Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

joukossa gynekologiset syövät, munasarjasyöpä on toiseksi yleisin ja on korkein kuolleisuus. Syöpä on geneettinen sairaus ja syntyy johtuen kertymistä somaattisten mutaatioiden kriittisissä geenejä. Ymmärtäminen geneettisen perustan munasarjasyöpä vaikuttaa sekä varhaisen havaitsemisen ja terapeuttisen intervention tässä potilasryhmässä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Viisitoista munasarjasyövän solulinjoissa, käytetään yleisesti in vitro kokeissa seulottiin mutaatioita käyttämällä kaksisuuntaista suoraa sekvensointia kaikilla koodaavat alueet

BRAF

,

MEK1

ja

MEK2

.

BRAF

mutaatioita tunnistettiin neljä viidestätoista munasarjasyövän solulinjoissa tutkittu. Yhdessä nämä neljä solulinjoja sisälsi neljä erilaista

BRAF

mutaatioita, joista kaksi oli uusia. ES-2 oli yhteinen B-Raf p.V600E eksonissa 15 ja Hey sisälsi eksoni 11 missensemutaatio, p.G464E. Kahden uusi B-Raf-mutantit tunnistettiin oli 5 aminohapon heterotsygoottinen poistetaan p.N486-P490del in OV90, ja eksoni 4 missense vaihdosta p.Q201H in OVCAR 10. Yksi solulinjojen, ES-2, sisälsi mutaation MEK1, erityisesti uutta heterotsygoottinen missensemutaatio korvaaminen, p.D67N joka johtui nt 199 G → siirtyminen. Yksikään solulinjoista sisälsivät koodaavan alueen mutaatiot

MEK2

. Toiminnallinen karakterisointi MEK1 mutantti p.D67N lyhytaikaisella transfektiolla myöhempien Western blot-analyysi osoitti kasvoi ERK-fosforylaation kontrolleihin verrattuna.

Johtopäätökset /merkitys

Tässä tutkimuksessa raportoimme novel

BRAF

mutaatiot eksonin 4 ja eksonin 12 ja raportoivat ensimmäisen mutaation

MEK1

liittyvät ihmisen syöpään. Toiminnalliset tiedot osoittavat

MEK1

mutaatio voi neuvotella muuttamista aktivointi kautta MAPK-reitin. Merkitys Näiden löydösten että

BRAF

ja

MEK1 /2

mutaatiot voivat olla yleisempiä kuin ennakoitua munasarjasyövän, jotka voivat olla merkittäviä vaikutuksia potilaiden hoitoon tämän taudin ja ehdottaa mahdollisia uusia hoitokeinoja.

Citation: Estep AL, Palmer C, McCormick F, Rauen KA (2007) Mutation analyysi

BRAF

,

MEK1

ja

MEK2

15 munasarjasyöpäsolu Lines: Implications for Therapy. PLoS ONE 2 (12): e1279. doi: 10,1371 /journal.pone.0001279

Academic Editor: Amanda Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 heinäkuu 2007; Hyväksytty 13 marraskuuta 2007; Julkaistu: 05 joulukuu 2007

Copyright © 2007 Estep et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: NIH avustus HD048502 (KAR) edellyttäen osarahoitusta. Canary Säätiö osarahoitusta. Kanarian Säätiö ei ollut rooli kerääminen, analysointi ja tietojen tulkinnassa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjojen syöpä on toiseksi yleisin gynecologic syöpä Yhdysvalloissa vaikuttavat noin 22000 naista vuosittain aiheuttaen arviolta 15200 kuolemantapausta [1]. Syöpä on geneettinen sairaus johtuvat kertyminen somaattisten mutaatioiden geenien kriittinen solureiteillä. Nämä mutaatiot johtavat tyypillisesti proteiinit, jotka osoittavat niiden kasvaimia synnyttävän vaikutuksen muuttamalla signaloinnin kautta elintärkeä transduktion verkkojen tai haploinsufficiency kriittisten tuumorisuppressorin proteiineja.

Ymmärtäminen geneettisen perustan munasarjasyöpä vaikuttaa sekä varhaiseen havaitsemiseen, samoin kuten terapeuttiseen interventioon tässä potilasryhmässä. Geenit, jotka on löydetty somaattisesti mutatoitu munasarjasyöpä ovat

KRAS

[2] – [5],

sääntelyviranomaisten

[2],

PIK3CA

[5] – [9 ],

PTEN

[5], [10], [11],

TP53

[5], [12], [13] ja

BRAF

[2] – [4]. B-Raf, proteiini tuote

BRAF

, on seriini /treoniini proteiinikinaasi, ja ensimmäinen mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) cascade, joka on yksi monista alavirtavaikuttajainhibiittorit polkuja Ras. Solunulkoisen ärsykkeitä johtaa aktivoitumiseen Ras, joka puolestaan ​​aktivoi Raf (A-Raf, B-Raf, ja /tai C-Raf-1). Raf sitten fosforyloi ja aktivoi MEK1 ja /tai MEK2 (MAPK-kinaasin). MEK1 ja MEK2 ovat treoniini /tyrosiinikinaaseja sekä isoformeja, joilla on kyky fosforyloida ja aktivoida ERK1 ja ERK2 (MAPK). ERK, kun aktivoidaan MEK, on ​​lukuisia soluliman ja ydin- alustoille [14]. Poikkeava ylävirtaan signalointi johtaen hyperactivated ERK avainasemassa patogeneesissä ja etenemistä noin 30% ihmisen syövissä, kuten munasarjasyöpä [15]. Tämän seurauksena, tämän reitin on ollut houkutteleva kohde kehittämiseen pienimolekyylisiä estäjiä syövän hoitoon [16].

Geenit, joka käsittää MAPK-reitin,

BRAF

,

MEK1

ja

MEK2

, systemaattisesti skannataan mutaatioita 15 munasarjasyövän solulinjoissa käyttämällä kaksisuuntaista suoraa sekvensointia kaikkien eksonien. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että B-Raf on mutatoitunut noin 28-37% on huono laatu vakavien karsinoomien [3], [17]. Tämän tiedon etsiä laajennettiin

MEK1

ja

MEK2

, kaksi geeniä yhdessä

BRAF

, jotka olemme hiljattain määritetty olevan kausaalinen varten sydän- facio -cutaneous (CFC) oireyhtymä (MIM 115150), joka on synnynnäinen poikkeavuus oireyhtymä, jossa ihmisillä on ominaista kallon ja kasvojen epämuodostumia, sydänvika ja ektodermaalinen poikkeamia [18]. Mielenkiintoista, toisin kuin ituradan mutaatioita tunnistettiin CFC-oireyhtymä, ei somaattisia mutaatioita on koskaan todettu

MEK1 /2

tahansa syöpätyypin. Meidän analyysi, uudet

BRAF

mutaatioita tunnistettiin eksonissa 4 ja eksonin 12 kahden erillisen solulinjoista. Lisäksi raportoimme ensimmäisen toiminnallisen mutaation

MEK1

liittyvät ihmisen syöpään. Merkitys Näiden löydösten että

BRAF

ja

MEK1 /2

mutaatiot voivat olla yleisempiä kuin aiemmin kirjattu munasarjasyövän, jotka voivat olla merkittäviä vaikutuksia hoitoon munasarjasyöpäpotilaalle.

tulokset

BRAF ja MEK1 mutaatiot

Perimän DNA 15 munasarjasyövän solulinjoissa seulottiin

BRAF

mutaatiot koodaus eksonien 1-18. Neljä mutaatiota tunnistettiin neljä yksittäistä solulinjoissa: OVCAR 10, OV90, Hey ja ES-2 (kuvio 1). Mikään muu solulinjat oli

BRAF

mutaatioita. Kaksi neljästä

BRAF

mutaatiota tunnistettiin olivat uusia. OVCAR 10 sisälsi nt 603 G → T transversio aiheuttaen heterotsygoottinen missense vaihdon p.Q201H eksonissa 4 (kuvio 1A). OV90 sisälsi uusi heterotsygoottinen 5 aminohapon deleetio, p.N486-P490del, eksonissa 12 (kuvio 1 B). Sen lisäksi, että kaksi uutta

BRAF

mutaatiot tunnistetaan kaksi mutaatiota, jotka on aiemmin raportoitu syöpää havaittu. Hei sisälsi nt 1391 G → Siirtymä tuloksena eksonissa 11 missensemutaatio, p.G464E (kuvio 1 C). Elektroferogrammi osoitti Heterotsygotian menetys tässä lokuksessa. ES-2 sisälsi eksonin 15, T → transversio nt 1799, korvaamalla glutamiinihapolla valiinia kohdassa 600 (p.V600E) (kuvio 1 D). Mitään näistä mutaatioista tunnistettiin kontrolleissa.

neljä

BRAF

mutaatioita tunnistettiin neljä yksittäistä solulinjoissa. A) OVCAR 10 sisälsi nt 603 G → T transversio aiheuttaen heterotsygoottinen missense vaihdon p.Q201H eksonissa 4. B) OV90 sisälsi uudenlainen heterotsygoottinen poisto alkaen nt 1457 (nuoli), joten 5 aminohapon deleetio, p.N486 -P490del, eksonissa 12. C) Hei sisälsi nt 1391 G → siirtyminen aiheuttaen heterotsygotian. D) ES-2 sisälsi eksonin 15, T → transversio nt 1799, korvaamalla glutamiinihapolla valiinia kohdassa 600 (p.V600E). E) nt 199 G → siirtymää

MEK1

eksonin 2 johti heterotsygoottiseen missensemutaatio korvaaminen, p.D67N.

Kaikki yksitoista koodaavat eksonit

MEK1

ja

MEK2

myös sekvensoitiin samalla solulinjoissa ja valvontaa. Yksi mutaatio

MEK1

tunnistettiin ES-2, joka koostuu uudenlainen heterotsygoottinen missensemutaatio korvaaminen, p.D67N, joka johtui nt 199 G → Siirtyminen (kuvio 1 E). Mikään muu nonsynonymous substituutioita MEK1 tunnistettiin. Kaikki yksitoista koodaavat eksonit

MEK2

sekvensoitiin eikä nonsynonymous substituutiot havaittu.

nukleotidi- muutos

Lisäksi nämä mutaatiot, yhteensä neljä erilaista synonyymi yhden nukleotidin polymorfismit (SNP: t), havaittiin

BRAF

(taulukko 1),

MEK1

(taulukko 2), ja

MEK2

(taulukko 3). Kolme näistä neljästä SNP: itä löydettiin viisi tai useampia viidestätoista solulinjoja, ja niitä on aikaisemmin raportoitu (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). Jotta taajuuden, kolmen synonyymi tietokantaan SNP kuuluvat: i) MEK2 p.I220I (rs10250) läsnä 11 15 solulinjojen (73%), ii) BRAF p.G634G (rs9648696) löytyy kuudessa 15 solun linjat (40%) ja, iii) MEK2 p.D151D (rs17851657) tunnistettu viidessä 15 solulinjojen (33%). Oli yksi yksilöidä MEK1 SNP OVCAR 10 johtuva nt 348 heterotsygoottinen G → Siirtyminen eksonissa 3, p.Q113Q (taulukko 2). Kaikki synonyymi SNP leimasi SEULOA (lajittelu Intoleranssi alkaen Suvaitsevainen) ja päättänyt suvaita.

toiminnallinen karakterisointi mutanttien

SEULOA käytettiin luonnehtimaan toiminnallinen merkitys nonsynonymous aminohapposubstituutioita tunnistettu B-Raf ja MEK1. B-Raf p.G464E, p.N486-P490del, p.V600E ja MEK1 p.D67N ennustettiin olevan vahingollisia vaihdot aiheuttavat muuttamista proteiinin toiminnan, kun taas B-Raf p.Q201H ennustettiin suvaita.

tukevat toiminnallisen muuttamista uuden MEK1 p.D67N mutantti tunnistettu ES-2, lyhytaikaista transfektiota HEK 293T-solujen myöhemmän Western blot-analyysi osoitti lisääntynyttä kinaasiaktiivisuutta mitattuna ERK-fosforylaation (kuvio 2). MEK1 p.D67N mutantti oli kasvanut ERK-fosforylaation villityyppiin verrattuna MEK1. Taso ERK-fosforylaation oli pienempi kuin CFC MEK1 p.Y130C mutantti, joka on tunnetusti korkea aktiivisuus (positiivinen kontrolli).

Ihmisen alkion munuaisen 293T-solut transfektoitiin ohimenevästi tyhjän vektorin, villin tyyppi MEK1, MEK1 p.Y130C (positiivinen kontrolli mutantti, joka on tunnettu korkean aktiivisuuden taso [18]) ja MEK1 p.D67N mutantti. ERK (P44 ERK1 ja p42 ERK2) fosforylaatio määritettiin Western blottauksella käyttämällä fosfospesifisiä vasta-aineita. P.D67N MEK1 mutantti oli kasvanut ERK-fosforylaation tasoon verrattuna aiheuttamien tyhjän vektorin ja villityypin MEK1. Taso ERK-fosforylaation aiheuttama p.D67N MEK1 on hieman pienempi kuin CFC MEK1 p.Y130C mutantti, jonka tiedetään olevan lisääntynyt aktiivisuus [18]. Myc-merkittyjen MEK1 esitetään transfektiotehokkuuden ja yhteensä ERK näkyy latauskontrollina.

Keskustelu

Altered signalointi kautta MAPK-reitin syövän aiheuttaa usein mutaatioista alkupään komponenttien ERK: n, mukaan lukien K-Ras, N-Ras, H-Ras, C-Raf-1 ja B-Raf [15]. Molecular tutkimukset munasarjasyövän solulinjoissa ja kasvain näytteet on tunnistettu geneettisiä mutaatioita joillakin näistä geeneistä,

KRAS

,

sääntelyviranomaisten

ja

BRAF

, jotka johtavat muuttaminen signalointi kautta tämä kriittinen polku [2], [19] – [23].

Somaattiset mutaatiot

BRAF

on raportoitu suurella taajuudella lukuisissa syövissä kuten melanooma, kilpirauhasen, peräsuolen ja munasarjojen. Noin 70 missensemutaatioita vaikuttaa 34 kodonit on raportoitu (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Syövän, suurin osa somaattisten

BRAF

mutaatiot johtavat missense substituutioita löytyy, mutta ei rajoittuen, eksonin 11 (glysiini-rikas loop) ja eksonin 15 (aktivointi segmentti) on proteiinikinaasidomeenin [ ,,,0],24]. Yksi missensemutaatio eksonissa 15 johtaa missense korvaaminen, B-Raf p.V600E, osuus on yli 90%

BRAF

mutaatioita on tunnistettu ihmisen syövän. Kiderakenteen B-Raf osoittaa, että aktivointi segmentti pidetään inaktiivisessa konformaatiossa yhdessä G-silmukka. Mutaatiot näillä kahdella alueella, glysiini-rikas silmukka ja aktivointi segmentissä uskotaan häiritä tätä vuorovaikutusta, muuntaa B-Raf osaksi aktiivisen konformaation [25].

Lisäksi somaattisista mutaatioista, ituradan mutaatioita

BRAF

äskettäin todettu aiheuttavan CFC oireyhtymä, synnynnäinen poikkeavuus häiriö jolloin ihmisillä on ominaista kallon dysmorphisms, sydämen vikoja, ektodermaalinen poikkeavuuksien ja kehitysviive [18], [26]. Suurin osa mutaatioista CFC oireyhtymä eivät kuulu eksonin 11 ja eksonin 15 proteiinikinaasidomeenin. Yleisin syy-CFC mutaatio, p.Q257R, sijaitsee eksonissa 6 runsaasti kysteiiniä sisältävän domeenin. Kuten useimmat syöpää aiheuttavia mutaatioita

BRAF

, biokemialliset tutkimukset ovat todenneet, että useimmat uudet CFC B-Raf-mutanttiproteiinit on lisääntynyt kinaasiaktiivisuutta suhteessa kinaasiaktiivisuuden villin tyypin B-Raf [18], [26 ]. Nämä tutkimukset pistemäinen, että

BRAF

mutaatioita ei ilmene ainoastaan ​​somaattisesti vaan myös ituradan, ja että mutaatiot, jotka antavat lisääntynyt kinaasiaktiivisuus eivät rajoitu niihin liittyy tyypillisesti syövän.

Kaksisuuntainen sekvensointi kaikkien koodaus eksonia

BRAF

15 hyvin tunnettu ja erittäin hyödynnetään munasarjasyövän solulinjoissa tunnistettu neljä solulinjoissa

BRAF

mutaatioita. Vain yksi solulinja oli yhteistä eksonin 15

BRAF

mutaatio. ES-2, joka on peräisin munasarjojen selvää cell carcinoma [27] oli yhteistä heterotsygoottinen p.V600E missense-mutaatio. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että B-Raf on mutatoitunut yleisimmin huono laatu munasarjojen serous karsinoomien taajuudella noin 28-37% ja että kaikki mutaatiot ovat yhteisiä B-Raf p.V600E variantti [3], [17]. Mielenkiintoista, kaksi serous solulinjat tutkittu tässä tutkimuksessa (Hey ja OV90) ei ollut yhteistä B-Raf p.V600E mutaation; kuitenkin, molemmat sisälsivät

BRAF

mutaatioita. Hei, on johdettu papillaarinen serous karsinooma [28], sisälsi eksoni 11 missense-mutaatio, p.G464E. Tämä missense-mutaatio, on kuvattu aiemmin (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), ja on myös kodoni, joka on mutatoitunut CFC-oireyhtymä ([29], Rauen, julkaisematon data). OV90 joka on johdettu serous adenokarsinooma [30] sisälsi uuden mutaation eksonissa 12 johtaa heterotsygoottinen viiden aminohapon deleetio, p.N486-P490del. Vaikka erittäin harvinainen, somaattinen eksoni 15 B-Raf in-frame poisto-insertiot on raportoitu syöpää [31], [32]. Lisäksi tunnistimme kaksi CFC yksilöiden pieni-frame deleetiot eksonissa 11 (Rauen, julkaisematon data). Lopuksi, OVCAR 10, joka on johdettu ihmisen munasarjan epiteelin syövän, oli ainutlaatuinen heterotsygoottinen missense vaihdosta p.Q201H eksonissa 4. Tämä nonsynonymous SNP ei ole tunnistettu syöpää tai CFC-oireyhtymä, ja määritettiin sietää SIFT, niin ehkä B-Raf p.Q210H edustaa harvinaista polymorfismi.

Vain kaksi munasarjasyövän solulinjoissa oli mutaatiot vaikuttavat yleensä eksonin 11/15 alueet B-Raf proteiinikinaasidomeenin. Tämä havainto herättää mahdollisuuden, että syöpään liittyvän

BRAF

mutaatioiden ulkopuolella eksonin 11/15 saattavat olla yleisempiä kuin odotettiin. Koska valtaosa

BRAF

mutaatio kyselyn julkaistut tutkimukset rajoittuvat eksonit 11 ja 15, muut mahdolliset mutaatiot näiden alueiden ulkopuolella voidaan jättää huomiotta.

tutkia toiminnallista merkitystä näiden uusien B- Raf-mutantit, kaikki tunnistetut tässä tutkimuksessa analysoitiin SIFT (https://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), online-mutaation analyysi ohjelma, joka ennustaa toiminnallisia seurauksena nonsynonymous aminohapposubstituutioita [33], [34]. Kaikki

BRAF

mutaatiota tunnistettiin ennustettiin muuttuneen proteiinin toiminnan paitsi p.Q201H. Toiminnallinen merkitys

BRAF

koodaus mutaatiot eksoneissa muihin kuin 11 ja 15 tukevat biokemialliset tutkimukset uusien ituradan mutaatioiden tunnistettu CFC. Kuten somaattisten mutaatioiden, useimmat CFC ituradan mutaatioita antaa lisääntynyt kinaasiaktiivisuutta, kun taas jotkut ovat kinaasin alentunut. Kuitenkin kaikki CFC mutaatiot, jotka ovat olleet biokemiallisesti tunnettu alter proteiinin toimintaan jossain määrin ([18], [26]; Rauen, julkaisematon data).

B-Raf on vain kaksi tiedossa loppupään -efektiboksejamme MEK1 ja MEK2 . Yrittäessään luonnehtivat mutaatio spektrin MAPK väylän munasarjasyövän, myös sekvensoitiin

MEK1 /2

ja tunnistaneet uuden MEK1 heterotsygoottinen missensemutaatio korvaaminen, p.D67N, ES-2, joka johtui nt 199 G → siirtyminen. Tämä on ensimmäinen toiminnallisia MEK mutaation liittyy syövän ja ei edusta harvinainen polymorfismi että tämä mutaatio ei ole yksilöity 40 terveillä (80 alleelit) tai 52 CFC yksilöitä (104 alleelien) olemme sekvensoitu tähän mennessä ([18 ] Rauen, julkaisematon data). Mielenkiintoista, vaikka emme olleet tunnistaneet tämän MEK1 p.D67N mutantti meidän CFC kohortissa, tämä sama MEK1 mutaatio on viime aikoina raportoitu kuin ituradan mutaatio CFC oireyhtymä [29]. Sen lisäksi

MEK1

mutaatio, ES-2 oli myös B-Raf p.V600E missense korvaaminen. Nämä kaksi mutaatiota ehkä tehneet yhteistyötä tuumorigeenisiä tapahtumia. Mikä tekee tästä havainto erityisen kiinnostavaa on se, että edellinen sekvensointi tutkimukset MEK1 /2 proteiinikinaasidomeenin ole yksilöinyt mitään mutaatioita glioomis-, kivesten sukusolujen kasvaimia, rintasyöpä ja keuhkosyöpä [35] – [38]. On huomattava, että p.D67N ES-2 kuulu proteiinikinaasidomeenin joka ulottuu AA 68-271 (www.ensembl.org/Homo_sapiens). Monet ituradan CFC mutaatiot sijaitsevat 5 ’proteiinikinaasidomeenin ([18], [29], [39], Rauen, julkaisematon data). Funktionaaliset tutkimukset näiden uusien CFC mutantteja ovat osoittaneet lisääntynyttä aktiivisuutta

in vitro

yli villityypin MEK edistämisessä ERK-fosforylaation, mutta nämä CFC mutantit eivät ole niin aktiivisia kuin keinotekoisesti luotu konstitutiivisesti aktiivinen MEK mutantti ([18]; Rauen, julkaisematon data). Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että muuttaminen N-päähän MEK lisää pohjapinta kinaasiaktiivisuuden syytetään tärkeä säätelevä rooli yhdessä substraatin tunnistaminen [40] – [42].

arvioimiseksi toiminnallinen seurauksena MEK1 s. D67N, tämä aminohapposubstituutio analysoitiin SEULOA ja todettu toiminnallisesti vaikuttaa. Vahvistavan tätä tietoa, MEK1 p.D67N transfektoitiin väliaikaisesti HEK 293T-soluihin, ja ERK-fosforylaatio mitattiin Western blot-analyysi. MEK1 p.D67N mutantti on aktivoiva osoituksena lisääntynyt ERK fosforylaation verrattuna tyhjän vektorin ja villityypin MEK1 kaksi tarkastuksia, jotka eivät aktivoi ERK. Kuitenkin taso ERK-fosforylaation varten p.D67N on pienempi kuin positiivinen kontrolli CFC MEK1 p.Y130C mutantti [18].

Lisäksi

BRAF

ja

MEK1

mutaatioita, useat synonyymi tietokantaan SNP tunnistettiin myös. B-Raf p.G634G (rs9648696) tunnistettiin 40% 15 solulinjojen, MEK2 p.I220I (rs10250) oli läsnä 73% ja MEK2 p.D151D (rs17851657) todettiin 33%: n solulinjoissa. Nämä synonyymi tietokantaan SNP: t olivat läsnä taajuudella, joka on verrattavissa aikaisemmin raportoitu (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp; [43]). Oli yksi yksilöidä

MEK1

SNP OVCAR 10 johtuva nt 348 heterotsygoottinen G → Siirtyminen eksonissa 3, p.Q113Q. Kaikki synonyymi SNP leimasi SEULOA ja päättänyt suvaita.

havainnot korostavat, että mutaatiot, jotka muuttavat funktio MAPK-reitin tärkeä rooli munasarjasyöpä [15]. Lisäksi mutaatioiden tunnistaminen keskeisten MAPK-reitin osat ovat tärkeitä määritettäessä reagointikykyä syövän hoitomuotoja, aggressiivinen ja metastaattinen käytös kasvaimen ja ennusteen potilaan. Neljä 15 (26%) solulinjat tässä tutkimuksessa oli

BRAF

mutaatioita ja 1 15 (7%) oli MEK mutaatio. On tunnettua, että

BRAF

mutaatioita on tunnistettu tietyntyyppisten munasarjasyövän; kuitenkin, mutaatiot loppupään efektoreina B-Raf lukien

MEK1

ja

MEK2

voi myös olla merkittävästi vaikuttaneet munasarjasyöpä kasvaimien syntyyn. Määrittely pathogenetics munasarjasyöpä voi mahdollistaa käytön kohdennettujen terapeuttisten, kuten pienmolekyylisalpaajilla MAPK-reitin, jotka ovat viime aikoina alkaneet osoittaa suurta lupausta [16]. Lisäksi raportti osoittaa, että solut aktivoituvat B-Raf ovat parantaneet, selektiivinen herkkyys MEK estäjiä [44]. Tuloksemme korostettaisiin että edelleen luonnehdinta herkkyys eri BRAF ja MEK mutanttien pienimolekyylinen esto on tärkeä keino jatkaa kohti kehittämään tehokkaita hoitoja munasarjasyöpä.

Methods

solulinjat ja eristäminen Genomisen DNA: n

Viisitoista munasarjasyövän solulinjoissa, jota käytetään yleisesti

in vitro

kokeissa seulottiin mutaatioita: OVCAR 3, SKOV 3, TOV-112D, A2780, OV90 ES-2, TOV-21g, Caov-3, A1847, IGROV 1, OVCAR 5, 2008, OVCAR 10, PEO1 ja Hey. Solupelletit kukin näistä solulinjoja toimitti ystävällisesti Drs. Charles Drescher ja Beatrice Knudsen. Genominen DNA eristettiin solupelleteistä käyttämällä QIAamp DNA Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neljäkymmentä tervettä ihmisen kontrolleja mukana tässä tutkimuksessa. Genominen DNA eristettiin periferaalisen veren lymfosyyttejä käyttämällä QIAamp DNA veren Midi Kit (Qiagen, Valencia, CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ohjaus näytteet saatiin osana hyväksyttyä laitos Review Board yliopistosta Kalifornian San Franciscossa.

PCR ja kaksisuuntainen Sequencing

PCR-alukkeet suunniteltiin monistamaan kaikki koodaus eksonit ja introni reunustavat alueet

BRAF

(NM_004333.2),

MEK1

(NM_002755.2) ja

MEK2

(NM_030662.2) (taulukko 4 ja taulukko 5). Sekvensointia varten, PCR-alukkeet muutettu 5′-pää sisältää M13 eteenpäin (GTAAAACGACGGCCAGT) ja taaksepäin (CAGGAAACAGCTATGACC) sekvenssit. PCR ja sekvensointi suoritettiin Agencourt Bioscience Corporation (Beverly, MA). Kaksisuuntainen sekvensointi suoritettiin ABI BigDye v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden ja ajettiin ABI3730xl kapillaarinen sekvensointi väline (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Analysis

Sekvensointitiedot analysoitiin käyttämällä kahta sekvenssianalyysiohjelmia, PolyPhred Software v5.02 (University of Washington, Seattle, WA) ja SeqScape® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Lisäksi manuaalinen tarkastelu suoritettiin mutaatio Surveyor 3.00 (SoftGenetics LLC, State College, PA). Lisäarviointia havaittujen nukleotidimutaatioita koostui lajittelu Intoleranssi alkaen Suvaitsevainen (SIFT, blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) ja seulomalla vastaan ​​tunnettu tietokantoja: NCBI, Cosmic, UniProtKB /Swiss-Prot ja JSNP (www.ncbi.nlm .nih.gov /SNP, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/, ca.expasy.org/sprot/, snp.ims.u-tokyo.ac.jp/).

Plasmidit

Human

MEK1

cDNA: ta (Origene, Rockville, MD) kloonattiin pcDNA3-vektoriin, jossa on Myc-tag: n N-päähän.

MEK1

nt 199 G → Siirtyminen tuotiin pika-Change kohdennettu mutageneesi (Stratagene, La Jolla, CA) ja varmistettiin suoralla sekvensoinnilla.

Transient transfektoinneilla ja Western Blot analyysi

Ihmisen alkion munuaisen (HEK) 293T-solut ympättiin päivää ennen kuuden kennon ruokia ja transfektoidaan, kahtena, 2 ug kokonais-DNA ja 5 ui Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Soluja seerumin puutteessa (0,5% naudan sikiön seerumia), ja 24 tuntia myöhemmin lyysattiin puskurissa, joka sisälsi proteaasi ja fosfataasinestäjällä cocktailit (Sigma, St. Louis, MO). Ekspressiotasot myc-MEK, yhteensä ERK ja fosforyloitu ERK analysoitiin Western blot. Myc (A-14) ja p-ERK (E-4) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), ja p44 /42 MAP-kinaasi-vasta ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Kiitokset

Tekijät Kiitokset Kanarian Foundation (www.canaryfoundation.org) taloudellista ja tieteellistä tukea ja Drs. Ingrid Revet ja William Tidyman varten harkittuja kommentteja ja teknistä tukea.