Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohonneita ilmentymisen ja aktiivisuuden kasvutekijän reseptorin (EGFR) /proteiinikinaasi B (Akt) signalointireitin liittyy kehitykseen, eteneminen ja hoito vastus pään ja kaulan alueen syöpä (HNC). Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että microRNA-7 (miR-7) säätelee EGFR ja Akt aktiivisuus erilaisia ​​syöpäsolutyyppien kautta erityinen vuorovaikutus EGFR mRNA 3′-alue (3′-UTR). Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-7 säännelty EGFR ja Akt aktiivisuutta HNC solulinjoissa, ja että tämä nähtiin lisääntynyt kasvu

in vitro

ja

in vivo

solujen ( HN5), jotka olivat herkkiä EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittori (TKI) erlotinibi (Tarceva). miR-7 toimivat synergistisesti erlotinibin kasvun inhiboimiseksi erlotinibin vastustuskykyisten Fadu soluja, vaikutus liittyy lisääntynyt inhibitioon Akt-aktiivisuutta. Microarray-analyysi HN5 ja Fadu solulinjat transfektoidaan miR-7 tunnistaa yhteiset vaimentua miR-7 kohdegeenien, perehdyttäisi tuumorisuppressorigeenin funktio miR-7. Lisäksi tunnistimme useita kohde miR-7-mRNA: t, joissa on otaksuttu rooli herkistymisestä Fadu solujen erlotinibille. Yhdessä nämä tiedot tukevat koordinoida sääntelyä Akt signaloinnin miR-7 HNC soluissa ja ehdottaa terapeuttista potentiaalia miR-7 yksin tai yhdessä EGFR TKI tässä sairaudessa.

Citation: Kalinowski FC Giles KM, Candy PA, Ali A, ganda C, Epis MR, et al. (2012) asetus kasvutekijän reseptorisignalointi ja Erlotinibi Herkkyys pään ja kaulan alueen syöpäsoluja miR-7. PLoS ONE 7 (10): e47067. doi: 10,1371 /journal.pone.0047067

Editor: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 30, 2012; Hyväksytty: 07 syyskuu 2012; Julkaistu: 24 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Kalinowski et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Health ja Medical Research Council of Australia ja Medical Research kaupallistaminen Fund of Australia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan alueen syöpä (HNC) on kuudenneksi yleisin syöpä, noin 600000 uutta tapausta maailmanlaajuisesti vuosittain [1]. Edistysaskelista huolimatta hoitomuotoja, ennuste monille HNC potilaat, jotka esittävät on levinnyt tai metastaattinen sairaus on edelleen heikko [2]. Epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), joka on jäsen, ErbB-reseptoriperheen (RTK) perhe, yliekspressoituu yli 80% kaikista HNCs ja on riippumaton ennustaja huono tulos [3]. EGFR signalointi aktivoi verkon alavirran polkuja, mukaan lukien fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) /Akt [4], [5] ja Ras /Raf /ERK1 /2 [6], [7] reittejä, jotka edistävät tuumorisolun proliferaatiota, invaasio, etäpesäke, angiogeneesi ja apoptoosin vastus. Näin ollen EGFR on tullut merkittävä terapeuttinen tavoite HNC.

Setuksimabi on monoklonaalinen vasta-aine (mAb), kohdistettu EGFR, joka paransi eloonjäämistä HNC hoidettujen potilaiden yhdistettynä sädehoitoa tai kemoterapiaa [8], [ ,,,0],9]. Pienimolekyylisiä TKI, kuten gefitinibi ja erlotinibi, on arvioitu myös kehittyneissä HNC ja on ollut jonkin verran kliinistä antituumorivaikutuksen pienessä potilasryhmässä [10], [11]. Kliiniset tutkimukset HNC arvioitaessa yhdistelmä EGFR: n estäjien muihin hoitomenetelmiä on aloitettu, sekä tutkimuksia tutkii uuden sukupolven anti-EGFR aineet, kuten anti-EGFR mAb panitumumabin ja dual EGFR /HER2-TKI lapatinib [12] . Huono kliininen vaste HNC anti-EGFR hoitoja johtuu luontaisesta ja hankittu vastustuskyky HNC solujen näille aineille, minkä uskotaan tapahtuvan useiden mekanismien kautta, mukaan lukien mutaatiot EGFR ja sen loppupään efektorien jotka aktivoivat signalointi (esim. Menetys PTEN, PI3K mutaation tai yli-ilmentyminen), korvaava signalointi kautta muihin RTK (esim. muiden ErbB- perheenjäseniä, insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF1 R), tai c-Met), ja siirtyminen epiteelin joka mesenkymaaliset fenotyypin ( EMT) [12], [13], [14]. Siksi tarvitaan uusia työtapoja tehokkaasti estää loppupään kasvaimia synnyttävän signalointireittejä, jotka aktivoituvat in EGFR-riippumattomalla tavalla EGFR estäjä kestävä HNC.

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä, endogeeninen, ei-koodaavat RNA: t, jotka sitoutuvat 3′-alue (3′-UTR) erityisten kohde-mRNA: tukahduttaa geenin ilmentymisen, joko indusoimalla translaation tukahduttamisen tai transkriptio hajoaminen [15]. miRNA voi säädellä monia geenikohteet, usein koordinoidusti matkapuhelintietoverkon kautta tai verkko [16], ja näin he hallitsevat erilaisia ​​solun prosesseja, kuten kehitys, erilaistuminen, apoptoosi ja solusyklin etenemisen [17]. Poikkeava miRNA ilmentyminen on ominaista monien syöpien, mukaan lukien HNC, ja nämä miRNA voivat toimia tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [18]. Oletetaan esimerkiksi,-7d ilmentyminen vähenee monissa HNCs aiheuttaen kohonnut RAS ilmaisua, lisääntynyt kasvaimen kasvua ja vähentää potilaiden eloonjäämistä [19]. Sen sijaan, miR-184 ilmentyminen on ylössäädelty kielen okasolusyöpä, mikä lisää ilmentyminen

c-Myc

onkogeeni, lisääntynyt solujen proliferaatiota ja kasvaimen kasvua [20]. Viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että miRNA voi olla käyttöä uutena syöpähoitojen tai diagnostisia /prognostisia biomarkkerit [18], [21], [22].

ja muut ovat osoittaneet, että miR-7 estää EGFR ja loppupään Akt ja ERK1 /2 aktiivisuutta keuhko-, rinta-, eturauhas- syöpä ja glioblastooma [23], [24], mikä vähentää solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. Sääntely EGFR liittyy suora, erityinen vuorovaikutus miR-7 kahdella miR-7 kohdesivustot sisällä EGFR mRNA 3′-UTR. Lisäksi miR-7 säätelee ilmentymistä muiden molekyylien alavirtaan EGFR koordinaatistossa tavalla, kuten RAF1, insuliinireseptorisubstraatti 1, IRS2, PAK1 [23], [24], [25], joka tukee kasvain vaimennin toiminto miR-7 näissä ja muita syöpiä. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme funktio miR-7 EGFR signalointi ja kasvun HNC

in vitro

ja

in vivo

keskittyen solulinjoja, jotka ovat herkkiä tai resistenttejä EGFR TKI erlotinibi. Oletimme, että miR-7 estäisivät EGFR ja alavirran signalointia, ja arvioi synergiaa erlotinibin ja miR-7 erlotinibin kestävä HNC soluissa. Lopuksi suoritetaan microarray analyyseja kahden HNC solulinjojen tunnistaa uusia miR-7 tavoitteet, jotka valaisevat molekyylitason mekanismeista sen tuumorisuppressoriproteiinia toimintaa HNC. Meidän havainnot ovat laajat vaikutukset hoitoon HNC EGFR kohdistettujen hoitojen ja käytön miR-7 uutena anti-HNC terapeuttista.

Tulokset

Differential herkkyys HNC Cell Lines EGFR-inhibiittorin erlotinibi

määrittää suhteellinen herkkyys HN5, Fadu, ja SCC-25 HNC solujen EGFR-inhibiittorin erlotinibin, teimme solujen tiitteri määrityksissä käsiteltyjen solujen laajan pitoisuudet (Fig. 1 ). Ottaa huomioon, HN5-solut olivat erittäin herkkiä erlotinibi (EY

50 = 0,6 uM), Fadu solut olivat resistenttejä lääkkeen (EY

50 = 8,3 uM). SCC-25-solujen näytetään väli- herkkyyttä erlotinibi (EY

50 = 3,8 uM) HN5-solujen on raportoitu yli-ilmentämään EGFR kautta geenin monistaminen [26], ja niiden on oltava erittäin herkkiä EGFR inhibitio

in vitro

ja

in vivo

[27]. Fadu ja SCC-25-soluilla kohtalainen EGFR ja on osoitettu resistenttejä EGFR-inhibiittorin gefitinibin [28]. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​näiden raporttien, jolloin Fadu solut ovat ~ 10-kertaisesti enemmän vastustuskykyisiä erlotinibille kuin HN5 soluja. Yhdessä, HN5-solut edustavat EGFR-inhibiittorin herkkä HNC, Fadu solut ovat HNC, joka on vastustuskykyinen EGFR inhibition, ja SCC-25-soluja edustavat HNC välituotteen EGFR-inhibiittorin vastus. Näin ollen voimme tutkia tuumorisuppressorigeenin aktiivisuus miR-7 kussakin näitä asetuksia.

HN5 (punainen), Fadu (sininen) ja SCC-25 (vihreä) Solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille ja käsitelty EGFR estäjän erlotinibi (lopullinen konsentraatio 0-100 uM). Puoli vaikuttavan pitoisuuden enimmäismäärästä (EY

50) erlotinibin määritettiin kullekin solulinjan mittauksen jälkeen suhteellisen elävien solujen lukumäärä solun tiitteri määritys 3 d lisäämisen jälkeen erlotinibin. Aineisto on normalisoitu alhaisin pitoisuus erlotinibin. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

miR-7 Säätelee EGFR ilmentäminen ja Akt aktiivisuus HNC Cell Lines

Aiemmin me ja muut tunnistaa EGFR mRNA 3′-UTR, kuten erityinen tavoite miR-7 useissa eri syöpäsolulinjoissa, ja osoitti, että miR-7 on tehokas estäjä EGFR signalointi ja solujen elinkelpoisuus [23], [24]. Mielenkiintoista, miR-7 heikennetty EGFR signalointia EGFR-inhibiittorin kestävä U87MG (glioblastooma) ja A549 (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä) soluihin [23], [24]. Koska tärkeä rooli EGFR signaloinnin HNC kasvainten synnyssä ja hoidossa, tutkimme kapasiteettia miR-7 estävän EGFR ja alavirran signalointia HNC solulinjoissa. Transfektoimme HN5, Fadu ja SCC-25-solulinjoissa miR-7 tai negatiivinen kontrolli miRNA, miR-NC, ja suoritetaan Western blotting selvittää vaikutukset miR-7 EGFR ja Akt-aktiivisuutta. miR-7 inhiboi EGFR ja aktiivisuutta (P-EGFR), sekä aktiivisuuden Akt (P-Akt), joka on keskeinen alavirtaan tiedoksiannon EGFR (Fig. 2A). Pieneneminen Akt aktiivisuuden aiheuttama miR-7 liittyi kasvuun suhteellinen taso koko Akt (Fig. 2A), vaikutus, joka mahdollisesti heijastaa palautemekanismin valvoa Akt ilmentymistä pään ja kaulan alueen syöpäsoluja. Emme havainneet inhibitio ERK1 /2 signalointi pään ja kaulan syövän solulinjojen miR-7 (dataa ei esitetty). Käänteiskopioijaentsyymin kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) analyysi HNC transfektoitujen solujen miR-7 osoittivat vähentää EGFR mRNA: n ekspressio (HN5 soluja, Fig. 2B, Fadu soluja, tuloksia ei ole esitetty), joka on löytää yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten kanssa miR -7 glioblastoma, keuhko-, rinta- ja eturauhassyövän solut [24]. Väheneminen EGFR mRNA miR-7 tukee myös tuoreessa raportissa ehdotetaan, että useimmat miRNA tukahduttavat geeniekspressiota edistämällä mRNA rappeutuminen [29]. Lopuksi vahvistettiin suoraan EGFR ilmentymisen miR-7 kautta toimia kun EGFR 3′-UTR käyttäen reportterigeenin määritykset HNC soluissa. Kotransfektion HNC solujen miR-7 ja tulikärpäsen lusiferaasi reportteri-konstrukti, joka sisältää täyspitkän EGFR mRNA 3′-UTR saatiin huomattavasti pienempi toimittaja aktiivisuus kuin miR-NC (Fadu soluja, Fig. 2C, HN5-solut, tietoja ei ole esitetty ), vahvistaa, että miR-7 vuorovaikutuksessa erityisten EGFR 3′-UTR kohdesivustot [24] on HNC soluissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miR-7 estää EGFR-mRNA ja proteiini ilmaisun ja loppupään signalointi ainakin osittain suoralla kohdentamista EGFR mRNA 3′-UTR.

(A) Western blotting-analyysi EGFR, P-EGFR, Akt ja P-Akt tasoilla HN5 (vasen paneeli) ja Fadu (keskellä paneeli) ja SCC-25 (oikea paneeli) solujen 3 d kuluttua transfektion miR-7 tai miR-NC prekursorimolekyylit tai ajoneuvo (LF2000) vain. β-aktiini on sisällytetty latauskontrollina. (B) RT-qPCR analyysi EGFR mRNA ilmaisun HN5 soluissa 24 tuntia transfektion jälkeen miR-7 tai miR-NC prekursorimolekyylit. Data oli normalisoitiin GAPDH mRNA: n ilmentymisen ja ilmaistu suhteessa miR-NC-transfektoiduissa soluissa. (C) lusiferaasireporttiterilla määrityksessä Fadu solut ko-transfektoitiin miR-7 tai miR-NC prekursorimolekyylejä, tulikärpäsen lusiferaasi täyspitkän EGFR mRNA 3′-UTR reportteriplasmidilla, ja

Renilla

lusiferaasireportteriplasmidi . Tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus arvioitiin 24 h transfektion jälkeen, normalisoitu

Renilla

lusiferaasin mittauksia, ja tiedot ilmaistiin suhteessa ajoneuvon (LF2000) vain-transfektoitujen solujen. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. *, P 0,001, miR-7 vs miR-NC.

miR-7 estää niiden kasvun, Erlotinibi herkkien HN5 Cells

in vitro

ja

in vivo

HN5 HNC solut ovat erittäin herkkiä erlotinibille ja siten tarjoavat erinomaisen mallin arvioida toiminnallista merkitystä EGFR inhibition miR-7

in vitro

ja

in vivo

. Olemme tutkineet vaikutus miR-7 erlotinibin herkkien HN5 soluissa mittaamalla solujen elinkyky solujen tiitteri määrityksissä 5 d kuluttua ohimenevän transfektion miR-7. Verrattuna ajoneuvo (LF2000) ja miR-NC, miR-7 vähensi HN5 solujen kasvua (Fig. 3A ja Fig. 3B).

(A) kolorimetrinen solu tiitteri määritys HN5 solujen 5 d kuluttua transfektion 96-kuoppalevyillä miR-7 tai miR-NC prekursorimolekyylit, tai ajoneuvo (LF2000) vain. (B) Graafinen esitys solun tiitteriä -määritystä (A). Data edustaa suhteellinen määrä elinkelpoisia HN5 solujen normalisoidaan LF2000 käsiteltyjen HN5 soluissa. (C) TaqMan RT-qPCR analyysi miR-7 ilmentyminen HN5 kloonien vakaa ilmentyminen miR-7 (klooni 39) tai miR-NC (klooni 2). Data oli normalisoitu U44 snRNA ilmaisun ja ilmaistu suhteessa HN5 miR-NC klooni 2 (D) Western blotting-analyysi EGFR, Akt ja P-Akt tasot HN5 klooneja vakaa ilmentyminen miR-7 (klooni 39) tai asennuspalveli- NC (klooni 2). β-aktiini on sisällytetty latauskontrollina. (E) Manuaalinen solujen laskeminen HN5 solujen vakaa ilmentyminen miR-7 (klooni 39) tai miR-NC (klooni 2). Data on ilmaistu suhteessa miR-NC. (F) kyky muodostaa klooneja määritystä HN5 solujen vakaata ekspressiota miR-7 (klooni 39) tai miR-NC (klooni 2), 10 d, kun soluja ympättiin 10 cm: n maljoille. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. *, P 0,01, miR-7 vs miR-NC; **, P 0,005, miR-7 vs miR-NC.

vaikutuksen arvioimiseksi miR-7 HN5 kasvaimen kasvuun

in vivo

, käytimme lentivirusten toimitus tuottaa HN5 solujen vakaa yli-ilmentymisen miR-7 tai miR-NC. Käyttämällä TaqMan miRNA RT-qPCR havaitsimme -80 kertainen ylössäätely miR-7 HN5 solujen vakaa miR-7 lauseke (HN5 vakaa klooni 39), verrattuna HN5 solujen vakaa miR-NC lauseke (HN5 vakaa klooni 2) (kuvio . 3C). Analyysi EGFR ja signalointi western blottauksella paljasti vaatimaton vähennys (-15%;

katso Menetelmät 2.7

) EGFR-proteiinin tasot HNC kanssa miR-7 stabiilin ilmentymisen (Fig. 3d), mutta suurempi ( -25%) tasojen aleneminen Akt fosforyloitiin seriini-473 (P-Akt). Seuloimme useita HN5 /miR-7 klooneja ja havaittu miR-7 yli-ilmentymisen ja samalla tasolla EGFR ja P-Akt kussakin klooni (kuvio. S1). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että lasku Akt aktiivisuuden välittämä miR-7 ei ole pelkästään estämällä EGFR ja sen sijaan on todennäköisesti johtuvat koordinoi väheneminen ilmentymisen ja aktiivisuuden useiden molekyylien vastuussa Akt-aktiivisuutta.

Voit selvittää vakaa miR-7 lauseke estää HN5 kasvu

in vitro

teimme manuaalinen solujen laskenta miR-NC HN5 stabiili klooni 2-solut ja miR-7 HN5 vakaa klooni 39 soluja. Nämä kokeet paljastivat merkittävä väheneminen leviämisen miR-7 vakaa HN5 soluja verrattuna miR-NC vakaa HN5 soluja (Kuva. 3E). Voit vahvistaa havainto, arvioimme kyky muodostaa klooneja meidän HN5 stabiileja solulinjoja. Pysyvää ilmentymistä miR-7 vähensi merkittävästi ja koko muodostuneiden pesäkkeiden jälkeen 10 d verrattuna HN5 solujen vakaa miR-NC ilmentymistä (Fig. 3F). Yhdessä nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​saimme ohimeneviä miR-7 transfektiota ja osoittavat, että -80 kertaiseen kasvuun miR-7 ilmentymisen HN5 miR-7 vakaa klooni 39 johtaa vähentyneeseen Akt-aktiivisuutta ja vähentää merkittävästi

vuonna vitro

kasvu HN5 HNC soluja.

vieressä pyrkimyksistä vaikutusta vakaan miR-7 ilme

in vivo

kasvun HN5 kasvaimen nude-hiirissä. Ihonalaisen injektion miR-7 HN5 stabiili klooni 39 tai miR-NC HN5 stabiili klooni 2-soluja kylkeen naisten nude-hiirten, kasvainten seurattiin yli 29 päivää ajan. Merkittävä väheneminen kasvaimen kasvua havaittiin HN5 ksenografteissa vakaat miR-7 ilmentymisen verrattuna miR-NC vakaa HN5 ksenograftit (Fig. 4A ja Fig. 4B). Käytimme TaqMan miRNA qRT-PCR-analyysi miR-7 tasoa vahvistaa, että miR-7 yliekspressio itsepintaisesti HN5 /miR-7-ksenografteissa ajaksi Tutkimuksemme (Fig. 4C), ja meillä on myös havaittu väheneminen P- Akt tasot HN5 /miR-7 klooni 39 ksenografteissa verrattuna HN5 /miR-NC klooni 2 ksenografteissa western blotting (Fig. 4D ja Fig. 4E). Tämä on ensimmäinen osoitus siitä, että miR-7 voi vähentää HNC kasvaimen kasvua

in vivo

, ja on yhdenmukainen muiden tuoreet tutkimukset että miR-7 vähentää kasvun maksasyövän, keuhkosyöpä ja schwannoma hiirissä [ ,,,0],30], [31], [32]. Vahvista meidän havainto ja sulkea pois mahdollisuutta klonaalisen vaikutus, suoritimme kasvainmuodostusta määritys, jossa HN5 solut transfektoitiin ohimenevästi viljelmässä miR-7 tai miR-NC, ja 24 tunnin kuluttua ihon alle kylkeen nainen alaston hiiret ja kasvainten muodostumiseen arvioitiin. Analyysi kasvaimen tilavuutta 10 d paljasti merkittävää tuumorin muodostumisen hiiriä, joihin injektoitiin HN5-soluja transfektoitiin väliaikaisesti miR-7 (HN5 /miR-7), verrattuna hiiriin injektoitiin apuaineella hoidettuihin tai miR-NC-transfektoitujen HN5-solujen (HN5 /miR-NC) (Fig. S2). Nämä tiedot tukevat havaintoa, että stabiileja miR-7 ilmentyminen estää niiden kasvun HN5 tuumoriksenograftien (Fig. 4A ja Fig. 4B) ja oletusta, että miR-7 on tehokas estäjä EGFR signaloinnin, Akt-aktiivisuutta, ja tuumorigeenisyystesti on HNC.

(A) HN5 -tuumoriksenografti kasvua ihonalaisen injektion vakaa HN5 miR-NC klooni 2 (punainen) tai miR-7 klooni 39 (sininen) soluja nude-hiiriin. Kasvaimen tilavuus (mm

3) on ajan funktiona (d). (B) edustaja valokuvia tuumoriksenograftien soluille vakaat miR-NC lauseke (klooni 2, vasemmalla) ja vakaa miR-7 lauseke (klooni 39, oikealla). (C) TaqMan RT-qPCR analyysi miR-7 ilmentymisen HN5 /miR-7 ja HN5 /miR-NC vakaa tuumoriksenografteja kokeelliselle päätepisteen. Data oli normalisoitu U44 snRNA ilmaisun ja miR-7 tasoa näytetään suhteessa HN5 /miR-NC klooni 2 kasvaimia. (D) Western blotting-analyysi Akt ja P-Akt: n välillä HN5 /miR-7 ja HN5 /miR-NC vakaa tuumoriksenograftien. β-aktiini ja Akt ovat mukana lastaus valvontaa. (E) Densitometria analyysi P-Akt: n välillä HN5 /miR-7 (klooni 39) ja HN5 /miR-NC (klooni 2) tuumoriksenografteja western blottauksella. P-Akt tasot normalisoitiin yhteensä Akt ilme. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. *, P 8,0 x 10

-5, miR-7 vs miR-NC; **, P 1,0 × 10

-8, miR-7 vs miR-NC; ***, P = 0,06, miR-7 vs miR-NC.

Syngergistic toiminta miR-7 ja erlotinibin Fadu ja SCC-25 HNC Cells

in vitro

koska miR-7 voi estää EGFR sekä aktiivisuuden Akt, me arveltu, että se saattaisi parantaa tehoa EGFR terapeuttiset kanssa HNC solut; eli yhdistelmä miR-7 ja erlotinibin voi synergisesti estää kasvun HNC soluja. Tämän tutkimiseksi käytimme Fadu solut, jotka ovat resistenttejä erlotinibi (EY

50 = 8,3 uM; -10 kertaa suurempi kuin HN5-solut). Fadu soluja transfektoitiin ohimenevästi miR-7, miR-NC, tai ajoneuvon vain, ja käsiteltiin 3 d transfektion jälkeen, jossa on osa-EY

50 ja kliinisesti merkityksellisiä [33] annos (7,5 uM) erlotinibin ( tai ajoneuvo). Vielä 4 d, solujen elinkelpoisuus arvioitiin solujen tiitteri määritys (Fig. 5A). miR-7 yksin (ilman erlotinibin) ja erlotinibin yksinään (ajoneuvon vain, LF2000) jokainen tuotettu pieni mutta tilastollisesti merkitsevä esto Fadu solujen kasvua. Kuitenkin yhdistelmä miR-7 ja erlotinibin tuotti vielä suurempi vähennys solujen kasvua, vaikutus, joka määräytyi Bliss additivism malli [34] olevan synergistinen, missä E

Bliss = E

miR-7 + E

erlotinibi-E

miR-7 × E

erlotinibin = 0,15 + 0,18-0,15 × 0,18 = 0,30, ja kokeellisesti havaittu murto esto (E

havaittu) kanssa miR-7 plus erlotinibi oli 0,61. Havaitsimme myös synergiaa miR-7 ja erlotinibin SCC-25 HNC soluja (Kuva. S3), jossa E

Bliss = E

miR-7 + E

erlotinibi-E

miR-7 × E

erlotinibin = 0,61 + 0,35-0,6 × 0,35 = 0,75, ja kokeellisesti havaittu murto esto (E

havaittu) kanssa miR-7 plus erlotinibi oli 0,84.

(A) Solujen tiitteri analyysi Fadu soluja, jotka oli transfektoitu vain vehikkelillä (LF2000), miR-7, tai miR-NC 3 d, ja sitten käsiteltiin erlotinibin (7,5 uM) tai vehikkeliä (DMSO) vielä 4 d. Tiedot on ilmaistu suhteessa ajoneuvon-transfektoitujen, ajoneuvojen käsiteltyjen Fadu soluja (LF2000 miinus erlotinibi, ensimmäinen sarake). (B) Western-blottaus-analyysi EGFR, P-EGFR, Akt: n ja P-Akt tasot Fadu soluissa, jotka oli transfektoitu vain vehikkelillä (LF2000), tai miR-7 tai miR-NC 3 d ja sitten käsiteltiin ± erlotinibi (7,5 uM) 24 tuntia. β-aktiini on sisällytetty latauskontrollina. (C) Densitometria analyysi P-Akt tasot Western blot välillä Fadu transfektoitujen solujen miR-NC tai miR-7 ja sitten käsiteltiin erlotinibin (7,5 uM) 24 tuntia. Data on esitetty suhteessa miR-NC-transfektoiduissa soluissa. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. *, P 0,05, miR-7 miinus erlotinibin vs miR-NC miinus erlotinibin, ja LF2000 plus erlotinibin vs LF2000 miinus erlotinibi; **, P 0,01, miR-7 plus erlotinibin vs miR-NC plus erlotinibi. † osoittaa synergiaa miR-7 ja erlotinibin määrittelemät Bliss additivism malli [34].

Samalla tutkimuksissa käytimme western blottauksella arvioida miR-7, erlotinibi, ja yhdistelmä miR-7 ja erlotinibin EGFR /aktiivisuutta ja aktiivisuutta Akt vuonna Fadu soluissa (kuvio. 5B). Havaitsimme EGFR fosforylaatiota (P-EGFR) sekä erlotinibin ja miR-7, kun taas miR-7 vähensi myös pohjapinta EGFR. Tärkeää on, että yhdistelmä miR-7 ja erlotinibin tuotti suuremman alentamisen P-EGFR kuin havaittiin joko erlotinibi tai miR-7 yksin, ja tiheysmittaus vahvisti, että P-Akt tasot olivat alemmat yhdistelmällä miR-7 ja erlotinibin kuin miR-NC ja erlotinibin (

katso menetelmät 2.7

; Fig. 5C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmä miR-7 ja erlotinibin toimii synergistisesti HNC soluissa samanaikaisesti estää EGFR ja aktiivisuus, Akt-aktiivisuutta, ja solujen kasvua.

Microarray Analysis of miR-7-säännelty geenejä HN5 ja Fadu HNC Cells

päästääkseen paremmin osaksi vaikutusmekanismi miR-7 sekä HN5 ja Fadu soluja, suoritimme microarray analyyseja rinnakkain totaali-RNA eristettiin HN5 ja Fadu soluja, jotka olivat transfektoitu miR-7 tai miR-NC. Me valittiin sato RNA mikrosiruanalyysi 24 tunnin transfektion kanssa miRNA, maksimoida spesifisyys ja herkkyys, joka perustuu meidän aikaisempaa kokemusta miR-7 transfektioon A549-solujen [24] ja raportissa esittänyt downregulation välillisten miR-124 kohde-mRNA HepG2 maksasyövän solut aloitetaan ~32 h transfektion jälkeen [35]. Kun tietoja normalisointi, päättelimme, että suora miR-7 kohdegeenien HN5 ja Fadu soluja voisi olennaisesti vaimentua seuraavat miR-7 transfektiota. Me puhdistettu nämä geeni luetteloita määrittämällä leikkaus pois downregulation vähintään -1,5 kertainen ja jonka merkitys p 0,05 (Fig. 6A), ja suorittaa klusterin analyysi tuloksena geenien merkittävästi vaimentua by miR-7 nähden miR-NC HN5 tai Fadu solut (Fig. 6B). Tämä paljasti päällekkäisyys geenien vaimentua by miR-7 kahden solulinjojen. Sata ja seitsemänkymmentäyhdeksän mRNA: t olivat merkittävästi vaimentua by miR-7 HN5 soluissa (taulukko S1), 357 mRNA: t olivat merkittävästi vaimentua vuonna Fadu soluissa miR-7 (taulukko S2), ja 103 mRNA: t olivat yleisesti vaimentua sekä HN5 ja Fadu solujen (Taulukko S3). Venn-kaavio, joka koostuu miR-7 vaimentua geenien kustakin solulinjasta (Fig. 6C) korostaa risteyksessä miR-7 vaimentua mRNA: iden välillä HN5 ja Fadu soluja, mikä merkitsee miR-7 tavoite allekirjoituksen HNC soluissa. Sirontakuvaajan analyysi osoitti vahva korrelaatio (R

2 = 0,435, p 0,001) väliin taitettava väheneminen ilmentyminen 103 geenien vastauksena miR-7 välillä HN5 ja Fadu soluja (Fig. 6D). Käytimme myös RT-qPCR analyysi vahvistaa downregulation RAF1 ja transformoiva kasvutekijä alfa (TGFa) mRNA miR-7 meidän microarray analyysit sekä HN5 ja Fadu solut (Fig. S4). Nämä havainnot viittaavat siihen, miR-7 on kyky kohdistaa EGFR, sen alavirran polut ja myös EGFR ligandin, kuten TGFa.

(A) Volcano tontteja edustaa joukko antureista välillä HN5 (vasemmalla) ja Fadu (oikea -solut) 24 h transfektion jälkeen miR-7 tai miR-NC prekursorimolekyylejä. Määrittäminen käytettiin raja-arvoa ± 1,5-kertainen muutos (miR-7 vs miR-NC) ja p 0,05, merkitsevästi vaimentua koettimet ovat vihreitä ja merkittävästi yliaktiivista koettimet ovat punaisia. (B) Cluster analyysi miR-7-vaimentua geenien HN5 ja Fadu soluja, jossa vihreä ja punainen varjostus vastaa vaimentua ja voimistunut geenejä, tässä järjestyksessä. (C) Venn kaavio miR-7-vaimentua geenien HN5 ja Fadu soluja. (D) sirontakuvaajaan Mir-7-vaimentua geenien yhteinen HN5 ja Fadu soluja (R

2 = 0,435, p 0,001).

Validoida lähestymistapamme yhdistää luki- 7 vaimentua geeni sarjat HN5 ja Fadu solujen tunnistamiseksi yhteisen tavoitteen mRNA: iden, käytimme Ingenuity Pathway Analysis (IPA) arvioimaan osuutta geenejä, jotka olivat merkittävästi vaimentua by miR-7 ja olivat kohtuullisen tai suuren luottamuksen ennusti, tai todistettu, miR -7 tavoitteita. IPA tunnistettu 91/179 (54%) vaimentua HN5 mRNA: iden olevan ennustetun tai todistettu miR-7 tavoitteet, 113/357 (32%) vaimentua Fadu mRNA: iden olevan ennustetun tai todistettu miR-7 tavoitteet, ja 57/103 (55%) vaimentua mRNA: iden yhteinen sekä HN5 ja Fadu solujen olevan otaksuttu tai todellinen miR-7 tavoitteet korostaen rikastuminen yhdistetyn miR-7 vaimentua geenin asetettu otaksuttu tai validoitu miR-7 kohde-mRNA: iden ja viittaa siihen, että se edustaa miR-7 kohde allekirjoitus HNC soluissa.

tunnistaa toiminnallinen merkitys miR-7 kohdegeenin asetettu yhteisiä HN5 ja Fadu soluja, käytimme IPA määrittää toimintoja 103 geenejä, jotka vaimentua by miR-7 molemmissa solulinjat. Osajoukko 103 geenejä – joista yli puolet oli ennustettu tai validoitu miR-7 tavoitteet – liittyi tehtäviä, jotka edustavat monenlaisia ​​prosesseja kasvaimen kasvussa ja etenemisessä, mukaan lukien ”solujen lisääntymistä”, ”solujen kehitystä”, ”tuumorigeneesiin”, ”proteiini synteesi”, ”angiogeneesi”, ”solukuolema”, ”solusyklin” ja ”solu liike” (Fig. 7). Tämä havainto korostaa kapasiteettia miR-7 yhteistyöhön ordinately säädellä useita kasvaimia synnyttävän prosesseja syöpäsoluissa.

miR-7-vaimentua geenien yhteinen sekä HN5 ja Fadu soluja (103) osoitettiin Annotated syöpään liittyvien prosessit käyttävät IPA ohjelmistoa. Näihin sisältyvät ”solusyklin”, ”cell liike”, ”solujen lisääntymistä”, ”solujen kehitystä”, ”kasvainten synnyssä”, ”proteiinisynteesiä”, ”angiogeneesi” ja ”solukuoleman”. Virallinen geeni symboleja käytetään kunkin miR-7-vaimentua geeni ja sininen ympyrä osoittaa, että geeni on ennustettu tai validoitu tavoite miR-7 IPA analyysi.

päästääkseen paremmin osaksi funktio miR-7 säätelijänä EGFR signalointi ja Akt-aktiivisuutta – kanssa kyky herkistää HNC soluihin erlotinibille – käytimme IPA määrittää ryhmän geenien vaimentua by miR-7 HN5 soluissa ja Fadu solujen kanoninen ”PI3K /Akt signalointi ”reitin (Fig. 8). Vaikka PIK3CD, PAK1, IKK: n ja NF-KB: n oli vaimentua by miR-7 HN5 mutta ei Fadu soluja, suurin osa miR-7 vaimentua liittyviä geenejä PI3K /Akt-reitin laskivat sekä HN5 ja Fadu soluja, mikä viittaa siihen, että ne edustavat lopullisen miR-7 kohde allekirjoitus liittyy PI3K /Akt signalointi myötävirtaan EGFR. Oletamme, että synergiaa miR-7 ja erlotinibin on ainakin osittain johtuen miR-7-välitteinen downregulation useiden molekyylien liittyy Akt aktiivisuutta HNC soluissa.

Kaaviokuva molekyylien EGFR /Akt signalointireitin jotka estyvät miR-7 HNC. IPA ohjelmistoa käytettiin kartoittamaan yhteisiä miR-7-vaimentua geenien (näkyy vihreänä) in Fadu ja HN5 solujen päälle kanoninen PI3K /Akt-reitin. Tiheys varjostus edustaa kertamuutoksen downregulation of a geenin miR-7. Sininen ympyrä osoittaa, että geeni on ennustettu tai validoitu tavoite miR-7 IPA analyysi. Useita geenejä, jotka kuuluvat PI3K /Akt-reitin jotka vaimentua by miR-7 HN5 soluissa vain varjostavat vaaleansinisellä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että miR-7 säätelee EGFR ja alavirran signalointia HN5 ja Fadu HNC solulinjoilla, joilla ero herkkyys EGFR TKI erlotinibi. Huomasimme, että miR-7 inhiboi erlotinibin herkkien HN5 solujen

in vitro

ja

in vivo

, ja että miR-7 voi herkistää erlotinibin kestäviä Fadu solujen erlotinibille. Microarray-analyysi miR-7-transfektoiduissa HN5 ja Fadu solut tunnistettiin yhteisen kohdegeenin allekirjoituksen miR-7, perehdyttäisi sen tuumorisuppressoriproteiinia toiminnan yhteydessä useiden syöpään liittyvien toimintojen, kuten solujen lisääntymisen ja solujen liikkumista. Lopuksi, analyysi meidän microarray tiedot osoittivat, että miR-7 herkistää EGFR-inhibiittorin resistenttejä HNC solujen erlotinibille jonka koordinoidusti säätelemällä ilmentyminen useiden molekyylien aktiivisuuteen liittyvän Akt, kriittinen alavirtavaikuttajainhibiittorit EGFR ja kehittymässä terapeuttinen kohde syövän.

keskeinen havainto oli Tutkimuksemme on, että miR-7 on kyky herkistää erlotinibiin kestäviä HNC solujen erlotinibille, yhdistelmällä erlotinibin ja miR-7 osoittaen synergististä vähenemistä solujen lisääntymisen verrattuna erlotinibi tai asennuspalveli- 7 yksin. Tämä havainto on tärkeää siksi, että vastus HNC on EGFR: n estäjien on yleinen ja merkittävä kliininen ongelma [12].