia kuin tavoitteensa [21] – [23]. Me tutkimme seuraavaksi miR-203 oli korreloi käänteisesti SRC keuhkosyövässä. Sen jälkeen pitoisuuksien määrittämiseksi miR-203 samalla kuusi paria keuhkosyöpään kudosten ja vastaavien noncancerous kudoksia, osoitimme, että miR-203-tasot johdonmukaisesti vaimentua keuhkosyövän kudoksissa (kuvio 2B). Käänteistä korrelaatiota miR-203 tasoa ja SRC-proteiinin tasot (kuvio 2C) ja epäsuhta miR-203 tasoa ja SRC-mRNA-tasot (kuvio 2D) on edelleen havainnollistettu käyttämällä Pearsonin korrelaatiota sirontakuvaajiin. Kuten havaitaan, käänteinen korrelaatio miR-203 tasoa ja SRC-proteiinin tasot, mutta ei mRNA-tasot, havaittiin ihmisen keuhkosyövän kudoksia. Samoin miR-203 taso oli myös pienempi A549-soluja verrattuna, että HLF soluissa (kuvio S1D File S1). Tulokset vahvasti mielestä tyypillinen miRNA-välitteinen, transkription jälkeisiin sääntelymekanismi osallistui SRC tukahduttaminen.

validointi SRC suorana kohteena miR-203

Korrelaatio miR -203 ja SRC tutkittiin edelleen arvioimalla SRC ilmentyminen ihmisen keuhkojen A549-solujen jälkeen yli-ilmentymisen miR-203. Näissä kokeissa miR-203 yliekspressio saatiin aikaan transfektoimalla soluja pre-miR-203 (synteettinen RNA-oligonukleotidi duplex jäljittelemällä miR-203 esiaste). Kuten odotettua, miR-203 tasot A549-soluja kasvatettiin yli 300-kertaisesti, kun nämä solut transfektoitiin pre-miR-203 (kuvio 3A). Vahvistaa, että transfektio miR-203 oli onnistunut, yksi edustaja kohdegeenien miR-203, PKCalpha (REF), arvioitiin ja se osoitti, että PKCalpha oli merkittävästi vaimentua A549-soluissa transfektion jälkeen miR-203 (kuvio S2 File S1). Samoin ilmaus SRC-proteiinin väheni käyttöön miR-203 A549-solut (kuvio 3, B ja C). Sen määrittämiseksi, millä tasolla miR-203 vaikuttavat SRC ilmaisu, me toistetaan edellä mainitut kokeet ja tutkittiin ilmentymistä SRC-mRNA: n transfektion jälkeen. Vaikka solunsisäinen taso miR-203 oli muuttunut merkittävästi hoidon jälkeen ennalta miR-203, yliekspressio miR-203 ei vaikuttanut SRC mRNA: n stabiilisuuteen (kuvio 3D). Toisaalta, korrelaatio miR-203 ja SRC tutkittiin myös arvioimalla SRC ilmentymistä normaalissa keuhkojen fibroblastien HLF soluja jälkeen knockdovvn miR-203 anti-miR-203 (kemiallisesti muunnetut vastinjuosteoligonukleotidit suunniteltu nimenomaan kohdistaa kypsä asennuspalveli- 203) (kuvio 3A). Kaatamalla miR-203 HLF soluissa johti kasvu SRC-proteiinin (kuvio 3, B ja C), mutta ei mRNA (kuva 3D) tasoilla. Nämä tulokset osoittavat, että miR-203 säännellään erityisesti SRC-proteiinin ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla, joka on tyypillinen eläin miRNA-säätelyyn mekanismi. Osoittaa luotettavuutta testi, me toistetaan edellä mainitut kokeet kaksi keuhkoadenokarsinooma solulinjat, HCC827 ja H1975. Samoin miR-203-tasot olivat merkittävästi kasvaa, kun HCC827 ja H1975-solut transfektoitiin pre-miR-203 (kuvio S3, A ja E File S1). Tästä seuraa, että SRC-proteiinin tasot tukahdutettiin, kun HCC827 ja H1975-soluja käsiteltiin valmiiksi miR-203 (kuvio S3, B, C, F ja G File S1), mutta SRC-mRNA-tasot eivät vaikuta tällaista hoitoa (kuvio S3, D ja H File S1).

(A) Quantitative RT-PCR analyysi miR-203 tasot A549-soluja käsiteltiin valmiiksi miR-ohjaus tai ennalta miR-203 ja HLF soluissa hoidettu anti-miR-ohjaus tai anti-miR-203. (B ja C) Western blot-analyysi SRC-proteiinin tasojen A549-soluja käsiteltiin valmiiksi miR-ohjaus tai pre-miR-203 ja HLF soluissa, joita käsiteltiin anti-miR-ohjaus tai anti-miR-203. B: edustava kuva; C: kvantitatiivinen analyysi. (D) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi SRC mRNA tasojen A549-soluja käsiteltiin valmiiksi miR-ohjaus tai ennalta miR-203 ja HLF soluissa, joita käsiteltiin anti-miR-ohjaus tai anti-miR-203. (E) tulikärpäsen lusiferaasi toimittajille, jotka sisältävät villin tyypin (WT) tai mutantti (MUT) miR-203 sitoutumiskohdat SRC 3′-UTR kotransfektoitiin A549-soluja pre-miR-ohjaus tai pre-miR-203 ja osaksi HLF solut anti-miR-ohjaus tai anti-miR-203. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut analysoitiin käyttäen lusiferaasianalyysissä kit. Tulokset lasketaan suhde tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuutta pre-miR-203- tai anti-miR-203-transfektoitujen solujen normalisoitu kontrollisoluihin. * P 0,05; ** P 0,01.

Voit selvittää kielteiset säätelyvaikutukset että miR-203 kohdistuu SRC ilmentyminen välittyvä sitoutumisen miR-203 oletettuun sivustoja 3′-UTR SRC mRNA, täyspitkä SRC 3′-UTR sisälsi neljä oletettu miR-203 sitoutumiskohdista fuusioitu alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi geenin reportteriplasmidi. Saatu plasmidi transfektoitiin A549-soluihin yhdessä transfektion ohjaus plasmidi (β-gal) ja pre-miR-203. Kuten odotettua, yliekspressio miR-203 aiheutti yli 50%: n vähennys lusiferaasireportteri aktiivisuuden verrattuna käsiteltyjen solujen negatiivisen kontrollin RNA: n (kuvio 3E). Lisäksi otimme käyttöön pistemutaatiot vastaaviin täydentävien alueiden SRC 3′-UTR poistamiseksi ennustettu miR-203 sitoutumiskohtiin (kaikki neljä sidontareunat oli mutantti). Tämä mutatoitunut lusiferaasireportterista ollut vaikutusta yliekspressio miR-203 (kuvio 3E). Sen sijaan, kun tuloksena saatu plasmidi transfektoitiin HLF soluihin yhdessä transfektion ohjaus plasmidi (β-gal) ja anti-miR-203 knockdovvn miR-203 aiheutti yli 75%: n kasvu ja lusiferaasireportterigeenin aktiivisuuden verrattuna solut, joita käsiteltiin negatiivisen kontrollin RNA: ta, kun taas mutatoitunut lusiferaasireportteri- oli vaikuta knockdovvn miR-203 (kuvio 3E). Tämä havainto viittaa siihen, että sitoutumiskohtien voimakkaasti edistää miRNA: mRNA vuorovaikutus välittävä transkription jälkeisellä tukahduttamisesta SRC ilmaisua. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että miR-203 suoraan tunnistaa ja sitoutuu 3′-UTR SRC mRNA otteen ja estää SRC käännös.

Suppression SRC /Ras /ERK signalointireitille by miR-203

vieressä analysoi biologisia seurauksia laski SRC ilmaisun aiheuttama miR-203 keuhkojen syöpäsoluja. Koska voimakas onkogeeni, SRC säätelee leviämisen ja liikkuvuus syöpäsolujen vaikuttamalla FAK, EGFR, ja Ras /ERK signalointireittien [7]. Siksi me tutkimme, tukahduttaminen SRC ilmaisun takia miR-203 toimintaa säätelevään molekyylien SRC /Ras /ERK signalointireitille. Ensin validoitu vaikutus SRC toiminnan Ras /ERK signaali väylän A549-soluja. Suostumuksella aikaisempien raporttien [7], [24], knockdovvn SRC siRNA-välitteisen RNA-interferenssin alensivat SRC mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 4, A-C), mikä puolestaan ​​vähensivät Ras-GTP ja fosforyloitu-ERK1 /2 (kuvio 4, A ja B). Sen sijaan, yliekspressio SRC lisännyt SRC mRNA: ta ja proteiinia tasoilla (kuvio 4, A-C), joka puolestaan ​​lisännyt Ras-GTP ja fosforyloitu-ERK1 /2 (kuvio 4, A ja B). Seuraavaksi tutkimme jos miR-203 induktio voivat jäljitellä SRC väheneminen tukahduttamaan Ras /ERK signalointireitille. Kuten odotettua, yli-ilmentyminen miR-203 A549-soluja vaimentua SRC proteiinin ja aiheutti vähemmän aktiivinen Ras-GTP, joka puolestaan ​​johti vähemmän fosforyloidun ERK1 /2 (kuvio 4, D ja E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Ras /ERK, koska loppupään signalointireitiksi SRC voidaan tiukasti ohjata miR-203 /SRC sääntelyn kautta.

(A ja B) Western blotting-analyysi Proteiinin tasot SRC, Ras-GTP, yhteensä Ras, fosforyloitu ERK1 /2, ja ERK1 A549-soluissa, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA, SRC siRNA, kontrollivektorilla tai SRC vektori. V: edustava kuva; B: kvantitatiivinen analyysi. (C) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi SRC mRNA tasot A549-soluja käsiteltiin ohjaus siRNA, SRC siRNA, kontrollivektorille tai SRC vektori. (D ja E), Western blotting-analyysi proteiinin tasot SRC, Ras-GTP, yhteensä Ras, fosforyloitu ERK1 /2, ja ERK1 A549-soluissa, jotka on transfektoitu pre-miR-ohjaus tai pre-miR-203. D: edustava kuva; E: kvantitatiivinen analyysi. * P 0,05; ** P 0,01.

rooli miR-203 säätelyssä SRC keuhkojen syöpäsoluja

seuraavaksi keskittyneet tutkimuksiin, jotka koskevat miR-203 säätelyssä SRC. Koska SRC tiedetään osallistuvan solujen jakautumisen, apoptoosin, ja muuttoliike, me tutkimme, miR-203 säätelisi SRC moduloimiseksi solujen lisääntymistä, apoptoosin, ja muuttoliikkeen A549-soluja. Tukeakseen ajatus, että SRC on olennaista edistää leviämisen [25], A549-soluja oli transfektoitu SRC siRNA estivät solujen lisääntymisen (kuvio S4A File S1); toisin transfektio SRC-yliekspressoivassa plasmidi, joka erityisesti ilmaisee täyspitkän avoimen lukukehyksen (ORF) SRC ilman miR-203-reagoiva 3′-UTR: n, oli päinvastainen vaikutus soluproliferaatioon (kuvio S4b Tiedosto S1). Myöhemmin, arvioimme rooli miR-203 soluproliferaatioon. Kuten odotettua, A549-soluja, jotka oli transfektoitu ennen miR-203 oli laskenut SRC-proteiinin tasoja (kuvio 5, A ja B) ja lisäännytettiin huomattavasti matalampi (kuvio 5C). Taulukko S1.