Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Notch ja Wnt reitit ovat keskeisiä säätelijöitä suoliston homeostaasin ja muutoksia näiden reittien voivat johtaa kehittämiseen peräsuolen syöpä (CRC). CRC

APC /β-kateniinin

geenien Wnt-signalointireitin usein mutatoitu ja aktiivinen Notch signalointi vaikuttaa tuumorigeneesiin pitämällä epiteelin solujen proliferatiivisen tilan. Nämä reitit ovat samanaikaisesti aktiivisia proliferatiivisia adenooma soluissa ja ylikuulumisen niiden välillä on aikaisemmin ehdotettu normaalin kehityksen sekä syöpään.

Keskeiset havainnot

Tässä tutkimuksessa

in silico

analyysi otaksutun osallistujatahojen transkription säätelyyn koodaavien geenien proteiinien Notch signalointireitillä paljasti useita otaksuttu LEF-1 /TCF sivustoja mahdollisina kohteina β-kateniinin ja kanonisen Wnt signalointia. Edelleen tulokset kilpailukykyinen elektroforeettisen liikkuvuuden-shift (EMSA) tutkimukset viittaavat sitova useiden mahdollista aluetta vuonna Notch koulutusjakson geenin promoottorit

in vitro

käännetty β-kateniinin /Lef-1. Villityypin (wt) -Apc säätelee negatiivisesti β-kateniinin. Indusoimalla wt-Apc tai β-kateniinin hiljentäminen in HT29, havaitsimme, että useat geenit Notch koulutusjakson, kuten

Notch-2

olivat vaimentua. Lopuksi aktiivinen Notch signalointi varmistettiin

APC

Min /

+ hiirimallissa jossa

Hes-1

mRNA havaittiin merkitsevästi yläreguloituja suoliston kasvaimet verrattuna normaaliin suoliston limakalvolle. Lusiferaasimäärityksiä osoitti lisääntynyttä aktiivisuutta ydin ja proksimaalinen

Notch-2

promoottorin yhteydessä kotransfektoimalla HCT116-solujen korkea ekspressio rekombinantti Tcf-4, Lef-1 tai β-kateniinin.

johtopäätökset

tässä artikkelissa tunnistimme

Notch-2

uutena kohteena β-kateniinin riippuva Wnt signalointia. Lisäksi meidän tiedot tukevat käsitystä, että ylimääräiset geenit että Notch polku saattaa transkriptionaalisesti säätelee Wnt signalointia peräsuolen syövän.

Citation: Ungerbäck J, Elander N, Grünberg J, Sigvardsson M, Söderkvist P (2011)

Notch-2

Gene säätelee Wnt Signaling in viljellyissä peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 6 (3): e17957. doi: 10,1371 /journal.pone.0017957

Editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Saksa

vastaanotettu: 28 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 21 helmikuu 2011; Julkaistu 18 maaliskuuta 2011

Copyright: © 2011 Ungerbäck et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Ruotsin tiedeneuvosto ja Östergötlandin maakäräjät. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelin ruoansulatuskanavan jatkuvasti korvattu sukupolvikierto kahdesta seitsemään päivään. Säilyttääkseen homeostaasiin suolen epiteelin, prosessit soluproliferaation, erilaistumisen, muuttoliike ja kuolema on säänneltävä tiukasti [1] – [3]. Muutama mutta erittäin konservoituneita signalointireitteihin uskotaan ajaa nämä prosessit (tarkistetaan [4], [5] ja [6]). Kanoninen Wnt signalointireitin oli ensimmäinen löydetty tavalla välttämätöntä suolen krypta solujen lisääntymisen ja homeostaasin [7] – [10]. Yksi keskeinen osa tämän reitin on sytoplasminen proteiini β-kateniinin, joka silloin, kun kulkeutua tumaan seurauksena Wnt signaaleja, toimii yhteistyössä tekijä transkriptiotekijät Lef-1 /Tcf (lymfaattisen edistäjän factor-1 /T Cell Factor) perhe jotta aktivoinnin alavirran geneettinen ohjelma [11]. Taso β-kateniinin paksusuolessa epiteelin säätelee ubiquitinin-proteasomin järjestelmä [12]. Yksi kriittinen komponenttien β-kateniinin tuhoaminen kompleksi on adenomatoottisen polypoosin coli (APC) proteiini [11]. Mutaatiotutkimukset tämän geenin aiheuttaa stabilointi β-kateniinin [13] ja kasvanutta solujen ja se on yksi yleisimmistä geneettisten muutosten peräsuolen syöpä (CRC) [14]. Tämä johtaa kohonneeseen ja ydinvoiman translokaation β-kateniinin ja myöhemmin säädeltyyn aktivointi LEF-1 /TCF kohdegeenien [5].

kypsymisen suolen kantasolujen säädellään myös Notch signalointireitille edustaa toista evoluution säilytetyn merkinantojärjestelmä mukana ylläpitää paksusuolen epiteelin homeostaasiin [2] – [4], [15] – [17]. Core elementtejä tässä signalointireitin ovat monomeerisiä transmembraaninen sitoutunut Notch reseptoreihin (Notch1-4 nisäkkäiden), joka sitoutumisen jälkeen ligandiin (Deltalike-1, -3, -4, Jagged-1 tai -2) vapauta solunsisäinen domeeni (NICD ), joka toimii transkription kofaktorina. Spesifisyys ligandi /reseptori vuorovaikutus määritetään lisäämällä sokeriosiin jonka glykosyylitransferaasien päässä

Fringe

geeniperheen (

ääriryhmä

,

Lfng

;

Maniac hapsut

,

Mfng

ja

Radical hapsut

,

Rfng

) [18] – [20]. NICD translokoituu tumaan muodostaa transkription aktivointi kompleksin DNA: ta sitovana tekijä CSL (RBP-JK) ja co-aktivaattorit kuuluvat

Mastermind-like

perhe (

Maml

) [ ,,,0],15], [21], [22]. Jotkut parhaiten tunnettu tavoitteet tämän transkriptionaalisen aktivaation monimutkainen kuuluvat

HES

-ja

Hei

geenien perhe, jotka toimivat transkription repressoreina myöhemmässä tavoitteita, kuten

ma- 1

(hiiren homologi ihmisen

Hath-1

) [23] – [25]. On ehdotettu, että Notch-1 ja Notch-2-toiminto redundanttisesti suolistossa, ja että kanoninen reitin aktivaatio joko näiden reseptorien on riittävä estämään erilaistumista proliferatiivisen crypt kantasolujen postmitoottisia pikarisoluja, mikä osoittaa, että Notch signalointi voisi olla altistavia pahanlaatuinen muutos [2]. Tämä on liittynyt derepressiota sykliiniriippuvaisen estäjät p27

Kip1 ja p57

Kip2 [2] sekä voimistumista

Math-1

mRNA ja proteiini [2], [26 ], [27]. Kuitenkin,

Notch-2

on myös ehdotettu olevan kasvaimen estävä vaikutus CRC [28], mikä viittaa siihen, monimutkaisia, mahdollisesti vaiheessa liittyviä funktioita Notch-signaloinnin suolistossa.

Lisäksi riippumattoman rooleja Wnt ja Notch signalointireittejä kasvainten synnyssä paksusuolessa, havainnot, että kasvaimen kehitystä APC-hiirissä lisääntyy edellyttää samanaikaisia ​​aktivoinnin Notch ja Wnt signaalit [29] ja että monet suoliston kasvaimet näyttää epänormaali aktivoituminen kummankin reittejä [3] viittaavat siihen, että molekyyli vuorovaikutusta Notch ja Wnt signalointia muodostumista CRC. Huolimatta ilmeinen merkitys tämän ylikuulumisen ja että koordinoituja toimia on raportoitu eri tasoilla [30], tiedetään vähän molekyylitason mekanismeja, jotka kytkevät nämä reittejä sisäepiteelissä. On osoitettu, että

onkos-1

ilmentyminen lisääntyy, kun Wnt reitin estyy [26] ja että

Hes-1

on välittömänä kohteena kanoninen Wnt signaloinnin peräsuolen adenoomien ja karsinoomien [29], [31] Lisäksi Jagged-1: n on osoitettu edustaa molekyylitason yhteydestä Wnt ja Notch CRC, jossa

Jagged-1

geeni säädetään suoraan β-kateniinin /Tcf-4 [32]. Välinen vuorovaikutus Wnt ja Notch CRC, ja niiden tulokset, ei täysin ymmärretä ja tulokset eri tutkimuksista ovat usein erilaiset [3], [31]. Tämä korostaa monimutkaisuus ylikuulumisen ja ehdottaa, että se ei voi yksinkertaisesti olla kysymys jaetun alavirtaan tavoitteita polkuja.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet mahdollisuuksia Wnt-signalointireitin suoraan sääntelyn geenien mukana Notch signalointi. Tämä paljasti, että useita oletetun promoottori alueiden Notch reitin liittyvät geenit sisältävät Lef-1 /Tcf-sitoutumiskohtia. Jotkut näistä geeneistä oli vaimentua ekspression toiminnallisen APC-geenin HT29 CRC-solulinja, joka tukee sitä ajatusta, että epänormaali Wnt signalointi on suora vaikutus geenien ekspressiota koodaavan proteiineja, jotka liittyvät Notch signalointia. Niinpä ehdotamme, että keskeisiin osiin Notch signalointireitin vaikuttaa suoraan Wnt signalointia seurasi, että vaikka geneettisesti normaali Notch polku voi edistää kasvainten kehittymiseen johtuen vastaus p-kateniinin tai

APC

mutaatioita.

tulokset

Järjestäjä sarjaa ja

in silico

potentiaalisten LEF-1 /TCF-sivustoja Notch koulutusjakson promoottorit

tunnistaa potentiaalisia yhteisvaikutuksia välillä Notch ja Wnt signalointireittejä, 65 geenejä, joiden tiedetään olevan tärkeitä Notch ja Wnt signalointia, valittiin bioinformatically käyttämällä Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) yhdessä laaja kirjallisuushakuja. Gene promoottorisekvenssit eristettiin käyttäen Genomatix Gene2Promoter ohjelmisto ja keskipituus oletetun ydin, proksimaalisten ja osat distaalisen promoottorit säädettiin noin 2500 emäsparin (yksityiskohdat saatavilla pyydettäessä). Avulla Matlnspector ohjelmistojen [33] promoottori sarjat putatitve LEF-1 /TCF sivustoja tunnistettiin oletetun konsensus sekvenssit: 5 ’- (A /T) (A /T) CAA (A /T) G-3 ”[34]. Kaksikymmentä neljä tutkittua geenien Notch reitin havaittiin sisältävän yhden tai useamman otaksuttu LEF-1 /TCF sivustoja (Fig. 1 ja lisätietoja S1).

In silico

analyysi geneettisen verkostojen suoraan mukana Notch ja Wnt signalointia ehdottaa päällekkäisyyttä ja suora ylikuulumisen kautta Notch kohdegeenin aktivointi kautta kanoninen Wnt signalointia. Avulla Matlnspector, [33] geenin promoottorit Notch reitin havaittiin sisältävän ainakin yhden otaksuttu LEF-1 /TCF-site (lukumäärä sivustoja kohti geeni on kuvattu hakasulkeissa). Geenit harmaissa laatikoissa alistettiin edelleen semi kvantitatiivinen RT-PCR-analyysillä.

Niinpä

in silico

analyysi geneettisen verkkojen mukana Notch ja Wnt signalointia tukee aiemmin osoittaneet vuorovaikutuksia jossa

Hes-1

[31] ja

Jagged-1

[32] ja lisäksi ehdottaa suoran ylikuulumisen kautta kohdegeenin aktivoinnin useita muita tasoilla Notch polku.

Euroopan β-kateniinin /Lef-1-kompleksi sitoutuu in vitro Notchiin koulutusjakson geenin promoottorit

onko

in silico

tunnistettu LEF-1 /TCF sitoutuvat sekvenssit fyysisesti sitoutuvat β-kateniinin /Lef-1 kompleksin

in vitro

teimme kilpailukykyinen elektroforeettisen liikkuvuuden-shift (EMSA) radioaktiivisesti leimatun konsensus LEF-1 /TCF vahva sitova koetin (CD1TOP [35]) ja duplex oligonukleotidit kattaa mahdolliset sivustoja kohde promoottorit. Notch polku EMSA promoottori antureista (taulukko S1) testattiin vastaan ​​

in vitro

käännetty Lef-1 /SS-kateniinin monimutkainen.

Varmista, että radioaktiivisesti leimattu CD1TOP sitoo Lef-1 sanottuna plasmidi vapaa retikulosyyttilysaatteja sovellettiin

in vitro

käännös- ja inkuboidaan radioleimatun koettimen. Kuten odotettua, ei ole sitovaa havaittiin (Fig. 2). Kaikki tutkituista

Notch

geenin promoottorit,

Notch-2

,

Jagged-1

,

Maml-1

,

Hes-1

,

Rfng

,

Lfng

ja

Numbl

, osoitti sitoutuminen vähintään yhden otaksuttu LEF-1 /TCF-sivuston niiden promoottorialueille tunnistettu

vuonna silico

(Fig. 2) (lisäkilpailupaineen EMSA tuloksia löytyy). Tietääksemme

Notch-2

,

Maml-1

,

Rfng

ja

Lfng

ovat uusia potentiaalisia Wnt kohdegeenien ei ole kuvattu aikaisemmin. Kaksi vahvin sitoutumiskohtien löytyivät

Jagged-1

promoottori -1933 ja -1635 suhteessa translaation aloituspaikasta, joka on sopusoinnussa aiempien tutkimusten jossa

Jagged-1

on osoitettu olevan β-kateniinin /Tcf-4 säädellään geenin ihmisen CRC [32] sekä hiiren karvatupet [36].

Hes-1

on äskettäin myös todettu olevan suora transkription kohteena β-kateniinin /Tcf-4-riippuvaisen Wnt signalointi CRC [31] ja meidän EMSA tiedot tukevat tätä käsitystä selkeästi määritelty

Hes -1

-528 kuin sitoutumiskohdan β-kateniinin /Lef-1 kompleksin (Fig. S1).

Kilpailukykyinen elektro liikkuvuus-shift määritys proksimaalisen

Notch-2

promoottori. Duplex CD1TOP Koettimet ”end merkitty” kanssa [

32P] dATP, inkuboitiin

in vitro

käännetty β-kateniinin /Lef-1 ja kilpaillulla kanssa runsaasti kylmää tai kylmä mutatoitunut promoottori duplex oligonukleotidit ( × 300 ja x 900, tässä järjestyksessä). Proteiini-DNA-kompleksit erotettiin elektroforeesilla ja visualisoitiin autoradiografialla. Koska kilpailun valvonnan kylmä CD1TOP ja kylmä mutatoitunut CD1FOP kilpaili radioleimatun CD1TOP ja vahvistamaan, että radioaktiivisen leimatun CD1TOP sitoo Lef-1 sanottuna plasmidi-vapaa retikulosyyttilysaatti alistettiin

in vitro

käännös- ja inkuboitiin radioleimatun koettimen. Gene numerointi kuvaavat paikan LEF-1 /TCF-site suhteessa geenin translaation aloituskohtaa. Säädöt kokonaan kuvan kontrastia tehtiin Adobe Photoshop CS4.

tuloksia sekä

in silico

ja DNA: ta sitovan analyysien mukaan transkription verkko yhdistää Wnt ja Notch polku , mikä toiminnallinen sääntely kanoninen Wnt signalointi useilla tasoilla Notch reitin.

Canonical Wnt signalointi säätelee Notch reitin geenien HT29 peräsuolen syövän solulinja ja hiiren suoliston adenoomia

Mutaatiotutkimukset inaktivointi

APC

geeni on keskeinen tapahtuma peräsuolen syövän synnyn ja tekee konstitutiivisen aktiivinen Wnt signalointia [13], [14]. Kehittämiseksi

in silico

ja DNA: ta sitova analyysit ja toiminnallisesti vaikutusten tutkiminen aktivoitua Wnt signaloinnin Notch reitin geenit yhdeksäntoista geenien Notch koulutusjakson, joiden tiedetään olevan tärkeitä kanoninen Notch signalointia (Fig. 1 ja Taulukko S1), joka sisältää otaksutun LEF-1 /TCF-sivustoja, valittiin jatkotutkimuksiin semi-kvantitatiivinen RT-PCR. Aktivoimaan p–Apc ja siten rajoitetaan tasoa ydin- β-kateniinin, joka on HT29 solulinjassa kuljettaa Zn-indusoituva wt-Apc vektoria käytettiin. Kuten odotettua, oli kasvua wt-Apc tasot HT29-APC, 6-24 tunnin kuluttua Zn

2 + stimulaatio, mutta ei HT29-β-gal-solut (Fig. 3A). 19 Notch reitin geenit analysoitiin semikvantitatiivinen RT-PCR ja

Hes-1

,

Hes-7

,

Notch-2

,

Maml- 1

,

Lfng

,

Rfng

,

Numb

ja

Numbl

havaittiin transkriptionaalisesti vaimentua, kun taas säätelee negatiivisesti geenin

Hath-1

oli selvästi voimistunut 18-24 tunnin kuluessa wt-Apc induktio (Fig. 3B). Positiivisena kontrollina,

sykliini D1

-geenin ilmentyminen, indusoitu β-kateniinin [37], on vaimentua 6-24 h post Zn-induktion, vahvistaa inhibitio Wnt-reitin kautta ilmentymisen wt-Apc ja vähensi β-kateniinin tasoja. Tulokset ovat yhdenmukaiset aiempien tutkimusten kanssa, joissa β-kateniinin proteiinin tasot on havaittu vaimentua [38] ja β-kateniinin /hTcf-4 ydinvoimalassa alennetaan [39], kun Zn-stimulaation HT29-APC-soluissa osoittaa, vähentynyt tasot ydinaseiden β-kateniinin. Mielenkiintoista, emme voineet havaita mitään vaikutusta Wnt signalointia ja wt-Apc ilme

Jagged-1

in HT29 vaikka vahvistettu spesifistä sitoutumista CD1TOP osoitteeseen

in vitro

käännetty Lef-1 syrjäytettiin 300-kertainen ylimäärä kylmää

Jagged-1

-1933 ja -1635 antureista, mutta ei niiden mutatoitunut variantteja (Fig. 2). Sen määrittämiseksi, onko vaimennussäätely Notch reitin geenit paino–Apc, suoraan ohjauksessa β-kateniinin, suoritimme anti-β-kateniinin siRNA hiljentäminen kokeissa (Fig. S2), käyttäen allas neljä eri siRNA: iden kohdistaminen β- kateniinin. Yleensä downregulation oli vähäisempi kuin Zn aiheuttama lasku

Notch-2

,

Numb ja Numbl

(Fig. 2A), näytetään heikko mutta johdonmukainen lasku niiden mRNA.

Hes-1

oli selvästi vaimentua 72-96 tuntia transfektion jälkeen, joka vahvistaa havainnot Peignon

et

ai. [31].

Rfng

ja

Lfng

ei vaikuttanut β-kateniinin hiljentäminen viitanneet downregulation by Wnt signalointia havaittu kuvassa. 3B ei voi olla suoraa vaikutusta β-kateniinin aiheuttama transkriptio käytetään tässä koejärjestely.

sykliini D1

käytettiin positiivisena kontrollina siRNA kokeita ja oli selvästi vaimentua 72-96 tunnin kuluttua transfektion. Testata enemmän pitkäaikaisia ​​vaikutuksia vapautettiin Wnt signaloinnin suoliepiteeliin analysoimme

Notch-1

,

Notch-2

ja

Hes-1

mRNA ekspressiotasot APC

Min /+ hiirillä (Fig. 3C), joka kantaa ituradan katkaisemalla heterotsygoottinen mutaatio kodonissa 850. mRNA-tasot on

mHes-1

havaittiin merkittävästi yliaktiivista adenoomien (mediaani suhteellinen ekspressio = 2,0, kvartiiliväli = 1,5-2,4) verrattuna normaaliin suolen limakalvon (mediaani suhteellinen ilmaisu = 1,5, kvartiiliväli = 0,9-1,7) (Mann-Whitney U-testi,

p

= 0,013), mikä osoittaa overactivated Notch signalointia hiiren adenoomia.

suuntaus voimistumista havaittiin

mNotch-2

kasvainkudoksessa (mediaani suhteellinen ilmaisu = 1,6, kvartiiliväli = 1,0-2,0) verrattuna normaaliin suolen limakalvon (mediaani suhteellinen ilmaisu = 1,3 , kvartiiliväli = 0,9-1,8) (Mann-Whitney U-testi,

p

= 0,14), kun taas tilastollisesti merkittäviä eroja voitiin havaita

mNotch-1

(mediaani suhteellinen ilmaisu = 3.9, kvartiiliväli = 2,5-5,7 (kasvainkudoksen)) vs. (mediaani suhteellinen ilmaisu = 3,8, kvartiiliväli = 2,4-5,3 (normaali kudos)) (Mann-Whitney

U

-testi,

p

= 0,9).

Wt-Apc indusoitiin HT29-APC-soluissa lisäämällä 100 uM ZnCl

2 kasvualustaan. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin cDNA käänteisesti transkriptoidaan 200 ng kokonais-RNA kunakin ajankohtana (0-24 h jälkeinen paino-Apc induktio). Bars kuvaavat suhteellista ilmentymistä

Notch-2

in HT29-APC-solut (*) versus HT29-β-galaktosidaasi-solut (**) normalisoidaan

GAPDH

ilme.

sykliini D1

käytettiin positiivisena kontrollina Wnt inaktivoitumisen. (B) proteiini ilmentymistä Apc (~310 kDa), Notch-2 (~265 kDa), p- ja kuormituksen valvonta, GAPDH, määritettiin Western blot seuraavien 0-24 h sinkkiä stimulaatiota. Säädöt kokonaan kuvan kontrastia tehtiin Adobe Photoshop CS4. (C) Suhteellinen mRNA ilmentyminen hiiren

Notch-1

,

Notch-2

ja

Hes-1

kasvaimissa ja vastaavat ei-kasvain normaalin suolen limakalvon aPC

Min /+ hiirillä. mRNA-ekspressio liittyi endogeeninen kontrolli GAPDH. Valkoiset pylväät (n = 16), mustat pylväät (n = 22). Bars esitetään mediaani ilme arvoja. Virhe palkit kuvaavat kvartiilivälejä.

Yhteenvetona inaktivaatio Wnt reitin aktivoitumisen kautta wt-APC: HT29 CRC soluissa downregulates useita kohdegeenien Notch polku taas mRNA-tasot Notch kohde

mHes-1

merkittävästi yliaktiivista suoliston kasvaimet APC hiirillä. Tämä edelleen tukee suoraa transkription ylikuulumisen ehdottamat

in silico

ja

in vitro

DNA-sitovan analyysejä.

in silico

tunnistettu Notch- 2-promoottori sisältää neljä oletetun LEF1 /TCF-sivustoja ja edistää korkea lusiferaasi-geenin aktiivisuus

Notch-2 toimii redundanttisesti, jossa Notch-1 paksusuolen epiteelisoluissa, jossa molemmat geenit ovat tärkeitä pitämään solut krypta in proliferatiivista ja erilaistumaton tila [2]. Kuitenkin suhteellisen vähän tiedetään transkription säätelyn

Notch

geenien ja mahdollisen sääntelyn

Notch-2

kautta Wnt signaloinnin voisi olla merkitystä kehitettäessä ja /tai etenemistä CRC ja potentiaalisesti muiden pahanlaatuisten kasvainten samoin. Aikaisemmin on osoitettu, että sekä

Hes-1

ja

Jagged-1

ovat kohdistu suoraa kanoninen Wnt signaloinnin CRC [31], [32]. Tuloksemme

in silico

,

in vitro

DNA-sitova analyysit ja aktivointi paino-Apc, viittaavat vahvasti siihen, että on olemassa suora positiivinen säätely

Notch-2

kautta Wnt-signaloinnin. Näin ollen halusimme edelleen selvittämiseksi β-kateniinin /Lef-1 /Tcfs säännellään potentiaalia

Notch-2

promoottorin CRC solulinjoissa HT29 ja HCT116.

Kuten edellä on kuvattu,

in silico

analyysejä käytettiin tunnistamaan ihmisen

Notch-2

promoottorin ja mahdollisesti transkription aloituspaikan (TSS) havaittiin 256 bp ylävirtaan translaation aloituspaikan, tarkistaa tulos Gene2Promoter analyysin. Neljä otaksuttu LEF-1 /TCF konsensus sivustoja tunnistettiin ydin ja proksimaalinen promoottorialue asemissa -2261, -869, -689 ja -110 suhteessa translationaalisen aloituskohdan (Fig. 4A). -110 Päällä osoitti vahvaa sitoutumista Lef-1

in vitro

DNA sitova kilpailukykyinen EMSA määrityksessä samalla sivustoja -2261 ja -689 osoitti heikkoa sitoutumista (Fig. 2).

(A ) Kaaviokuva proksimaalisen

Notch-2

promoottori neljällä otaksuttu LEF-1 /TCF-sitovaa konsensus sivustoja, tunnistetaan Genomatix Matlnspector, asemissa -2261, -869, 0,689 ja -110 suhteellinen translaation aloituskohtaa (ATG). Mahdollinen transkription aloituskohdasta kartoitettiin asentoon -256 käyttäen Genomatix Gene2Promoter ja PromoterInspector ohjelmistoja. Isot kirjaimet tarkoittavat ydin konsensussekvenssi. (B) N2PR -2327 /-99, N2PR -110 pGL3-TATA kuten myös tyhjät pGL3-TATA (Smith

et al

, 2002 [40]) transfektoitiin HCT116 ja ja ko-transfektoitiin pSV-β-galaktosidaasi kontrollivektorilla. Solulysaatista 24 tuntia transfektion jälkeen alistettiin lusiferaasireportterista määrityksiä ja suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus määritetty. Virhepalkkeja kuvaavat SEM.

analysoimiseksi

Notch-2

promoottori, keskityimme 2200 nukleotidin alueella, joka kattaa sekä 5 ’ja 3’ alueilla

Notch -2 otaksuttu

transkription aloituskohdasta. Kaksi erillistä konstruktit tuotetaan, yksi ulottuen asema -2327–99 (N2PR -2327 /-99) (numerot suhteessa translationaalisen aloituskohdan), mikä kattaa kaikki neljä otaksuttu LEF-1 /TCF-sivustoja ja toinen kattaa otaksuttu LEF- 1 /TCF-site -110. Ne kloonattiin tulikärpäsen lusiferaasi reportteri-vektoriin (pGL3 lusiferaasireporttiterilla vektori, Promega), joka sisälsi TATA-laatikko voidaan havaita mahdolliset edistäjän ja repressori

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT elementtejä (kuvattu aiemmin [40]). Konstruktit transfektoitiin lyhytaikaisesti HCT116 tai HT29-soluihin ja reportterigeenin toiminnan mitattiin 24 tuntia transfektion jälkeen. -Promoottorin aktiivisuus on parannettu 13-kertainen N2PR -2327 /-99 vs. 1,7-kertainen N2PR -110 promoottorikonstruktiin verrattuna tausta HCT116-solulinjoissa (p 0,007 vs. p = 0,04, n = 6 (Fig. 4B )). Lusiferaasi määritys osoittaa, että kloonattu alue oletetun

Notch-2

promoottori sisältää tehostajaelementit joka parantaa transkription lusiferaasigeenin. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, sijainti ydin, proksimaalisesta ja osien distaalisesta

Notch-2

promoottori jonka osoittaa

in silico

analyysiin.

yli-ilmentyminen β-kateniinin, Lef-1 tai Tcf-4 tulos kasvoi Notch-2 promoottorin aktiivisuuden

Notch-2

mRNA ja proteiini tasoilla ovat selvästi vaimentua 18-24 tunnin kuluessa Zn-induktion wt-APC HT29-soluissa (kuvio. 3B ja B).

Notch-2

mRNA ilmentyminen analysoitiin myös seuraavat

RNAi

vaiennettu β-kateniinin HT29 jossa heikompi vaikutus havaittiin samanlainen kuin muut paino-Apc /β-kateniinin säännelty Notch polku geenien (kuvio. S2).

tulokset HT29-APC solulinja, jossa APC aktivoitiin tai β-kateniinin vaiennettu, merkitse aktivoiva rooli Wnt-reitin päälle

Notch-2

ja loppupään kohdegeenin

Hes-1

[31].