Krooninen sairaus

tiivistelmä

Endogeeninen S-nitrosotiolit, mukaan lukien S-nitrosoglutathione (GSNO), välittävät typpioksidin (NO) -pohjaisen signalointi, tulehdusreaktioita, ja sileän lihaksen funktio. Alennettu GSNO tasot on liitetty useisiin hengitystiesairaudet, ja inhibitio GSNO reduktaasin, (GSNOR) ensisijainen entsyymi, joka metaboloi GSNO, edustaa uutta lähestymistapaa tulehdussairauksien keuhkosairaudet. Äskettäin yhdistyksen välillä väheni GSNOR ilmaisun ja ihmisen keuhkosyövän riskiä ehdotettiin osittain perustuu immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttäen polyklonaalista GSNOR vasta-ainetta. GSNOR on isotsyymi alkoholidehydrogenaasi (ADH) perhe, ja me osoittavat, että vasta-aine käytetään näissä tutkimuksissa ristiin reagoi olennaisesti muiden ADH proteiineja ja ehkä ole sopiva reagenssi. Arvioimme ihmisen keuhkosyöpä kudosmatriisien käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita erittäin spesifinen ihmisen GSNOR minimaalisella ristiinreagoinnin muihin ADH proteiineihin. Varmistimme läsnäolo GSNOR vuonna ≥85% yksilöiden tutkitaan, ja laaja analyysi näistä näytteistä osoitti eroa GSNOR proteiinin ilmentymisen välillä syöpä- ja normaalien keuhkojen kudoksia. Lisäksi GSNOR ja muut ADH mRNA arvioitiin kvantitatiivisesti keuhkosyöpä cDNA matriisia qPCR. Vastaa meidän immunohistokemiallinen havainnot, GSNOR mRNA-tasot eivät olleet muuttuneet keuhkosyöpä kudoksissa, mutta ekspressiotasot muiden ADH geenejä vähentynyt. ADH IB mRNA tasot alenivat ( 10-kertaisesti) 65% keuhkosyöpä cDNA yksilöitä. Olemme päätellä, että aikaisemmin raportoidut tulokset osoittivat virheellinen yhdistys GSNOR ja ihmisen keuhkosyövän riskiä, ​​ja lasku ADH IB sijaan GSNOR korreloi ihmisen keuhkosyöpä.

Citation: Mutka SC, Green LH, Verderber EL, Richards JP, Looker DL, Chlipala EA, et al. (2012) ADH IB Expression, mutta ei ADH III, vähenee Human Lung Cancer. PLoS ONE 7 (12): e52995. doi: 10,1371 /journal.pone.0052995

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 23 lokakuu 2012; Hyväksytty: 27 marraskuu 2012; Julkaistu: 28 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Mutkan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: N30 Pharmaceuticals , Inc on yksityisomistuksessa oleva yritys. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat paitsi Elizabeth Chlipala ovat tai olivat työntekijöitä N30 Pharmaceuticals, rahoittaja tämän tutkimus. Elizabeth Chlipala (Premier Laboratory) maksettiin suorittamaan immunohistokemiallisesti työ raportoitu tässä käsikirjoitus. N30 Pharma kehittää uusi luokka taudin kulkuun hoitoja, jotka säilyttävät solunsisäinen GSNO (Snitrosoglutathione), keskeinen säätelijä urut korjaus, uudistaminen, ja paranemista. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden merkitystä tämän paperin julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

S-nitrosoglutathione (GSNO) on endogeenisen typpioksidin luovuttajan, joka toimii varastona typpioksidin (NO) kehossa ja sillä on keskeinen rooli viestintään NO välittämä signalointi toimintoja. Alentuneet GSNO ovat korreloineet erilaisia ​​sairauksia ja sen palauttaminen on ehdotettu terapeuttiseksi lähestymistavaksi kystinen fibroosi [1] ja astma [2], [3]. Oksidoreduktaasi, S-nitrosoglutathione reduktaasin (GSNOR), on tärkein entsyymi, joka osallistuu hajoamista solunsisäisen GSNO, ja sen farmakologisen inhibition aikaan terapeuttisen mekanismi säilyttää solunsisäisen GSNO tasoilla. Suuri voimakkuus GSNOR inhibiittorit ovat parhaillaan kliinisessä kehityksessä [4] – [7].

GSNOR, joka tunnetaan myös alkoholidehydrogenaasi-luokan III-entsyymin (ADH III) ja formaldehydidehydrogenaasin, on evoluutiossa vanhin jäsen ADH proteiini perhe, ja kaikki muut ADHs uskotaan johtuvan GSNOR geenin päällekkäistä [8], [9]. Ihmisillä ADH isotsyymien ovat homologisia ja näyttää jopa 60% aminohapposekvenssi-identiteetti. Ne ovat myös hyvin konservoituneita lajien välillä. Tämä korkea aminohapposekvenssi-identtisyys luo haasteita kehittämällä spesifisiä vasta-aineita GSNOR. Polyklonaalisia vasta-aineita on käytetty useissa julkaisuissa [3], [10] – [13], ja ainoa kaupallisesti saatavilla vasta-aineita GSNOR ovat polyklonaalisia. Esimerkiksi, Marozkina ja työtovereiden käyttää kaupallisesti saatavilla olevia polyklonaalisia vasta-aineita ihmisen GSNOR viittaa siihen, että vähentynyt GSNOR aktiivisuutta terapeuttisen GSNOR estäjä voisi jättää keuhkojen alttiita kasvaimia vaikutuksia nitrosative stressistä [12]. Osoitamme, että nämä polyklonaaliset vasta-aineet eivät ole tarpeeksi spesifinen päätellä, että havaittu signaali johtui GSNOR sijaan muut ADH isotsyymien. Olemme kehittäneet useita erittäin spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen GSNOR ja käytetään näitä vasta-aineita seuloa ryhmät eri syöpä- ja normaalin keuhkokudoksen kudosnäytteitä. Lisäksi Immunohistokemian me määrällisesti mitattuna mRNA tasoilla GSNOR ja muiden ADH isotsyymien. Osoitamme, että aiemmin raportoitu signaali havaita Marozkina et al. oli todennäköisempää ADH IB eikä GSNOR. Monoklonaalisia vasta-aineita GSNOR tarjota sopivampi väline luonteenomaiset GSNOR proteiinin ilmentymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja puhdistettuja proteiineja

ADH IA proteiini hankittiin Abnova (Taipei City , Taiwan, # H00000124-Q01), mutta jotkut hajoaminen todettiin tämän valmisteen. Muita proteiineja, joita käytetään tässä tutkimuksessa valmistettiin meille Emerald BioStructures (Bainbridge Island, WA), kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, GSNOR, ADH IB, ADH II, ja ADH IV esitettiin, jossa on N-terminaalinen 6 x histidiinillä affiniteettilisäkkeenä ja Smt-fuusion sekvenssi, joka poistettiin ULP-1 katkaisun jälkeen Ni-affiniteettikromatografialla tuottaa täyspitkän rekombinanttiproteiineja. Likimääräinen molekyyli- painot ADH-proteiinien ennen poistamista ja sen jälkeen His-Smt tag ovat: ADH IB (51 kDa, 40 kDa), ADH II (51 kDa, 40 kDa), ja ADH IV (53 kDa, 41 kDa) . His-Smt-GSNOR fuusioproteiini on noin 50 kDa. GSNOR proteiinin valmisteet, joita käytetään vasta-aineen sukupolven vahvistettiin Emerald BioStructures olla täyspitkä massaspektrometrialla [4], jonka molekyylipaino on 39,6 kDa. Me ja muut [15] ovat osoittaneet, että GSNOR, joko puhdistettuna tai ihmisen solulysaateista, johdonmukaisesti kulkeutuu hieman nopeammin kuin ennustettu molekyylipaino on SDS-PAGE. Polyklonaalinen vasta-aine synnytettiin seerumista rottien immunisoitiin puhdistetulla rekombinantti, ihmisen täyspitkän GSNOR proteiinia Biomodels (Watertown, MA) ja N30 Pharmaceuticals. Kolme erillistä monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen GSNOR (N30-C3 rotan anti-GSNOR, N30-F6 hiiren anti-GSNOR, ja N30-G11 hiiren anti-GSNOR) tuotettiin immunisoimalla hiiriä tai rottia puhdistetulla rekombinantti, ihmisen täyspitkän GSNOR proteiinia ProMab Biotekniikka (Richmond, CA) N30 Pharmaceuticals. Seerumin tiitteri arvioitiin ELISA: lla ennen valintaa varten hybridisaatio. Hybridoomafuusiomenetelmin myeloomasolujen kanssa (ProMab Biotechnologies, Richmond, CA) suoritettiin pernasolut hiiren tai rotan paras tiitteri. Supernatantit hybridoomasta kuopat seulottiin ELISA positiivisten reaktiivisuus GSNOR. Supernatantit seulottiin myös ELISA: lla negatiivinen reaktiivisuus ADH IB, ADH II ja ADH IV. Supernatantti 10 klooneista seulottiin sitten klo N30 Pharmaceuticals Western blot varten spesifisyyttä GSNOR isotsyymiä ja minimaalinen epäspesifinen proteiiniin sitoutuminen. Kaksi 10-kloonien sekä hiiren ja rotan valittiin ja sitten jatkokloonattiin ProMab rajoittavalla laimennuksella. Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita, tarjonta-vasta valmistettiin askitesta tuotanto 10 hiirtä, ja vasta-aine kerättiin ja puhdistettiin IgG kromatografialla. Rotan monoklonaalinen vasta-aine, vasta-aine tuotettiin in vitro soluviljelmässä ja IgG puhdistettiin. Kanin polyklonaalista GSNOR hankittiin Proteintech (Chicago, IL, # 11051-1-AP).

GSNOR immunoblottauksella

Puhdistetut ADH proteiineja (22.5 ng /kuoppa) analysoitiin SDS PAGE: lla ja immunoblottauksella käyttäen polyklonaalista vasta-ainetta (Proteintech; laimennos 1:50 lopulliseen konsentraatioon 1,4 ug /ml) tai monoklonaalisia vasta-aineita (rotan anti-GSNOR N30-C3, 2,4 ug /ml; hiiri-anti-GSNOR N30-F6 ja N30- G11 10 ng /ml). HRP konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) käytettiin havaitsemiseen.

GSNOR immunohistokemia

immunohistokemiallinen analyysi GSNOR suoritettiin käyttäen formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut ihmisen keuhkokudoksen mikrosirut (Folio Bioscience, Columbus, OH, # ARY-HH0178, # ARY-HH0176). Objektilasit poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydroida veden läpi useita alkoholin kaltevuudet. Levyjä esikäsiteltiin 95 ° C: ssa sitraatti pH 6,1 antigeenistä haku liuosta (Dako, Carpinteria, CA). Sen jälkeen, kun kalvot jäähtyä huoneenlämpötilaan, 3,0%: ista vetyperoksidiliuosta (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) lisättiin sammuttamaan endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Dioja esi-inkuboitiin Serum Free Protein Block (Dako), ja sen jälkeen inkuboimalla GSNOR vasta-aineen tai sopivan ei-spesifisen immunoglobuliinin ohjaus: rotta-IgG-kontrolli (ABD Serotec, Raleigh, NC), hiiren IgG2B (Dako), tai kaniinin Ig-osa (Dako). Liukuu leimattiin N30-C3-vasta-ainetta inkuboitiin sitten kanin anti-rotta-immunoglobuliini (Dako), ja kaikki levyt sitten leimattu vuohen anti-kani tai anti-hiiri-polymeeri (Dako). DAB + (Dako) käytettiin havaitsemiseen, ja objektilasit laskuri värjättiin hematoksyliinillä (Dako).

Analyysi mRNA keuhkokudoksessa

cDNA paneelit valmistetaan 23 pareina normaalin ja syöpä- keuhkokudoksen ostettiin Origene (Rockville, MD, # HLRT504, erä # 0411). Paria sisältyy keuhkosyöpä kudosta, joka kattaa Vaihe IA (n = 4), IB (n = 4), II A (n = 2), IIB (n = 8), IIIA (n = 3), ja IIIB (n = 2) kunkin pariksi viereisen normaalia kudosta. Yksi Vaihe IV kudosnäyte ei pariksi normaalissa näytteessä, ja ei sisällytetty analyysiin. Geenien ilmentyminen of GSNOR (ADH III; geenin nimi

ADH5

), ADH IB (geeni

ADHIB

), ADH II (geeni

ADH4

), ADH IV (geeni

ADH7

), ja beeta-aktiini kvantifioitiin qPCR käyttäen TaqMan aluketta koetinsarjoja (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): Ihmisen B-Actin (Hs00357333_g1), Human GSNOR (Hs00605185_m1), Human ADH IB (Hs00605175_m1) , Human ADH II (Hs00923466_m1), ja Human ADH IV (Hs00609447_m1). Kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin ABI 7300 RT-PCR väline (Applied Biosystems) käyttäen Perfecta qPCR fastmix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD) mukaan valmistajan ohjeiden. Näytteet altistettiin 1 sykli 95 ° C: ssa 3 minuuttia, jonka jälkeen 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Data-analyysin, vertaileva kynnyssyklinä arvot (C

t) ja beeta-aktiini käytettiin normalisoimaan lastaus muunnelmia ja laskea ACk

t-arvot. ΔΔC

t-arvot laskettiin vähentämällä ACk

t arvon ohjaus (normaali) kudosta ACk

t-arvo sovitetun kasvainkudoksen. ΔΔC

t-arvot muutettiin taittaa eroja kaavalla 2

-ΔΔCt.

Tulokset

Kaupalliset polyklonaalista GSNOR vasta-aine reagoi ristiin muiden ADH proteiinien

Viimeaikaiset työ tutkii GSNOR ihmisen keuhkosyövän [12] palveluksessa immunohistokemiallisella värjäyksellä ihmisen keuhkosyöpä näytteitä kaupallisesti saatavilla polyklonaalinen GSNOR vasta-ainetta (katso materiaalit ja menetelmät). Koska proteiinisekvenssiä GSNOR on erittäin konservoitunut muiden ADH isotsyymien, päätimme sen spesifinen GSNOR verrattuna sen spesifisyys toisia ADHs. Ristireaktiivisuus tutkittiin immunoblottauksella käyttäen puhdistettua ihmisen rekombinantti-GSNOR (ADH III), ADH IA, ADH IB, ADH II, ja /tai ADH IV. Kuten kuviossa 1A on esitetty, käytetään yleisesti kaupallisessa polyklonaalista vasta-ainetta vahvasti reagoi ristiin muiden ADH-proteiinien, erityisesti ADH IB, ADH II, ja ADH IV. Testasimme muita kaupallisesti saatavissa polyklonaalisia vasta-aineita ja in-house valmistettu rotan polyklonaalisia GSNOR vasta-aineella ja löysi kaikki polyklonaalisia vasta testataan myös voimakkaasti rajat reagoida ADH proteiineja (tuloksia ei ole esitetty ja kuvio 1 B). Tämän kysymyksen, monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä GSNOR kehitettiin immunisoimalla hiiret ja rotat puhdistetulla, täyspitkä rekombinantti ihmisen GSNOR, kuten on kuvattu menetelmissä. Tätä työtä myös vasta-seulonta vaihe minimoimiseksi ristiinreagoinnin muihin ADH proteiineihin. Kuten kuviossa 2 on esitetty, kolme uutta monoklonaalisia vasta-aineita GSNOR on joko huomattavasti vähentää tai ei lainkaan ristireaktiivisuutta muiden ADH proteiineja. Tietääksemme tämä on ensimmäinen paperi kuvaamaan vasta-aineiden kanssa, tämän tason spesifisyys kohti GSNOR.

22,5 ng puhdistettuja rekombinanttiproteiineja erotettiin SDS-PAGE, ja immunoblot suoritettiin määrittämään vasta-aineen reaktiivisuutta GSNOR, ADH IA, ADH IB, ADH II, ja ADH IV. Lukuun ottamatta ADH IA, puhdistettua yhdistelmä-DNA-proteiinit tuotettiin fuusioproteiinin tag kloonauksen aikana, ja tunnisteen pilkottiin pois puhdistuksen aikana, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Molekyylipainot on fuusioproteiinit ovat noin 50-51 kDa, ja lopullinen, puhdistettu proteiinit ovat 39-41 kDa. Ihmisen GSNOR jatkuvasti kulkeutuu nopeammin kuin laskettu molekyylipaino. Kuten nähdään, että läsnä on sekä 50 ja 40 kDa: n bändejä ADH II, suurin osa proteiinin tämä valmiste sisältää edelleen fuusioproteiini tag. Kuitenkin, puhdistetun GSNOR immunisaatiossa käytettyyn proteiiniin vahvistettiin täyspitkä, ja ilman ylimääräisiä tag-sekvenssin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. A) Kaupallisesti saatavilla kanin polyklonaalinen GSNOR vasta-ainetta (Proteintech # 11051-1-AP). B) In-house polyklonaalista vasta-ainetta tuotetaan rottien immunisointi puhdistetulla rekombinantti, ihmisen täyspitkän GSNOR proteiinin Biomodels (Watertown, MA) ja N30 Pharmaceuticals.

Puhdistetut rekombinanttiproteiineja erotettiin SDS- PAGE ja immunoblot suoritettiin määrittämään vasta-reaktiivisuutta GSNOR, ADH IB, ADH II, ja ADH IV. Kolme riippumatonta monoklonaalisia vasta-aineita testattiin: A) N30-F6 hiiren anti-GSNOR; B) N30-G11 hiiren anti-GSNOR; C) N30-C3 rotan anti-GSNOR.

Monoklonaaliset GSNOR vasta-aineita havaita ilmentymisen monenlaisissa ihmisen keuhkosyöpien

tutkittiin GSNOR proteiinin tasot eri keuhkosyöpä kudoksia immunohistokemiallisesti käyttäen edellä kuvattua kolmea GSNOR-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, ja sitä verrataan kudoksen värjäyskuvio kaupallisesti saatavilla polyklonaalinen vasta-aine, jota käytetään edellisessä julkaisussa [12]. Vertasimme myös vasta-signaali normaalissa keuhkokudoksessa. Neljällä vasta, me värjätään neljä identtistä ihmisen keuhkosyöpä kudossiruina joista jokainen sisältää ihmisen kudosta ytimien yli 100 keuhkosyöpää eri vaiheissa etenemistä. GSNOR voimakkaasti havaittu normaalista ihmisen keuhkokudoksessa, mukaan lukien keuhkojen epiteelisoluissa, keuhkorakkuloiden makrofageissa, ja tyypin 2 penumosyy- in keuhkorakkuloihin (kuvio 3). GSNOR havaittiin myös monenlaisia ​​keuhkosyövän kudoksissa, mukaan lukien adenokarsinooma, okasolusyöpä, papillaarinen adenokarsinooma, ja suuri karsinooma, kun kudokset värjättiin monoklonaalisella GSNOR vasta-aineita (kuvio 4, N30-C3, N30-F6, N30-G11 ). Värjäytyminen keuhkosyöpä kudoksissa oli heikompi, kun polyklonaalista vasta-ainetta käytettiin (kuvio 4, 11051-1-AP). Kudosleikkeet tekee kolme arvioijat GSNOR värjäystä kunkin vasta-aineen (taulukko 1). Käyttämällä kolmea erityisiä monoklonaalisia vasta-aineita, GSNOR proteiinin tasot eivät olleet erilaisia ​​keuhkosyöpä yksilöiden verrattuna normaaliin kudokseen; kun taas polyklonaalinen vasta-aine, jossa osoitettu ADH ristireaktiivisuus ehdotti, että GSNOR ekspressio oli suurempi normaalissa keuhkokudoksessa.

Normaalit ihmisen keuhkojen kudossiruina värjättiin N30-C3 monoklonaalinen GSNOR vasta-aineella (1 ug /ml) ja sen jälkeen DAB havaitseminen . Keuhkoputken epiteelisolujen, keuhkorakkuloiden makrofageissa, ja tyypin 2 penumosyy- in keuhkorakkuloihin voimakkaasti värjätään.

Normaalit ihmisen keuhkosyövän kudossiruina värjättiin monoklonaalisella GSNOR vasta-aineita (N30-C3, N30-F6, N30-G11 ) tai kaupallisesti saatavilla polyklonaalinen GSNOR vasta-ainetta (11051-1-AP) ja sen jälkeen DAB-havaitseminen. Erilaisia ​​ihmisen keuhkosyöpä kudoksia voimakkaasti värjätään kaikki kolme GSNOR monoklonaalisia vasta-aineita, mutta värjäystä on vähäisempää silloin, kun ei-spesifistä polyklonaalista GSNOR vasta-ainetta käytetään.

GSNOR mRNA-tasot eivät vähentyneet ihmisen keuhkosyöpä kudosta verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen

Koska mahdollisuuksia subjektiivisuuden arvostelussa kudosvärjäyksellä, GSNOR ja ADH-mRNA-tasot arvioitiin kvantitatiivisesti ihmisen keuhkosyövän cDNA taulukot. Kaupallisesti saatavia cDNA pakat (katso materiaalit ja menetelmät) käytettiin, jotka sisälsivät 23 pareina normaalin ja syöpä- keuhkokudoksessa. Paria sisältyy vaihe IA (n = 4), IB (n = 4), II A (n = 2), IIB (n = 8), IIIA (n = 3), ja IIIB (n = 2), keuhkosyöpä kudoksiin kunkin pariksi viereisen normaalia kudosta. GSNOR mRNA-tasot määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen qPCR, ja suhteelliset määrät GSNOR kasvaimen verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen laskettiin, kuten on kuvattu täydentävillä menetelmillä. Ei havaittu mitään korrelaatiota välillä GSNOR mRNA: n ilmentymisen ja keuhkosyöpä. Tässä analyysissä 11 23 kasvain näytteissä suhteessa kasvain /normaali ilmaisu suhteet 1 ja 12 23 näytettä oli ilmaisu suhteet 1. Lisäksi todisteet laski rajusti GSNOR ilmentyminen oli harvinaista testattu keuhkosyöpä näytteitä; vain 3 kasvaimen näytteen havaittiin kanssa GSNOR ilmentymisen määrä väheni yli 3-kertainen (suhteessa 0,33; kuvio 5). Käänteisesti, kun ilmaus ADH IB, ADH II, ja ADH IV analysoitiin, enemmän näytteistä osoitti suuremman ilmentymisen pienenee kasvain näytteissä verrattuna GSNOR. Lisäksi havaitsimme huomattavasta laskusta ADH IB ilmentymisen keuhkosyöpä kudoksissa, 12 23 paria, joilla on ≥10-kertaisesti alentunut ADH IB ilmaisun keuhkosyövän näytteet (suhteellinen kasvain /normaali ilmaus suhde ≤0.1). Vain 3 23 paria oli kasvanut ilmentyminen ADH IB keuhkosyöpä näytteet verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen (kuvio 5).

GSNOR (geenin nimi

ADH5

), ADH IB (

ADHIB

), ADH II (

ADH4

), ja ADH IV (

ADH7

) mRNA-tasot arvioitiin qPCR ihmisen keuhkosyöpä cDNA paneelit (Origene, # HLRT504, erä # 0411, Rockville, MD) ja normalisoitiin p-aktiini-tasot. Arrays sisälsi 23 pareina normaalin ja syöpä- keuhkokudoksessa. Kasvaimen ilmentymisen suhteen vastaaviin normaaleihin näytteessä laskettiin käyttäen ΔΔCt menetelmää. Suhteelliset määrät 1 edustavat vähentynyt ilmentyminen kasvaimen näytteessä. Keuhkosyöpä yksilöt sisältyy vaihe IA (n = 4), IB (n = 4), II A (n = 2), IIB (n = 8), IIIA (n = 3), ja IIIB (n = 2), jossa kunkin näytteen pariksi viereisen normaalia kudosta. Ei korrelaatiota GSNOR mRNA-tasoja ja keuhkosyöpä havaittiin, kun taas ilmaus ADH IB voimakkaasti vähennetty keuhkosyövän näytteissä.

Keskustelu

keuhkoissa, endogeeninen S-nitrosotiolit lukien GSNO välittävät NO-pohjainen signalointi, tulehdusreaktioita, ja sileän lihaksen funktio. Esto GSNOR edustaa uutta lähestymistapaa hoitoon hengityselinten sairauksien kautta säilyttäen endogeenisen GSNO, ja uusi GSNOR estäjä on parhaillaan kliinisessä kehityksessä varten astman ja syövästä [4].

Tässä tutkimuksessa osoitamme ole yhdenmukaista eroja ilmentymistä GSNOR verrattaessa keuhkosyöpä kudoksen normaaliin keuhkokudokseen. Nämä havainnot ovat ristiriidassa aiemmin julkaistu työ Marozkina ja työtovereiden [12], joka ilmoitti, että GSNOR ilmentyminen väheni keuhkosyöpä kudoksissa. Heidän analyysissä tekijät huomasivat, että 69% ihmisen keuhkosyöpä koepaloja osoittivat merkitsevästi pienempiä GSNOR tasolle. Arvioidessaan, GSNOR tasot olivat huomattavasti matalammat myöhäisessä vaiheessa kasvaimissa verrattuna alkuvaiheen kasvaimet, ja he päättelivät, että vähennetään GSNOR aktiivisuus korreloi myöhemmissä vaiheissa kasvain huolto. On todennäköistä, että ensisijainen ristiriita meidän raportissa ja aiemmissa raporteissa johtuu puutteesta spesifisyyden polyklonaaliset vasta-aineet käytetään niiden analyysiin. Olemme osoittaneet, että polyklonaalinen vasta voimakkaasti rajat reagoi muiden, läheisesti liittyvät proteiinit, kuten ADHIB, ADH II, ja ADH IV. Itse asiassa, olemme havainneet, että jokainen polyklonaalista vasta olemme testanneet kärsii tästä samasta spesifisyyden puutteen, ja päätelmät GSNOR ilmaisun ja lokalisointi vetää kokeiluja käyttämällä polyklonaalisia vasta-aineita on loistavat mahdollisuudet tulkita väärin. Puute erityisiä myös polyklonaalisten vasta ei ole yllättävää, koska korkeat sekvenssin identiteetti GSNOR ja muiden ADH isotsyymien. Kun kehittää monoklonaalinen vasta-aine GSNOR, löysimme tarpeelliseksi vasta-näytön kloonit vastaan ​​useita muita puhdistettuja ADH proteiinien saamiseksi riittävän yksilöidysti. Käyttäen GSNOR spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, löydettiin eroa värjäytymistä syövän ja normaalissa keuhkokudoksessa.

Lisäksi olemme tutkineet ilmentyminen ei ainoastaan ​​GSNOR mutta myös muita ADHs keuhkosyövän kudoksessa käyttämällä lisää lopullisen qPCR menetelmiä. Ei muutosta GSNOR mRNA ilmaisun välillä normaalin ja syöpä- keuhkokudoksessa havaittiin. Käänteisesti, kun ilmaus ADH IB, ADH II, ja ADH IV analysoitiin, näimme yhä suurempia ilmaisun pienenee kasvain näytteissä. Lisäksi havaitsimme huomattavasta laskusta ADH IB ilmentymisen keuhkosyöpä kudoksissa 12 23 paria, joilla on ≥10-kertaisesti alentunut ADH IB ilmaisun keuhkosyövän näytteet (suhteellinen kasvain /normaali ilmaus suhde ≤0.1).

Tämä ADH IB ilmaisu osoittaa joitakin suhde keuhkosyöpä ei ole yllättävää. ADH IB on olennainen useilla väyliä, joiden tiedetään vaikutus keuhkosyöpään kuten rasvahappo, retinoli ja tyrosiini aineenvaihduntaa, sekä glykolyysin ja glukoneogeneesin [16]. Meta-analyysi julkaistut tutkimukset tarkastellaan suhdetta ADH IB keuhkosyöpä, ADH IB ilmentyminen väheni keuhkosyövän ylivoimainen määrä näytteitä ja analyysi [16] ja selvästi polymorfismit ADH IB ovat osoittaneet korrelaatioita muihin syövän lukien ruokatorven [17]. Toisin ADH IB jossa on tehty merkittävä tutkimus sen suhteen syöpä, GSNOR ekspressiotasot on hiljattain ehdotettu korreloivan maksasyövän [13]. Nämä tutkimukset osittain vetosi GSNOR knock-out hiirillä, joilla on huomattavia fenotyyppisiä eroja verrattuna villin tyypin valvontaa, ja viimeaikaiset tutkimukset meidän lab ovat osoittaneet tämän oletetun suhdetta geneettisen poistamisen GSNOR ja maksasyövän ei ole nähty haplosufficient malli (GRJ ja D. Colagiovanni, käsikirjoitus valmisteilla, N30 Pharmaceuticals).

Yhteenvetona näyttää siltä, ​​että lasku ADH IB, pikemminkin kuin GSNOR korreloi ihmisen keuhkosyöpä, ja aiemmin raportoidut tulokset osoittivat virheellinen yhdistys GSNOR ja ihmisen keuhkosyövän riskiä. Sen lisäksi tämän päätelmän tueksi, julkaistujen tutkimusten hiirten homotsygoottista geneettinen deleetio GSNOR löytäneet mitään kasvua hiiren keuhkosyöpään sekä käsittelemätöntä GSNOR

– /- hiirillä eikä GSNOR

– /- hiirille on annettu karsinogeeni diethylnitrosamine [13]. Näin GSNOR ilmaisun ja esto eivät näytä liittyvän riskin ihmisen keuhkosyöpää.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Ross Benik teknisen tuen kanssa kudosvärjäyksellä.