Krooninen sairaus

tiivistelmä

Esitämme tuloksia maailmanlaajuisen tutkimuksen säädeltyyn miRNA pariksi näytteitä normaali limakalvo ja kasvaimen kahdeksan potilasta, joilla peräsuolen syöpä. Vaikka on olemassa olevat tiedot miRNA panoksen peräsuolen kasvaimien syntyyn, nämä tutkimukset ovat tyypillisesti pienten ja keskisuurten tutkimukset solulinjoja tai ei-pariksi kasvainnäytteestä. Tämä tutkimus on tietääksemme ainutlaatuista kahdessa suhteessa. Ensinnäkin, normaali ja viereisen kasvain kudosnäytteitä ovat pareittain, jolloin otetaan huomioon lähtötason erot yksilöiden välillä testattaessa erilainen ekspressio. Toiseksi käytämme suurikapasiteettisten sekvensointi, jolloin laaja selvitys kaikista miRNA ilmaistu kudoksissa. Käytämme Illumina sekvensointitekniikan suorittamaan sekvensointi ja kaksi erilaista työkaluja tilastollisesti testi erot luku- määrä per geeni näytteiden välillä: särmäysautomaatin käytettäessä paria tiedot ja DESeq kun unohdetaan tämä tieto, eli hoitoon kasvain ja normaali näytteitä riippumattomien. Tunnistamme 37 miRNA jotka ovat merkittävästi väärin säädellystä molemmissa tilastollisista menetelmistä, 19 alassäädetty ja 18 sääteli. Jotkut näistä miRNA ovat aiemmin julkaistu mahdollisina sääntelyviranomaiset peräsuolen adenokarsinooman kuten miR-1, miR-96 ja miR-145. Kattava kartoitus ilmentyvät eri miRNA vahvistaakin joitakin nykyisiä havaintoja. Olemme myös löytäneet 16 säädeltyyn miRNA, joka meidän tietomme ei ole aiemmin liittynyt peräsuolen syövän synnyn: seuraavat merkittävästi alassäädetty miR-490-3p, -628-3p /-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p, -3656 ja säädelty miR-105, -549, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p, -4326. Vaikka tutkimuksessa on alustavasti kanssa vain kahdeksan potilaista, uskomme tulokset lisätä tämänhetkisen tietämyksen miRNA säätelyhäiriötä kolorektaalisyövän karsinogeneesissä. Sellaisenaan tulokset olisivat muodosta vankkaa koulutusta asetettu validointi mahdollisia biomarkkereita suuremmassa kohorttitutkimus. Lopuksi myös läsnä data tukee oletusta, että on eroja miRNA ilmaisun välillä adenokarsinomia ja neuroendokrii- paksusuoli-.

Citation: Hamfjord J, Stangeland AM, Hughes T, Skrede ML, Tveit KM, Ikdahl T , et ai. (2012) Differential ilmentäminen miRNA kolorektaalisyövässä: vertailu Paired Tuumorikudoksen ja vieressä Normaali Mucosa käyttäminen suuren tuotantotehon Sequencing. PLoS ONE 7 (4): e34150. doi: 10,1371 /journal.pone.0034150

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 06 syyskuu 2011; Hyväksytty: 23 helmikuu 2012; Julkaistu: 17 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Hamfjord et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Ulkopuolinen rahoitus saadut ”Ivar, Ragna og Morten Reiät legat til fremme av kreftforskningen i Norge” (Ivar, Ragna ja Morten Reikiä ”Foundation palvelemaan syöpätutkimukseen Norjassa). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi useimmin esiintyvien syöpien maailmanlaajuisesti [1]. Ennuste riippuu kasvaimen vaiheesta aikaan diagnoosin. On korkea keskittyä löytämisen ja validointi varhaisen havaitsemisen merkkiaineiden sekä ennakoivaan ja ennustetekijät kuin tarkastelleet Asghar

et al

. [2]. Molekyyli synty CRC on yksi parhaiten kuvattu kaikista ihmisen syövistä. Vogelsteinin malli [3] on vuosien varrella muutettu ja laajennettu, esimerkkinä Slabý

et al

. [4].

MikroRNA (Mirs) ovat pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylien 18-25 nukleotidin pituisia, ensin löydettiin 1990-luvun alussa

C. elegans

[5]. He väittävät homeostaasin muuttamalla geenien ilmentyminen erilaisissa solun prosesseja, kuten erilaistumista, lisääntymistä, eloonjääntiä ja apoptoosin [6]. On arvioitu, että yli 10% kaikista koodaavan ihmisen geenejä voidaan säädellä näiden mekanismien [7]. Uusin määrä ihmisen Mirs kirjattu miRBase ylittää tuhat [8], ja lisääntyvä käyttö suurikapasiteettisten sekvensointi ajaa edelleen löytö. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että MIRS voidaan väärin säädellystä eri ihmisen syöpiä, ja näin ollen toimivat tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [9], [10]. Nämä molekyylit ovat mielenkiintoisia, sillä ne voivat olla mahdollisia biomarkkereita diagnoosi tai prognoosi ja toimia mahdollisina kohteina syövän erityisiä terapiassa tarkastelleet Cho

et al

. [11], [12]. Lopullisena tavoitteena olisi henkilökohtaisen lääketieteen genotyypin-fenotyypin syöpä verkkojen suunnitelmasta kliinisiä päätöksiä [13].

Useat tutkimukset ovat keskittyneet miR ilmentymisen profilointi kolorektaalisyövässä. Useimmat näistä tutkimuksista ovat analysoineet pienempi määrä MIRS käyttäen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) tai hybridisaatioon perustuva tekniikka, osittain solulinjoja tai ei-pariksi potilaan kudoksissa [14], [15], [16], [17 ], [18]. Vain muutama tutkimukset ovat maailmanlaajuisemmin sekvensoitiin MIRS suuremmassa mittakaavassa ilmaisun profiilin, kuten tutkimus melanooma [19] ja peräsuolen [20] microRNAome. Viimeksi mainittu tutkimus oli ainutlaatuinen lajissaan ja esittänyt joukon uusia otaksuttu Mirs käyttämällä kokeellista lähestymistapaa nimeltään kangastus. Koska tämä tutkimus on peräisin usean vuoden ajan, vain osa kypsä Mirs tunnetaan nykyään aktiivisesti tutkittu.

Global ilmaus Mirs on perinteisesti arvioitu käyttäen hybridisaatiota perustuu array tekniikoita. Nämä taulukot perustuvat sekvenssiin hybridisaation jälkeen merkintä, jossa on fluoresoivaa väriainetta. Fluoresenssi-intensiteetti on tallennettu ja heijastaa ilmaisu tietyn geenin. Käyttämällä useita väriaineita, ero fluoresenssin voidaan käyttää indeksinä geenin ilmentymisen. Suurikapasiteettisten sekvensointi, toisaalta, käyttää näyte selostukset lähtö- malliin. Suora sekvensointi suoritetaan sitten useita reaktioita käyttäen fluoroforin terminaattori nukleotidia. Sequence lukee kuvataan sitten takaisin viite genomiin tai tietokanta selostukset ja määrä järjestyksessä lukee kartoituksen takaisin tietyn transkriptin mittaa geenin ilmentymisen. Yleisessä tapauksessa mRNA: n, tämän määrä on normalisoitu pituus transkriptin ja kokonaismäärä lukee tuotettu näytteen. Kun kyseessä on miR, normalisointi transkriptio pituutta ei tarvita, koska lukee kattaa täyspitkän transkriptin. Erilainen ekspressio mitataan sitten ero normalisoidaan laskee tietyn geenin. Tuoreessa julkaisu vertaa ero geeniekspression

D. pseudoobscura

käytettäessä array teknologian ja korkean suoritustehon sekvensoinnin. Valtaosa ilmentymisen tasot ovat samankaltaisia ​​menetelmiä kanssa vertailukelpoisen suorituskyvyn [21]. Samanlainen tutkimus

S. cerevisiae

on osoittanut, että menetelmät ovat yhtä mieltä melko hyvin geenien keskipitkän ilmentymisen määrät mutta korrelaatio on hyvin alhainen geenejä joko alhaisen tai korkean ekspressiotasot. Tämä johtuu osaltaan suuresti kasvanut dynaaminen alue kvantifiointiin geeniekspression toimittamien suurikapasiteettisten sekvensointi menetelmä [22]. Suurikapasiteettinen sekvensointia lisäksi katsotaan ylivoimainen käsiteltäessä rakennetta ja dynamiikkaa transcriptome. Esimerkkejä tästä ovat ilmaus tuntematon kohdesekvenssien, RNA muokkaus tapahtumia ja muita RNA-sekvenssin variaatiot kuten polymorfismien [21], [22], [23].

Koska nämä ominaisuudet suurikapasiteettisten sekvensointi viittaavat siihen, että on erinomainen menetelmä maailmanlaajuisen tutkimuksia pieniä RNA: iden, me mukana kahdeksan potilasta, joilla peräsuolen syöpä joille resektioleikkaukselle paksusuolen tutkimiseen kasvain erityisiä muutoksia miR ilmaisun käyttäen Illumina suuren läpimenon sekvensointitekniikan. Kudokset normaalin limakalvon ja kasvainten kerättiin kirurgisista näytteistä kaikille potilaille, joten saadaan ainutlaatuisia pariksi näytteitä. Analyysimme sekvenssin aineistojen tuotimme näistä näytteistä voimme tunnistaa MIRS jotka eivät ole aiemmin todettu liittyvän peräsuolen adenokarsinooman. Olemme myös tunnistaneet eroja miR ilmaisun välillä adenokarsinomia ja neuroendokriinikasvain paksusuolen. Nämä tulokset lisäävät nykyisen tietämyksen miR säätelyhäiriötä peräsuolen syövän syntymistä.

Tulokset

Kahdeksan potilasta valittiin satunnaisesti mukaan sukupuolivaatimukset (miehillä vain) päässä kolorektaalisyövän kohortti. Kokonais-RNA kasvainkudoksessa ja viereisen normaali limakalvo uutettiin. Alustavissa analyysi ero ilmaisun välillä kasvaimen ja vierekkäisten normaali limakalvo, yksi pari osoitti ekspressiomalli eroaa muusta paria. Histopatologia tarkasteli patologi (taulukko 1), ja oli ilmeistä, että yksi potilas oli luokiteltu väärin elätellen epätyypillinen neuroendokriinikasvain (NET), kun taas loput adenokarsinooman. Kaikki tulevat tilastolliset analyysit käsitelty potilaan kanssa NET yhtenä erillisenä asian muut potilaat. Prosenttiosuudet kasvainsolujen ja strooman komponentit arvioidaan myös hematoksyliinillä ja eosiini värjätään osastoja primäärikasvain, joka osoittaa, että seitsemän kahdeksan näytettä kanna yli 60% tuumorisoluja vastaan ​​(taulukko 1).

16 näytteet onnistuneesti sekvensoitiin käyttämällä Illumina Genome Analyzer II (Illumina, CA, USA) ja käsiteltiin käyttäen miRanalyzer [24], jossa on keskimäärin 562 kypsä MIRS kartoitettu miRBase per sekvensointi kokeessa, kun sallivat yksi yhteensopimattomuus nukleotidin (kuvio 1 B). Noin 80% sekvensointi lukee kartoitettiin kypsyä ihmisen MIRS in miRBase (release 16) seitsemäntoista kahdeksantoista sekvensoinnin kulkee, loput lukee enimmäkseen kartta muihin osiin transcriptome. Viime näytteen (normaali kudos N7) oli huomattavasti pienempi osuus lukee kyseisen kartan miRBase (37,2% kokonaismäärästä lukee) (kuvio 1A). Tämä saattaa johtua teknisistä kysymyksistä näytteen valmistuksen aikana. Lisäksi muutama sata otaksuttu uusia miR sekvenssit ja geenilokusten viite- genomin (HSA hg18) ennustettiin sekvensointi kulkee. Nämä otaksuttu sekvenssit määrä on pieni osa kaikista lukea määrä (tuloksia ei ole esitetty).

Paneeli A prosenttiosuus sekvensointi lukee kartoitettu kypsyä MIRS (musta) koko lukee koetta kohti. Paneeli B määrässä kypsiä Mirs tunnistettiin sekvensoimalla koetta. Kokonaismäärä valmiin ihmisen Mirs in miRBase vapauttamaan 16 (n = 1212) on sisällytetty viitteenä.

Differential lauseke (DE) tunnistettujen Mirs peräisin miRBase laskettiin kaksi bioinformatiikan välineitä, DESeq [25 ] ja Edger [26]. Edger toteuttaa toimintoja suorittaa sekä pariksi ja ei-pariksi testien (pari tiedot ohitetaan, ja normaali ja kasvaimen käsitellä näytteet itsenäisinä ryhmät), kun taas DESeq voi suorittaa pariksi testejä, mutta hyötyy tilastollisia tarkennuksia suhteessa reunamäärittäjää. Hoitoon normaalin ja kasvaimen näytteitä kahdesta riippumattomasta on teoreettisesti ennustettu olevan enemmän konservatiivinen testi sillä toisin kuin parina testi, se ei selitä lähtötason erot potilaiden. Käyttämällä molempia menetelmiä, saamme kaksi merkittävästi eri tavoin ilmaistuna Mirs. Leikkauspiste näiden kahden on hyvin konservatiivinen ennusteen merkittävästi väärin säädellystä Mirs. Lisäksi pystyimme tarkkailemaan, missä määrin ei-pariksi testaus on enemmän konservatiivinen kuin pariksi. Ensimmäisen taitoksen muutos tunnettuja MIRS analysoitiin ryhmien välillä adenokarsinooma (n = 7) ja normaali limakalvo (n = 8), sen jälkeen välillä neuroendokriinisten tapauksessa (n = 1) ja normaali limakalvo (n = 8) käyttäen DESeq (kuviot 2A ja 2C). Kun tarkastellaan adenokarsinoomista ryhmänä ja käyttäen Benjamini ja Hochberg säätö [27] useiden testaus (FDR 0,1), yhteensä 52 Mirs merkittävästi säädeltyyn verrattuna normaalin limakalvon: 28 oli alassäädetty ja 24 sääteli (taulukko S1). Neuroendokriinivasteen tapauksessa kuitenkin osoitti yhteensä 38 Mirs merkittävästi väärin säädellystä verrattuna normaaliin limakalvon ryhmä, kaikki säädelty (taulukko S2). Mielenkiintoista on, että vain 6 MIRS ovat edustettuina sekä histopatologisia ryhmään: miR-7, -96, -204, -1269, -1827 ja -3177. Tässä analyysissä on siis yhteensä 46 ja 32 MIRS jotka näyttävät hieman ominaisia ​​adenokarsinooma ja neuroendocrine histopatologia, vastaavasti.

Kaaviokuva tilastollista lähestymistapaa. Kentät A ja C esittävät etenevää ei-pariksi tilastoja ja DESeq työkalu. Paneeli B esittää lähestymistapaa käyttäen pariksi tilastoja ja särmäysautomaatin työkalu. Katso Tekstin lisätietoja.

Koska meillä tutkivat pariksi näytteitä kasvain ja normaali limakalvon kudos samasta potilaat, myös suoritettu koe seitsemästä adenokarsinooma tapauksissa käyttää pariksi tilastojen särmäysautomaatin (kuvio 2B ). Kaikkiaan 118 Mirs havaittiin merkittävästi väärin säädellystä samoissa olosuhteissa kuin ei-pariksi analyysi (taulukko S3). Näistä oli 81 MIRS, joita ei tunnistettu ei-pariksi analyysi, ja yhteinen päällekkäisiä 37 molemmat lähestymistavat. Tämä vahvistaa ennustus, että ei-pariksi analyysi on enemmän konservatiivinen testi, vaikka on 15 MIRS tunnistettu väärin säädellystä on DESeq ei-pariksi testiä, joita ei tunnistetaan pariksi analyysi särmäysautomaatin (kuva 3).

on ilmeistä, että on olemassa 37 yhteisiä MIRS havaittu merkittävästi väärin säädellystä käytettäessä molempia tilastollisia lähestymistapoja (taulukko 2). On suunnilleen sama jakautuminen alas- ja ylöspäin säädelty Mirs. On sekä nöyrä (noin 10-10 000 absoluuttinen lukee) ja erittäin (noin 10 000-5 000 000 absoluuttinen lukee) ilmaistuna Mirs edustettuina yhteisessä miR osajoukko, kaksi merkittäviä esimerkkejä ovat miR-7 ja miR-1, tässä järjestyksessä. Tarkasteltaessa ekspressiotasot maailmanlaajuisesti kannalta kaikki tunnistetut Mirs, on maailmanlaajuinen ylössäätöä ilmaisun kasvain verrattuna normaalin limakalvon (pohdittu pariksi analyysin adenokarsinoomien).

suurikapasiteettisten sekvensointi kokeellisesti validoitu käyttämällä kvantitatiivista polymeraasiketjureaktio valituille MIRS ja kudosnäytteiden (kuva S1). Tuloksemme ovat linjassa aiempien välisten platform vahvistustulokset [28]: tulokset eri menetelmillä korreloivat, mutta tämä korrelaatio on kaukana täydellisestä.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat havainneet, että Mirs ovat globaalisti alassäädetty eri syöpiä, joiden korrelaatio erottelua ja globaalin ekspressiotasot Mirs. Vaikka on osoitettu, että maailmanlaajuinen alassäätöä edistää solujen transformaatio ja kasvaimen kehittymisen [10], [15], [29], suuri ilmaus profilointi tutkimus kiinteiden kasvainten Volinia

et al

. ei ole noudattanut alas-säätely Mirs aiemmin raportoidun [30]. Tutkimuksemme osoittaa, että globaali alassäätöä ei asianlaita peräsuolen adenokarsinooman meidän kohortin vaikka huomattava määrä erillisiä Mirs ovat alaspäin säännellään adenokarsinoomat suhteessa tavanomaiseen näytteitä.

mukaan miRecords tietokanta [31], miR-1 on 117 validoitu tavoitteet ja saattavat vuorovaikutuksessa useita tärkeitä geenejä syövän synnyssä kolorektaalisyövän. Eräässä tutkimuksessa 2009, miR-1 ja miR-551b (muun muassa), havaittiin olevan matalampi ilmentymisen alkion kantasoluja suhteessa erilaistuneiden solujen ja peräsuolen syövän suhteessa normaaliin limakalvoon [17]. Tämä on johdonmukainen havaintojen alassäädetty miR-1 ja miR-551b on peräsuolen adenokarsinoomat. Alassäädetty miR-1 havaitaan myös neuroendokriinivasteen tapauksessa. miR-1 on lisäksi raportoitu olevan alas-säänneltyä ja ehdotti kasvaimen tukahduttava toiminto kohdistamalla transgelin 2-geenin (

TAGLN2

) virtsarakon syöpä [32] sekä pään ja kaulan okasolusyöpää [33] .

miR-145 on alaspäin säännellään adenocarcenomas Tutkimuksemme, ja tämä miR on usein liittynyt down-asetuksen kolorektaalisyövissä [16], [34], [35], [36] . Se uskotaan olevan kasvaimeen vaimennin rooli, osittain kohdistamalla insuliinin reseptori substraatti 1 (ISR-1) ja tyyppi I insuliinin kaltainen kasvutekijä-reseptori (IGF-IR). Menetys miR 145 esto lisääntyy antiapoptooppinen signaalit solussa ja edistää solujen kasvua [37], [38].

tutkielma 2010 miR-195 todettiin olevan säädellä vähentävästi 81 peräsuolen syöpä kudoksiin verrattuna vastaaviin normaaleihin limakalvolle ja tämän mukaisesti meidän tulokset adenokarsinooman. Tämä miR uskotaan kohdistaa Bcl-2 ja siten käyttää sen pro-apoptoottisen funktion kun fysiologisesti säännellään [39]. Toinen tutkimus osoitti, että alentunut ilmentyminen miR-195 esiintyi useammin potilailla, joilla imusolmuke etäpesäke ja kehittynyt kasvain vaiheessa. Alhainen ekspressiotasot olivat myös huono ennustajia kokonaiselinaika [40].

Kahdessa sivuaineopinnot, yksi paksusuolen syövän ilman imusolmuke etäpesäke [41] ja toinen mahasyövän [31], miR-378 oli todettu alassäädetty kasvaimissa verrattuna normaaliin viereiseen kudokseen katsottuna tutkimuksessamme. On kuitenkin raportoitu, että miR-378 edistää solujen eloonjäämistä ja kasvaimen kasvua kohdentamalla Sufu ja Fus-1 [42], ja se voi myös olla muuttavan rooli muiden MIRS angiogeneesissä [43]. On lisäksi näyttöä siitä, että Myc /miR-378 /TOB2 /sykliini D1 toiminnallinen moduuli säätelee onkogeenisen transformaatio [44].

miR-383 on myös alas-säädellä adenokarsinoomat verrattuna normaaliin kudokseen. Tietääksemme tämä ei ole raportoitu ja peräsuolen adenokarsinoomat, mutta on havaittu pienessä tutkimuksessa mahasyövän [45]. On hyvä vastaavuutta välillä havaintojen alassäädetty MIRS peräsuolen adenokarsinooman ja aiemmin julkaistu raportteja. Sekä Mirs edellä kuvatun tunnistimme huomattava määrä muita yhtenäisesti alassäädetty Mirs, vähemmän viitataan kirjallisuudessa; -139-5p, -363, -422a, -486-5p, -490-3p, -628-3p, -628-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p ja -3656 (taulukko 2 ). Tämä korostaa potentiaali suurikapasiteettisten sekvensointi välineenä tunnistaa MIRS mahdollisesti liittyvät syövän synnyn, joka olisi voitu jäänyt käyttäen array perustuvaa tekniikkaa.

miR-7 on toiminnallinen rooli erilaistumista epiteelisolujen suolistossa , tarkistaa Tazawa

et al

. [46]. Sen ajatellaan säätelemään transmembraanisen glykoproteiinin CD98, joka on tärkeä rooli solun tarttumiseen vuorovaikutuksen kautta integriinin beeta-1. Up-regulation miR-7 estää CD98 ilmentymistä Caco2-BBE soluihin ja siten moduloi beeta-1-integriini-laminiini-1 vuorovaikutusta. Tämä voi lisäksi vaikuttaa lisääntymistä ja erilaistumista enterosyyttien aikana siirtymät krypta-nukkalisäke akselilla [47]. miR-7 on raportoitu toimia kasvaimen vaimentimen schwannoomat [48], mutta kuten onkogeenin keuhkojen okasolusyöpää [49]. On saatu näyttöä siitä, että lisääntynyt EGFR on liitetty suurentunut miR-7 tasolla, ainakin okasolusyöpää. MIR-7 puolestaan ​​suunnattu Ets2 repressori tekijä (ERF), vaimentaa EGFR ja moduloi solujen kasvua [49]. Näin ollen on mahdollista, että miR-7 voivat toimia useissa palautetta ja feedforward silmukoita, sekä kasvaimen-vaimennin ja onkogeenin riippuen kasvaimen tyypistä. Meidän tulokset viittaavat vahvasti siihen, että miR-7 on säädelty sekä peräsuolen adenokarsinoomia ja neuroendokriinivasteen tapauksessa. Perustuen aiempien havaintojen ja julkaistu validoitu tavoitteet miR-7 kuten

EGFR

,

PAK1

,

RAF1, insuliinireseptorisubstraatti 1/2

ja

CD98

[ ,,,0],31], on kohtuullista oletuksen, että tämä miR voi olla osallisena säätelyssä solunsisäinen signalointi, kasvua ja erilaistumista kolorektaalisyövissä.

ilmauksia miR-96, miR-135b ja miR-493 korotettiin useilla tutkimuksia peräsuolen syövän sekä tutkimuksessamme [14], [17], [50]. miR-135: n on osoitettu suoraan kohdistaa 3 ’UTR:

APC

ja indusoivat alavirtaan Wnt-reitin [51]. Tuloksemme osoittavat myös, että miR-552 ja -592 ilmaisuja on korotettu adenokarsinoomat verrattuna normaaleihin kudoksiin. Aiemmin julkaistut tiedot näiden kahden MIRS osoitti ylössäätöä peräsuolen syöpiä taitava mismatch korjaus tila (MMR), mutta alassäätöä MMR puutteellinen kasvaimissa suhteessa normaaliin paksusuolikudos [17]. Yoon

et al

havaittu, että miR-296 vuorovaikutuksessa 3 ’UTR

CDKN1A

(p21 /WAF1) geenin, ja että tämä miR oli usein säädelty aikana kuolemattomaksi ihmissolutyypin [52]. Kiinnostavaa kyllä, myös tarkkailla ylös-säätely miR-296-3p. Tämä miR voisi sellaisenaan edistää syövän syntymistä estämällä p53-p21 /WAF1 reitin.

Ei ole monta julkaisuja toiminta miR-549 (CHR 15 in

KIAA1199

), ja tietomme kukaan suhteessa peräsuolen syöpä. Mielenkiintoista on, että geeni transcribing tämän miR on lokalisoitu

KIAA1199

geenin. Tämä geeni on epävarma toiminta on aiemmin raportoitu olevan vahvasti säädellään ylöspäin peräsuolen adenoomien (n = 32) ja karsinoomia (n = 25) analysoitiin tutkimuksessa Sabates-Bellver

et al

. Tutkimus osoittaa myös, että ilmaus 19 Wnt tavoitteista oli tiiviisti korreloi säätely ylöspäin

KIAA1199

, ja että ilmaisu normaalissa limakalvo rajoittui soluihin alaosaan paksusuolen kryptissa [53], [ ,,,0],54]. Yli-ilmentyminen

KIAA1199

on myöhemmin vahvistettu paksusuolen adenoomia [55] ja mahasyövän [56]. Jos

KIAA1199

ja miR-549 ovat yhdessä puhtaaksi, tämä saattaa selittää lisääntynyt ekspressiotasot miR-549 löytyi tutkimuksessamme. Lisäksi, kuten ylössäätöä näyttää olevan varhainen tapahtuma aikaisemmin julkaistuista tutkimuksista, MIR-549 saattaa olla korvike biomarkkeri adenooma kehityksen ja varhaisen adenokarsinooma vaiheissa. Tämä tulisi tutkia tarkemmin suuremmissa tutkimuksissa.

Tutkimus epigeneettiseltä vaiennettu MIRS peräsuolen syöpä todettiin, että miR-1247 oli metyloitavaa HCT116-soluissa. HCT116 ja DLD1 solut transfektoitu miR-1247 matkivat joka johti merkittävään vähentää solujen kasvun ja aineenvaihdunnan aktiivisuutta molemmissa solulinjoissa. DKO soluja (HCT 116 solua poistettu DNA metyylitransferaasi) ei kuitenkaan ole vähentää solujen kasvua, kun esiteltiin matkia, mutta aiheutti heikentynyt solujen vaeltamiseen [57]. Rooli tämän miR edelleen epäselvä, mutta on oletettu toimivan tuumorisuppressorina. Löysimme tämän miR olevan ajan säännellä adenokarsinoomat, joka voisi osoittaa erilaisia ​​tavoitteita puhtaan solulinjoissa verrattuna järjestäytyneen kasvainkudoksen.

Lopuksi on vähän, jos lainkaan, raportteja toiminto ja rooli paksusuolen adenokarsinooman seuraavista Mirs säädelty tutkimuksessamme: -105, -483-3p, -584, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p ja -4326 (taulukko 2).

kuten sisältyi neuroendokriinikasvain (NET) tässä tutkimuksessa, voisimme hyödyntää analysoida tämän erikseen käyttäen samanlaista tilastollista lähestymistapaa kuin adenokarsinooman. Vaikka pyrimme osittain ilman rinnakkaista, The DESeq työkalu voi hoitaa tämän haasteen [25]. NETit ovat harvinaisia ​​kasvaimia, jotka ovat peräisin neuroendokriinisoluissa eri kohtiin kehossa, mukaan lukien maha-sivustolla. On olemassa kasvava esiintyvyys, mikä johtuu osittain rekisteröinnin parantaminen ja mahdollisesti parempia diagnostisia työkaluja [58]. Kuitenkin vain harvat tutkimukset ovat tutkineet miR ilmaisun NET. Tutkimuksessamme NET osakkeita muutamia merkittäviä Mirs kanssa adenokarsinoomat, mutta mitä enemmän silmiinpistävää on joitakin ainutlaatuisia ja erittäin ilmaisi MIRS (taulukko S2). Näillä on suuret kertainen muutoksia verrattuna ei-pariksi normaaleissa kudoksissa, ja myös suurempi suhteellinen ilmentyminen verrattuna adenokarsinoomat. Ekspressiokuviota Mirs NET poikkeaa laajasti normaalista limakalvolla. Tämä voi tietenkin olla osittain neuroendokriinivasteen itse kudoksesta, joka on toiminnallisesti ja geneettisesti erilainen normaaliepiteelissä ja strooman. Kuitenkin tunnistettu Mirs saattavat auttaa erottamaan pahanlaatuisten neuroendokriinisoluissa paksusuolen ja normaali limakalvo (kuten meidän tiedot osoittavat) ja mahdollisesti myös välillä hyvänlaatuinen neuroendokriinisoluissa ja normaali limakalvo (ei tietoja). Näytteen koon yksi tarkoittaa, että NET data voidaan pitää vain ohjeellinen. Kuitenkin mielestämme huomattavat erot sarjaa säädellään eri tavalla Mirs kahden syöpien syytä raportoitu. Meidän havainto viittaa siihen, että se voi olla hedelmällistä tutkia tarkemmin näitä miR markkereita, koska ne voivat olla käyttökelpoisia alkuperää määritettäessä on huonosti eriytetty peräsuolen syöpiä.

mikrodissektion kasvainkudoksen ei ole standardin tutkimuksissa aiemmin tehty. Olemme kuitenkin tutkineet histopatologia kudosnäytteet, ja arvioitu kasvain ja strooman prosenttiosuudet. Kasvain prosenttiosuus oli noin 67% vuonna keskimäärin selvästi yli keskiarvon alaryhmä KAM kohortin (n = 139), joka oli 49% +/- 24% (data ei julkaistu). Valitettavasti yksi näyte aineisto oli poikkeava alhaisella kasvaimen prosentuaalinen (taulukko 1), ja tämä on heikkous tutkimuksemme. Ihannetapauksessa tutkimuksessa näytteet olisi ollut homogeenisempi kasvain väestöstä. On kuitenkin käsitys, että normaali limakalvo koostuu pääasiassa epiteelisolujen ja strooman. Kun verrataan kasvainkudoksen ja normaalin limakalvon, olemme pääasiassa vertaamalla kasvainsoluja (vaihteleva määrä strooman) ja epiteelisolujen ja strooman normaalissa limakalvolla. Sinänsä uskomme vaikutus liian pieni kasvain prosenttiosuus on vääriä negatiivisia tuloksia.

suurikapasiteettisten kokeita (joko array tai sekvensointi pohjainen), on tavallista suorittaa validointimenettelyssä käyttäen toista tekniikkaa. Suoritimme niin validointimenettelyssä kvantitatiivisena polymeraasiketjureaktio valituille MIRS ja kudosnäytteiden (kuva S1). Tulokset osoittavat positiivista korrelaatiota kaksi eri teknologia-alustat. On seitsemän Mirs joille taitteen muutokset ovat hyvin erilaisia ​​validointi. Tällaiset erot kertaluokkamuutos välillä teknologiayhteisöt eivät ole epätavallisia osoituksena tutkimus ero miR ilmaisun käyttäen Affymetrix, Agilent, ja Illumina microarray alustoille, sekä kvantitatiivinen PCR ja suuren suorituskyvyn sekvensointi [28]. Vaikka huolta, tämä havainto ei mitätöi saadut tulokset. Itse asiassa on havaittu, että menetelmiä miR geeniekspressioprofilointi voimakkaasti painotettu tiettyjen Mirs, estää tarkka määrittäminen absoluuttinen määrä. Havaittu bias voimakkaasti määritettiin menetelmällä, jota käytetään kirjaston valmistelua. Kuitenkin, koska harhat ovat järjestelmällisiä ja hyvin toistettavissa tietyn tekniikan, geeniekspressioprofilointi sopii määrittämiseksi suhteellinen ekspressio eroja näytteiden välillä, niin kauan kuin samaa tekniikkaa käytetään koko näytteet [23]. Tutkimuksessamme johtuen suuria määriä cDNA tarvitaan suurikapasiteettisten Sekvensointianalyysin meillä ei ollut riittäviä cDNA käytettävissä kvantitatiivinen PCR validointi kaikille potilaille. Siksi oli tehtävä toisen kierroksen RNA viereisten kudosten jos saatavilla. Mahdolliset heterogeenisyys vierekkäisten kudosten voi lisätä erot olivat validointitiedot (kuva S1).

Tämä tutkimus on tietääksemme ainutlaatuista, että globaali suurikapasiteettisten sekvensointi on käytetty kuvaamaan miR ilmaisun pariksi peräsuolen syövän kudoksen ja vieressä normaali limakalvo. Vaikka alustava, uskomme, että tulokset voivat olla vankka koulutus asettaa suuremman kohorttitutkimus. Hyödynsimme pariksi ja ei-pariksi tilastoja, ja tunnistettiin 37 MIRS jotka väärin säädellystä seitsemällä adenokarsinooma tapauksissa niin tilastollisia lähestymistapoja; 19 alassäädetty ja 18 sääteli. Kattava kartoitus differentiaalisesti ilmaisi Mirs vahvistaa joitakin nykyisiä havaintoja. Olemme myös löytäneet 16 säädeltyyn Mirs joka tietojemme mukaan ei ole aiemmin liittynyt peräsuolen syövän synnyn. Tuloksemme osoittavat, että nämä voivat olla tärkeitä sääntelyviranomaiset ja että jatkotutkinnan potentiaali miR tavoitteet ja niiden mahdolliset käyttöä ennustavaa tai ennustetekijöitä markkereita ovat perusteltuja. Erityisen mielenkiintoinen on miR-549-geeni sijaitsee

KIAA1199

joka itse on aiemmin liittynyt ylössäätöä koolonin adenoomien ja karsinoomien. Jos miR on co-transkriboidaan, se voisi olla mahdollinen korvike merkkiaine varhaista taudin havaitsemista kehon nesteissä tai ulostetta. Tutkimus on myös uutta tietoa potentiaalisia miR biomarkkerit, jotka näyttävät olevan spesifisiä NETeista paksusuolessa.

Materiaalit ja menetelmät

kohortti

Kahdeksan peräsuolen syövän potilasta valittiin alkaen Norja kolorektaalisyövän kohortti (

Kolorectalcancer, arv og miljø,

KAM), joka perustuu parametreihin iän ja sukupuolen. Kaikki potilaat olivat miehiä, joiden keski-ikä on 60 vuotta. Kaikki kudosnäytteet uutettiin kirurgisista näytteistä. Normaali limakalvo kerättiin distaalisessa osassa suolen lähellä resektio marginaalit. Näytteet jälkeen jäädytettiin nestetypessä ja säilytetään pakastimessa -80 astetta. Seitsemän potilasta vahvistettu olevan adenokarsinooman ja yksi luonnehdittiin neuroendokriinikasvain jonka histopatologinen tutkimus. Kliininen ja histopatologisia ominaisuuksia potilaista on esitetty taulukossa 1.

RNA uuttaminen ja Digital Sequencing

kokonais-RNA: lla potilaista uutettiin 10 jääleikkeiden 10 um kasvaimen ja normaalin kudoksen vastaavasti käyttäen Mirvana kittiä (Ambion, TX, USA) valmistajan protokollan. Jotkut näytteet konsentroitiin vakuumissa sentrifugissa saada tarvittavat pitoisuuteen 1 ug /ul. Läsnäolo pieniä RNA varmistettiin on Bioanalyzer 2100 (Agilent, CA, USA) ilman merkkiä heikkenemisen arvioinnissa OD suhde 260/280. Laskentapohjaa oli 10 ug kokonais-RNA, ja valmiste protokolla suoritettiin valmistajan suositusten. Pieniä RNA eristettiin kokonais-RNA on 15% Novex TBE-Urea PAGE-geelillä. Alueella edustavat bändi kokoa 18-30 nukleotidin (nt) leikattiin pois ja hajanainen, RNA eluoitui 0,3 M NaCl ja puhdistettiin Spin X sarakkeeseen. 5′-adapteri ligoitiin 6 tunnin ajan 20 ° C: ssa. Pieniä RNA: ligatoidulla 5′-sovitin eristettiin 15% Novex TBE-Urea PAGE-geeli (Invitrogen, CA, USA).