Krooninen sairaus

tiivistelmä

Superantigeenit (sags) ovat mikrobitoksiinien että rajat link T-solu- reseptorit jossa major histocompatibility class II (MHC-II) molekyylit johtaa aktivoinnin suuri määrä T-soluja. Tässä kuvaamme kehitystä ja prekliinistä testaus uusi kasvain kohdistetun SAG (TTS) terapeuttiset rakennettu käyttäen streptokokin pyrogeeninen eksotoksiini C (Spec) SAG ja kohdistaminen syöpäsolujen ilmentävät 5T4 kasvaimeen liittyvä antigeeni (TAA). Estävän mahdollisesti haitallisia laajaa immuunisolujen aktivoitumisen, joka on spec mutaation suuren affiniteetin MHC-II sitova rajapinta luotiin (Spec

D203A), joka osoitti lausutaan väheneminen mitogeeniaktiivisuuden, mutta tämä mutantti voi silti aiheuttaa immuunijärjestelmän soluvälitteisen syöpäsolun kuoleman

in vitro

. Kohdistaa 5T4

+ syöpäsoluja me valmistimme humanisoitu yksiketjuinen vaihteleva fragmentti (scFv) vasta-aine tunnistaa 5T4 (scFv5T4). Kohdentaminen scFv5T4 todennettiin. Spec

D203A fuusioitunut scFv5T4 säilyy kyky aktivoida ja aiheuttaa immuunijärjestelmän soluvälitteinen sytotoksisuus paksusuolisyövän soluja. Käyttäen ksenograftimallia vakiintuneiden ihmisen paksusuolen syöpä, osoitimme, että spec-pohjainen TTS pystyi hallitsemaan kasvua ja leviämistä suuria kasvaimia

in vivo

. Tämä edellytti sekä TAA kohdistamista scFv5T4 ja funktionaalinen SAG toimintaa. Nämä tutkimukset luovat perustan kehittämiselle streptokokin sags kuin ”seuraavan sukupolven” TTS syövän immunoterapiassa.

Citation: Patterson KG, Dixon Pittaro JL, Bastedo PS, Hess DA, Haeryfar SMM, McCormick JK (2014 ) valvonta Perustettu Colon Cancer ksenoqraftit käyttäminen Novel Humanisoidun yksiketjuinen vasta-aine-streptokokin Superantigen rifuusioproteiini kohdistaminen 5T4 onkofetaaliantigeenia. PLoS ONE 9 (4): e95200. doi: 10,1371 /journal.pone.0095200

Editor: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus tekninen yliopisto-Dresden, Saksa

vastaanotettu: 03 helmikuu 2014; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2014; Julkaistu: 15 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Patterson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Canadian Institutes of Health Research (CIHR) toiminta-avustuksen JKM (MOP-64176). SMMH omistaa Kanadan Research Chair Viral Immunity ja Patogeneesi ja JKM oli vastaanottajaa New tutkija palkinnon CIHR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Superantigeenit (sAGS) ovat mikrobitoksiinien, jotka toimivat tehokkaina T-solujen aktivaattoreita ja ovat välittäjiä toksisen sokin oireyhtymä [1]. Nämä molekyylit toimivat sitoutumalla sivupinnat major histocompatibility class II (MHC-II) molekyylit [2] – [5], kun taas samanaikaisesti harjoittaa ituradan-koodattu alueiden vaihtelevan alueen T-solureseptorin (TCR) β-ketju ( Vp) [6] – [9]. Koska on olemassa -50 toiminnallisia Vp geenejä ihmisissä [10], [11], ja koska eri sags voi usein kohdistaa useisiin Vβs [12], nämä toksiinit stimuloivat hyvin suuri osa altistuu T-solujen johtaa vastaavasti vapauttaa pro- tulehduksellisten sytokiinien (esim IL-2, IFN-γ, ja TNF-α) [1]. Vaikka sags eivät tee MHC I molekyylien, nämä myrkyt eivät aktivoida sekä CD4

+ ja CD8

+ T-solujen [13], ja tämä voi myöhemmin johtaa sivullisten aktivointi apusoluja kuten NK-solujen [14]. Erityistapauksissa SAG voi myös aktivoida epäsovinnaisia ​​T solualaryhmiä kuten invariant luonnon tappaja-T (

i

NKT) soluihin [15] ja γδ T-solujen [16].

perimmäisenä tavoitteena syöpä immunoterapia on valjastaa immuunivälitteisiä mekanismeja kohdistaa ja hävittämiseksi syöpäsoluja. On ollut merkittäviä ponnisteluja suunnitella SAG-pohjainen immunotoksiineja, joka tunnetaan myös kasvain kohdistetut superantigeeneilla (TTS), jotta keinotekoisesti ”pakottaa” T-solut tunnistaa kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) ei-HLA-rajoitetusti. Alkuperäinen TTS edusti fuusio hiiren vasta-aineen fragmentti (Fab) kohdistaminen peräsuolen syövän antigeeni, villin tyypin stafylokokkienterotoksiinin A (SEA) SAG. Tässä uraauurtavaa työtä, Fab :: SEA TTS osoittanut huomattavaa vähentämistä kasvaintaakkaa ja kuolleisuus käyttäen B16 hiiren etäpesäke malli [17]. Myöhemmät tutkimukset käytetään fuusio hiiren Fab kohdistaa 5T4 onkofetaaliantigeenia kanssa mutatoitunut versio SEA (suunniteltu vähentämään MHC-II sitoutuminen) ja tämä johti ~95% vähennys kasvaimen massan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ( NSCLC) malli [18]. Lisäksi yhdistelmä hoitojen kanssa TTS ovat myös vaikuttaneet lupaavilta prekliinisissä yhdessä sytokiinien hoitojen (esim. IFN-α) [19] ja CTLA-4 [20]. Nämä ja muut tutkimukset ovat selvästi osoittaneet potentiaalia TTS syövän immunoterapiaa. Tästä huolimatta TTS on toistaiseksi rakennettu yksinomaan käyttämällä jäseniä SE luokan SAG, ja tautien ovat myös aineita stafylokokkien ruokamyrkytysepidemioiden sairaus, toimintaa, joka on ajateltu olevan riippumaton kyky aktivoida T-soluja [21]. Vaikka hallittavissa, jotkut sivuvaikutukset TTS faasin I ja faasin II kliinisissä kokeissa mukana pahoinvointi, oksentelu ja ripuli [22] – [24], ja on saattanut liittyviä emetic ominaisuuksia SEA [25]. Lisäksi monet potilaat oli ennestään vasta SEA johon vaaditaan yksilöllisiä TTS annostelu [26]. Jotta voitaisiin vähentää antigeenisyyttä TTS terapeuttisen anti-5T4-Fab liitetty suunniteltu SEA /SEE fuusio (kutsutaan Naptumomab estafenatox, ABR-217620) [27]. Tämä viimeisin TTS terapeuttinen on tehty vaiheen I kliinisen tutkimuksen monoterapiana potilailla, joilla on edennyt NSCLC, haimasyövän ja munuaissolukarsinooma (RCC), ja koska yhdistelmähoito Docetaxel potilailla, joilla on NSCLC, mikä osoittaa, että ABR-217620 oli hyvin siedetty joitakin todisteita tuumorin vastaista aktiivisuutta [24]. Varhainen informaatiota äskettäin valmistunut vaiheen II /III tutkimuksessa ABR-217620 potilailla, joilla on RCC verrattiin ABR-217620 ja interferoni-α, interferoni-α yksin, ei yltänyt primaarivasteen kokonaiselinaika; vaikuttaa kuitenkin siltä, ​​että monet potilaat olivat odotettua suurempi lähtötasolle anti-SEA /SEE vasta, mikä on saattanut vaikuttaa optimaalinen hoito [28].

Bakteerien genomista sekvensointia ponnisteluja viime vuosikymmenen aikana ovat nyt paljastaneet laaja ”perhe” SAG exotoxins sekä

Staphylococcus aureus

ja

Streptococcus pyogenes

. Yleinen piirre nämä toksiinit on, että geneettisesti erilaista sags ovat antigeenisesti erillisten, ja lisäksi erilliset sags myös tyypillisesti näyttää ainutlaatuinen Vp aktivointi profiilit [12]. Siten

S. aureus

ja

S. pyogenes

ovat antaneet runsaasti T solumitogeenejä joka voitaisiin muokata niin TTS syöpähoitoa varten. Nykyisessä työssä olemme pyrkineet laajentamaan ohjelmistoon TTS sisällyttää ensimmäiseen streptokokki SAG käyttäen streptokokki pyrogeeninen eksotoksiini C (Spec) kuin prototyyppi. Mahdollinen etu tekniikan streptokokkiperäinen SAG kuin TTS on, että nämä toksiinit puuttuu bona fide emetic toimintaa [29], mikä voi johtaa vähemmän sivuvaikutuksia. Myös Spec on hyvin tutkittu kannalta sekä rakenne [4], [30], [31] ja toiminta [9], [32] – [35] tarttumista varten isännän reseptorien, tarjoaa foorumin räätälöintiin toimintaan. Tässä osoitamme, että spec mutagenoiduista sisällä sinkki-riippuvaisen, suuren affiniteetin MHC-II sitova domeeni (Spec

D203A) on vähentänyt superantigenicity säilyttäen tuumorisidistä ominaisuuksia. Olemme tuottaneet spec

D203A-pohjainen TTS fuusioproteiini käyttämällä suunniteltu ihmisen scFv että kohdistuu erityisesti ihmisen 5T4 (scFv5T4). Vuonna humanisoitu hiirimallissa paksusuolensyöpä, osoitamme, että scFv5T4 :: SPEC

D203A TTS säätelee kasvun ja metastaattisen potentiaalin vakiintunut paksusuolensyöpä kasvain, ja että tämä antituumorivaikutuksen edellyttää sekä erityistä kohdennusta scFv5T4 osalla sekä Såg funktiona.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausuntoja

Kokeet käyttämällä ensisijaista ihmisen lymfosyyttejä tarkistettiin ja hyväksyttiin Länsi yliopiston tutkimuseettiseltä for Health Sciences Research Ottamalla ihmisen aiheet. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kaikilta verenluovuttajien. Kaikki eläinkokeet olivat mukaisesti Kanadan neuvoston Animal Care Guide to the Care ja eläinkokeisiin, ja protokolla hyväksyi Animal Käytä alivaliokunnan Western University (London, Ontario).

Vasta-aineet ja väriaineet

seuraavat monoklonaalisia vasta-aineita ja väriaineita käytettiin: PE anti-ihmisen CD4 (klooni RPA-T4; BD Pharmingen); AlexaFluor700 anti-humaani CD8 (klooni RPA-T8, BD Pharmingen); APC anti-ihmisen CD3 (Clone UCHT1; BD Pharmingen); CellTrace CFSE (karboksifluoreskeiini diasetaatti; Molecular Probes); 7-AAD (7-aminoactinomycin D; Molecular Probes); anti-ihmisen 5T4: lle (ab88091, Abcam); IgG2b isotyypin (eBioscience); FITC-anti-hiiri-IgG (eBioscience); strepativdin-IRDye800 (Rockland Immunochemicals); streptavidiini-FITC: tä (Rockland Immunochemicals).

Bakteerikannat

Escherichia coli

XL1-Blue (Stratagene) tai DH5a (Invitrogen) käytettiin kloonaamiseen tarkoituksiin ja

E. coli

BL21 (DE3) (Novagen), käytettiin proteiinin ilmentymisen isäntänä.

E. coli

kantoja kasvatettiin aerobisesti 37 ° C: ssa Luria-liemessä (LB), joka sisälsi kanamysiiniä (50 ug /ml), ampisilliinia (200 ug /ml) tai kloramfenikolia (10 ug /ml) säilyttää plasmidit.

kloonausmenetelmiin

plasmidikonstrukteja olivat joko aiemmin julkaistu [34], [35] tai tuottamat vakiintuneita kloonaustekniikoita [36], joko pET-41a (Novagen) tai pET-32a (Novagen) ja ovat yhteenveto taulukossa S1. Kaikki plasmidi insertit sekvensoitiin Robarts Research Institute Sequencing Facility (London, Ontario, Canada). Proteiinin ilmentyminen kloonia pET-32a tai pET-41a muutettiin siten, että enterokinaasin pilkkoutumiskohta (DDDDK ↓ X) korvattiin Tobacco Etch Virus (TEV) proteaasihajotuspaikan (ENLYFQ ↓ S). Transfektiovektorit pCMV6-XL5, pCMV6-XL5 :: 5T4 ja pEGFP-N1 hankittiin Origene Technologies, ja Clontech Laboratories, vastaavasti. Kaikki muut transfektion plasmidit syntyvät vakiintuneita kloonaustekniikoita. Hiiren scFv5T4 cDNA [37] sen recoded ja sitten valmistaa GenScript Inc. tuottaa humanisoitua järjestyksessä. Aminohapposubstituutioita tehtiin selkäranka sekvenssin scFv5T4 alkuperäisen hiiren scFv-sekvenssin, määritetään kohdistamalla kanssa ihmisen konsensussekvenssin. CDR-silmukat spesifinen 5T4 [37], ja välittömästi aminohapon reunustavat ennustettuja silmukoita ei muutettu säilyttää vasta-aineen spesifisyyden.

Proteiinin ekspressiota

Rekombinantti proteiinit tuotettiin käyttäen

E. coli

BL21 (DE3) ilmaisu, johon sisältyvät pBirACm plasmidin. Soluja kasvatettiin aerobisesti 37 ° C: ssa LB-alustassa, OD

600 = 0,5, ja proteiinin ilmentyminen indusoitiin yön yli (18-24 tuntia) huoneenlämpötilassa (RT) ja 0,2 mM isopropyyli-D-tiogalaktopyranosidia (IPTG; BioBasic Inc .) ja biotinyloitu lisäämällä 50 uM D-biotiini (BioBasic Inc.). Solut pelletoitiin 4 ° C: ssa ja suspendoitiin uudelleen kylmään 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl: a, joka sisälsi 0,25 mg /ml lysotsyymiä (Sigma-Aldrich) ja 0,02 mg /ml DNaasi I (Sigma-Aldrich). Soluja inkuboitiin jään päällä 1 h ennen lyysiä, joissa on jatkuva pää virtauksen solun haitta (Constant Systems Ltd) 25 psi: ssä, jota seurasi sonikointi, jossa lähtö 4, 1 pulssi /ml. Solujäänteet pelletoitiin 4 ° C: ssa 10000 x g. Supernatantit laitettiin ladattu Ni-NTA-affiniteettipylvääseen (Novagen) ja nousevalla pitoisuu- della imidatsolia eluoimiseksi käytettiin puhdistetun proteiinin. Puhdistetut fraktiot dialysoitiin 3 x 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCI, ja N-pään tunnisteet lohkaista autoinactivation kestävä His

7 :: TEV [38], kuten on kuvattu [39]. Pilkkoa proteiineja sovellettiin ja eluoitiin toisesta Ni-NTA affiniteettipylvästä poistamiseksi TEV-proteaasin ja saada puhdasta proteiinia. Proteiinit dialysoitiin 3 x 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCI ja 0,9% NaCl (suolaliuos) ja arvioitiin homogeenisuuteen SDS-PAGE: lla ja kvantitoitiin (BCA Protein Assay, Pierce).

solulinjat

Ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman solulinjoja (HT-29 ja WiDr) viljeltiin täydellisessä Dulbeccon Modified Eagle Medium (cDMEM, Gibco) ja HEK293-soluja viljeltiin täydellisessä Minimum Essential Media (cMEM, Gibco). Kaikki viljelyalustassa, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma-Aldrich), 10 mM HEPES, pH 7,4 (Gibco), 2 mM L-glutamiinia (Gibco), 1 mM natriumpyruvaattia (Gibco), 100 uM ei- välttämättömiä aminohappoja (Gibco), 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco), ja 100 U /ml penisilliiniä (Gibco).

scFv5T4 spesifisyysmittaukset

HEK293-solut (1 x 10

5) ympättiin 24-kuoppaisille levyille (Corning) 500 ul: cMEM ja annettiin kasvaa yön yli (24 h) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Liposome:DNA kompleksit muodostettiin käyttämällä Iipofectamine2000 (Invitrogen) ja plasmidi-DNA valinnan kohti valmistajan protokollaa. Kompleksit muodostettiin cMEM ilman FBS tai antibiootteja. Solujen transfektio tapahtui samalla median 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2, jonka jälkeen väliaine poistettiin ja korvattiin cMEM plasmidin ekspressio 24 tuntia. Kun ilmaistaan, scFv5T4 :: mRFP1 (1:100; 2 mg /ml), inkuboitiin solujen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen pestiin ja katsella fluoresenssimikroskopiaa käyttäen Olympus IX71 fluoresenssimikroskoopilla. Vaihtoehtoisesti, transfektoidut HEK293-solut (kuten edellä) tai HT-29-soluja (1,0 x 10

6) inkuboitiin 1 h mAb5T4 (1:200) tai scFv5T4-biotiini (1:100; 2 mg /ml), ja sen jälkeen anti-hiiri-IgG-FITC: llä (1:1000) tai streptavidiini-FITC: llä (1:1000), vastaavasti, 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa ja katsella fluoresenssimikroskopiaan tai FACS (BD FACSCanto II), vastaavasti. Mikroskopia kuvat otettiin käyttäen ImagePro Plus Software, ja FACS-analyysi valmistui käyttäen Flowjo Software.

Proliferaatiomääritykset

Ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) valmistettiin kokoverestä terveiden luovuttajien ja eristetään tiheyssentrifugoimalla Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences). Ihmisen lymfosyyttejä viljeltiin RPMI-1640 (Gibco), jossa 10% FBS ja täydennetään edellä (cRPMI). Kaikki kudosviljelmän soluja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. Ihmisen PBMC leimattiin CellTrace CFSE: llä (Molecular Probes) kohti valmistajan ohjeiden mukaan. Solut (0,8 x 10

6-1,0 x 10

6) viljeltiin cRPMI sisälsi 2 ug /ml polymyksiini B (ICN Biomedicals Inc.) ja käsiteltiin joko villityypin Spec (Spec

WT) tai variantteja spec

Y15A, spec

D203A tai spec

Y15A /D203A (1 ug /ml) ja inkuboitiin 5 päivää 37 ° C: ssa 5% CO

2. Sitten solut pestiin ja värjättiin anti-ihmis-CD3 (1:200), anti-ihmis-CD4 (1:200) ja anti-ihmis-CD8 (1:200) vasta-aineita 30 minuutin ajan jäissä ja analysoitiin FACS: llä (BD Canto II ), käyttäen FlowJo ohjelmistoa. Radioaktiivista proliferaatiomäärityksillä, ihmisen PBMC (2,0 x 10

5) viljeltiin cRPMI sisälsi 2 ug /ml polymyksiini B (ICN Biomedicals Inc.) kanssa titraamalla spec variantteja, scFv5T4, scFv5T4 :: Spec

D203A tai scFv5T4 :: spec

Y15A /D203A U-pohjaisen 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (BD Biosciences). Soluja inkuboitiin 72 tuntia ja sen jälkeen merkitty

3H-tymidiiniä (Perkin Elmer Inc.) 18 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solut kerättiin päälle lasikuitusuodattimet ja DNA-sisällytetty

3H-tymidiinin mitattiin beta tuikelaskimessa (Wallac 1450 Microbeta Counter).

Sytotoksisuusmääritykset

Kaksi määrityksiä käytettiin mittaamaan kykyä eri proteiinien indusoimaan PBMC:-välitteistä tappamista syöpäsoluja. Ensiksi,

in vitro

tappaminen arvioitiin viljellään yhdessä ihmisen PBMC joko WiDr soluja tai HT-29 suhteessa 10:01 ja titrataan sags lukien tekniset

WT, Spec

Y15A, spec

D203A tai spec

Y15A /D203A 48 tuntia. Solut leimattiin 7-AAD seuraten valmistajan protokollaa ja analysoitiin FACS: llä (BD Canto II). Käyttäen FlowJo ohjelmisto, WiDr tai HT-29-populaatiot saatiin erotettua, kun vertaamalla ihmisen PBMC-yksin näytteiden ja myöhemmin arvioidaan läsnä tai poissa 7-AAD. Toiseksi, ihmisen PBMC hoidettiin SAG scFv5T4 tai fuusioproteiinit kuten FACS määrityksessä 48 h U-pohjaisen mikrotiitterilevyn (BD Biosciences). Target HT-29-solut leimattiin (Na)

2

51CrO

4 (Perkin Elmer Inc.) in cRPMI. PBMC: t lisättiin effector:target solusuhteissa joko 01:01, 05:01 tai 10:01 vastaan ​​HT-29. Sytotoksisuus mitattiin 4-6 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa 5% CO

2 standardissa krominvapautusmäärityksestä mittaamalla

51Cr sisältö Viljelmäsupernatanttien käyttämällä gamma-laskuri (Wallac Wizard 1470 Automatic Counter). Yhteensä vapautumisen säädelty saatiin kohdesolut altistetaan 1% natriumdodekyylisulfaattia (EMD Millipore). Spesifinen hajoaminen laskettiin kaavalla:

arviointi kasvaintaakkaa ja etäpesäkkeitä

immuunivajaisiin NOD.Cg-Prkdc

scid Il2rgt

m1Wjl /SzJ (NSG) hiiriä kasvatetaan eläimessä este laitos, ja sijoitetaan steriileissä olosuhteissa ruokaa ja vettä mielin määrin. Joka perustuu aiemmin kehitetty protokolla [18], [40], 13-viikon ikäisiä hiiriä injektoitiin intraperitoneaalisesti 3 x 10

6 HT-29-soluja 0,2 ml: ssa vehikkeliä (PBS). Kolme viikkoa myöhemmin, kun kasvaimet olivat palpoitavissa, hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti joko pelkkää vehikkeliä (n = 3) tai 1 x 10

6 ihmisen PBMC: 0,2 ml: ssa vehikkeliä (n = 20). PBMC-hoidetut hiiret ryhmiteltiin (n = 4), jossa on satunnaislukugeneraattori saamaan joko scFv5T4 :: Spec

D203A, tai ohjaa Spec

D203A, scFv5T4, scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A, tai pelkkää vehikkeliä. Kaksi tuntia saatuaan PBMC, 2 uM /kg hoidon, valvonnan, tai pelkästä ruiskutettiin suonensisäisesti. Hiiret ilman PBMC saivat pelkkää kuljetinta. Suonensisäinen hoito injektiot annettiin päivittäin 7 päivän kuluessa. Sen jälkeen, kun 4 viikkoa, hiiret tapettiin ja kasvaimen kokonaistilavuus määritettiin. Hiiret tutkittiin visuaalisesti makrotason etäpesäkkeitä ja teki vastaavasti asteen perusteella alueellisten levisi kaukana primaarikasvaimen sivusto. Kaikki kasvaimet irrotettiin, koko- ja paino-mitataan sokkona.

Tilastollinen

Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä paritonta Student

t

testiä tai 2- tapa ANOVA Bonferronin monivertailukoetta (GraphPad Prism). Eroja pidettiin merkittävinä, kun p 0,05.

Tulokset

Generation of spec-pohjainen TTS

spec on voimakas ja hyvin tunnettu streptokokin SAG tiedetään kohdistaa ensisijaisesti Vβ2

+ ihmisen T-solujen [32], joka edustaa noin 7%: n noin 25 miljoonaa erillistä TCRiä [41]. Ennen työ osoittaa, että Tyr

15 on kriittinen tähteen tälle SAG sitoutua TCR [34], ja Asp

203 on tarpeen koordinoida sinkki-välitteisen suuren affiniteetin rajapinta β-ketjun MHC-II [4], [35], [42] (kuvio 1A). Todellakin, yksi Asp

203 → Ala mutaation Spec on osoitettu dramaattisesti vähentää myrkyllisyydestä tappavan malli toksinen shokki -oireyhtymä [42]. Ensin arvioitiin kyky villityypin Spec (Spec

WT), Spec

Y15A, Spec

D203A, ja SPEC

Y15A /D203A aktivoida ihmisen PBMC ja aiheuttaa PBMC-välitteistä tappamista syövän solut. Molemmat Spec

Y15A ja SPEC

D203A oli heikentynyt kykyä laajentua PBMC: t by -100-kertainen verrattuna spec

WT, ja spec

Y15A /D203A kaksinkertainen mutantti ei kyennyt indusoimaan PBMC leviämisen (kuvio 1 B). Seuraavaksi PBMC riippuva tappamista ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja WiDr- arvioitiin. Spec

Y15A aiheutti merkittävä väheneminen WiDr- sytotoksisuuden verrattuna spec

WT, ja molemmat spec

D203A ja SPEC

Y15A /D203A mutantit onnistunut indusoimaan WiDr- sytotoksisuus (kuvio 1 C). Olemme myös nuorten kykyä rekombinanttiproteiineja nimenomaan indusoida ihmisen CD3

+ CD4

+ ja CD3

+ CD8

+ T-solujen populaatioiden 1 ug /ml. Spec

WT ja kunkin yksittäisen mutantit kykenivät indusoimaan proliferaatiota sekä osajoukkoja, kun kaksinkertainen mutantti ei onnistunut indusoimaan proliferaatiota joko osajoukko (kuvio 1 D ja 1 E). Nämä tiedot osoittavat, että TCR ja MHC-II sitoutuminen ovat tärkeitä immunologisen soluvälitteinen tappaminen SPEC

WT, ja että SPEC

D203A voi olla sopiva mutantti vähentää tai estää systeemistä immuunisolujen aktivaation säilyttäen täyden sitoutuminen TCR.

A) Rakenteelliset katsaus spec monimutkainen TCR ja MHC-II. TCR Va ketju on väriltään oranssi, TCR Vp-ketjuun on väriltään harmaa, MHCα-ketjut ovat punaisia, MHCβ-ketjut ovat värillisiä vihreä, antigeeniset peptidit väriltään musta, ja sinkki atomi on värillinen magenta. Spec on värillinen sininen tärkeä rajapinta jäämiä Y15 ja D203 korostettu keltaisella. Kolmiosaisessa malli TCR-Määri- (MHC)

2 valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [9] ja nauhadiagrammi luotiin käyttäen PyMOL (https://www.pymol.org). B) leviämisen ihmisen PBMC välittämän SPEC

WT tai proteiineja sisältäviä mutatoitunut jäämiä Y15A (TCR-sitova mutantti), D203A (MHC-II-sitova mutantti) tai Y15A /D203A määritettiin otto

3H- tymidiini kuluttua 72 h stimulaation jälkeistä (n = 5 kolmena kappaleena; edustavan datan yhden yksilön). C) Annoksesta riippuvaa sytotoksisuutta 7-AAD

+ WiDr soluissa 48 tunnin kuluttua inkubaation ihmisen PBMC ja joko SPEC

WT, Spec

Y15A, Spec

D203A tai Spec

Y15A /D203A (n = 3-6 ryhmää kohden). (D-E) leviämisen CFSE leimatun ihmisen PBMC välittämä SPEC

WT tai proteiineja sisältäviä mutatoitu jäämiä määritettiin FACS viisi päivää stimulaation jälkeistä, erityisesti mittaamalla yhteensä CD3

+ T-solujen populaatio, CD3

+ CD4

+ T-solut ja CD3

+ CD8

+ T-soluja (n = 4; FACS edustavan datan yhden yksilön).

Tekniset ihmisen scFv5T4 kohdistuu erityisesti 5T4 kasvaimeen liittyvä antigeeni

jotta kehittää erityinen kohdistaminen mekanismi spec

D203A, me syntyy humanisoitu scFv perustuu komplementaarisuuden määräävät alueet (CDR: t) on ominaista hiiren scFv spesifinen ihmisen 5T4 TAA [37]. CDNA-sekvenssi oli suunniteltu sisällyttämään ”humanisoitu” selkäranka sekvenssi CDR: ien kanssa jäljellä spesifinen ihmisen 5T4: lle. Aminohapposubstituutiot määritettiin kohdistamalla aikaisemmin on kuvattu hiiren scFv5T4 10 ihmisen scFv-sekvenssien tuottamiseksi konsensussekvenssi. Tämä cDNA sekvenssi kodonioptimoitiin optimoitu

E. coli

ja syntetisoitu, ja myöhemmin käytettiin sukupolven useiden rekombinanttiproteiineja (taulukko S1).

ensin tutkittava spesifisyyden humanisoidun scFv5T4 sitoutumisesta ihmisen 5T4, The scFv5T4 cDNA muokattu sisältämään C-terminaalisen biotiinimerkkiaineen, tai geneettisesti fuusioitu monomeerisen punainen fluoresoiva proteiini 1 (mRFP1) [43]. Inkuboitaessa ihmisen HT-29-peräsuolen syövän solut tiedetään ilmentävän 5T4 [44], josta WiDr-solut ovat peräisin, [45], scFv5T4 sitoutunut näiden solujen pinnalla verrattain kaupallisen anti-ihmisen 5T4: lle mAb (kuvio 2A). HEK293-solut muokattu ekspressoimaan 5T4-antigeenin sitovat sekä mAb5T4 sekä scFv5T4 fragmentti, kuten on esitetty immunofluoresenssimikroskopialla, kun taas ohjata HEK293-solut, jotka sisältävät vain vektorin ei värjäytynyt joko vasta-aineella (kuvio 2B). scFv5T4 spesifisyys 5T4 määritettiin myös inkuboimalla scFv5T4 :: mRFP1 kanssa HEK293-solut transfektoitiin pEGFP-N1 :: 5T4, tai kontrollivektorilla pEGFP-N1. Mikroskooppinen analyysi GFP :: 5T4-ilmentäviä HEK293-soluja, osoitettiin, että scFv5T4 sitoutuu vain ne solut, jotka ekspressoivat 5T4 :: GFP fuusion, mutta ei kontrolloida transfektoiduissa soluissa (kuvio 2C). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että humanisoitu scFv5T4 voi sitoutua spesifisesti ihmisen 5T4.

A) Histogrammit osoittavat pinnan sitoutumisen mainituilla vasta-aineilla, joko kaupallista mAb5T4 tai tuottaa scFv5T4 (tyhjä käyrät), ja 5T4-TAA on kolorektaalisyöpä solulinjaa HT-29 mitattiin FACS. Varjostettu käyrät esittävät IgG2b isotyyppikontrollia (yläpaneeli) tai streptavidiini-FITC yksin (alapaneeli). B) visualisointi kaupallisten mAb5T4 tai scFv5T4 kohdentaminen HEK293-solut oli transfektoitu tyhjällä vektorilla (pCMV6-XL5) tai pCMV6-XL5 :: 5T4 fluoresenssimikroskopialla. Kuvat ovat otettu 400-kertaisella suurennuksella. C) visualisointi HEK293 transfektoitu pEGFP-N1 tai pEGFP-N1 :: 5T4 ja inkuboitiin scFv5T4 :: mRFP1. Sama näkökenttä otettiin valokuvia alla vaihekontrasti, ja vihreä ja punainen fluoresoiva suodattimet 100 x suurennus.

Generation of scFv5T4 :: Spec

D203A

Jotta tavoite spec 5T4, spec oli translaation fuusioitu scFv5T4 ja yhdistelmä scFv5T4 :: spec

D203A ilmennettiin

E. coli

BL21 (DE3) ja puhdistettiin (kuvio 3). Lisäksi, kontrollireagensseja syntyi lukien scFv5T4 yksin, ja ei-toiminnallinen fuusioproteiini, joka sisältää SPEC

Y15A /D203A, kukin kuten liukoisia proteiineja, jotka sisältävät C-terminaalisen biotiini tunnisteet (kuvio 3).

A) kaavamainen kuva edustaa komponentit syntyvän fuusioproteiinin konstrukteja. Proteiini koostuu syntyvän 5T4 kohdistetun humanisoidun yksiketjuinen vaihteleva fragmentteja, V

H ja V

L (harmaa palkki), geneettisesti fuusioitu streptokokki superantigeenista Spec (sininen palkki) joko sisältää alaniinia tähteessä D203 tai ylimääräinen alaniini tähteessä Y15. Kaikki konstruktit tuotetaan sisältävän C-terminaalisen biotiinimerkkiaineen. Puhdistettuja rekombinanttiproteiineja on esitetty SDS-PAGE (paneeli B), ja havaittiin Western blot -analyysillä streptavidiini-IRDye800 (paneeli C).

Ihmisen T-solujen lisääntymistä ja sytotoksisuutta aiheuttama scFv5T4: : sPEC

D203A

testattiin ensin scFv5T4 :: spec

D203A ja valvontaa proteiinien kyky lisääntyä aiheuttamaa ihmisen PBMC. scFv5T4 :: Spec

D203A indusoi annoksesta riippuvan proliferatiivinen vaste ihmisen lymfosyyttejä, jotka oli verrattavissa spec

D203A (kuvio 4A). Tärkeää on, että scFv5T4 vasta-ainefragmentin yksin ja kaksinkertainen mutantti fuusio (scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A) ei aiheuttanut merkittäviä proliferatiivisia vasteita. Tämä osoittaa, että spec

D203A osan fuusio on vastuussa indusoimaan PBMC-aktivaation. Immunoterapeuttinen aine arvioitiin sitten kyky välittää kasvainsolujen tappaminen ihmisen spec-reaktiivinen PBMC: t kahdessa kokeessa. Ensimmäinen, ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja WiDr käytettiin kohteena on 7-AAD-pohjainen tappamista määrityksessä. Tehokas soluntappokyky jälkeen havaittiin ihmisen PBMC stimuloitiin 200 nM agentti 48 tuntia, verrattuna villityypin spec ja stimuloimattomasta valvonta (kuva 4B). Toiseksi, HT-29-solujen merkitty

51Cr käytettiin kohteina. Tehokas solujen tappaminen havaittiin annoksesta riippuvalla tavalla, kun ihmisen PBMC: t stimuloitiin aineen 48 tuntia, ja sen jälkeen lisätään kasvainsoluihin yhä efektori-kohde (E:T) suhteet (kuvio 4C). Lisäksi yksittäinen mutantti fuusio (scFv5T4 :: Spec

D203A) oli tehokkaampi kuin samanlainen kaksinkertainen mutantti fuusio (scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A) tai vasta yksin, mutta väheni verrattuna Spec

WT. Nämä tiedot osoittavat, että scFv5T4 :: Spec

D203A on toiminnallinen indusoimiseksi immuunijärjestelmän soluvälitteisen syöpäsolun kuoleman ja että SPEC

D203A, scFv5T4, ja scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A proteiinit voivat toimia tarkka valvonta arvioimaan vaatimuksen kohdistamiseen ja SAG aktiviteetti

in vivo

.

A) spec proteiineja käytettiin vertaamaan scFv5T4 yksin, scFv5T4 :: spec

Y15A /D203A ja myöhemmin scFv5T4 :: spec

D203A vuonna ottoa

3H-tymidiinin mittana PBMC leviämisen kuluttua 4 vuorokauden inkuboinnin (n = 5). B-C) Annoksesta riippuvaa Spec-välitteistä PBMC sytotoksisuutta scFv5T4 :: Spec

D203A määritettiin vertaamalla spec valvontaa scFv5T4 yksin ja scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A kuluttua 48 h inkubaation käyttämällä FACS-analyysi WiDr (paneeli B), mittaamiseksi prosenttia syöpäsolun kuoleman kanssa 7AAD-syrjäytymisen värjäytymistä (n = 3) ja

51Cr-release mitata spesifisten sytotoksisten potentiaali (paneeli C), kun inkuboidaan yhä effector:target suhteet ja

51Cr-leimattuja HT-29 syöpäsoluja. Data esitetään (keskiarvo ± SEM) on neljästä itsenäistä ihmisluovuttajilta kukin tehdään kolmena kappaleena. * P 0,05, *** p 0,001 verrattuna aktiivinen spec

Y15A /D203A ohjaus proteiinia.

immunoterapia vakiintuneiden paksusuolensyöpä käyttäen scFv5T4 :: Spec

D203A

spec on spesifinen ihmisen Vβ2

+ T-soluja, mutta tämä SAG ei tunnista hiiren T-solujen [32]. Siten testaus spec-pohjainen TTS tarvitaan mallia hyödyntäen ihmisen lymfosyyteissä. Lisäksi ihmisen 5T4 kohdistaminen scFv on minimaalinen ristireaktiivisuutta hiiren 5T4 [37]. Näin ollen, ihmisen kasvainsoluissa, jotka ekspressoivat ihmisen 5T4: lle olivat välttämättömiä kokeiden. Perustuen aiemmin kehitetty malli [18], [40], käytimme immuunivajavuustila NOD-SCID IL2Rγ

– /- (NSG) hiirien engraftmentissa 5T4

+ ihmisen HT-29 ja peräsuolen adenokarsinooma soluissa. NSG hiirillä puuttuu T, B ja NK-solujen [46] ja edustaa optimaalinen Hiirikanta ihmisen kasvainten siirteen [47]. Lisäksi nämä hiiret sallivat selviytymisen siirretty ihmisen immuunisolujen [46], [48]. HT-29-soluja injektoida vatsakalvonsisäisesti NSG hiiriin ja kerran kiinteitä kasvaimia kouraantuntuva (3 viikon kuluttua injektio), hoito aloitettiin kanssa vatsaonteloon ihmisen PBMC, jonka jälkeen 8 päivittäinen intravenöösien scFv5T4 :: Spec

D203A (Kuva 5A). Ohjaus NSG hiiret eivät saaneet PBMC, tai vastaanotettu PBMC ilman lisäkäsittelyjä. Muita ryhmiä olivat scFv5T4 yksin, Spec

D203A yksin, tai aktiivinen scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A. Kasvaimen pinta-ala on seurattu jarrusatula mittaus koko kokeen ajan ja osoittanut juurikaan mitään kasvua kasvaimia scFv5T4 :: SPEC

D203A testiryhmässä kun kasvu havaittiin kaikissa muissa ryhmissä (kuvio 5B). Hiiret lopetettiin viikolla 8 kokeen ja tuumorit arvioitiin sokkona. Tämä koe osoitti, dramaattinen väheneminen kasvaimen kokonaistilavuus hoidon jälkeen scFv5T4 :: Spec

D203A, joka oli merkittävästi erilainen kuin hiirillä, jotka eivät saaneet PBMC, huijausta hoidetut hiiret (suolaliuos), ja hiiret käsiteltiin SPEC

D203A tai scFv5T4 :: spec

Y15A /D203A (kuvio 5C). Tärkeää on, että scFv5T4 :: SPEC

D203A hoitoryhmässä osoitettiin myös merkittävä väheneminen koko etäpesäkkeitä pisteet verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin (kuvio 5D ja 5E).