Krooninen sairaus

tiivistelmä

Telomerase on käänteistranskriptaasi liittyy solujen kuolemattomuus kautta telomere huoltoa. Tämä entsyymi on aktivoitu 90% ihmisen syövissä, ja inhibiittorit telomeraasin ovat tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa toimia kasvaimen kasvua. Monet seikat telomeraasi biologian on tutkittu hoidossa, erityisesti estää entsyymin, mutta vähän tehtiin koskevat sen subsellulaariset shuttling. Olemme äskettäin osoittaneet, että mutaatiot tumasta signaali hTERT, katalyyttinen komponentti telomeraasin, johti mutantti (

NES-hTERT), joka epäonnistui solut kuolemattomiksi huolimatta ydinvoiman lokalisointi ja katalyyttinen aktiivisuus. Expression of

NES-hTERT in primaarifibroblastin johti telomeeri- perustuvia ennenaikaisen vanhenemisen ja mitokondrioiden. Tässä osoitamme, että ilmaus

NES-hTERT LNCaP, SQ20B ja HeLa-solut nopeasti ja merkittävästi vähentää niiden leviäminen korko ja kyky muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa, kun ei häiritse endogeenisen telomeraasiaktiivisuutta. Syöpäsolut osoitti lisääntynyttä DNA-vaurioita klo telomeerisesti ja extra-telomeerisesti sivustoja, ja tuli herkkä ionisoivaa säteilyä ja vetyperoksidia vastuita. Tuloksemme osoittavat, että ilmentyminen

NES-hTERT tehokkaasti ehkäisee syöpäsolujen kasvua

in vitro

ainakin kahdella eri tavalla, ja ehdottaa manipulointi kanssa NES hTERT tai sen subsellulaarisista shuttling uutena strategia syövän käsittely.

Citation: Kovalenko OA, Kaplunov J, Herbig U, deToledo S, Azzam EI, Santos JH (2010) Expression of

NES-hTERT syöpäsoluissa Myöhästymiset solusyklin etenemisen ja Lisäykset Herkkyys Genotoksiset Stressi. PLoS ONE 5 (5): e10812. doi: 10,1371 /journal.pone.0010812

Editor: Marcelo G. Bonini, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 03 toukokuu 2010; Julkaistu: May 25, 2010

Copyright: © 2010 Kovalenko et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat New Jersey komission Cancer Research (NJCCR), lupanumeroon 808033 (JHS), 09-1124-CCR-EO (HY) ja 10-2412-CCR-E0 (JF), armeijan tutkimuksen toimisto, myöntää numero 56027LS (JHS), Ellison Lääketieteen säätiö myöntää AG-NS-0387-07 (HY). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keskeinen ominaisuus pahanlaatuisia kasvaimia on niiden kyky lisääntyä määräämättömän ajan. Tämä välittyy, 90%: ssa tapauksista, jonka aktivoituminen telomeraasin, käänteistranskriptaasia ylläpidosta vastaa telomeres [1], [2]. Telomerase koostuu minimaalisesti kahdesta eri alayksiköstä, katalyyttinen ydin (hTERT) ja RNA komponentti (hTR), jotka toimivat konsertti täydentymään telomeres jokaisen solunjakautumisen. hTERT on viime aikoina osoittanut hankkia ominaisuudet RNA-riippuvaista RNA-polymeraasia, kun kompleksin RNA komponentin mitokondrioiden endoribonukleaasi MRP [3]; tällainen toiminta ei ole mukana ylläpitoon telomeres. Kun taas hTR on läsnä sekä somaattisia ja sukusoluissa konstitutiivisesti, ilmentyminen hTERT säädeltyä. Telomeraasiaktiivisuus on korkea alkionkehityksen aikana ja valtaosa kasvaimia, mutta on pieni tai olematon useimmissa aikuisten somaattiset solut [1]. Tästä syystä, estämällä telomeraasi on tullut lupaava strategia syövän hoitoon.

Useita erilaisia ​​lähestymistapoja on kehitetty salpaavat telomeraasin holoentsyymin, jotka vaihtelevat estäjien hTERT G-Nelivaiheinen stabilointiaineita kohdennettua hajoaminen siihen liittyvä hTR [4] – [17]. Kaikissa tapauksissa, suoraa tai epäsuoraa telomerase inhibitio johtaa kyvyttömyys solujen ylläpitämiseksi telomeres ja lopulta solut pysäyttävät kasvun tai kuolee. Ongelma näistä lähestymistavoista on se, että useita viikkoja tai kuukausia varten tarvitaan vaikutuksia, koska ne useimmiten luottavat laajaan telomere lyhenemiseen [5]. Kuitenkin telomeraasiestäjät hetkellä kliinisissä tutkimuksissa [18].

Olemme äskettäin osoittaneet, että mutantti hTERT puutteellinen sen tumasta signaali (

NES-hTERT) onnistuneet säilyttämään telomeres ja ”terve” mitokondrioita sekä ensimmäisen ja SV40-transformoidut ihmisen fibroblasteissa [19]. Huolimatta ydinvoiman lokalisointi ja katalyyttinen aktiivisuus in vitro, mutantti proteiini oli biologisesti inaktiivinen in vivo johtaa ennenaikaiseen vanhenemiseen kanssa aktivointi klassisen telomere liittyvien DNA-vaurioita vastaus (DDR), kun ilmaistu ensisijainen soluissa. Expression of mutantti proteiini liittyi myös mitokondrioiden ja DNA-vaurioita sekä telomeerisesti ja extra-telomeerisesti sivustoja [19]. Koska nopea ja dramaattinen vaikutukset, me arveltu, että ektooppinen ilmentyminen

NES-hTERT voi myös olla tehokas keino torjua syöpäsolujen kasvua. Tässä tutkimuksessa olemme ilmaisseet

NES-hTERT erilaisissa syöpäsoluissa linjat ja osoittavat nopeaa ja tehokasta viivästyminen solusyklin etenemisen ilman havaittavaa muutosta tasot endogeenisen telomeraasin entsyymiaktiivisuus. Expression of mutanttiproteiinia vähentää merkittävästi kykyä solujen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun in vitro. Huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen

NES-hTERT johti ydinaseiden telomeerisesti, extra-telomeerisesti ja mitokondriaalisen DNA (mtDNA) vahinkoa syöpäsoluja ja herkistyneet ainakin yhdenlaista syöpäsolujen sekä oksidatiivisen stressin ja γ-säteily. Yhdessä tuloksemme ehdottavat kohdistaminen NES hTERT tai sen solunsisäisen liike uutena strategia tehokkaasti toimia kasvaimen solujen kasvua.

Tulokset

yli-ilmentyminen

NES-hTERT ihon ja eturauhassyöpäsolulinjoissa nopeasti estää solusyklin etenemisen

Olemme äskettäin osoittaneet, että ektooppinen ekspressio mutantti hTERT jossa NES on häiriintynyt (

NES-hTERT) aiheuttaa ennenaikaista vanhenemista telome–negatiivinen ihmisen fibroblasteja [19]. Ensisijainen solut, jotka ilmentävät

NES-hTERT enää kasva 5-20 populaation kaksinkertaistumista jälkeen käyttöönoton mutanttiproteiinia joka liittyi klassisen merkkejä solujen vanhenemista kuten saarto G1 S siirtymistä, säätelyä p21

waf1 , p16 ja positiivisuutta vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasi (β-gal) toimintaa [19]. Koska nämä vaikutukset, kysyimme, onko ilmaus

NES-hTERT vaikuttaisi myös solusyklin etenemistä telomeraasia positiivisten syöpäsolujen. Käsitellä tätä kysymystä, me pysyvästi ilmensivät

NES-hTERT in SQ20B (levyepiteelikarsinooma – ihosyöpä) ja LNCaP (eturauhassyöpä) solujen ja seurasi kasvu massa kulttuureissa useita viikkoja; kontrolli solut joko vasemman ei-tartunnan tai tartunnan tyhjällä vektorilla. Mitään eroja ei havaittu ei-tartunnan saaneiden ja tyhjä vektori transdusoidut solut (tuloksia ei ole esitetty). Solut valitaan antibiooteilla 2 viikkoa ennen aloittamista kokeiluja. Viral transductions toistettiin ainakin kaksi riippumatonta kertaa kukin solulinjan osoittaa toistettavia tuloksia. Kaikki kokeet esitettiin tässä tukeutua saadut soluilla peräisin vähintään kahdesta itsenäisestä virusinfektioita.

Pian kiinnitti huomiota, että kun virustransduktio muutoksia fenotyypin solujen tapahtunut; tällaiset muutokset havaittiin, kun solut vielä valittu. Fraktio (~30-50%) on SQ20B soluja, jotka ilmentävät

NES-hTERT oli litistetty ja laajentuneen morfologia joitakin näistä soluista osoittaa useita ytimiä (Fig. 1A, ylemmät paneelit), muistuttaa vaikutukset havaittiin ensisijaisen soluissa [19]. Toisin kuin ensisijainen fibroblasteissa, mitään positiivista β-gal-värjäyksen havaittiin SQ20B soluissa, jotka ilmentävät

NES-hTERT (tietoja ei esitetä), mikä viittaa siihen, että laajentuneen solut eivät senescent. Nämä solut olivat myös ei apoptoottisia, koska ne eivät olleet kupliminen tai irtoamasta astiat (tuloksia ei ole esitetty). Laajentunut morfologia ei havaittu LNCaP ilmentävät mutantti hTERT; vaikka nämä solut taipumus kasvaa klustereita /pesäkkeitä riippumatta niiden yhtymäkohta (katso myös ATCC), ilmaus

NES-hTERT tukahdutetaan tämän fenotyypin (Fig. 1A, keskimmäinen paneeli).

(A ) SQ20B (ylempi paneeli) LNCaP (keskellä paneelit) ja niiden johdannaiset, jotka ilmentävät stabiilisti

NES-hTERT maljattiin ruokia yhtä paljon ja analysoitiin 72 tuntia myöhemmin. Vaihekontrasti kuvat otettiin Olympus IX70 mikroskoopilla. Huomautus suurennettu morfologia SQ20B

NES-hTERT ja solujen kätkeminen useita ytimiä (nuolet). Klustereiden havaitaan LNCaP (katso laatikko), mutta ei nähty LNCaP

NES-hTERT. Pohja paneelit osoittavat HeLa-soluja, jotka oli ohimenevästi transfektoitu

NES-hTERT mutantti. Kuvat on otettu 48 tunnin kuluttua transfektioiden. Nuolet osoittavat laajentunut ja monitumaisia ​​soluja (keskellä) havaittiin vain, kun transfektio mutantti hTERT. (B) SQ20B, LNCaP ja

NES-hTERT johdannaiset maljattiin ja annettiin kasvaa jopa 144 tuntia. Eri aikoina solut kerättiin ja laskettiin käyttäen hemosytometria. Kun kyseessä on LNCaP, solut maljattiin uudelleen ja laskettiin uudelleen 72 tuntia myöhemmin. Mean kolme analyysien näkyy, virhe palkit edustavat s.e.m. (* P≤0.05) (C) Suhteellinen solujen kunkin vaiheen solusyklin laskettiin virtaussytometrialla perustuen PI-värjäyksellä. (D) Soluja ilman seerumia yön yli, sitten vapautetaan seerumin lisäämällä. Solut leimattiin [

3H] -tymidiinin ja analysoidaan aikataulun välein tymidiinin. Tarkoittaa kahden itsenäisen kokeen on esitetty, virhepylväät ovat S.D.

On mahdollista, että nämä morfologisia muutoksia yksinkertaisesti seurausta ei-spesifisen integrointi

NES-hTERT pBabe vektori. Sulkea pois tätä mahdollisuutta, me ohimenevästi transfektoitu mutantti proteiini HeLa-soluissa (adenokarsinooma). HeLa-solut valittiin, koska korkea hyötysuhde lyhytaikaisissa transfektioissa (-60%) verrattuna sekä SQ20B ja LNCaP (~10-20%; tuloksia ei ole esitetty) ja sillä myös ilmaista endogeenistä telomeraasia. Sen varmistamiseksi, että solut analysoitiin ilmensivät mutanttiproteiinia

NES-hTERT subkloonattiin pCMV vektoriin ja joko transfektoitiin yksinään tai ko-transfektoitiin GFP; Tulokset olivat verrattavissa molemmat lähestymistavat. Solut transfektoitu tyhjällä pCMV-vektoria (+ tai – GFP) käytettiin negatiivisina kontrolleina. Kuten voidaan nähdä kuviosta. 1A (oikealla alhaalla paneelit), 48 tunnin kuluessa ilmentymisen mutanttiproteiinia murto HeLa-solujen osoitti myös laajentunut ja litistetty morfologia, jota ei havaittu transfektoitujen solujen vektorisäädön (Fig. 1A, alhaalla vasemmalla paneeli). Nämä tiedot viittaavat siihen, että morfologiset muutokset havaitaan liittyivät nimenomaan ilmaus

NES-hTERT. Mielenkiintoista on, ei muutosta solujen lukumäärän havaittiin ensimmäisen 96 h jälkeen, transfektioiden konstruktilla mutantti proteiini (tuloksia ei ole esitetty), kun taas HeLa-solut transdusoitiin vektorilla kontrollina kaksinkertaistaa 48 h transfektion jälkeen (kuvio. 1A, vasen alapaneeli) .

Seuraavaksi määritellään, onko

NES-hTERT muuttunut solusyklin etenemistä SQ20B ja LNCaP käyttäen kolmea eri lähestymistapoja. Ensin ympättiin sama määrä soluja, jotka ilmentävät stabiilisti tai mutantti-proteiinia ja sen jälkeen niiden kasvu ajaksi 6 päivää. Kunakin ajankohtana (24, 72 ja 144 tuntia) solut trypsinoitiin ja laskettiin hemosytometrillä. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, ilmaus

NES-hTERT muuttanut leviämisen nopeus molempien solutyyppien. Näissä olosuhteissa, SQ20B solut tehtiin 1 väestöstä kaksinkertaistuu joka 28 tunnin ajan samalla SQ20B ilmentävät mutantti hTERT kaksinkertaistunut välein ~36 tuntia. Times kaksinkertaistamiseksi ollessa kyseessä LNCaP ja sen

NES-hTERT johdannainen oli arviolta 36 ja 57 tuntia, vastaavasti (34 tuntia on kaksinkertaistaa aikaa LNCaP mukaan myyjä (ATCC)). Sitten seurataan solusyklin etenemisen virtaussytometrialla. Solut synkronoitu seerumin peruuttamisesta 16-18 tuntia. 8 tunnin kuluttua seerumin Lisäksi solut kerättiin ja niitä inkuboitiin RNaasi A ja propidiumjodidilla (PI). Tiedot on esitetty. 1C ovat edustavia neljä erillistä määritystä; molemmissa solulinjoissa ilmentämisen

NES-hTERT lisäsi solujen prosenttiosuus G1, kun se laski osa solujen S (Fig. 1 C). Nämä tiedot johtivat meidät määrällisesti erityisesti osa solujen S-vaiheessa, joka perustuu tritioidun tymidiinin. Konfluentteja solupopulaatiot jatkoviljellään pienempi tiheys ja inkuboitiin, kun läsnä oli [

3H] -tymidiinin. Movement S-vaiheen seurattiin autoradiografialla useana ajankohtana jopa 72 tunnin kuluttua alakulttuuria. Nämä kokeet toistettiin kaksi itsenäistä kertaa ja selvästi osoittivat merkittävää laskua solujen prosenttiosuus S-vaiheessa, kun ilmentymistä mutantti-proteiinin (Fig. 1 D), joka noudattaa saadut tulokset virtaussytometrialla. Keskimäärin, jonka ~20-70 tuntia alakulttuurin SQ20B ja LNCaP ilmentävät

NES-hTERT oli 40% ja 60-80% vähemmän soluja S-vaiheessa vastaavasti verrattuna niiden valvontaa.

voidaan väittää, että korkea hTERT voitaisiin ajo solusyklin vaikutuksia, kuten aiemmin väitti [20]. Emme kuitenkaan eivät suosi tätä hypoteesia ektooppinen ilmentyminen villin tyypin (WT) tai R3e /R6E hTERT, mutantti hTERT joka ei kykene antamaan mitokondriot [21], ei ollut vaikutusta leviämisen nopeus solujen (tuloksia ei esitetä ). Muut ryhmät ovat myös ektooppisesti ilmaisseet WT hTERT vakaasti erityyppisiä syöpäsoluja eikä vikoja solusyklin etenemisen raportoitu [22], [23]. Yhdessä nämä tiedot on esitetty. 1 osoittavat, että ilmentyminen

NES-hTERT tehokkaasti ja nopeasti hidastaa etenemistä SQ20B ja LNCaP solusyklin läpi.

yli-ilmentyminen

NES-hTERT ihon ja eturauhasen syöpäsolujen vähenee pesäkemuodostuksen potentiaali

in vitro

Useat muunnokset tarvitaan solujen tulla kasvaimia aiheuttavasta, mukaan lukien lisääntynyt kasvunopeus ja kyky kasvaa kiinnityskohdassa riippumattomalla tavalla [22] – [24]. Kyky transformoitujen solujen muodostamaan pesäkkeitä pehmeässä agarissa on käyttökelpoinen in vitro ennustaja kasvaimen muodostumisen in vivo [24]. Olemme pyrkineet tutkimaan, ovatko havaitut vaikutukset lisääntymisnopeus käyttöönoton jälkeen

NES-hTERT ihon ja eturauhasen syöpäsolujen vaikutettaisiin niiden kyky muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa. Tätä varten me päällystetty yhtä monta SQ20B, LNCaP ja niiden

NES-hTERT johdannaisten kolmena kappaleena pehmeä agar ja annettiin niitä kasvaa jopa 3 viikkoa; pesäkkeet lasketaan joka viikko käyttämällä kristalliviolettivärillä. Koska suuri määrä muodostuneiden pesäkkeiden viikkoina 2 ja 3, erityisesti valvonnan, me sai kasvu 1 viikon kuluttua kasvun, jossa yksittäiset pesäkkeet olivat vielä selvästi erotettavissa. Tulokset toistettu kaksi riippumatonta kertaa. Ylä paneelit Fig. 2 osoittaa muodostuneiden pesäkkeiden määrästä, alempi paneelit esittävät edustavat kuvat levyjen. Molemmissa syöpäsolutyyppien, käyttöönotto

NES-hTERT vähensi muodostuneiden pesäkkeiden määrästä, mikä viittaa siihen, vähentynyt Tuumorigeenisuustutkimuksissa näiden solujen verrattuna vastaavaan tyhjän vektorin-ilmentävät hallintalaitteet.

5 x 10

3 solua /kuoppa SQ20B, LNCaP ja niiden

NES-hTERT johdannaisia ​​kasvatettiin pehmeä agar jopa 3 viikkoa. Pesäkekasvun arvioitiin viikoittain ja pesäkkeiden perustuvat kristalliviolettia värjäystä. Käyrät osoittavat tulokset pesäkkeiden 1 viikolla, kun yksittäiset pesäkkeet, erityisesti valvonnan soluissa, olivat vielä helposti erotettavissa. Pesäkkeet tekee kaksi riippumatonta tarkkailijaa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo kahdesta riippumattomasta kokeesta tehdään kolmena kappaleena. Pylväät edustavat keskiarvoa ± sd. Edustavat kuvat levyjä alla kunkin kaavion.

ilmentäminen

NES-hTERT ei muuta endogeenisten tasojen telomeraasiaktiivisuuden entsyymiaktiivisuuden mutta lisää tasoja telomeerisesti ja extra-telomeerisesti DNA-vaurioita

ektooppinen ekspressoituminen katalyyttisesti inaktiivinen mutantti hTERT että käyttäytyi kuten dominantti negatiivinen osoitettiin estävät tehokkaasti telomeraasia entsymaattista aktiivisuutta, mikä johtaa telomeerien eroosio ja vähentynyt proliferaatio eri syöpäsolutyyppien. Lisääntynyt spontaani apoptoosin, laski pesäkekasvun pehmeässä agarissa ja heikon kasvainten muodostumista nude-hiirissä havaittiin myös [9], [17]. Vaikka

NES-hTERT on entsymaattisesti aktiivinen in vitro, se ei pysty pitkänomainen telomeres in vivo [19]. Siten on mahdollista, että telomeraasia positiivinen SQ20B ja LNCaP,

NES-hTERT käyttäytyy hallitseva negatiivinen tavalla lopulta johtaa väheni proliferaationopeus edellä (Fig. 1). Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, analysoimme hTERT: in mRNA ja telomeraasiaktiivisuus kokonaan solu-uutteiden ilmentävien solujen tai

NES-hTERT käyttäen, vastaavasti, RT-PCR ja telomeerisesti toista vahvistusta protokolla (TRAP). Kuten odotettua, RNA tasot hTERT korotettiin soluissa ektooppisesti ilmentävät mutantti (Fig. 3A). Kuitenkaan mitään muutoksia telome- entsyymiaktiivisuuden havaittiin ilmentämällä mutantti proteiinin arvioituna TRAP (Fig. 3B), mikä osoittaa, että

NES-hTERT ei kohdista vallitsevaa negatiivista vaikutusta endogeenisen proteiinin ainakin suhteen entsymaattista aktiivisuutta.

(A) tasot hTERT-RNA: ta mitataan RT-PCR: llä. GAPDH monistettiin ja käytettiin latauskontrollina. (B) 100 ng kokonais-solu-uutteet käytetään suorittamaan TRAP. Nuoli osoittaa sisäinen valvonta määritystä. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit eivät näy.

telomeraasi negatiivinen fibroblasteja, ilmaus

NES-hTERT johtaa telomeerisesti ja extra-telomeerisesti DNA-vaurioita [19]. Siten toinen mahdollinen selitys lasku leviämisen nopeus on, että

NES-hTERT aiheuttaa DNA-vaurioita syöpäsoluissa, mikä puolestaan ​​hidastaa niiden kykyä edetäkseen solusyklin. Testasimme tämän hypoteesin arvioimalla läsnäolo fosforyloidun muodon histoni H2A variantti, γH2AX, ja 53-sitova proteiini 1 (53BP1). Olemme myös havainneet DNA-vaurioita suoraan telomeres immuno-fluoresenssi in situ -hybridisaatio (immunologiseen FISH) yhden soluissa, mtDNA vahingot arvioitiin geenispesifisestä kvantitatiivinen PCR (QPCR) [25] – [27].

muoto histoni H2A fosforyloidun seriinin 139 (S139 of γH2AX) on olennaista tunnistaa tehokkaasti DNA kaksijuosteisen tauko (DSB) sivustoja. Satoja tai tuhansia γH2AX molekyylejä tuottaa ydin- pesäkkeitä, jotka löytyvät sivuston jokaisen alkavaan DSB immunovärjäämällä vasta γH2AX [28] – [30]. 53BP1 on aktivoitu osana DNA-vaurion vaste (DDR) ja myös muodostaa pesäkkeitä [28], [29], [31]. Me tehdään yhden solun analyysi SQ20B, LNCaP ja niiden

NES-hTERT johdannaiset kuten aikaisemmin on kuvattu [19], [29]. Solut pisteytettiin olevan DNA-vaurioita, jos ne oli positiivinen sekä γH2AX ja 53BP1 pesäkkeitä. Lukumäärä ja koko pesäkkeitä havaittiin kunkin yksittäisen solun kvantifioitiin ja vastaavat kuvassa. 4A. Molemmissa solulinjoissa määrä pesäkkeitä lisäsi merkitsevästi ilmaus

NES-hTERT (

p

= 0,006 varten SQ20B ja 0,034 varten LNCaP). On huomattava, että ilmaus mutanttiproteiinin johti merkittävään kasvuun esitteleville soluille suurempia pesäkkeitä. Esimerkiksi määrä SQ20B

NES-hTERT soluissa osoittaa 6 pesäkkeitä tai enemmän oli 3 kertaa suurempi kuin SQ20B kontrolli soluissa (

p

= 0,004) (Kuva. 4A).

(A) Soluja immunovärjättiin vasta-aineiden γH2AX ja vastaan ​​53BP1. DNA vastavärjättiin DAPI. Kuvaaja osoittaa positiivisten solujen prosenttiosuus sekä γH2AX ja 53BP1 pesäkkeet sekä määrän ja koon pesäkkeitä solua kohden (jota edustaa eri värejä mukaan kaavion merkinnät). Baarit ovat keskiarvo ± S.D. (B) ImmunoFISH värjäys visualisoida samanaikaisesti DNA-vaurioita pesäkkeet ja telomeres. DAPI käytettiin vastavärjäämiseksi DNA. Kaavio näyttää prosentteina DNA-vaurioita pesäkkeitä paikallistaa telomeres (TIF) per yksittäinen solu. (C) mtdna eheys analysoitiin QPCR kolmessa riippumattomassa kokeessa. Kaavio näyttää arvioidun vaurio taajuus ± s.e.m.

Seuraavaksi arvioimme tasoja telomere aiheuttaman pesäkkeitä (TIF), joka on kuvattu DNA-vaurioita pesäkkeitä esitetty telomeerisesti sivustoja. TIF voi syntyä vähitellen telomere eroosio koska jatkuva solujen lisääntymisen tai stokastista telomeerisesti DNA-vaurioita [31] – [34]. Hyväksyimme protokolla, että me aiemmin kuvattu [29], ja määrä TIF positiivisten solujen laskettiin kokonaispainon perusteella analysoitujen solujen lukumäärä. Solu pidettiin TIF-positiivinen, kun 50% suurempi DNA-vaurion yhteistyössä paikallistaa telomeres. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, tasot TIF-positiiviset solut lisääntyi merkitsevästi ilmentymistä mutantti hTERT. Todellakin, TIF-positiivisten solujen kasvoi noin 2-kertaiseksi LNCaP taustalla kun SQ20B tämä lisälaite oli vähäisempää (Fig. 4B). Vuonna SQ20B soluissa, pohjapinta taso TIF oli korkea: noin 45% soluista oli TIF-positiivisia. Tällainen korkea pohjapinta taso telomere vahinko oli odottamaton, koska nämä solut ilmentävät endogeenistä telomeraasia että oletettavasti säilyttävät telomeres. Kuitenkin käyttöönotto

NES-hTERT johti kasvaa edelleen TIF joka havaittiin noin 70% kaikista soluista analysoitiin (Fig. 4B, palkit vasemmalla).

Lopuksi analysoidaan mtDNA eheys QPCR, kuten olemme aiemmin osoittaneet, että ilmaus

NES-hTERT liittyi mitokondrioiden toimintahäiriö kuten menetys mtDNA eheyden perusterveydenhuollossa fibroblasteissa. Tällaisia ​​vaikutuksia kiinteästi sidoksissa havaitun tuman DNA vauriot telomeerisesti ja extra-telomeerisesti sivustoja [19].

Olettaen, että vahinko on satunnaisesti jakautunut, QPCR mahdollistaa kokonaiskuvan genomin eheyttä tutkitaan [25 ] – [27]. Määritys toimenpiteet eheys DNA käyttää pitkiä PCR-kohteisiin, tässä tapauksessa 8,9 kb pituudeltaan, joka on noin 2/3 koko mtDNA. Koska identtisissä olosuhteissa, DNA ohjaus ja käsiteltyjen näytteiden monistamiseen eri tavalla riippuen määrä vaurioista läsnä malliin mennessä reaktion. Esimerkiksi DNA: ta, jotka oli altistettu UV monistaa vähemmän kuin DNA vastaavista ei-hoidettuun kontrolliryhmään [35]. Vahingon määrä voidaan ilmaista määrä vaurioista per 10 kb olettaen Poisson jakauma vaurioiden malliin. Läsnäolo vaurioita kuvastaa, että näyte kiinnostava voimistaa alle sen valvonnassa, kun taas negatiivinen määrä vaurioista voidaan havaita, kun DNA Tietyn näytteet vahvistaa paremmin kuin omassa hallinnassa. Seurata mahdollisia muutoksia mtDNA kopiomäärä, lyhyt fragmentti mitokondrion genomin myös monistetaan jotta normalisoinnista. Herkkyys raja tekniikka on 1 vaurio /10

5 emästä (lisätietoja määritys, katso viitteet [25] – [27] ja [35].

Tiedot on esitetty. 4C heijastavat keskimääräinen ± sem 3 erillistä määritystä. Basal tasoja vaurioista verrokkeihin keskiarvon perusteella monistamisen kontrollinäytteistä kunkin solulinjan, jota sitten käytetään referenssinä verrata jokaisen yksittäisen ohjaus (lisätietoja katso menetelmät -osiossa). Kuten odotettua, niin solu taustat ilmentymisen

NES-hTERT huomattavasti-tasojen mtDNA vaurioita (Fig. 4C), mikä viittaa siihen, että mitokondrioiden myös monistetaan syöpäsoluissa ilmentämällä mutanttiproteiinia.

Yhteenvetona esitetyt tiedot on esitetty. 4 osoittavat, että ilmentyminen

NES-hTERT että telomeraasia positiivinen SQ20B ja LNCaP johtaa DNA-vaurioita klo telomeerisesti ja extra-telomeerisesti sivustot, jotka eivät ole aiheuttama lasku tasot aktiivisen entsyymin tumassa, mutta voi liittyä toimimattomia mitokondrioita.

NES-hTERT lisää herkkyyttä genotoksinen stressi ihon syöpäsoluja

Expression of telomeraasi on liittynyt modulaatio solukuoleman genotoksisten aineiden aiheuttamien. Herkistyminen, edistäminen ja ei vaikutusta apoptoosin ja /tai nekroosia on raportoitu, jotka näyttävät luottaa tyypin soluja Tutkimuksen genotoksinen aine, jota käytetään, ja erityisesti, pituudesta telomeres [17], [36] – [45]. Koska merkittävän kasvun pohjapinta tasoilla ydin- ja mtDNA havaittujen vaurioiden ilmennettäessä mutantin hTERT, tutkimme onko solut edelleen herkistyä genotoksinen stressiä. Näitä kokeita varten, valitsimme SQ20B soluja, joiden tiedetään olevan erittäin säteilyresistenteille olipa DNA-vaurion ja menetys proliferatiivisen kapasiteetin [46], [47].

Ensimmäisessä koesarjassa, me alttiina solut

137Cs γ-säteitä. SQ20B solut ja sen

NES-hTERT johdannainen maljattiin yhtä paljon ja rikastuneet G1 48 tuntia ennen säteilytystä kunnossapidon konfluentteja tilassa. Tämä on tärkeää, koska solujen eri vaiheissa solusyklin eroavat säteilyherkkyydestä [48]. Solut altistettiin 1 Gray (Gy) ja γ- säteilyn (0,65 Gy /min), ja analysoimme tuman DNA (nDNA) vaurioituisi QPCR heti valotuksen seuraamalla eheyden 13,5 kb fragmentti β-globiinigeenin [ ,,,0],25] – [27]. Tulokset esitetään kuvassa. 5A osoittavat selvästi kasvanut merkittävästi määrän γ-ray-induced DNA-vaurioita SQ20B

NES-hTERT-soluja. Kun taas kontrolli SQ20B soluissa, 1 vaurio havaitaan jokaisessa 50 kb genomista, vahinkojen taso havaittiin SQ20B

NES-hTERT soluissa on 5 kertaa suurempi, kääntämisestä 1 vaurion jokaista 10 kb kaksijuosteisen DNA: n ( kuva 5A).

(A) Nuclear DNA-vaurioita arvioitiin SQ20B ja sen

NES-hTERT johdannainen välittömästi altistuksen jälkeen 1 Gy gammasäteilyä avulla QPCR. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen ± s.e.m. (B) Soluja käsiteltiin 200 uM: H

2O

2: ssa 60 minuuttia ja annettiin toipua 24 tuntia kunnostetussa alustassa. Tässä vaiheessa solut kerättiin ja määrä apoptoottisten, kuolleet ja elävät solut arvioitiin virtaussytometrialla käyttäen PI ja YOPRO-1. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) Sama elinkykyisten solujen määrä (500000) maljattiin uudelleen sen jälkeen, kun H

2O

2 vastuut ja niiden kasvu seurasi 2 viikon ajan. Solujen lukumäärä laskettiin hemosytometrillä 24 tuntia, ja joka kerta solujen tuli konfluentteja jälkeen. Kuten määrä käsitellyn SQ20B

NES-hTERT eivät muuttuneet seuraavien 2 viikkoa, vain tiedot 24 tunnin kuluttua altistuksesta näkyvät. Tulokset ovat keskiarvo kolmen erillisen kokeen ± s.e.m. (* P≤0.05).

Seuraavaksi määritetään, onko solut olisi herkistynyt muunlaisiin rasituksia. Tätä varten me alttiina niiden vetyperoksidia (H

2O

2) ja analysoitiin solukuoleman virtaussytometrialla. Valitsimme H

2O

2, koska meillä on kokemusta tämän oksidatiivista stressitekijästä; Kokeet suoritettiin, kuten on kuvattu meidän aiemmin [21], [49], [50]. Lyhyesti, yhtä monta SQ20B solujen ympättiin 16 tuntia ennen H

2O

2 vastuita. Soluja käsiteltiin 200 uM H

2O

2 60 minuuttia peruselatusaineessa ilman FBS ja kerättiin joko välittömästi altistuksen jälkeen H

2O

2 tai annettiin toipua 24 tuntia kunnostetussa kasvualustaan. Molemmissa pistettä määrä kuolleita ja apoptoottisten solujen pisteytettiin perustuu propidiumjodidi oton (PI) ja YOPRO-1 värjäystä. YOPRO-1 on vihreä fluoresoiva väriaine, joka tunnistaa spesifisesti apoptoottisten solujen [51] – [55]. Solut analysoitiin virtaussytometrialla määrällisesti enemmän luottamusta prosenttiosuus elinkelpoinen, kuolleiden ja apoptoottisten solujen. Koska mitään merkittäviä muutoksia näiden parametrien havaittiin heti H

2O

2 hoitoa, seuraavassa esitettävät tiedot liittyvät 24 tunnin palautumispiste.

Kuvio 5B havainnollistaa kokeita, jotka edustavat 3 riippumattomia analyysejä. Suuri kasvu määrä YOPRO-1 ja PI-positiivisia soluja havaittiin käsitellyn SQ20B tausta ilmentävät mutantti hTERT (Fig. 5B). Kvantifiointi elinvoimaisten, kuolleiden ja apoptoottisten solujen paljasti, että kun 2-kertainen määrä kuolleita soluja (joko PI-positiivisia ainoastaan ​​tai PI ja YOPRO positiivinen) havaittiin SQ20B 24 tunnin kuluttua hoitojen, tämä kasvu oli noin 5-kertaiseksi SQ20B ilmentävät

NES-hTERT (Fig. 5B). Mitään merkittäviä eroja basaalin kuolleiden /apoptoottisia soluja havaittiin verrattaessa ei-käsiteltyjen SQ20B mutantti ilmentävien johdannainen (Fig. 5B, ylemmät paneelit).

etsiä pitkäaikaisia ​​vaikutuksia hoitoja, me sitten seurasi leviämisen hinnat ohjaus- ja käsitelty SQ20B ja SQ20B

NES-hTERT 2 viikon kuluttua H

2O

2 altistumista. Yhtä suuret määrät elinkelpoisten ohjaus ja käsiteltyjä soluja (0,5 x 10

6) maljattiin ja niiden määrä laskettiin hemosytometrillä ensimmäisen 24 tunnin aikana ja joka kerta solut saavuttivat 100% konfluenssiin jälkeen. Vaikka valvonta ja käsitellään SQ20B kaksinkertaistunut määrä vähintään kerran ensimmäisten 24 tunnin aikana, mitään muutosta solujen määrän havaittiin käsiteltiin SQ20B

NES-hTERT (Fig. 5C). Huomattavaa on, nämä solut pysyivät lepotilassa 2 ylimääräistä viikkoa, kun ne lopulta alkoivat kaksinkertaistaa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset ovat erityisen kiehtovia otetaan huomioon, että SQ20B satama mutatoitunut p53, joka ei kykene indusoimaan G1-S tarkastuspiste upon DNA-vaurioita [46], [47].

Yhteenvetona tiedot kuvassa. 5 osoittavat, että ilmentyminen

NES-hTERT pystyy herkistää SQ20B ja y-säteilyn ja oksidatiivisen stressin aiheuttamia H

2O

2.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että käyttöönotto

NES-hTERT, mutantti, joka on viallinen ydin–sytoplasman shuttling, osaksi suomuinen karsinooma (SQ20B) ja eturauhassyöpä (LNCaP) soluissa johtaa merkittäviä viiveitä solusyklin etenemistä, vähentynyt proliferaatio korko ja ankkurointi riippumattoman kasvun (kuviot 1, 2). Nämä vaikutukset eivät liittyneet vähentynyt endogeenisen telomeraasiaktiivisuuden entsyymiaktiivisuus jälkeen ilmaus mutantti hTERT ei muuttanut TRAP aktiivisuutta (Fig. 3). Havaitsimme myös lisääntynyt DNA-vaurioita telomeerisesti ja extra-telomeerisesti sivustoja, ja suurempi määrä mtDNA vaurioiden normaaleissa ilmennettäessä

NES-hTERT (Fig. 4). Huomattavaa on, hTERT mutantti herkistyneet SQ20B soluja, jotka ovat muuten hyvin kestäviä ionisoivaa säteilyä aiheuttaman DNA-vaurion ja solukuolemaan aiheuttama H

2O

2 (Fig. 5). Yhdessä meidän tiedot viittaavat manipuloimalla NES hTERT tai telomeraasin n subsellulaarisista shuttling uusina ja tehokkaasti keinot toimia kasvaimen solujen kasvua.

NES-hTERT vaikuttaa solusyklin ja tuumorigeenisyystesti syöpäsolujen

vuonna