Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nikotiini kykenee sen kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle kautta sitoutumalla nikotiiniasetyylikoliinireseptorien (nAChr) ja aktivointia loppupään polkuja, jotka estävät apoptoosin ja edistää neo-angiogeneesiä. NAChr on α7 alatyypin ovat läsnä monenlaisia ​​syöpäsolujen ja niiden inhibitioon kobra myrkky hermomyrkkyjen on ehdotettu useita artikkeleita ja arvosteluja mahdollisena innovatiivinen keuhkosyöpä hoito. Koska osa julkaistut tulokset hiljattain vedettynä, uskomme, että kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus kobra myrkky neurotoxins on itsenäisesti arvioidaan uudelleen.

määritetty aktiivisuus α-hermomyrkyistä päässä

Naja atra

(lyhytketjuiset neurotoksiini, α-kobrotoksiini) ja

Naja kaouthia

(pitkäketjuiset neurotoksiini, α-cobratoxin)

in vitro

sytotoksisuuden mittausten 5 keuhkosyövän solulinjat, by pesäkemuodostusta kanssa α7nAChRs ilmentävien että ilmentämissolulinjat ja

in vivo

arvioimalla kasvaimen kasvu käytettäessä potilaalle tehdä ei-lihavilla Diabetic /Severe Combined immuunivajaisiin (

NOD /SCID

) hiirimallissa hyödyntävä erilainen kohtelu aikatauluja ja annoksia.

Ei tilastollisesti merkittävä väheneminen kasvaimen kasvua havaittiin hoitoryhmissä verrattuna kontrolliin molempien toksiinien. Paradoksaalisesti α-kobrotoksiini päässä

Naja atra

osoitti taipumusta parantaa kasvaimen kasvua, vaikka tässäkin tapauksessa tilastollista merkitsevyyttä ei saavutettu.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että toisin kuin muissa raporteissa nAChR inhibiittorit α-cobratoxin päässä

N. kaouthia

ja α-kobrotoksiini päässä

N. atra

kumpikaan tukahdutti kasvaimen kasvua eikä lisäsi elinaikaa hoidetuista eläimistä.

Citation: Alama A, Bruzzo C, Cavalieri Z, Forlani A, Utkin Y, Casciano I, et al. (2011) esto nikotiiniasetyylikoliinireseptorien Cobra Venom α-Neurotoxins: Onko olemassa Perspective in Lung Cancer Treatment? PLoS ONE 6 (6): e20695. doi: 10,1371 /journal.pone.0020695

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 10 joulukuu 2010; Hyväksytty: 7. 2011; Julkaistu: 13 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Alama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli jotka Italian terveysministeriön (www.salute.gov.it/) ja Fondazione Compagnia di San Paolo, Torino (www.compagniadisanpaolo.it/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

koetulokset viittaa siihen, että stimuloivia tai inhiboivia hermovälitys syövän kehityksen etenemistä ja hoitovaste ovat jatkuvasti kertynyt [1]. Todellakin, tupakka komponentit säätelevät solujen liittyviä toimintoja solutransformaatio ja ovat mukana tupakoinnin riippuvuus ja keuhkosyövän alttius ja kehitystä suoraan vuorovaikutuksessa hermosolujen ja ei-hermosolun nikotiiniasetyylikoliinireseptorien (nAChr) [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Nikotiini itsessään on rajallinen keuhkosyöpää aloittamista tuki, mutta se ylläpitää kasvaimen kasvua ja edistää metastaaseja kautta antiapoptoottisten ja neoangiogenic ominaisuudet [2], [7], [12].

ilmentyminen nAChr kuin hermosoluissa keuhko-, ja erityisesti hengitysteiden epiteelin, heijastaa useita keskeisiä tehtäviä kohdistamaa kolinergisen järjestelmän normaalissa keuhkojen kehitykseen ja toiminta [13], [14]. Tässä yhteydessä on ehdotettu, että rooli nAChr keuhkosyöpä voi olla samanlainen kuin estrogeenireseptoreihin rintasyövän, koska molemmissa tapauksissa sopimaton stimulointi reseptorien edistää syövän kehitystä [15]. Ottaen huomioon korkean tason ilmentymisen tiettyjä alatyyppejä nAChr keuhkosyöpäsoluissa verrattuna ympäröivään ennallaan kudokseen [16], [17] ja tukea kokeellisia todisteita [18], [19], [20], [21] , se hypoteesi, että antagonisteja nAChr, ja erityisesti cobra α-neurotoksiineja, voitaisiin hyödyntää mahdollisina terapeuttisina aineina [22], [23], [24]. Kuitenkin vähän tietoa toimivuuden ja pitkän aikavälin vaikutuksia stimulaatio näiden reseptorien syöpäsoluissa [2], [25], [26] ja, mikä tärkeintä, viime takaisinvedon raportti tukee kasvaimen kasvua estävä vaikutus Cobra α-neurotoxins

in vitro

ja

in vivo

[27] tekee kyseenalainen kohdentaminen nAChr näitä myrkkyjä keuhkosyöpään hoitoon.

Cobra myrkky muodostuu monet polypeptidit useita myrkyllisiä toimintaan. Näistä kolmisormisten toksiinien (TFT) ovat tärkeimmät osat ja edustaa α-neurotoxins ja sytotoksiinit. Α-neurotoxins sitoutuvat nAChR eri spesifisyys ja affiniteetti: lyhytketjuiset toksiinien (60-62 aminohappotähdettä, 4 disulfidisiltojen) lohko lihas-tyyppinen nAChr taas pitkän ketjun toksiineja (66-75 aminohappotähdettä, 5 disulfidisidoksia , viides sidos on läsnä Keski polypeptidi loop) lisäksi lihas-tyypin nAChr estää myös hermosolujen reseptorit [28], [29]. Esimerkkinä lyhytketjuisia toksiineja, α-neurotoksiini kutsutaan α-COBr * o * toksiini

Naja atra

kobra myrkky voidaan mainita. Pääasiallinen α-neurotoksiinin päässä

Naja kaouthia

Cobra myrkky kutsutaan α-COBr * a * toksiini on esimerkki pitkäketjuisten toksiineja. Lyhytketjuista toksiinit ovat rakenteellisesti sukua sytotoksiinit, että ei-selektiivisesti tappaa soluja [30].

Tarkistaessamme kirjallisuudessa anti-kasvain vaikutuksia α-cobratoxin [18], [19], [20], [21], [22], [27] huomasimme, että erilaisia ​​raportteja esitellään merkittäviä eroja annostus toksiinia käytetään

in vivo

kokeissa määrästä ruiskutetaan solujen ja hiirillä selviytyminen. Myös läsnäolo α7 nAChR solulinjasta hyödynnetään in vivo tutkimuksissa oli epävarma, koska ristiriitaisia ​​tuloksia ovat läsnä kirjallisuudessa [22], [31]. Lisäksi, koska osa tiedoista oli vedettynä ilman erityistä motivaatiota [27], tunsimme tarpeen arvioida uudelleen syövän ominaisuuksia kobra hermomyrkyistä

in vitro

ja

in vivo

vuonna kliinisesti merkityksellistä eläinmallissa keuhkosyöpään [18] selventää jos nämä toksiinit voidaan pitää prototyyppi uutta luokkaa luonnontuotteet antituumoriominaisuuksia ehdottaman [15], [22], [24].

tulokset ja pohdinta

ilmentäminen α7 nAChR A549 ja A549-luc solujen

vuorovaikutus α-cobratoxin ja α7 nikotiinireseptorin [32] oli yksi kokeellisen todisteiden takana perustelut hyödyntää kobra myrkky toksiinien syövän vastaisina aineina [22]. Vaikka tämä reseptori ilmentyy laajasti eri kudosten ja solujen linjat, viime kirjallisuuskatsaus [22], [31] raportoitu ristiriitaisia ​​ilmoitustapa tämän reseptorin A549, solulinjan hyödynnetään

vuonna vivo

ja useimmat

in vitro

syövänvastainen määrityksiä α-cobratoxin. Siksi, koska ensimmäinen askel tarkistaa aktiivisuuden α-cobratoxin NSCLC, teimme semikvantitatiivinen RT-PCR ja qPCR tutkimus osoittaa ilmentymisen α7 nAChR 5 keuhkosyövän solulinjat. Kolme solulinjojen käyttää esillä olevassa tutkimuksessa (A549, H1650 ja SK-MES 1) olivat samat alkuperäisen koesarja [18], [19], [20], [27]. Kuten on esitetty kuviossa 1, paneeli A α7 nikotiinireseptorin oli helposti havaittavissa A549, H1650 ja SK-MES 1, mutta ei H1975 ja CALU 1. qPCR-analyysi vahvisti läsnäolo eri määrän α7 nAChR-mRNA: n A549, H1650 ja SK-MES 1 (kuvio 1, paneeli B). Yhteisymmärryksessä RT-PCR tuloksin H1975 ja CALU 1 α7 nAChR transkriptio käyttäen samaa määrää cDNA käyttää kaikkiin solulinjoihin, ilmestyi jälkeen sykli 40, että tulos voi johtua joko erittäin alhaiselle tasolle ilmaus tai taustamelua

A) semikvantitatiivinen alfa7- RT-PCR-analyysi ihmisen NSCLC adenokarsinooma e levyepiteelikarsinooma solulinjat. GAPDH ilmentyminen käytettiin sisäisenä kontrollina mRNA eheyden ja cDNA kvantifiointiin. NCI-H1975 ja Calu1 ovat negatiivisia. C: Ei templaattia sisältämättömään verrokkiin. B) qPCR alfa 7 ilmentyminen samassa solulinjoissa. On y-akselilla luonnollinen logaritm (ln) ja kertaluokkamuutos. NCI-H1650 käytettiin kalibraattorimatriiseina, GAPDH viitteenä geeni. Yksi UGR Total RNA retrotrascibed ja sama määrä cDNA per näyte (2 ui) käytettiin (Ct GAPDH, joka on välillä 15.65 ja 17.65). NCI-H1975 ja Calu1 aiheutti negatiivisia tai erittäin heikkoa ilmentymistä johtuen Ct 40. C) Western blot analyysi alpha 7. PC12 ladattiin positiivisena kontrollina. Aktiinin ilmentymistä käytettiin sisäisenä kontrollina.

ilmentyminen α7 nAChR proteiinitasolla vahvistettiin Western blot -analyysillä A549 ja A549-luc-soluja (kuvio 1, paneeli C).

on raportoitu, että stimulointi α7 nAChR ihmisen keuhkosyövän solujen johtaa ylöspäin sääntelyn tämän reseptorin [33]. Olemme testanneet vaikutuksesta α-hermomyrkkyjä päässä

N. atra

ja

N.kaouthia

tasosta α7 nAChR keskitytään A549 ja A549-luc.

qPCR analyysi osoitti, että hoito joko α-kobrotoksiini tai α-cobratoxin pitoisuudella 0,003 uM, raportoidut IC

50 α-cobratoxin A549 [20], ja pitoisuudet kolme kertaa pienempi (0,001 uM) ja kolme kertaa suurempi (0,009 uM), ei muuttanut olennaisesti tasoa reseptorin ekspression näissä solulinjoissa (alle kaksinkertaiseksi muutos, kuva S1).

in vitro vaikutukset lyhyt- ja pitkäketjuisten α-neurotoxins on NSCLC solulinjoissa

Early

in vitro

kokeiden mukaan kategorioiden vaikutus α-cobratoxin on annoksesta riippuvainen ja että suuri selektiivisyys ja spesifisyys tämän molekyylin riippuu tiheydestä α7 nAChR [20], [21]. Tässä suhteessa ei-kasvainsolujen keuhkojen soluihin sekä muita ensisijaisesti vaikuta soluihin, jotka ilmentävät alhaisia ​​α7 reseptorien olivat huomattavan resistenttejä a-cobratoxin hoitoon [20].

arvioimiseksi sytotoksinen aktiivisuus α-cobratoxin, että tehokkaasti sitoutuu α7 nAChR (katso materiaalit ja menetelmät) sekä erityinen ja valikoiva sen toimintaa, suoritimme MTT määritysten kanssa lyhyen ja pitkän ketjun α-neurotoxins on oletettavasti herkkä α7 nAChR-positiivisia ja oletettavasti kestävä α7 nAChR-negatiivinen solulinjat. Annos-vaste-käyrät tehtiin arvioimaan lääkeaineen pitoisuutta alentavan selviytymistä. Alkuperäinen sytotoksisuus Kokeet suoritettiin käyttämällä myrkkyjä pitoisuudet että muissa julkaisuissa on raportoitu olevan tehokkaita α7 nAChR-positiivisten NSCLC solulinjoissa, mutta ei toksinen normaaleissa soluissa (IC50: 0,003 uM A549, 0,04 uM SK-MES 1 ja 1 uM H1650) [18], [20], [21], [22]. Kuitenkin, näissä pitoisuuksissa ei voitu havaita merkittävää sytotoksista aktiivisuutta ja IC50 ei saavutettu mitään kahdesta toksiinien (tuloksia ei ole esitetty).

korkeammat pitoisuudet (30 pM) α-kobrotoksiini osoitti rajoitetun ei annoksesta riippuvaa toksisuutta, joka pysyi olennaisesti vakiona monenlaisia ​​pitoisuuksia kaikki 5 solulinjoissa (kuvio 2, paneeli A).

NSCLC solulinjat A549, NCI-H1975, H1650, CALU 1 ja SK-MES 1 inkuboitiin 72 tuntia α-kobrotoksiini (0,6-30 uM), ylemmän levyn, tai α-cobratoxin (0,75-50 uM), alempi paneeli, ja myrkyllisyyttä mitattiin kolorimetrisellä MTT testi. IC50 saavutettiin vain α-cobratoxin.

Korkeissa pitoisuuksissa α-cobratoxin osoitti selvästi annoksesta riippuvainen toksisuus (kuvio 2, paneeli B). Kuitenkin IC50 pitoisuus havaittu tutkimuksessamme A549- ja SK-MES 1 oli 2466 ja 105-kertaisesti suurempi kuin mitä aikaisemmassa julkaisussa [20]. Ero oli paljon vähäisempi H1650 (2,9-kertainen) tuloksena yhteensopiva hyödyntäminen eri toksiini valmiste.

rajallinen myrkkyvaikutus lyhytketjuisia α-kobrotoksiini voitaisiin selittää sen kyvyttömyys sitoutua α7 reseptoriin. Yllättäen kuitenkin α-cobratoxin oli tehokas myös α7 nAChR-negatiiviset solut viittaa siihen, että myrkylliset toiminta ei välitä sitoutumisen toksiini on α7 reseptoriin.

Vahvista ja laajentaa Tämän havainnon olemme suorittaneet pesäke muodostuminen määrityksessä α7 nAChR + A549 ja jossa α7 nAChR-NCI-H1975 solulinjoissa. Koska IC 50 ei ole päästy α-kobrotoksiini, käytimme kaksi korkeimmat pitoisuudet testataan MTT (15 ja 30 uM). Sillä α-cobratoxin käytimme pitoisuudet vastaavat IC50 A549 ja NCI-H1975 (7. 5 ja 3 uM, tässä järjestyksessä) ja pitoisuudet vastaavat puolta ja kaksi kertaa IC50. Kuten on esitetty kuviossa 3, klonogeenisten aktiivisuus kahdessa solulinjassa ei vaikuta hoidon ja läsnäolo α7 nach reseptoriin.

solulinjat A549 (α7 AChR +) ja NCI-H1975 ( α7 AChR -) maljattiin 35 mm: n petrimaljoille tai 24-kuoppalevyille tiheyksinä 150 (A549) ja 300 (NCI-H1975) solua /malja ja altistettiin joko pitkäketjuisten α-neurotoksiinin päässä

Naja Kaouthia

, pitoisuuksissa 15 uM, 7,5 uM, 3,8 uM (A549) ja 6 uM, 3 uM, 1,5 uM (NCI-H1975), tai lyhyen ketjun

Naja Atra

pitoisuuksina, 30 uM ja 15 uM (molemmissa solulinjoissa). Käsiteltyjä soluja inkuboitiin 7-10 päivää, kunnes näkyvissä muodostuneiden pesäkkeiden.

aktivointi apoptoottisen kaskadin pidettiin keskeinen vaikutus sitoutumisen α-cobratoxin on α7 nAChR [18 ], [20], [21], [22]. Kun otetaan huomioon suuret erot tuloksemme ja ne aiemmin julkaistu koskien annosta, jolla IC50 voitiin saada ja puuttuminen selektiivinen vaikutus α-cobratoxin on α7 nAChR-positiivisten solujen, yritimme ymmärtää, jos aktivointi apoptoosin todellakin tapahtuu käsiteltäessä α-cobratoxin anneksiini V-PI virtaussytometrialla värjäyksen. On raportoitu, että suurin apoptoosin induktio A549-solut voidaan saada käsittelemällä 1 uM toksiinia 24 tunnin ajan [18]. Olemme toistaneet sama koe käyttämällä samaa menetelmää, mutta toksiinin pitoisuudet (1, 10 ja 50 uM), joka indusoi kasvua inibition vaihtelee 5-87% MTT määrityksissä.

Kuten kuviossa 4 on esitetty, jopa korkein pitoisuus hyvin harvat solut (1-3%), esitetään todisteita apoptoosin nekroottisten solujen ollessa vallitsevia.

soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan 1, 10 ja 50 uM α-cobratoxin ja apoptoosi arvioitiin anneksiini V-PI värjäystä ja FACS erottaminen. Apoptoosin käsittelemättömissä soluissa oli 0,63% ja käsitellyissä soluissa oli alueella 0,98-2,32%.

Kaiken nämä tulokset viittaavat siihen, että solukuolemaa havaittiin in vitro on todennäköisesti seurausta kuolion sijaan aktivointi apoptoottisen reitin seuraavan spesifinen sitoutuminen α-cobratoxin sen ligandiin.

In vivo

myrkyllisyys α-neurotoksiinien

akuutti toksisuus kasvavia annoksia toksiinien jälkeen iv hallinto (kuten M M) arvioitiin CD1-hiirille perusteella kliinisten ja käyttäytymisen merkkejä. Akuutit oireet kehittyi 15 minuutin kuluttua ja käytti enimmäkseen ominaista yleinen epämukavuus ja hengitysvaikeudet että palautettu normaaliolosuhteissa sisällä 60-180 minuutin. Perustuen kuolleiden CD1-hiirille, annon jälkeen joko α-kobrotoksiini tai α-cobratoxin ja yli tarkkailujakson aikana 14 päivää, LD-arvot määritettiin ja MTD tunnistettu 0,1 mg /kg α-kobrotoksiini ja 0,2 mg /kg α-cobratoxin kuten esitetty taulukossa 1.

on tärkeää, että LD50 α-kobrotoksiini määritelty tutkimuksessamme (0,128 mg /kg) oli erittäin hyvä kanssa kirjallisuuden tietoihin (0,1 mg /kg: https://www.uniprot.org/uniprot/P60770). Havaittu LD50 α-cobratoxin oli 0,35 mg /kg, mikä on samaa suuruusluokkaa kirjallisuuden tietoja (0,1 mg /kg; https://www.uniprot.org/uniprot/P01391).

raportteja in vivo toksisuus α-cobratoxin ovat hämmentäviä ja viime kirjallisuudessa olemme havainneet, että LD50 pitoisuus raportoidaan kolmessa eri julkaisuissa samasta ryhmästä eroaa 1000-kertainen (0,15 mg /kg tai 0,15 ug /kg ) [18], [21], [22]. Saadut tulokset tässä tutkimuksessa ovat oleellisesti yhtäpitäviä kahden edellisen raportit [18], [21] ja mikä tärkeintä, osoittavat biologinen aktiivisuus

in vivo

meidän toksiinia valmisteiden.

Puolet MTD kunkin toksiinin (0,05 ja 0,1 mg /kg, vastaavasti) käytettiin sitten toinen hoito-suunniteltu arvioimaan tuumorin vastainen aktiivisuus in vivo nämä toksiinit.

antituumoriaktiivisuus ja α-neurotoksiinien

arvioimiseksi antituumorivaikutuksen molempien toksiinien,

NOD /SCID

hiiret ortotooppisesti oli siirretty 0,5 x 10

6 ihmisen A549-luc solua /tilavuudessa 10 ui PBS oikeaan keuhkoissa. Koska korvikemarkkerilta kasvaimen kasvua mittasimme valon emissio lusiferaasi-merkittyjen A549-solut; Tämän järjestelmän avulla pystyimme pitkittäin seurata jokaisen eläimen ja seurata hoidon vaikutuksesta.

jälkeen arvioinnin kasvain implantit, jonka IVIS havaitseminen, hiiret satunnaistettiin johonkin tutkimukseen ryhmien ja hoito aloitettiin 7 päivän kuluttua ortotooppisten transplantaation mukaan kahden eri protokollia esitetty kuviossa 5.

Hiiret injektoitiin 0,5 x 10

6 ihmisen A549-luc-soluja. Päivänä 7, kun IVIS määrityksen, eläimet satunnaistettiin ja käsitelty. Aikataulun 1 hiiriä käsiteltiin 1/1000 LD10 kuten on osoitettu [20], kolme kertaa /viikossa kolmen viikon ajan. Aikataulun 2 hiiriä hoidettiin kerran viikossa, jossa on annos, joka vastaa ½ MTD (määritelty tässä tutkimuksessa).

Protocol 1: 8 eläimet jaettiin saamaan i.v. 0,12 ug /kg toksiinia (1/1000 LD

10 osoitettu [20]), kolme kertaa viikossa kolmen viikon ajan mukaisesti aiemmin raportoitu aikataulu [20] ja 8 eläimet saivat pelkkää vehikkeliä.

o 2: 8 eläimiä käsiteltiin iv kerran viikossa kolmen viikon ajan 0,05 mg /kg α-kobrotoksiini tai 0,1 mg /kg α-cobratoxin (vastaa puoli-MTD). Sillä α-cobratoxin puolen MTD vastaa 12,8 uM keskittymä, joka

in vitro

pitäisi tappaa 50 ja 63%: n A549-soluja. Kahdeksan ohjaus eläimet saivat pelkkää kuljetinta.

Toisessa julkaisu [18], jossa aikataulu ohjeen 1 käytettiin, raportoidut α-cobratoxin annos oli 0,12 mg /kg. Pohjalta meidän

in vivo

myrkyllisyyden määrittämistä me pidetään tällä annostuksella liian korkea määrä antaa kolmena peräkkäisenä päivänä hiirille, joilla on heikentynyt keuhkojen toiminta.

Kun alustava arviointi kasvaimen kasvua päivänä 7 kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus aiheuttama myrkkyjen arvioitiin käsitellyn ja käsittelemättömän hiirillä päivinä 14, 21 ja 28 annon jälkeen molemmissa protokollia. Olemme havainneet, että alkuvaiheessa kasvun bioluminesenssitekniikalla eläinten tarkasti edustaa kasvaimen kasvun laajuuden suhteen. Sitä vastoin myöhemmissä vaiheissa, tuumorinekroosi ja vähentää perfuusion todennäköisesti vähentynyt valon emission hiirissä, vaikka kasvain oli täysin tunkeutuneet rintaontelosta ja useimmissa tapauksissa oli laajennettu ulkopuolella rintakehän.

pre- käsittely IVIS arviointi 56 hiirien tutkimukseen sisältyvät 7. päivänä osoitti onnistunut kasvaimen kasvua kaikilla eläimillä huolimatta 300-kertainen yksilöllinen vaihtelu (keskiarvo fotoniemissio: 5,5 × 10

7 /hiiri, alue 6,68 × 10

5-2,06 x 10

8). Siksi tietojen analysointiin, me pidetään kertamuutosta päästöjen välillä käsiteltyjen ja käsittelemättömien eläinten lukumäärä kussakin hoitoaika pisteen (14, 21 ja 28 päivää) pikemmin kuin absoluuttinen fotoni päästöarvot [18].

kuvassa 6, raportoimme raaka IVIS määrittäminen kussakin hoidetuilla hiirillä α-kobrotoksiini aikataulun mukaisesti 1 ja vastaavassa kontrolliryhmässä. Kuten on esitetty, tämä hoito ei näytä olevan merkittävää vaikutusta kasvaimen kasvuun tässä eläinmallissa järjestelmää. Ainoa ilmeinen Silmiinpistävä ero oli kuolleiden eläinten lopussa havainnointijakson aikana (4 kontrolliryhmässä ja 2 hoitoryhmässä). On kuitenkin huomattava, että tällä hetkellä kaikki eläimet oli teurastettava eettisistä syistä ja että ruumiinavaus paljasti, että kasvain oli ulottunut ulkopuolella rintaonteloon kaikissa käsiteltyjen ja käsittelemättömien hiirten. Kuten kuviossa 7 on esitetty myös korkeammat annokset hyödynnetään aikataulun 2 hoitosuunnitelma, vaikutus α-kobrotoksiini kasvaimia aine oli vähäinen, jos sellaisia ​​on. Mitä ohjelma 1 hoitosuunnitelma, myös nämä eläimet lopetettiin päivänä 28, koska kasvaimen kasvun liittyviä oireita. Todellakin, ruumiinavauksessa kaikkien eläinten esitti täysin tunkeutuneet rintaonteloon ajoksilla ulkopuolelle ulottuvaa rinnassa riippumatta hoitosuunnitelman mukaisesti.

X merkitsee kuolleita eläimiä.

X tarkoittaa kuolleita eläimiä.

kuvassa 8 on raportoitu keskimäärin kertamuutosta päästöjen käsittelyyn ja säätövarret aikataulun 1 (paneeli A) ja aikataulu 2 (paneeli B). Vaikka ero, arvioi Mann-Withneu testiä, ei ollut tilastollisesti merkitsevä (paitsi ohjelma 1, päivä 14, p = 0,04), havaitsimme silmiinpistävää korkeampi päästö toksiini hoitoryhmässä suhteessa kontrolliryhmään. Tämä vaikutus oli dramaattisesti ilmeinen aikataulussa 2 päivänä 28, vaikka ero fotoniemissio ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä, todennäköisesti siksi, että rajallinen määrä eläimiä,

Paneeli A: hiiret, joita käsiteltiin α- kobrotoksiini aikataulun mukaisesti 1. paneeli B: hiiret, joita käsiteltiin α-kobrotoksiini aikataulussa 2. paneeli C lämpötilassa: hiiret, joita käsiteltiin α-cobratoxin aikataulun mukaisesti 1 ja 2.

sama kohtelu aikataulut olivat myös hyödyntää kanssa α-cobratoxin. Tulokset tästä koesarja osoitti, että tämä toksiini puuttuu ilmeinen kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus samoin. Kuviossa 9, raportoimme raaka IVIS määrittämiseksi kunkin hiirissä, joita käsiteltiin α-cobratoxin aikataulun mukaisesti 1 ja 2, kun taas kuviossa 8, paneeli C, osoitamme keskimääräinen kertamuutosta päästöjen valvonnassa ja käsitellyissä hiirissä. Kuten voidaan nähdä, hoito ei olennaisesti vaikuta kasvaimen kasvua fotoniemissio käsitellyissä hiirillä oli verrattavissa tarkastukset kussakin ajankohdassa. Eläinten lukumäärän, jotka oli uhrattu inhimillisistä syistä ennen loppua havainnointijakson aikana oli suurempi hallinnassa verrattuna käsitellyillä hiirillä. On kuitenkin todettava, että myös tässä tapauksessa kaikki eläimet, päivänä 28, esitteli massiivinen kasvaimen kasvua että laajennettu ulkopuolella rintaonteloon riippumatta hoitosuunnitelma.

X tarkoittaa kuolleita eläimiä.

in vivo

kokeet suoritettiin vain A549-luc-solulinja, koska käyttö ei-luc-TAG-soluja olisi vaatinut suuren määrän hiiriä arvioida tuumorin vastainen aktiivisuus myrkkyjä. Ottaen huomioon saadut tulokset

in vitro

5. solulinjoissa ja

in vivo

A549-luc me epäeettistä edeltää ylimääräisiä eläinkokeet

molekyyliperustan keuhkosyöpä on tutkittu laajasti ja vuorovaikutusta nikotiinin ja nAChr on tunnustettu yhdeksi tärkeimmistä tapahtumista, jotka johtavat kehittämistä tämän kasvain [2], [4], [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [16], [26]. Näin ollen ei ole yllättävää, että nAChr katsottiin hyvä ehdokas tavoitteet innovatiivinen ”biologinen” hoitojen [15], [22], [23], [24]. Tässä suhteessa on olemassa voimakas toksiineja estämällä nach reseptoreita saattaa avoimeksi mahdollisuus mukauttaa Paul Ehrlich n ”ihmelääke” käsite keuhkosyövän hoidossa [34].

Kobra käärmeen myrkky on lähde eri toksiinien jolla sytolyyttinen ja nAChR inhibointiaktiivisuudet [32], [35]. Tämän vuoksi jälkimmäisen toimintaa, α-cobratoxin päässä

N. kaouthia

on ehdotettu innovatiivinen luonnollinen terapeuttinen aine keuhkosyöpään [18], [19], [20], [22], [24], jotka kykenevät dramaattisesti estävät keuhkojen kasvainsolujen kasvua ja parantaa merkittävästi eloonjäämistä keuhkojen on kasvain. Olemme arvioi uudelleen kasvaimen kasvua estävän toiminnan kahdella eri kobra neurotoxins

in vitro

ja

in vivo

käyttämällä kahta aikataulut hallinnon ja samoja koeolosuhteita aiempien raporttien. Tulokset kokeissa osoittavat selvästi, että nämä kaksi biologisesti aktiivisia toksiineja ole olennaisesti mitään vaikutusta kasvaimen solukasvua

in vitro

määrityksissä siinä pitoisuudessa raportoitu muissa julkaisuissa. Merkittävä kasvainsolujen kasvun esto saatiin klo α-cobratoxin pitoisuus liian korkea voidaan hyödyntää

in vivo

. Tärkeää on α-neurotoxins pitoisuuksina käyttökelpoinen

in vivo

, ei estää kasvaimen kasvua eikä kykenivät merkittävästi pidentää selviytymisen hiirillä, joilla on Maailman ortotooppisesti-oksastettu NSCLC. Todellakin,

in vivo

kokeissa oli keskeytettävä 28. päivänä, tai aiemmin, vuonna hoidettujen ja hoitamattomien koe-eläimille eettisistä syistä, koska kaikissa tapauksissa oksastetun kasvain oli laajennettu ulkopuolella rintakehään. Nämä tulokset ovat silmiinpistävä vastakohta muiden kyseisessä tutkimuksia, jotka on raportoitu lisääntynyt elinikä 93% vuonna α-cobratoxin käsiteltyjen versus käsittelemättömien hiirten [20] ja ehdottaa, että kobra α-neurotoxins ole mahdollista terapeuttista vaikutusta keuhkosyöpään.

jää selitti, miksi yhdessä julkaistussa raportissa samasta ryhmästä kaikki eläimet pitänyt tappaa humanitaarisista syistä päivänä 29 [18], kun taas toisessa tutkimuksessa eläimet, käsitelty muulla vastaavalla tavalla, voitaisiin seurattu päivä 170 [20 ], (katsaus [22]).

Yllättäen olemme havainneet, että

in vivo

kasvaimen kasvua hiirissä, joita käsiteltiin α-kobrotoksiini oli suurempi kuin verrokkiryhmässä. Tämä odottamaton havainto saattaisi viitata siihen, että vaikka tämä toksiini ei sitoudu α7 reseptorin raportoitu vallitseva alatyyppi on läsnä A549-soluja, se voi aktivoida nikotiiniriippuvaisilla tuumorigeenisiä reitin sen sitoutumisen kautta eri nAChR (todennäköisimmin lihas-reseptori) . Siten tämä toksiini voi olla erinomainen työkalu hienoksi dissecting biologisen polkuja jossa nAChr ovat mukana.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki tietoja: käyttöoikeudet asetusten ja eläinten hyvinvointia raportoidaan ”Animals” sub-osa tämän menetelmät jaksossa

Kasvaimen solulinjat ja α-hermomyrkky valmisteiden

rotan pheochromocytoma solulinja PC12, hyödynnetään positiivisena kontrollina ja α7 nAChR ilmentymisen, ihmisen NSCLC adenokarsinooma solulinjojen H1650 ja H1975 saatiin ATCC; NSCLC A549 ja levyepiteelikarsinoomasolu linjoja SK-MES 1 ja CALU 1, saatiin meidän Institutional Cell Repository (ICLC, www.iclc.it). Solu A549-luc, muokattu vakaasti ilmaista lusiferaasi ja hyödyntää

in vivo

tutkimuksissa luovutti ystävällisesti Dr. J.W. Shay (H. Simmons Kattava Cancer Center, University of Texas, Dallas). A549, A549-luc, SK-MES 1 ja H1650 käyttää esillä olevassa tutkimuksessa oli sama alkuperä näiden hyödyntää muilla julkaistujen teosten [18], [19], [20], [27]. Soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% naudan seerumia. (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia).

lyhytketjuisia α-kobrotoksiini päässä

N. atra

(MW 6949 kDa) saatiin Sigma (Milano, Italia). LD50 hiirillä erän hyödynnetään tässä työssä, määräytyy yhtiön, oli 0,09 mg /kg.

pitkäketjuiset α-cobratoxin (MW 7821 kDa) puhdistettiin

N. kaouthia

myrkky, kuten on kuvattu [36]. Menetelmässä: geelisuodatus, korkean suorituskyvyn ioninvaihto ja käänteisfaasikromatografialla ja käytetään tuottamaan suuria määriä toksiinia reseptorin tutkimuksissa [37]. Α-cobratoxin valmistettiin tällä menetelmällä on täysin aktiivinen ja esti asetyylikoliinin aiheuttama virtojen

Xenopus

varhaismunasolujen ilmentävät ihmisen α7 nikotiiniasetyylikoliini reseptorin IC

50 4,1 nM [38]. Biologista aktiivisuutta erän toksiinia käytetään tässä tutkimuksessa testattiin kyky estää radioaktiivisen α-Bungarotoksiini sitoutumisen ihmisen α7 asetyylikoliinin nikotiinireseptorin heterologisesti ilmaistuna GH4C1 soluissa. 20 nM α-cobratoxin esti α-Bungarotoksiini sitova yli 50%.

Lyofilisoitu toksiinien liuotettiin klo kantakonsentraatiolla 10

-3 M fosfaattipuskuroituun suolaliuos (PBS) ja pidetään -20 ° C: ssa.

Western blot-analyysi

Solususpensiot saatu trypsinaatiolla A549 tai A549-luc ja PC12-viljelmissä (käytetty positiivisena kontrollina). Solut liuotettiin lyysipuskurissa ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [39]. Proteiinin pitoisuus solulysaateista määritettiin Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italia) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Viisikymmentä ug kokonais-proteiinit erotettiin NuPAGE 4-12% bis-Tris-geeliä (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia) ja sitten siirrettiin nitroselluloosakalvolle iBlot ™ Gel Siirto pinot (Invitrogen).

blotit anti α7 AChR polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz, Heidelberg, Saksa) ja sen jälkeen anti-ßActin monoklonaalinen vasta-aine (Sigma, Milano, Italia) varmistaa, että sama määrä proteiinia ladattiin kuhunkin kaistaan.

immunodetektio suoritettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (ECL) kit (GE Healthcare, Milano, Italia) seuraten toimittajan suosittelemien menettelytapojen mukaisesti.

RT ja qPCR analyysi

Yhteensä RNA A549-luc (käsittelemättömät ja käsiteltiin 1, 3 ja 9 nM α- cobratoxin tai α-kobrotoksiini 72 h), A549 (käsittelemättömät ja käsiteltiin 1, 3 ja 9 nM α-cobratoxin), H1650, H1975, SK-MES 1, CALU 1 ja PC12-solulinjoja eristettiin käyttäen RNAeasy Mini Kit (Qiagen) seuraten valmistajan ohjeita. RNA käsiteltiin RNAasi-vapaata DNAasi aikana kolonniin puhdistusta. RNA eheys arvioitiin geelielektroforeesilla: suhde 28S ja 18S oli noin 02:01. RNA kvantitoitiin spektrofotometrisesti. Suhde lukemat 260 nm: ssä ja 280 nm: ssä, joka on välillä 1,9 ja 2,1.

Yksi ug kokonais-RNA: ta käytettiin cDNA: n valmistamiseen kanssa SuperScript ™ II RNaasi H- Reverse Trascriptase (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeita.

läsnäolon määrittämiseksi α7 nAChR solulinjoilla, cDNA käytettiin semikvantitatiivinen reaktiossa muualla on kuvattu [40], [41], [42].

PCR-olosuhteet olivat: 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 45 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 55 ° C 15 sekuntia ja 72 ° C 30 s).

qPCR-reaktiot suoritettiin käyttäen Maxima SYBR Green qPCR Master Mix .