Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant Wnt signalointi on osallisena lukuisissa ihmisen syövissä, ja ymmärtää vaikutuksia modulaation reitin jäsenten voi johtaa kehittää uusia hoitomuotoja. Expression of erittyvän frizzled related protein 4 (SFRP4) ekstrasellulaarinen säätelijä Wnt-signalointireitin, on vähitellen menettänyt aggressiivisempia munasarjasyövän fenotyyppejä. Tässä osoitamme, että yhdistelmä-DNA-SFRP4 (rSFRP4) hoitoon vakavien munasarjasyövän solulinja johtaa inhibitioon β-kateniinin riippuvainen Wnt signaloinnin mitattuna TOP /FOP Wnt reportterimääritys ja laski transkription Wnt kohdegeenien, Axin2, CyclinD1 ja Myc. Lisäksi rSFRP4 hoito lisäsi merkittävästi kykyä munasarjasyöpäsoluja kiinni kollageenin ja fibronektiinin, ja laski niiden kyky siirtää yli aiheutettu haava. Olemme päätellä, että nämä muutokset solussa ongelma voi välittyvän mesenkymaalisten epiteeli- siirtyminen (MET), kuten rSFRP4 hoito myös lisännyt ilmentyminen epiteelin merkki E-kadheriinin, ja vähentää ilmentymistä vimentiinista ja Twist. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että modulaatio yhden alkupään portinvartija Wnt signalointi voi olla vaikutuksia loppupään Wnt signalointia ja munasarjasyövän solujen käyttäytymistä, kuten välittyvät epiteelin ja mesenkymaaliset plastisuus (EMP). Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että SFRP4 voidaan käyttää sekä diagnostisesti ja terapeuttisesti epiteelin munasarjasyöpä.

Citation: Ford CE, Jary E, Ma SSQ, Nixdorf S, Heinzelmann-Schwarz VA, Ward RL (2013) Wnt Gatekeeper SFRP4 moduloi EMT, Cell Migration ja Downstream Wnt signalointi seroosit munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (1): e54362. doi: 10,1371 /journal.pone.0054362

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 heinäkuu 2012; Hyväksytty 11 joulukuuta 2012 mennessä; Julkaistu: 11 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Ford et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoitettiin osittain avustusta Cure Cancer Australia Foundation (# 1008633, CEF), National Health ja Medical Research Council CJ Martin Fellowship (# 466005, CEF), Cancer Institute NSW (# 09 /CRF /2-02, VHS) William Maxwell Trust (VHS) ja Royal Australian ja Uuden-Seelannin College of Synnytyslääkärit ja Gynekologit (VHS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epiteelin munasarjasyöpä on korkein kuolleisuus kaikista naisten gynekologisten syöpien [1], [2]. Huolimatta viimeaikaisista oivalluksia heterogeenisyys tämän taudin [3] – [6], ja keskustelu solun alkuperän [7], [8], suurin osa epiteelin munasarjasyöpä potilaat saavat saman systeemisen hoidon (karboplatiini, paklitakseli [5] . lisätutkimuksia molekyylitason reitit ohjaa tätä tautia on tarpeen tunnistaa uusia kasvain-markkereita ja kohteita terapeuttiselle interventiolle. Yksi polku, joka on tunnistettu potentiaalisia merkitys munasarjasyövän on Wnt-signalointireitin [9] – [11 ].

Wnt-signalointireitin on ratkaiseva kehityskulku mukana erilaistumiseen, polaarisuus, muuttoliike, invaasio, tarttuvuus ja selviytyminen [12]. Nämä samat solujen prosessit ovat avaintekijät tuumorigeneesiä ja etäpesäkkeiden, ja siten rooli Wnt signalointi ihmisen syövässä yhä tutkitaan yhdessä hoitostrategioita kohdistaa reitin osia. häiriöstä Wnt-signalointireitin on ollut mukana lukuisissa syövissä, mukaan lukien ne, joilla on korkea esiintyvyys ja /tai huono tuloksia, kuten kolorektaalisen, rinta-, munasarja-, ja eturauhassyöpä (tarkistetaan [13]).

Tässä monipuolisessa signalointiverkolla on perinteisesti yksinkertaistettu jakamalla verkko tulee kanoninen (β-kateniinin riippuvainen) ja ei-kanoninen (β-kateniinin riippumaton) polkuja. Kanoninen Wnt signalointi sisältää sitoutumisen Wnt ligandin yksi kymmenestä Frizzled-reseptorien (FZD), kun läsnä on alhaisen tiheyden lipoproteiinin reseptoriin liittyvä proteiini (LRP) co-reseptori. Tämä luo kaskadin tapahtumia johtaa purkaminen ak- siini /APC /GSK3p tuhoa monimutkainen ja vakauttamiseen β-kateniinin. Kertyminen β-kateniinin sytoplasmassa tulokset translokaatio tumaan ja TCF /LEF aktivaatio kohdegeenien osallistuvat solujen erilaistumiseen ja proliferaatioon. Keskeiset alavirtaan tavoitteet aktivoitujen kanoninen Wnt signalointia sisältävät C-myc (

MYC

), CyclinD1 (

CCND1

) ja Axin2 (

AXIN2

) [12].

Wnt reitin säädellään useilla tasoilla, Wnt antagonistien tai ”portinvartijana proteiinit” saanut huomiota viime vuosina, koska niiden usein inaktivaatioon syövässä. Tämä ryhmä Wnt modulaattorit sisältää Dickkopf perhe (DKK1-4), WIF-1 ja perhe eritettyjen frizzled reseptorin proteiinit (SFRP1-5). SFRP: t ovat liukoisia solunulkoisia proteiineja ominaista niiden frizzled kaltainen kysteiinirikkaan (CRD), jonka ajatellaan olevan vastuussa niiden kyky moduloida Wnt signalointia sitoutumalla suoraan Wnt ligandeja tai Frizzled reseptoreihin. SFRP: t on osoitettu toimivan tuumorisuppressoreilla muihin syöpätyyppeihin [14] – [17]. Olemme aiemmin osoittaneet, että yksi näistä gatekeepereistä SFRP4, erittyy verenkiertoon ja vähitellen hävisi aggressiivisempia munasarjasyövän fenotyyppejä, kuten tyypin II syöpiä [18]. Lisäksi potilaille puuttuvat SFRP4 ilme oli huonompi ennuste kuin ilmentävät SFRP4 [18].

epiteelikasvaimet kohteeseen mesenkymaalitransitioon (EMT) on keskeinen kehitysprosessiin että syöpäsolut kaapata lisätä aggressiivisuutta ja invasiivisia potentiaalia [19] . Vaikka monimutkainen, ja solutyyppispesifisiä, solut meneillään EMT voidaan yleisesti ominaista menetys E-kadheriinin ja voitto vimentiinista, Twist ja Snail. Siirtymävaihetta voi tapahtua myös vastakkaiseen suuntaan (mesenkymaalisten ja epiteelin siirtymistä (MET).) Nykyään on selvää, että MET on yhtä tärkeitä organogeneesin ja etäpesäkkeiden, ja että monet väli- tai ”metastable” solu todetaan olemassa solujen siirtyminen kahden ääripään [20], [21]. Tämä dynaaminen prosessi on nimetty epiteelin ja mesenkymaaliset plastisuus, tai EMP. Monet signalointireitteihin on yhdistetty EMP, erityisesti TGF β, Notch ja Wnt polkuja.

Tässä Tässä tutkimuksessa tutkimme toiminnalliset vaikutukset modulaation keskeinen Wnt koulutusjakson portinvartija, SFRP4 on Wnt signalointia, solu käyttäytymistä ja EMT. Me raportoimme ensimmäistä kertaa, että uudelleen ilmentäminen SFRP4 vuonna epiteelin munasarjasyövän solulinja estää Wnt signalointia, lisää tarttuvuutta, estää solujen vaeltamiseen ja estää EMT. Koska SFRP4 ilmaisu on osoitettu kadota suuri enemmistö munasarjasyöpä potilaiden [18], tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että modulaatio Wnt signalointia SFRP4 tai muun ylävirran Wnt reitin jäsenet voivat edustaa uusi väylä kohdennetun hoidon munasarjasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen vakavien munasarjasyövän OVCAR3 soluja, saatiin ATCC: stä (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) viljeltiin RPMI, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia. Media oli täydennetty penisilliinillä /streptomysiinillä (90 yksikköä /ml penisilliiniä, 90 ug /ml streptomysiiniä), ja 1,8 mM GlutaMAX (Life Technologies). Kaikki solut kasvatettiin kosteassa ilmakehässä, 5% CO

2, 37 ° C: ssa ja oli osoitettu olevan vapaita mykoplasmakontaminaation.

Wnt toimittaja määrityksissä

OVCAR3 solut maljattiin pitoisuutena 5000 solua /kuoppa valkoinen pohja 96-kuoppalevyille. Solut seerumia yli yön ja ko-transfektoitiin 0,2 ug joko TOPflash (3 x TCF4 sitoutumiskohdat) tai FOPflash (3 x mutatoitu TCF4 sitoutumiskohdat) ekspressioplasmidien (Millipore, Temecula, CA, USA), ja 0,1 ug PRL-TK (Renilla-TK-lusiferaasi vektori, Promega) kontrollina, käyttäen Iipofectamine2000. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin kasvavia annoksia rSFRP4 ja /tai rekombinantti Wnt3 a kappale (rWnt3 0,1 ug /ml) 48 tunnin ajan ennen lusiferaasiaktiivisuudet mitataan käyttäen Glomax 96 Microplate Luminometer (Turner Biosystems Instrument, Sunnyvale, CA, USA). Tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus normalisoitiin transfektiotehokkuuden jakamalla Renilla lusiferaasiaktiivisuus. TOP /FOP suhdetta käytettiin mittana β-kateniinin jentymisen. Keskimääräinen aktiivisuus ja keskihajonnat on saatu octopulate transfektoiduista näytteistä.

Quantitative käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä PCR (qPCR) B

jälkeen DNaasikäsittelyä, 1 ug kokonais-RNA: ta transkriptoitiin cDNA: ksi käyttäen Quantitect RT kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Ohjaimet sisältävä RNA mutta ilman käänteistranskriptaasia olivat mukana kaikki näytteet. qPCR suoritettiin kolminkertaisena on Stratagene MxPro 3005 P laitteeseen 25 ng cDNA-templaattia ja SYBR vihreä /Rox master mix (Qiagen). Expression oli normalisoitu kolmeen eri siivous geenit (SDHA, HSPCB, YWHZA) käyttäen Vandesompele normalisoinnin menetelmää [22].

Alukesekvensseillä käytetään qPCR olivat SFRP4: eteenpäin (F) 5 ’TGTGTTACGAGTGGCG 3’, käänteinen ( R) 5 ’GGGGGATTACTACGACTG 3’, CDH1: F 5 ’AGGCCAAGCAGCAGTACATT 3’ R 5 ’ATTCACATCCAGCACATCCA 3’, VIM F 5 ’CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC 3’ R 5 ’GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA 3’, TWIST F 5 ’GCCAATCAGCCACTGAAAGG 3’ R 5 ’TGTTCTTATAGTTCCTCTGATTGTTACCA 3’ , AXIN2 F 5 ’TCAAGTGCAAACTTTCGCCAACC 3’ R 5 ’TAGCCAGAACCTATGTGATAAGG 3’, MYC F 5 ’CGTCTCCACACATCAGCACAA 3’, R 5 ’CACTGTCCAACTTGACCCTCTTG 3’, CCND1 F 5 ’GGCGGAGGAGAACAAACAGA 3’ R 5 ’TGGCACAAGAGGCAACGA 3’, JNK F 5’TCTGGTATGATCCTTCTGAAGCA 3 ”R 5 ’TCCTCCAAGTCCATAACTTCCTT, RhoA F 5’ GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT 3 ’R 5’ GGCTGTCGATGGAAAAACACAT 3 ’, Rac1 F 5’ TGTAGTCGCTTTGCCTATTGATG 3 ’R 5’ CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3 ’, PRKCA F 5’ GCTTCCAGTGCCAAGTTTGC 3 ’R 5’ CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3 ’, SDHA F 5 ’CTTGAATGAGGCTGACTGTG 3’ R 5 ’ATCACATAAGCTGGTCCTGT 3’, HSPCB F 5 ’TCTGGGTATCGGAAAGCAAGCC 3’ R 5 ’GTGCACTTCCTCAGGCATCTTG 3’, YWHZA F 5 ’ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 3’ R 5 ’CCGCCAGGACAAACCAGTAT 3’.

Western blotit

Solulysaatit valmistettiin hajottamalla solut lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM natriumortovanadaattia, 50 mM natriumfluoridia, 0,27 M sakkaroosia, 1 x täydellinen proteaasinestäjä (Roche, Basel, Sveitsi)). Lysaatit sentrifugoitiin ja supernatantti otettiin talteen proteiinipitoisuus analyysi käyttäen BCA-pakkausta (Pierce, Rockford, IL, USA). Nuclear proteiini lysaatit valmistettiin lysoimalla solut jääkylmään Nuclei puskuri (10 mM Tris, pH 7,4, 10 mM NaCl: a, 3 mM MgCI2, 0,1 mM EDTA: a ja 0,5% NP-40, proteaasi-inhibiittorit) ja inkuboimalla jäillä 10 minuutin ajan . Tumat talteen sentrifugoimalla 900 g: ssa 3 minuutin ajan, pestään ytimet Wash Buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 10 mM NaCl: a, 3 mM MgCI2 ja 0,1 mM EDTA: ta, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita), ja suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Western blotting, vasta-aineita SFRP4 (ab32784, Abcam, Cambridge, MA, USA), E-kadheriinin (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), vimentiinistä (# 5741, Cell Signaling Technology), Twist (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), β-kateniinin (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), histoni H3 (# 9715s, Cell Signalling) ja α-Tubulin (# 3873, Cell Signaling Technology) käytettiin. Proteiiniviivat tunnistettiin ja mittaamaan Image Quant LAS 4000 (GE Healthcare).

Migration määrityksissä

OVCAR3-solut ympättiin IBIDI Culture-insertit (IBIDI GmbH, Am Klopferspitz 19, 82152 Martinsried , Saksa) ja käsiteltiin 24 tuntia rSFRP4 (5 ug /ml). IBIDI insertit poistettiin ja sulkemisen tuloksena haavan seurattiin seuraavan 48 tunnin aikana. Kuvia haavan siepattiin eri ajankohtina käyttäen Leica DMIL mikroskooppi järjestelmä (Leica, Wetzlar, Saksa).

Adhesion määrityksissä

Kudosviljelytutkimusten levyt päällystettiin ratkaisuja 10 ug /ml: n tyypin I kollageenin (Sigma, Castle Hill, Australia), 5 ug /ml fibronektiiniä (Millipore, Bedford, MA, Yhdysvallat) ja 3% BSA: ta PBS: ssä ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Levyjä huuhdeltiin 80% etanolilla, inkuboitiin 3% BSA seerumivapaassa 30 min ajan 37 ° C: ssa ja huuhdeltiin jälleen PBS: llä. Solususpensiot lisättiin päällystetyille levyille ja annettiin kiinnittyä 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Levyt pestiin varovasti PBS: llä, kiinnitettiin 96% etanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Ylimääräinen tahra poistettiin laajasti pesemällä levyt steriiliin veteen. Sen jälkeen kun levyt olivat kuivuneet, solut lyysattiin 50% etikkahappoa, ja absorbanssi luettiin 595 nm: ssä käyttämällä SpectraMax-Plus384 Absorbanssi Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Tilastollinen analyysi

tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastot suoritettiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin t-testiä. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001.

Tulokset ja keskustelu

SFRP4 estää Wnt signalointia on serous munasarjasyövän solulinja

Jatkona meidän edellisestä työstä osoittaa, että SFRP4 tappio oli yleinen tapahtuma epiteelin munasarjasyöpä [18] määritimme jos lisäämällä ihmisen rekombinantti SFRP4 (rSFRP4)

in vitro

voivat estää β-kateniinin riippuvainen Wnt signalointia. Valitsimme serous munasarjasyövän solulinja OVCAR3 näitä kokeita kuten siitä puuttuu havaittavissa SFRP4 ilmaisua ja on aiemmin raportoitu olevan konstitutiivista Wnt signalointia (osoituksena kertyminen /läsnäolon ydin- β-kateniinin, [23]). Stimulointi OVCAR3 solut yhdistelmä Wnt3a (rWnt3a) johti merkittävään kasvuun β-kateniinin riippuvainen Wnt signalointia mitattuna kautta TOP /FOP FLASH lusiferaasin Wnt reportterianalyysi (kuvio 1A), joka vahvistaa, että se oli todellakin Wnt reagoiva solulinjassa. Sitten testattiin kasvavilla pitoisuuksilla rSFRP4, ja havaittiin, että 5 ug /ml rSFRP4 tarvittiin merkittävästi inhiboimaan β-kateniinin riippuvainen Wnt signalointia (kuvio 1A). Tämä pitoisuus rSFRP4 myös osoitettu estävän proteiinin tasot β-kateniinin tumassa (kuvio 1 B). Tämä pitoisuus käytettiin sitten kaikkien myöhemmissä kokeissa.

(A) OVCAR3 solut ko-transfektoitiin PRL-TK (Renillaa) ja joko TOPflash tai FOPflash ekspressioplasmideja. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin kasvavia annoksia rSFRP4 ja /tai rekombinantti Wnt3 a kappale (rWnt3a 0,1 ug /ml) 48 tunnin ajan ennen lusiferaasiaktiivisuudet mitataan käyttäen Glomax 96 Microplate Luminometer. Keskimääräinen aktiivisuus ja keskihajonnat olivat peräisin octopulate transfektoiduista näytteistä. Tulokset edustavat keskiarvoa 3 kokeita ja pylväät edustavat keskihajonta (S.D) keskiarvon. *

P

0,05. (B) edustaja immunoblot oli lisääntynyt SFRP4 ja laski ydin- β-kateniinin proteiinin ilmentymisen OVCAR3 soluissa 72 tuntia hoidon rSFRP4 (5 ug /ml). Ylälevy SFRP4 lauseke (SFRP4, ab32784, Abcam, Cambridge, UK), toinen paneeli α-tubuliinin ilmaisu (α-tubuliinin # 3873, Cell Signalling Technologies, Danvers, MA, USA), kolmas paneeli ydin- β-kateniinin (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), alalevy Histone H3 (# 9715s, Cell Signalling). (C) densitometrinen analyysi SFRP4 proteiinin ilmentymisen 3 erillisestä kokeesta. Pylväät edustavat S.D keskiarvon. *

P

0,05. (D) Suhteellinen SFRP4 RNA ekspressio lisääntyi OVCAR3 käsitellyissä soluissa rSFRP4 (5 ug /ml) 48 tuntia. qRT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena ja normalisoitiin kolme erilaista siivous geenit (SDHA, HSPCB, YWHZA). Tulokset edustavat keskimäärin 6 kokeiluja. Pylväät edustavat S.D keskiarvon. *

P

0,05. (E) Suhteellinen ilmentyminen β-kateniinin riippuvainen Wnt kohdegeenien aleni OVCAR3 käsitellyissä soluissa rSFRP4 (5 ug /ml) 48 tuntia. qRT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena ja normalisoitiin kolme erilaista siivous geenit (SDHA, HSPCB, YWHZA) Expression of AXIN2, MYC ja CCND1 vähenivät rSFP4 käsitellyissä soluissa, verrattuna kontrolliryhmään. Tulokset edustavat keskimäärin 4 kokeita ja baaria edustavat S.D keskiarvon. *

P

0,05. (F) suhteellinen ekspressio β-kateniinin riippumaton Wnt kohdegeenien oli ennallaan OVCAR3 käsitellyissä soluissa rSFRP4 (5 ug /ml) 48 tuntia. qRT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena ja normalisoidaan kolme erilaista siivous geenit (SDHA, HSPCB, YWHZA) Expression JNK, RhoA, Rac1 ja PRK2A pysyivät muuttumattomina rSFP4 käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolliryhmään. Tulokset edustavat keskimäärin 3 kokeita ja baaria edustavat sd keskiarvon.

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia hoidon rSFRP4 (5 ug /ml) johtaa noin kaksi kertaiseen kasvuun SFRP4 mRNA ja proteiini kuten lisäksi solunulkoisten yhdistelmä-Wnt-proteiinien tehostaa endogeenisen proteiinin tuotantoa. (Kuvio 1 B-D). Ilmaisu Kolmen loppupään Wnt kohdegeenien CyclinD1 (CCND1), C-myc (MYC) ja Axin2 (AXIN2) pieneni seuraavat rSFRP4 hoidon (kuvio 1 E). Kuitenkin näistä 3 geeneistä, vain AXIN2 ilmentyminen väheni merkittävästi (

P

= 0,03). Toisin kuin CCND1 ja MYC, AXIN2 on hyvin hyväksytty erityisenä Wnt kohdegeenin ja tähän mennessä ei ole yhteydessä muihin signaalinvälitysreittien [24] – [27]. Lisääntynyt ilmentyminen AXIN2 kerrottiin kaikissa serous munasarjasyöpää sairastavilla potilailla tuoreessa tutkimuksessa [10], mikä osoittaa, että poikkeava Wnt signalointi voi olla yleisempää epiteelin munasarjasyöpä kuin aiemmin on ajateltu. Sekä MYC ja CCND1 tiedetään toimivan muita ratkaisevia signaalireitteihin osallisena munasarjan syövän synnyn [28] – [31], jotka voivat selittää, miksi he osoittivat heikompi ilmentyminen muuttuu kuin AXIN2 vastauksena SFRP4 hoitoon. On kuitenkin syytä muistaa, että lisäys SFRP4 järjestelmässämme kykeni vähentämään transkription kolme alavirran geenien Wnt-signalointireitin, mutta ei vaikuttanut alavirtaan tavoitteisiin β-kateniinin riippumaton Wnt signalointia (kuvio 1 F) eikä on ylävirran reseptorin reitin (FZD7) ja kolme muuta reseptorien (EGFR, ErbB3, AKT, tuloksia ei ole esitetty).

yhdessä nämä alkuperäisen kokeet osoittavat, että lisäämällä yhden Wnt-reitin modulaattori voi moduloida geeni transkriptio mallissa serous munasarjasyövän solulinja. Perustuen TOP /FOP Wnt reportterianalyysi, Western blotit ja Wnt kohdegeenin tuloksia, meidän tiedot viittaavat myös siihen, että kun kyseessä on munasarjasyöpä, SFRP4 toki toimivat antagonistina kanonisen tai β-kateniinin riippuvainen Wnt-signalointireitin. Näyttää myös siltä, ​​että SFRP4 ei toimi estää β-kateniinin riippumaton Wnt signalointia, kuten neljä kohdegeenien ei vaikuttanut käsittelemällä SFRP4. Tämä on kiinnostava, koska on epäselvää alan Wnt signalointia mitkä Wnt ligandeja estyvät mitä erityisiä jäsenet SFRP perheen, ja onko joissain tapauksissa SFRP: t saattavat itse asiassa lisätä sen sijaan estävät Wnt signalointia [32] – [34 ].

SFRP4 käsittely laski muuttoliike ja lisääntynyt adheesio munasarjasyöpäsoluja

SFRP4 hoito ei ollut vaikutusta solujen lisääntymistä (kuvio 2A), mutta estivät merkittävästi kykyä OVCAR3 solujen kyvyn vaeltaa aiheutettu haava (kuvio 2B). Se on myös osoittanut, että lisäys SFRP4 lisääntynyt kyky munasarjasyöpäsoluja kiinni kollageenin ja fibronektiinin päällystetty kudosviljelylevyille (kuvio 2C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että SFRP4 on kyky estää metastaattista potentiaalia munasarjasyöpäsoluja

in vitro

, joka sopii meidän aiempien kliinisten tietojen raportointi, että potilaat ilmentävät SFRP4 oli parempi ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika verrattuna puuttuu SFRP4 ilmaisun [18]. Se lisää yhä enemmän todisteita siitä, että Wnt-signalointireitin voi ensisijaisesti olla rooli syövän etäpesäkkeiden sijaan syöpä aloittamista.

(A) 24 tuntia rSFRP4 hoito (5 ug /ml) ei ollut vaikutusta solujen leviämisen, mitattuna kautta trypaanisinistä solulaskennalla käyttäen Countess järjestelmä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tulokset edustavat keskiarvoa 3 kokeita ja baaria edustavat S.D keskiarvon. (B) SFRP4 esti solumigraation. OVCAR3-solut ympättiin IBIDI Culture-insertit ja käsiteltiin 24 tunnin ajan rSFRP4 (5 ug /ml). IBIDI insertit poistettiin ja sulkemisen tuloksena haavan seurattiin yli 24 tunnin. Koe toistettiin kolme kertaa ja tulosten edustavat keskiarvoa prosenttiosuus avoimen haavan ja pylväät edustavat S.D. **

P

0,01. (C) SFRP4 kasvoi tarttumista kollageeniin ja fibronektiiniin. SFRP4 (5 ug /ml, 48 tuntia) käsiteltiin solujen annettiin kiinnittyä 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa joko 10 ug /ml tyypin I kollageenin tai 5 ug /ml fibronektiiniä, pestään, hajotetaan ja absorbanssi mitattiin 595 nm: ssä käyttämällä SpectraMax Plus384 Absorbanssi Microplate Reader. Tulokset edustavat keskiarvoa 6 kokeita ja palkit edustavat S.D keskiarvon. *

P

0,05.

SFRP4 estää EMT in munasarjasyöpäsoluja

Koska muutoksia solujen käyttäytymisen liittyvät EMT, tutkimme myös, onko SFRP4 olisi vaikuttaa solujen morfologiaan ja ilmaisu avaimen EMT markkereita, E-kadheriinin (CDH1), vimentiinistä (VIM), ja Twist1 (TWIST1). Vaikka ei ole selvää muutosta solun morfologiassa ei havaittu 48 tunnin jälkeen SFRP4 hoidon (kuvio 3A), hoito rSFRP4 lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin (kuvio 3B-D), ja vähentää ilmentymistä vimentiinista ja Twist (kuvio 3B-D) sekä transkription ja translaation tasolla viittaavia aloittamisesta MET.

(A) SFRP4 käsittely (5 ug /ml, 48 tuntia) ei aiheuttanut ilmeisiä muutoksia solun morfologian vakavien munasarjasyövän solulinja , OVCAR3 (10-kertainen suurennus). (B) E-kadheriinin (CDH1) ekspressio oli merkittävästi lisääntynyt, ja vimentiinin ja Twist laski SFRP4 (5 ug /ml, 48 tuntia) käsiteltiin OVCAR3 soluja. qRT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena ja normalisoitiin kolme erilaista siivous geenit (SDHA, HSPCB, YWHZA). Tulokset edustavat keskimäärin 6 kokeita ja palkit edustavat S.D keskiarvon. **

P

0,01, ***

P

0,001. (C) edustaja immunoblot oli lisääntynyt CDH1, ja laski VIM ja TWIST1 proteiinin ilmentymisen OVCAR3 soluissa 72 tuntia hoidon rSFRP4 (5 ug /ml). Ylälevy CDH1 ilme (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), toinen paneeli VIM ilme (# 5741, Cell Signaling Technology), kolmas paneeli TWIST1 ilme (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ), ja alalevy α-tubuliinin ilmaisu (α-tubuliinin # 3873, Cell Signalling Technology). (D) densitometrinen analyysi CDH1, VIM ja TWIST1 proteiinin ilmentymistä 3 erillisestä kokeesta. Pylväät edustavat S.D keskiarvon. **

P

0,01, *

P

0,05.

EMT, kuten Wnt reitissä on vahvimmin sidoksissa kehitykseen, mutta viime aikoina on saanut laajaa kiinnostusta sen mahdollisuuksia kohteena syövän hoidossa. Yleistynyt prosessit, jotka tapahtuvat kaikki syöpäsolut ovat houkutteleva avenue syöpähoidon mahdollisina hoidot on laajaa sovellettavuutta. Lisäksi poikkeava Wnt signalointia on vahvasti sidoksissa syöpiä huonoon ennusteeseen [12], [35], joten edelleen selvittäminen roolia tämän reitin ja sen luonnollinen portinvartijat tuottaa tärkeitä oivalluksia ihmisen sairauksien. On tiedetty jo vuosia, että Wnt signalointi voi vaikuttaa syöpäsolun migraation ja adheesion, ja tämä tutkimus tarjoaa jonkin verran näyttöä, että nämä vaikutukset voidaan suunnata prosessin kautta EMT. Tuloksemme antaa tukensa Tuoreen tutkimuksen yhdistää AXIN2 ja EMT kolorektaalisyövässä [27]. Lisäksi olemme hypoteesin, että SFRP4 estää kyky erityisiä Wnt-ligandien sitoutua Frizzled-reseptoreihin. Perustuu kahden aikaisempien tutkimusten, yksi osoittaa, että Wnt7a yliekspressoituu munasarjasyöpä [11], ja yksi viittaa SFRP4 voi estää Wnt7a sitoutumista Fzd5 endometriumin syöpä [36], spekuloida, että normaaleissa olosuhteissa SFRP4 sitoo ja sitoo pois Wnt7a. Kuitenkin epiteelin munasarjasyöpä, SFRP4 hiljenee, jolloin Wnt7a sitoa Fzd5 ja aktivoivat β-kateniinin riippuvainen Wnt signalointia, ja aja TCF /LEF välittämän transkription Wnt reportterigeenien kuten AXIN2, MYC ja CCND1.

Wnt-signalointireitin on erittäin monimutkainen ja toisiinsa polku liittyy moniin ihmisen sairauksiin. Koska reitti on pääasiassa mukana alkionkehityksen ja aikuisten kudosten korjaamiseen, huumeet suunnattu tämän reitin ei odoteta aiheuttavan merkittäviä sivuvaikutuksia tai myrkyllisyyttä [37]. Kuitenkin yrittää kohdistaa Wnt-signalointireitin syövän ovat olleet pääosin asian, jossa ei ole kliinisesti hyväksyttyjä huumeita tasalla. Tämä saattaa johtua siitä, että valinta lääkekohteita asuvat myöhemmässä vaiheessa Wnt signalointireitillä (äskettäin tarkistetaan [38]). Lukuisat tutkimukset ovat nyt raportoineet inaktivointi ylävirtaan komponenttien Wnt väylän syövän jäsenet mukaan luettuina SFRP ja DKK perheitä, mikä osoittaa keskeinen rooli näiden portinvartija proteiinien oncogenesis [14] – [17], [34], [39] . Nämä ekstrasellulaariproteiineista myös vahva potentiaali lääkekohteita johtuu niiden ylävirtaan asemansa kautta. Tässä tutkimuksessa osoitetaan potentiaalin alkupään koulutusjakson modulaatio yhdellä Wnt antagonisti. Koska on olemassa ainakin kymmenen solunulkoinen antagonisteja Wnt koulutusjakson selvittänyt, näiden yhdistelmät voivat tuottaa jopa vahvempi vaikutuksia [40] ja ansaitsee tutkia edelleen.