Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelisolujen muuttamassa järjestyksessä 2 (ECT2) on guaniininukleotidiä vaihto tekijä Rho perheen GTPaasi, joka on osallisena pahanlaatuiseen fenotyyppiin ihmisen syövissä. Tiedetään vain vähän vaikutusta korkeatasoisen ECT2 säätelyssä suun syöpäsolun käyttäytymistä. Tässä tutkimuksessa tutkimme osallistumista ECT2 suun levyepiteelisyöpä (OSCC).

Menetelmät /Principal Havainnot

Analysoimme ECT2 ilmentymistä OSCC solulinjat ja ensisijainen OSCCs verrattuna Hyväksytty normaalia kudosta (n = 96) kvantitatiivisella käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio, Western blot, ja immunohistokemia. Sitten arvioitiin korrelaation ECT2 ilmentymistilanne perusasteen OSCCs ja kliinis. ECT2 ilme oli merkitsevästi säädellään ylöspäin OSCCs

in vitro

ja

in vivo

(

p

0,05). Niistä kliininen muuttujia analysoidaan, korkeampi ECT2 ilmentyminen liittyi myös TNM vaiheessa luokittelu (

p

0,05). Kun teimme funktionaalisia analyysejä ECT2 in OSCC peräisin olevia soluja käyttäen shRNA järjestelmä, solujen proliferaatiota ECT2 pudotus solut vähenivät merkittävästi kontrolliin verrattuna soluihin (

p

0,05). Solusyklianalyysiä virtaussytometrialla osoitti pidätys solusyklin etenemisen klo G1 vaihe ECT2 pudotus soluja. Olemme myös löytäneet säätely ylöspäin CIP /Kip perheen sykliiniriippuvaisen estäjät, p21

CIP1 ja p27

kip1, ja alas-säätely sykliini D1, sykliini E, ja CDK4. Nämä tiedot osoittivat, että kohonnut CIP /Kip perhe inhiboivan vaikutuksen sykliini D1-CDK monimutkainen toiminta johtaa solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa.

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme ehdotettu ensimmäistä kertaa, että ECT2 on indikaattori soluproliferaatiota OSCCs ja että ECT2 voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde uusien hoitojen OSCCs.

Citation: Iyoda M, Kasamatsu A, Ishigami T, Nakashima D, endo-Sakamoto Y, Ogawara K, et ai. (2010) epiteelisolujen muuntaminen Sequence 2 Human Oral Cancer. PLoS ONE 5 (11): e14082. doi: 10,1371 /journal.pone.0014082

Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 28 lokakuu 2010; Julkaistu: 29 marraskuu 2010

Copyright: © 2010 Iyoda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Grant-in-Aid Scientific Research (nro 20592353) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun levyepiteelisyöpä (OSCC) on merkittävä syy sairastuvuutta ja kuolleisuutta maailmanlaajuisesti, mikä vastaa 275000 uutta tapausta ja yli 120.000 kuolemaa vuodessa [1]. Monet riskitekijät on tunnistettu, kuten tupakan ja alkoholin käyttö [2], [3], [4]. Jotkut potilaat kehittää OSCC ilman riskitekijöitä, mikä viittaa siihen, että isäntä alttius on tärkeä rooli. Molecular muutoksia useiden onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille liittyy kehittämiseen OSCC saattaa olla tärkeää vihjeitä estää tämän taudin [4], [5].

Microarray tekniikka on ollut hyödyllinen analysointiin muutoksia tuhansia geenejä ja merkityksellisten kuvioita. Olemme aiemmin raportoitu geenin ilmentymisen profilointia OSCC tunnistaa syöpään liittyvien geenien [6]. Niistä geenit, epiteelisolujen muuttamassa järjestyksessä 2 (ECT2) oli merkitsevästi säädellään ylöspäin OSCC. ECT2 on guaniininukleotidiä vaihto tekijä (GEF) ja Rho perheen GTPaasina liittyvät sytokineesiin [7], [8], [9], [10], [11]. GEFs katalysoivat vaihtoa BKT GTP, siten aktivoimaan Rho GTPaasit signaalinsiirtomekanismeissa. ECT2 ilmentymistä ohjataan dynaamisesti koko solusyklin aikana. Kun jakautuminen ydin- kirjekuoren mitoosin aikana, ECT2 on hajallaan solulimassa, sitten ECT2 tulee lokalisoitu mitoottisiin karat aikana metafaasissa, lohkaisu vako telofaasin aikana hitaasti liikkuvista ja keskivartalon lopussa sytokineesin [8]. Rho-GTPaasit ovat sekaantuneet pahanlaatuinen fenotyyppi ihmisen syöpien seurauksena niiden osallistumisesta poikkeavien signalointi kasvainsoluissa [12], [13], [14], [15], [16], [17].

nykyisessä tutkimuksessa ECT2 oli usein yli-ilmennetään OSCC solulinjat ja ensisijainen OSCCs. Lisäksi shRNA koe osoitti, että ECT2 alassäätöä alensivat solujen lisääntymistä solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa. Siksi ehdotimme, että ECT2 voi olla biomarkkeri leviämisen ja mahdollisten terapeuttinen kohde OSCCs.

Tulokset

arviointi

ECT2

mRNA: n ekspression OSCC solulinjat

tutkimiseksi mRNA ilmentymisen

ECT2

tunnistettiin syöpään liittyvien geeni meidän mikrosiruanalyysillä [6], suoritimme kvantitatiivinen käänteistranskriptaasia PCR (qRT-PCR) analyysi käyttämällä kuutta OSCC peräisin oleva solu linjat (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, ja Sa3) ja ihmisen normaali suullinen keratinosyyttejä (HNOKs). mRNA: n ilmentymisen tasot normalisoitiin GAPDH.

ECT2

mRNA oli merkittävästi säädelty kaikissa OSCC solulinjoissa verrattuna HNOKs (kuvio 1A, *

p

0,05).

(A) kvantifiointi

ECT2

mRNA-tasoja in OSCC solulinjat mukaan qRT-PCR-analyysillä. Määrittämään mRNA: n ilmentymisen

ECT2

Suun syövän, suoritimme qRT-PCR-analyysi käyttäen kuuden OSCC solulinjat (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, ja Sa3 ) ja HNOKs. Merkittävät säätely ylöspäin

ECT2

mRNA nähdään kuusi OSCC solulinjat verrattuna että HNOKs. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM-arvot kolmesta määritykset (*

p

0,05, Mann-Whitney

U

testi). (B) Western blot-analyysi ECT2 proteiinin OSCC solulinjat ja HNOKs. Tutkia proteiinin ilmentymisen ECT2 suun syövän, teimme Western blot-analyysi käyttämällä kuutta OSCC solulinjat (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, ja Sa3) ja HNOKs. ECT2 proteiinin ilmentyminen on säädelty vahvistavasti OSCC solulinjat verrattuna HNOKs. Densitometrinen ECT2 proteiini Aineisto on normalisoitu a-tubuliinin proteiinin tasoja. Arvot on ilmaistu prosentteina HNOKs.

arviointi ECT2 proteiinin ilmentymisen OSCC solulinjat

suoritettiin Western blot-analyysi tutkia ECT2 proteiinin ilmentymisen tila OSCC solulinjat ja HNOKs (kuvio 1 B). Molekyyli- paino ECT2 oli 112 kDa. Merkittävä kasvu ECT2 proteiinin ilmentyminen havaittiin kaikissa OSCC solulinjoissa verrattuna HNOKs. Expression analyysi osoitti, että sekä transkriptio ja kääntäminen tuotteita tämän molekyylin olivat erittäin ilmaistaan ​​OSCC solulinjat.

arviointi ECT2 ilmaisun ensisijainen OSCCs

mitattiin

ECT2

mRNA ekspressiotasot ensisijainen OSCCs ja pariksi normaali suullinen kudokset 96 potilasta. Samanlainen datan OSCC solulinjat, qRT-PCR-analyysi osoitti, että

ECT2

mRNA: n ekspressio oli säädelty 75 (78%) 96 ensisijaisen OSCCs verrattuna vastaaviin normaaleihin suun kudoksiin. Suhteellinen mRNA ekspressiotasot normaalissa suun kudosten ja ensisijaisen OSCCs vaihteli 0,003-1,632 (mediaani, 0,081) ja 0,005-4,39 (mediaani, 0,289), (kuvio 2,

p

0,05).

tutkimiseksi

ECT2

mRNA ekspressiotasot ensisijainen OSCCs ja pariksi normaali suun kudoksia 96 potilasta, suoritimme qRT-PCR-analyysillä. Suhteellinen mRNA ekspressiotasot ensisijainen OSCCs ja vastaavan suun kudoksiin (n = 96) vaihtelevat 0,005-4,39 (mediaani, 0,289) ja 0,003-1,632 (mediaani, 0,081), tässä järjestyksessä.

ECT2

-mRNA säädellään ylöspäin 75 (78%) 96 ensisijaisen OSCCs verrattuna vastaaviin normaaleihin suun kudoksiin. Merkittävästi suurempia

ECT2

mRNA: n ekspressio havaittiin ensisijaisesti OSCCs kuin vastaaviin normaaleihin suun kudoksiin (

P

0,05, Mann-Whitney

U

testi).

sitten analysoimme ECT2 proteiinin ilmentymistä immunohistokemiallinen (IHC). Edustavia IHC tulokset ECT2 proteiinia normaalissa suun kudosten ja ensisijainen OSCC on esitetty kuvassa 3A ja B. Positiiviset immunoreaktiotuotteet varten ECT2 havaittiin tumassa ja sytoplasmassa. Vahva ECT2 immunoreaktioita havaittiin OSCCs, kun taas normaali suullinen kudosten osoitti negatiivista immunovärjäyksen. ECT2 IHC tulokset normaalien suun kudosten ja OSCCs vaihteli 8,33-85,33 (mediaani, 44,00) ja +55,67-+211,33 (mediaani, 163.33), tässä järjestyksessä. ECT2 IHC arvosanat ensisijainen OSCCs olivat huomattavasti korkeammat kuin normaaleissa kudoksissa (kuvio 3C,

p

0,001). Väliset korrelaatiot ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia potilaiden OSCC ja asema ECT2 proteiinin ilmentymisen käyttäen IHC pisteytysjärjestelmä on esitetty taulukossa 1. Yksi kliinisen luokittelun, ECT2-positiiviset OSCCs korreloivat kasvaimen kokoa (

p

= 0,043) ja TNM lavastus OSCC (

p

= 0,044) (taulukko 1).

(A, B) edustaja IHC tulokset ECT2 normaalissa suun kudosten ja ensisijainen OSCC. (A) Normaali suullinen kudos ei ECT2 proteiinin ilmentymisen. Alkuperäinen suurennus, × 100. Mittaviivat 50 pm. (B) ECT2-positiivisia tapauksia OSCC. Positiivinen immunoreaktiotuotteet for ECT2 havaitaan tumassa ja sytoplasmassa. Alkuperäinen suurennos, × 400. Mittaviivat 10 pm. (C) tila ECT2 proteiinin ilmentymistä nomal suun kudosten ja ensisijainen OSCC. Tutkimaan proteiinin ilmentymisen ECT2 perusterveydenhuollossa OSCCs, suoritimme IHC. ECT2 IHC tulokset lasketaan seuraavasti: IHC pisteet = 1 × (joitakin heikkoja värjäytyneiden solujen alalla) + 2 x (lukumäärä kohtalaisen värjäytyneiden solujen alalla) + 3 × (lukumäärä voimakkaasti värjätään solujen alalla) . ECT2 IHC pisteet OSCCs ja normaali suullinen kudosten vaihtelevat +55,67-+211,33 (mediaani, 163.33) ja 8,33-85,33 (mediaani, 44,00), tässä järjestyksessä. ECT2 ekspressiotaso in OSCCs on huomattavasti suurempi kuin normaalissa suun kudoksissa (

p

0,001; Mann-Whitney

U

testi).

perustaminen ECT2 pudotus solujen

Jos haluat saada vakaa ECT2 pudotus transfektantit, käytimme ECT2 shRNA (shECT2) plasmidi ja ohjaus shRNA (Mock) plasmidi. Arvioida ECT2 mRNA ja proteiinin ilmentyminen in shECT2-transfektoiduissa soluissa, suoritimme qRT-PCR ja Western blot -analyysit. Kuvio 4A osoittaa, että

ECT2

mRNA: n ekspression shECT2-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi alhaisempi kuin Mock-transfektoiduissa soluissa. ECT2 proteiinin tasot shECT2-transfektoiduissa soluissa myös pieneni merkittävästi verrattuna Mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 4B). ECT2 proteiinin ekspressiotasot vastasivat mRNA: n ekspression transfektanteista.

saamiseksi vakaan ECT2 pudotus transfektantit, teimme transfektion ECT2 shRNA (shECT2) ja ohjaus- shRNA (Mock) in OSCC solulinjoissa (Sa3 ja H1). Suoritimme qRT-PCR ja Western blot -analyysit tutkia ECT2 mRNA ja proteiinin ilmentyminen in shECT2-transfektoiduissa soluissa. (A) ilmentyminen

ECT2

mRNA shECT2- ja Valetransfektoitu Sa3 soluissa. (B) Western blot-analyysi ECT2 proteiinin shECT2- ja Mock-transfektoiduissa soluissa. ECT2 mRNA ja proteiinit ovat merkittävästi säädellä vähentävästi shECT2-transfektoiduissa soluissa.

Alennettu solujen kasvua ECT2 pudotus soluissa

tutkimiseksi antiproliferatiivisia vaikutuksia shECT2-transfektoiduissa soluissa, solu kasvua seurattiin 7 päivää. ShECT2-transfektoidut solut osoittivat merkittävää vähenemistä solujen kasvua verrattuna Mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 5).

vaikutuksen määrittämiseksi shECT2 on solujen lisääntymisen, shECT2- ja Mock-transfektoidut solut ympättiin 6 kuoppaiset levyt tiheydellä 1 x 10

4 elävää solua kuoppaa kohti. shECT2- ja Valetransfektoitu solut laskettiin 7 peräkkäisenä päivänä. Kasvu shECT2-transfektoitujen solujen inhiboi merkittävästi verrattuna Valetransfektoitu soluissa, sen jälkeen 7 päivää. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM arvoja kolmesta määrityksissä. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja jäljitellyistä ja shECT2-transfektoidut solut (

p

0,01, Mann-Whitney

U

testi).

knockdovvn ECT2 edistää solusyklin pysähtymisen

tutkimiseksi mekanismi, jonka ECT2 liittyy solusyklin etenemistä, teimme FACS-analyysi shECT2-transfektoitujen solujen. Prosenttiosuus G1 vaiheen shECT2-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi suurempi kuin Mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 6A,

p

0,05), mikä viittaa siihen, että down-regulation of ECT2 inhiboi solujen lisääntymisen indusoimalla G1 pidätys. Tunnistaa mekanismia, jolla ECT2 lohkot G1 etenemistä, arvioimme ilmentymistaso sykliiniriippuvaisen estäjät (p16

INK4a, p21

CIP1, p27

kip1), sykliini D1, sykliini E, ja CDK4 (kuvio 6B). PCR tiedot osoittivat säätely ylöspäin

p21

CIP1

ja

p27

kip1

ja alas-säätely

sykliini D1

,

sykliini E

,

ja CDK4

in shECT2-transfektoiduissa soluissa.

tutkimiseksi solusyklin etenemisen, analysoimme virtaussytometrinen määritys DNA-pitoisuuden jonka FACScalibur G0-G1, S, ja, G2-M-vaiheisiin. Sitten määritetään ekspressiotaso sykliini-riippuvaisen kinaasin estäjät (p16

INK4a, p21

CIP1 ja p27

kip1), sykliini D1, sykliini E, ja CDK4 tunnistaa mekanismia, jolla ECT2 lohkot G1 etenemistä. (A) virtaussytometrinen analyysi suoritettiin tutkimaan solusyklin shECT2- ja Mock-transfektoiduissa soluissa. Solujen lukumäärä G1 on kasvanut merkittävästi vuoden ECT2 pudotus soluja. (B) qRT-PCR suoritettiin tutkimaan mRNA tasoilla solusyklin liittyviä geenejä. PCR näkyy säätely ylöspäin

p21

CIP1

ja

p27

kip1

ja alas-säätely

sykliini D1

,

sykliini E

,

ja CDK4

. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM-arvot kolmesta määritykset (*

p

0,05, Mann-Whitney

U

-testi).

Keskustelu

aikaisemmat microarray data [6] osoitti merkittäviä säätely ylöspäin

ECT2

in OSCC solulinjat. Esillä olevassa tutkimuksessa, ECT2 mRNA ja proteiini olivat erittäin ilmaistaan ​​

in vitro

ja

in vivo

in OSCC. Alueelliset kopioluku 3q26 nousu useissa syövissä, kuten pään ja kaulan, keuhko-, ja kohdunkaula [18], [19]. Tämä alue on syöpään liittyvien geenien (PRKC1 ja Sox2) sekä ECT2. Siksi genominen epäsymmetria olisi syy ECT2 yli-ilmentymisen OSCC. ECT2 proteiinin ekspressiotasot ensisijainen OSCCs korreloivat TNM vaiheessa luokittelu (taulukko 1) (

p

0,05). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ECT2 on tärkeä rooli OSCC kehittymistä ja etenemistä. Kuitenkin tiedetään vähän mekanismi ECT2 in OSCC etenemistä. Voit selvittää ECT2 toiminto on merkitystä OSCC etenemiseen, me suorittaneet shECT2 kokeen ja totesi, että solujen lisääntymistä väheni merkittävästi seurauksena solusyklin pysähtymisen G1 vaiheeseen ECT2 pudotus solujen säätely ylöspäin p21

CIP1 ja p27

kip1 ja alas-säätely sykliini D1, sykliini E, ja CDK4, mikä osoittaa, että ECT2 toiminto liittyy läheisesti OSCC etenemiseen.

GEFs, kuten ECT2, katalysoivat vaihtoa BKT GTP, aktivoiden Rho GTPaasit signaalinsiirtomekanismeissa [7], [8], [9], [10], [11]. Aktivoidut Rho GTPaasit sitoutuvat ja aktivoivat useita alavirran -efektiboksejamme johtaa useita biologisia prosesseja, kuten solun koon, solusyklin etenemistä, apoptoosin, selviytyminen, morfologia, cellular napaisuus, soluadheesiota, ja kalvokuljetuksessa [20], [21]. Up-regulation of Rho GTPaasi-aktiivisuus, liittyy usein tuumorigeneesiin [22], on todettu, että useissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien haima-, rintasyövän, melanooma, keuhkosyöpä, kolorektaalisyöpä, ja mahasyövän [12], [23]. Toisaalta, Rho GTPaasit on merkittävä rooli edistettäessä G1-S etenemisen kautta modulaatio sykliini ja sykliiniriippuvaiset estäjät (CDKIs) [24], [25]. Yamamoto et ai. kertoi, että kun Rho GTPaasina estyi

Clostridium botulinum

C3 toksiini tai dominantti negatiivinen mutantti, G1-S solusyklin etenemistä merkittävästi alentunut [26]. Heikentyneestä aktivointi GTPaaseja liittyy konstitutiivisesti kohonneet p21

CIP1 ja p27

kip1 aiheuttaen solujen kerääntyä G1 vaiheessa [27], [28], [29], [30], [31 ], [32]. Me arveltu, että ECT2 pudotus johtaa heikentynyt aktivoinnin Rho GTPaasina, ja joka on yhdenmukainen, löysimme paitsi säätely ylöspäin CIP /Kip perhe (p21

CIP1 ja p27

kip1), mutta myös alas-säätely sykliini D1, sykliini E, ja CDK4, mikä johtaa solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa, ECT2 pudotus soluissa.

sykliini D1, sykliini E, ja CDK4 ovat myös kriittinen säätelijä G1 etenemisen ja G1-S siirtyminen. Esto sykliini D1, sykliini E, ja CDK4 ilmaisu lohkot G1-S siirtymisen solusyklin [33], [34], [35], [36]. Sykliinit D1-D3 ja E perheitä ja niiden kinaasi kumppanit, CDK4 /6 ja CDK2, ovat vastuussa sääntelystä siirtymistä G1 S-vaiheessa. Toiminta sykliini-CDK-kompleksit moduloidaan kahdenlaisia ​​CDKIs, CIP /Kip (p21

CIP1, p27

Kip1, ja p57

Kip2) ja INK4 (p15

INK4B, p16

INK4a, p18

INK4C, ja p19

INK4D) perheitä, jotka molemmat säätelevät solusyklin etenemisen [37]. Jäsenet CIP /Kip perhe sitoutuvat sykliini-CDK-komplekseja ja estävät niiden toiminnan, mikä johtaa vähentyneeseen fosforyloidun retinoblastoomaproteiiniin ja G1 solusyklin pysähtymiseen.

Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että ECT2 yli-ilmentyy usein OSCC . Lisäksi ECT2 pudotus esti solujen lisääntymistä

in vitro

pidättämällä solusyklin etenemistä on G1-vaiheessa ilmentymisen moduloimiseen solusykliin liittyvien molekyylien, joka lopulta johtaa inhibitioon sykliini D1-CDK kompleksin aktiivisuutta. Nämä tiedot osoittivat, että ECT2 on tärkeä rooli OSCC solujen lisääntymisen. ECT2 ilmaisu on todennäköisesti biomarkkereiden leviämisen ja mahdollisen terapeuttisen kehityskohde syöpälääkkeiden perusterveydenhuollossa OSCCs.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki potilaat tarjotaan tietoisen suostumuksen protokolla tarkistettava ja hyväksynyt Institutional Review board of Chiba University. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta potilailta.

OSCC solulinjat ja kudosnäytteiden

HSC-2, HSC-3, HSC-4, ja Ca9-22 solulinjat, johdetut ihmisen OSCCs, hankittiin Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japani). H1 ja Sa3 solulinjoja ystävällisesti tri S. Fujita at Wakayama Medical University (Wakayama, Japani). Ensisijainen viljeltiin HNOKs saatiin kolme terveiltä luovuttajilta [38], [39]. Kaikki solut kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium /F-12 HAM (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Sigma) ja 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä (Sigma).

kudosnäytteitä 96 etuyhteydettömältä japani primaarisessa OSCC jotka hoidettiin Chiba University Hospital saatiin aikana poistettu kirurgisella. Resektoitua kudokset jaettiin kahteen osaan, joista toinen jäädytettiin välittömästi ja varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n eristys, ja toinen, joka on vahvistettu 10%: puskuroidussa formaldehydiliuosta patologista diagnosointiin ja IHC. Histopatologisten analyysi kudosten suoritettiin Maailman terveysjärjestön kriteerien Department of Pathology, Chiba University Hospital. Ennusteeseen viittaavia pysähdyspaikan määritettiin TNM luokittelu International Union syöpää vastaan. Kaikilla potilailla oli OSCC, joka oli histologisesti vahvistettu, ja kasvaimen tarkastettiin sen varmistamiseksi, että kasvainkudoksen oli läsnä yli 90%: n näytteen.

valmistaminen cDNA

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA tuotettiin 5 ug kokonais-RNA käyttäen Ready-To-Go You-Prime First-Strand helmiä (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ja oligo (dT) alukkeen (Sigma Genosys, Ishikari, Japani), mukaan valmistajan ohjeiden .

mRNA: n ilmentymisen analyysi

Reaaliaikainen qRT-PCR suoritettiin arvioimiseksi ekspressiotasoja kohdegeenien (

ECT2

,

p16

INK4a

,

p21

CIP1

,

p27

kip1

,

sykliini D1

,

sykliini E

, ja

CDK4

) in OSCC peräisin olevia soluja ja ensisijainen OSCCs. qRT-PCR suoritettiin yhdellä menetelmällä käyttäen LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green 1 Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa). Seuraavia alukkeita käytettiin: ECT2, eteenpäin 5′-ATTTTCATGTCGCCCGTTGT-3 ’ja reverse 5′-CCCATGTGATGGACCAATGTC-3’; p16

INK4a, eteenpäin 5′-CAGACATCCCCGATTGAAAGAAC-3 ’ja reverse 5′- GGTAGTGGGGGAAGGCATATATCT-3’; p21

CIP1, eteenpäin 5′-CCCAGTTCATTGCACTTTGATTAGC-3’and käänteinen 5′- CAGTCTAGGTGGAGAAACGGGAAC-3 ’; P27

kip1, eteenpäin 5′-CCGGCTAACTCTGAGGACAC-3’and käänteinen 5′- AGAAGAATCGTCGGTTGCAG-3 ’; sykliini D1, eteenpäin 5′-GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA-3’and käänteinen 5’- CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC-3 ’; sykliini E, eteenpäin 5′-TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC-3’and käänteinen 5’- TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC-3 ’; CDK4, eteenpäin 5′-TGCAACACCTGTGGACATGTG-3’and käänteinen 5’- ATTTTGCCCAACTGGTCGG-3 ’. Monistetut tuotteet analysoitiin 3% agaroosigeelielektroforeesilla selvittää koko ja puhtaus. PCR-reaktiot käyttäen LightCycler laitteistoa suoritettiin lopullisessa tilavuudessa 20 ui reaktioseoksessa, joka koostui 2 ui FirstStart DNA Master SYBR Green I sekoita, 3 mM MgCI

2, ja l uM alukkeita, mukaan valmistajan ohjeita. Reaktioseos ladattiin lasikapillaariputkis- ja siihen kohdistetaan alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 45 kierrosta vahvistus 95 ° C (10 sekuntia) ja denaturoinnin, 62 ° C (10 sek) hehkutus, ja 72 ° C (10 sek) jatkamista, joiden lämpötila kaltevuus 20 ° C /sek. Otteen määrät kohdegeenien arvioitiin vastaavista standardin käyriä ja normalisoidaan glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) (eteenpäin 5′- CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’and käänteinen 5′- GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ’) transkriptin määritettyä määrää vastaavat näytteet.

proteiinin uutto

solut pestiin kahdesti kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja sentrifugoitiin lyhyesti. Solupelletit inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan lyysipuskuria (7 M urea, 2 M tioureaa, 4% paino /tilavuus CHAPS, 10 mM Tris, pH 7,4), proteinaasi-inhibiittorin cocktail (Roche). Proteiinipitoisuus mitattiin BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL).

Western blot-analyysi

Protein-uutokset ajettiin elektroforeesissa 4-12% Bis-Tris geeli, siirrettiin nitroselluloosalle kalvoja (Invitrogen), ja blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä Blocking One (Nacalai Tesque, Kioto, Japani). Membraanit pestiin kolme kertaa 0,1% Tween 20: Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa ja niitä inkuboitiin 2 ug /ml affiniteettipuhdistettua kanin anti-humaani ECT2 polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) yli yön 4 ° C: ssa. Membraanit pestiin jälleen ja inkuboitiin 1:10,000 vuohen anti-kani-IgG (H + L) HRP-konjugaattia (Promega, Madison, WI), kuten sekundaarisen vasta-aineen 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Lopuksi kalvot todettiin käyttäen SuperSignal West Pico Chemiluminescent alustan (Thermo) ja immunoblottaus tehtiin näkyväksi valottamalla kalvojen ATTO Light-Capture II (ATTO, Tokio, Japani). Signaalin voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen CS Analyzer versio 3.0 -ohjelmisto (ATTO).

Transfektio

OSCC solulinjoja (Sa3 ja H1) on stabiilisti transfektoitu ECT2 shRNA (shECT2) tai kontrolli shRNA (Mock) (Santa Cruz Biotechnology) rakentaa Lipofectamine LTX ja Plus reagenssit (Invitrogen). Transfektion jälkeen solut stabiilisti shECT2 eristettiin elatusaineesta, joka sisälsi 2 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen). 2-3 viikkoa transfektion jälkeen, elinkelpoisia pesäkkeitä poimittiin ja siirrettiin uusia ruokalajeja. shECT2- ja Mock-transfektoituja soluja käytettiin lisäkokeisiin.

IHC

IHC 4-um: n osat parafiiniin upotettu yksilöitä suoritettiin käyttäen kaniinin anti-ECT2 polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology ). Lyhyesti, sen jälkeen, kun deparaffinization ja nesteytys, endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin 30-min inkuboinnin seoksessa, jossa 0,3% vetyperoksidiliuosta 100% metanolia, minkä jälkeen leikkeet blokattiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 1,5% esto seerumia ( Santa Cruz Biotechnology) PBS: ssä ennen reaktiota anti-ECT2-vasta-ainetta (1:100 laimennos) 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa yön yli. Kun inkubaatio primaarisen vasta-aineen, näytteet pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja käsiteltiin Envision reagenssilla (DAKO, Carpinteria, CA), minkä jälkeen värin kehittyminen on 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAKO). Objektilasit sitten oli kevyesti vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu etanolilla, puhdistetaan ksyleenillä, ja asennettu. Ei-spesifinen sitoutuminen vasta-aine proteiinien muu kuin antigeenin joskus tapahtunut. Välttää ei-spesifinen sitoutuminen, joka on immunisoimalla peptidi estää koe suoritettiin. Negatiivisena kontrollina, kolmena kappaleena leikkeet immunovärjättiin ilman altistumista primaarisilla vasta-aineilla, mikä vahvisti värjäyksen spesifisyys. Kvantifioimiseksi tilan ECT2 proteiinin ilmentymistä näitä komponentteja, käytimme IHC pisteet järjestelmissä kuvattu aiemmin [6], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45] , [46], [47]. Lyhyesti, värjätyt solut määritettiin vähintään viisi satunnaista kentät 400 × suurennuksella kussakin osassa. Intensiteetti ECT2 immunoreaktion solussa pisteytettiin seuraavasti: 1 +, heikko; 2+, kohtalainen; ja 3+, voimakas. Solu numero ja värjäytymisen intensiteetti sitten kerrottiin tuottaa ECT2 IHC pisteet. Tapaukset, joiden pistemäärä ylittää 85,33 (korkeimman pistemäärän normaalia kudosta) määriteltiin ECT2-positiivisia. Kaksi itsenäistä patologia, molemmat olivat naamioituneet kuin potilaan kliininen tila, teki nämä tuomiot.

Solujen lisääntyminen

vaikutuksen tutkimiseksi shECT2 on soluproliferaatioon shECT2- ja Valetransfektoitu -soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

4 elävää solua kuoppaa kohti. Osoitetuissa aikapisteissä solut trypsinoitiin ja laskettiin hemosytometrillä kolmena kappaleena.

Solusyklianalyysiä

määrittämiseksi solusyklin jakautuminen, solut kerättiin, pestiin PBS: llä, ja tutkitun jossa CycleTEST Plus DNA reagenssipakkauksen (Becton-Dickinson, San Jose, CA), mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut väkevöitiin 5,0 x 10

5 solua /ml sentrifugoitiin 400 x g: ssä 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten lisäsimme 250 pl liuosta A (trypsiinin puskuri) putkeen ja sekoitettiin varovaisesti. Annoimme trypsiinin reagoida 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavaksi lisäsimme 200 pl Liuos B (trypsiininestäjää ja RNaasi puskuriin) ja sekoita varovasti. Olemme inkuboitiin seosta 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lopuksi lisätään 200 ui liuosta C (propidiumjodidin väriliuokselta). Ja me sekoitetaan varovasti kuin edellä ja inkuboidaan 10 minuutin ajan pimeässä jäissä. Virtaussytometrinen määritys DNA-pitoisuuden analysoitiin FACScalibur (Becton-Dickinson). Fraktioiden solut G0-G1, S ja G2-M Faasit analysoitiin käyttäen Flow Jo ohjelmistoa (Puu Star, Ashland, OR).

Tilastollinen

Tilastollinen merkitys n ECT2 ekspressiotasoja arvioitiin käyttämällä Fisherin testiä tai Mann-Whitney

U

testi.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SEM.

Kiitokset

Kiitämme Lynda C. Johtosääntö muokkaamalla tätä käsikirjoituksen, ja Drs. Hiroshi Nakajima ja Hiroaki Takatori, Department of Molecular Genetics, Graduate School of Medicine, Chiba University, saat hyödyllisiä keskusteluja ja kriittinen tarkastelu käsikirjoituksen.