Krooninen sairaus

tiivistelmä

Autophagy on hyvin säädeltyä, energia riippuvainen soluvälitteinen prosessi, jossa proteiinit, soluelimiin ja sytoplasma erottautuvat autophagosomes ja hajotettiin ylläpitämään solujen homeostaasin. Oletimme, että aikana autophagy aiheutettiin syöpäsoluissa i) nälkään kautta seerumin ja aminohappo puutteesta tai ii) käsittely PI-103, I-luokan PI3K /mTOR-estäjä, glykolyyttisissä aineenvaihdunta kärsisi, vähentämällä vuon laktaatti, ja että tämä vaikutus voi olla palautuva. Me koetettiin aineenvaihdunta aikana autophagy peräsuolen HT29 ja HCT116 Bax knock-out-soluissa käyttäen hyperpolarisoidun

13C-magneettiresonanssispektroskopia (MRS) ja vakaan tilan

1 H-MRS. 24 tunnin PI103-hoitoa tai nälkään aiheuttanut merkittävä väheneminen näennäinen eteenpäin nopeusvakio (k

PL) ja pyruvaatin laktaatin vaihtoon verrattuna valvonnan HT29 (100 uM PI-103: 82%, p = 0,05) ja HCT116 Bax -ko solut (10 uM PI-103: 53%, p = 0,05; 20 uM PI-103: 42%, p 0,0001; nälkään: 52%, p 0,001), liittyy alentunut laktaatti eritys ja solunsisäinen laktaattia kaikissa tapauksissa ja muuttumaton laktaattidehydrogenaasin (LDH) aktiivisuus ja lisääntynyt NAD + /NADH-suhde seuraavat PI103 hoidon tai vähentynyt LDH-aktiivisuuden ja muuttumaton NAD + /NADH-suhde seuraavan nälkään. 48 tunnin kuluttua toipumisen PI103 hoitoon, k

PL jäi alle valvonnan tasolla HT29 (74%, p = 0,02), ja lisääntynyt edellä käsiteltiin arvoja, mutta kuitenkin alle 24 tuntia apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään tasot HCT116 Bax-ko soluja (65%, p = 0,004) sekä mukana oli vähentää pysyvästi laktaatti erittymistä, elpyminen NAD + /NADH-suhde ja solunsisäinen laktaatti. Sen jälkeen toipuminen nälkään, k

PL oli huomattavasti korkeampi kuin 24 tunnin ajoneuvo-käsiteltyihin kontrolleihin (140%, p = 0,05), joka liittyy lisääntynyt LDH-aktiivisuuden ja solun kokonais NAD (H). Muutokset k

PL ja solu- ja erittyy laktaatti tarjotaan mitattavissa indikaattoreita tärkeimmistä aineenvaihduntaan liittyvien starvation- ja lääkkeen aiheuttama autophagy. Muutokset ovat palautuvia, palaavat kohti ja yli ohjaus arvoja solujen talteenotto, joka potentiaalisesti tunnistaa vastuksen. k

PL (hyperpolarisoidun

13C-MRS) ja laktaattia (

1 H-MRS) annetuissa biomarkkereiden varten autophagic prosessin, joka mahdollistaa ei-invasiivisia seuranta Warburg vaikutus.

Citation: Lin G, Andrejevan G, Wong Te Fong AC, Hill DK, Orton MR, Parkes HG, et al. (2014) Alennettu Warburg vaikutus syöpäsoluissa Undergoing Autophagy: vakaan tilan

1 H-MRS ja Real-Time Hyperpolarisoituneilla

13C-MRS Studies. PLoS ONE 9 (3): e92645. doi: 10,1371 /journal.pone.0092645

Editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2013 Hyväksytty: 25 helmikuu 2014; Julkaistu 25 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat vastaanottaneensa tukea päässä Cancer Research UK ja EPSRC Cancer Imaging Centre yhdessä MRC ja Department of Health (Englanti) myöntävät C1060 /A10334, myös NHS rahoitusta NIHR Biomedical Research Centre, MRC-rahoitusta stipendi, myös Chang Gung Medical Foundation (Taiwan) myöntää CMRPG370443 ja CMRPG3B1922. MOL on NIHR Senior tutkija. Kirjoittajat myös kiittää Alice Warley Kuninkaan College London Centre for Ultrastructural Imaging (CUI) apua elektronimikroskoopilla. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Autophagy on lysosomifuusio riippuva palautuva catabolic soluvastetta aktivoidaan nälkään tai stressi jolloin proteiineja, soluelimiin ja sytoplasma erottautuvat sisällä kaksinkertainen kalvo autophagosomes ja sen jälkeen hajotettiin ja kierrätetään ylläpitämään solujen aineenvaihduntaa [1]. Autophagy on kriittinen ylläpitämiseksi solujen homeostaasiin ja on erittäin säännelty prosessi, joka voi korvaavan öljyn energiavarastoja aikana nälkään poistamalla ja hajoamista sytoplasman komponentteja. Kuitenkin pitkäaikainen aktivointi autophagic polkuja voi johtaa ehtyminen soluelimiin ja kriittisiä proteiineja, jotka voivat johtaa solukuolemaan [2], [3]. Autophagy on tutkittu monilla tutkimusaloilla, kuten syöpä [2] – [4], sydän [5] ja hermosolujen rappeutumisen [6], koska toisaalta se tarjoaa biologisen suojamekanismi vastauksena solujen rasituksia mutta toisaalta se voi myös edistää solukuolemaan mekanismeja. Tämä prosessi saattaa paradoksaalisesti mahdollistaa syöpäsolujen hengissä vihamielisessä ympäristössä ja tukea elpymistä, kun stressi on poistettu, potentiaalinen resistenssimekanismi hoidon [4]. Jotkut syöpähoitojen, kuten PI3K /mTOR-inhibiittorit, tiedetään aiheuttavan autophagy syöpäsoluja [7], ja se voi myös aiheuttaa autophagy kasvaimissa, mahdollisesti pidentää kasvain selviytymisen [4], [8]. Nykyisin autophagy arvioimaan parhaiten havainto kaksinkertaisen kalvon autophagic vacuoles elektronimikroskopialla (EM) ja western blottaus muuntaminen ubikitiinistä kaltaisen proteiinin LC3I on LC3II [9]. Tällä hetkellä ei ei-invasiivisia menetelmiä, joilla seurataan induktioon autophagy tai myöhempien toipuminen autophagy. Lisäksi metaboliset muutokset mukana autophagy ja talteenotto tästä prosessista ovat huonosti tunnettuja.

Syöpäsolut usein ilmenee pa- aerobinen Glykolyysivaiheen, joka tunnetaan myös Warburg vaikutus, lisääntynyt transkription säätely useita glykolyyttisten entsyymien, kuten laktaattidehydrogenaasi -A (LDH-A). Lisääntynyt Warburg vaikutus on osoitettu ajaa sekä kasvaimen kasvua ja leviämistä etäpesäkkeiden ja liittyy huono lopputulos syöpä [10]. Autophagy liittyy monia suuria aineenvaihduntaan, joista osa säätelee onkogeeninen signalointireitteihin. On huomattava vuorovaikutusta autophagic ohjauslaitteet ja keskeisten solmujen kasvaimia synnyttävän signalointireiteissä, mikä polkuun estäjien joissakin tapauksissa suoraan vaikuttavat autophagic prosessi, tai epäsuorasti moduloimalla samaa metaboliareittiä, jotka indusoituvat autophagy [11], [12]. Esimerkiksi, inhibitio mTORC1 on keskeinen tekijä induktion autophagy syöpäsoluissa [11], [12]. Solustressiä johtuvat puutteesta aminohappojen tai suoraan PI3K esto voi aiheuttaa autophagy eston kautta mTORC1 molemmat näistä prosesseista aiheuttaa metabolisia vaikutuksia niiden lisäksi, jotka johtuvat suoraan autophagy. Nämä tilanteet voitaisiin myös esiintyneet syövän hoidossa potilailla.

magneettikuvauksessa (MRI) on laajalti käytetty kuvantaminen lääketieteessä ja MR spektroskopia (MRS) tarjoaa kemiallisesti erityistä analyysiä metaboliittipitoisuuksien soluekstrakteissa, kokonaisia ​​soluja , kudoskoepaloihin ja

in vivo

[13]. Viimeaikaiset edistysaskeleet hyperpolarisoidun

13C-magneettiresonanssispektroskopia (MRS), joissa työskentelee Dynamic Nuclear Polarisaatio (DNP) ansiosta paranevat merkittävästi luontainen

13C-MRS signaali monet suuruusluokkaa useissa aineenvaihduntatuotteiden ja on mahdollistanut todellisia -Aika mittaukset kinetiikka monia tärkeitä endogeenisen entsyymin reaktioita sekä

in vitro

suspensioissa elinkykyisten kokonaisten solujen ja

in vivo

kasvaimissa [14]. Näennäinen kurssi vakio hyperpolarisoidun [1-

13C] pyruvaatin laktaatti (k

PL) tarjoaa mahdollisen metabolisen biomarkkeri diagnoosia [15] ja arvioimiseksi hoitovasteen [16] – [20]. k

PL on myös osoitettu vähentävän seuraavat lääkkeen aiheuttama solukuolema, johtuvan apoptoosin aktivointi poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja vähenemistä kofaktori nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD (H)) [14 ].

TCA sykli odotetaan aktivoituvan aikana autophagy, kuten aminohappoja ja rasvahappoja syntyy autophagic prosessin hyödynnetään ylläpitämään energiaa homeostaasin [21], mikä modulaatio aerobinen Glykolyysivaiheen vuonna autophagic solut. Oletimme, että nämä muutokset johtaisivat väheneminen vuo pyruvaatin laktaatti, joka voitaisiin peruuttaa, jos solut talteen autophagy. Tässä tutkimuksessa mittasimme näennäinen [1-

13C] pyruvaatin laktaatti vaihtokurssi k

PL, DNP ja

13C-MRS, jotta voitaisiin kehittää ei-invasiivisia biomarkkereiden huumeisiin aiheuttama autophagy ja myöhemmät toipuminen autophagy, ja saada edelleen oivalluksia aineenvaihdunnan muutoksia mukanaan lääkkeen aiheuttama autophagy. Tutkimme pituussuunnassa aineenvaihdunnan muutoksiin liittyy lääkkeen aiheuttama autophagy ja sen hyödyntämistä ja niitä verrattiin aineenvaihdunnan muutoksiin liittyy vakiintunut malli autophagy, induktio nälkään. Käytimme kahta solulinjaa, HT29: n ja Bax-puutteellisia HCT116 paksusuolen karsinooma (HCT116 Bax-ko) [22], näissä tutkimuksissa. HCT116 Bax-ko soluja on heikentynyt apoptoosin polkuja mahdollistaa arvioida aineenvaihdunnan muutoksia, jotka liittyvät lääkkeen aiheuttama autophagy puuttuessa apoptoosin. Autophagy aiheutettiin näissä soluissa joko seerumin ja aminohappo nälkään Hanksin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS) media, tai käsittelemällä PI-103, I-luokan PI3K /mTOR-estäjä [7].

tutkimus vahvisti hypoteesiemme, joka osoittaa, että solut käynnissä autophagy oli vähentänyt k

PL mitattu DNP ja

13C-MRS, ja vähentyneen solunsisäisten laktaatti ja laktaatti eritys mitataan

1 H-MRS, mikä alennettua Warburg vaikutus aikana starvation- ja lääkkeiden aiheuttaman autophagic soluprosesseihin. Nämä tärkeät metabolisia vaikutuksia ovat päinvastaiset, kun solut toipua starvation- ja lääkkeen aiheuttama autophagy, joka tarjoaa mahdollinen keino tunnistaa vastuksen. Tulokset osoittavat, että mittaukset k

PL by hyperpolarisoidun

13C-MRS sekä laktaatti mukaan

1 H-MRS tarjoavat herkkiä biomarkkereita metabolisen liittyviä vaikutuksia starvation- ja lääkkeen aiheuttama autophagy yhdessä sen hyödyntämistä, joka tarjoaa kriittistä tietoa tärkeä osa syövän solujen aineenvaihduntaa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kaikki media ja reagenssit soluviljelmässä hankittiin Life Technologies . HT29 (American Type Culture Collection, ATCC) viljeltiin McCoyn 5A väliaineessa glutamiinilla ja HEPES. HCT116 Bax-ko soluja (ystävällinen lahjoitus tri Bert Vogelstein, Johns Hopkins Medical Center, USA; kautta tohtori Paul Clarke, ICR, Sutton, UK [23]) viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium glutamiinilla, ja ei- välttämättömiä aminohappoja. 10% lämmöllä inaktivoitua FCS: ää, jossa on 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä lisättiin kaikki väliaineessa. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä ja kasvualustojen täydennetään 48 tunnin välein. HT29-soluja käsiteltiin 100 uM PI-103 24 tunnin ajan. HCT116 Bax-ko soluja käsiteltiin HBSS väliaine 6 tai 24 tuntia ja 10 uM tai 20 uM PI-103 24 tuntia.

solu- ja metabolisen analyysi solujen talteen autophagy, 24 h HBSS tai 20 uM PI-103-käsitelty HCT116 Bax-ko-soluja ja 100 uM PI-103-käsiteltyjen HT29-soluja säilytettiin vielä 48 tunnin ajan normaalissa DMEM (yhdessä glutamiinin kanssa, ei-välttämättömiä aminohappoja, 10% vasikan sikiön seerumia ja penisilliiniä lisätty) tai McCoy 5A väliaineessa (glutamiinilla ja HEPES) elatusaineet standardiolosuhteissa, vastaavasti.

Cell-kaarianalyysin

2 x 10

6 solut kiinnitettiin 70% etanolilla 30 min 4 ° C: ssa, inkuboitiin 100 ug /ml RNaasi ja 40 ug /ml PI fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa 301min 37 ° C: ssa. DNA-histogrammit tuotettiin FACS-analyysillä.

anneksiini V /PI-analyysi

5 x 10

5 solut suspendoitiin uudelleen sitoutumispuskuriin, inkuboitiin 25 ° C: ssa 5 minuutin ajan pimeässä 5 ui fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) -annexin-V ja 5 ui PI (BioVision), ja analysoitiin fluoresoivalla soluerottelulla (FACS, BD LSRII virtaussytometrillä) määrittää anneksiini sitoutumisen ja PI: n syrjäytymistä.

Western blotting

Solulysaatit analysoitiin western-blottauksella, kuten on kuvattu aiemmin [22]. Solulysaatti proteiini siirrettiin Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Bedford, MA, USA). Blotteja blokattiin 5% rasvatonta maitoa tai 5% naudan albumiinia ja inkuboitiin sitten ensisijaisen vasta-aineen pS6RP (Cell Signaling), S6RP (Cell Signaling), p4E-BP1 (Cell Signaling), yhteensä 4E-BP1 (Cell Signaling) , Pakt (Cell Signaling), yhteensä Akt (Cell Signaling), lohkaistaan ​​PARP (Cell Signaling), kaspaasi 3 (Cell Signaling), LC3 (Cell Signaling), MCT-1 (Millipore) tai MCT-4 (Santa Cruz Biotechnology). Membraanit inkuboitiin sitten anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (GE Healthcare). Western blotit α-tubuliinin (Cell Signaling) edellyttäen latauskontrollina. Spesifinen sitoutuminen vasta-aine-kohdeproteiinin vuorovaikutukset havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin plus reagenssit (Amersham Biosciences, Buckingham-shire, UK) ja altistuminen joko Hyperfilm ECL (Amersham) tai XOMAT Kodak (Rochester NY, USA) -autoradiografiafilmille.

Laktaattidehydrogenaasi entsymaattinen määritys

Yhteensä solujen LDH aktiivisuudet mitattiin käyttämällä tavallisia Spectro-fotometriset menetelmät [24]. Solut kerättiin standardin Trysin hoito, hajotettiin jäällä uuttopuskuria (Trietanoliamiini /HCL 50 mM, EDTA 1 mM, MgCI

2 2 mM, merkaptoetanoli 26 mM) ja sentrifugoidaan 16000 g 10 minuuttia, jolloin saatiin yhteensä proteiinikonsentraatioiden supernatanteissa noin 5 mg /ml. Reaktiot aloitettiin lisäämällä määritys ratkaisuja (Trietanoliamiini /HCL 60 mM, NADH 0,17 mM, natriumpyruvaattia 0,4 mM, Triton 0,05%), ja toiminta LDH entsyymien mitattiin spektrofotometrisesti 340 nm: ssä, jossa entsymaattinen toiminta mitattuna nmol /min per miljoonaa solua.

NAD + /NADH mittaus

solun totaali NAD + /NADH suhteet mitattiin käyttäen NAD + /NADH kvantifiointiin kit (BioVision, Mountain View, CA, USA), protokollan mukaisesti edellyttäen.

elektronimikroskopialla

Soluja kasvatettiin 13 mm ruokia ja kiinteä 4 tuntia 2,5% glutaraldehydillä kiinnitystahnat fosfaattipuskurissa 4 ° C: ssa. Kiinnityksen jälkeen yksisoluiset kerrokset sijoitettiin glutaraldehydin pesuliuoksessa ja sitten jälkifiksattiin Millonigs Osmiumtetroksidia fiksatiivia 15-30 minuuttia. Viljelmiä dehydratoitiin luokiteltujen sarjojen läpi 10%: sta 100%: ista etanolia, suodattunut, ja sitten upotetaan väliaineessa TAAB Esiseos Resin. Ultraohuet leikkeet kerättiin kupari- verkkoja ja värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijyä sitraatti. Osiot näytettiin käyttäen Hitachi H7600 transmissioelektronimikroskoopin.

DNP

13C-MRS tutkimukset

[1-

13C] palorypälehapon sisälsi 15 mM OX63 vapaita radikaaleja polarisoitui varten 1 tunti on HyperSense DNP polarisaattorin (Oxford Instruments Molecular Biotools Ltd, Abingdon, UK) klo 3.35T ja 1,4 K kuten aiemmin on kuvattu [25]. Polarisoitunut Näyte liuotettiin fosfaattipuskuroituun liuosta, joka sisälsi 50 mM leimaamatonta laktaatti, EDTA: ta ja NaOH: ta saavuttaa lopullinen pH on 7. 100 ui tätä seosta lisättiin 500 ui solususpensiota (~40-80 miljoonaa solua) 5 mm: n NMR-putkeen. Lopullinen pitoisuus polarisoitunut pyruvaatti oli 8 mM, minkä jälkeen sarja

13C-MRS spektrit hankittiin joka BBO koetin 2 sekunnin välein, jossa on 10 ° radiotaajuista pulssi on 500 MHz Bruker NMR-järjestelmä (Bruker Biospin, Coventry, UK). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa koko. Serial spektrit olivat vaiheessa ja lähtötilanteessa korjattu, ja integroitu käyttäen Topspin ohjelmistoa (Bruker Biospin, Coventry, Iso-Britannia). Integroitu huippu integraaleja pyruvaatti /laktaatti kokeita piirrettiin ajan funktiona ja pienimmän neliösumman istuva tehtiin Matlab (MathWorks Inc, Natick, MA, USA). Näennäinen nopeusvakiot saatiin samanaikaisesti istuva pyruvaatti ja laktaatti integrals modifioidun Bloch yhtälöt käyttämällä two-site vaihto malli sisältää flip-kulma korjauksen aikaisemmin kuvatulla [25]. Näennäinen nopeusvakiot (k

PL) varten eteenpäin reaktio Pyruvaatin laktaatin normalisoidaan solujen määrä.

1 H-MRS ° f viljelyalusta ja solu-uutteista

Solut uutettiin kaksi faasin uutolla menettelyjä, kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Vesiliukoiset uutteet kylmäkuivattiin ja liuotetaan 700 ul: deuteroitu vesi (D

2O, Sigma Aldrich) ja uutteet (500 ui) laitettiin 5 mm NMR putkiin. 50 ui 0,75%: ista 3-trimetyylisilyyli-2,2,3,3-tetradeuteropropionate (TSP) D

2O (Sigma Aldrich) lisättiin näytteiden kemiallinen siirtymä kalibrointia ja kvantifiointi. Kasvatusaine näytteitä soluista seuraavista eri hoito-analysoitiin myös

1 H-MRS, kerättävä ennen solut kerättiin solu- uuttoja. 500 ui materiaalinäyte ja 50 ui D

2O sijoitettiin NMR-putkeen 50 ui 0,75% TSP in D

2O kemiallisten shift kalibrointia ja kvantifiointiin. Spectral toimeksiantoja perustuivat kirjallisuuden arvoihin [27].

1 H-spektrit saatiin Bruker 500 MHz -spektrometrillä (Saksa), jossa 7500 Hz spektrin leveys, 16384 aikatasossa pistettä, 128 skannausta, lämpötila 298 K, hankinta-aika noin 5 minuuttia. Vesi resonanssi tukahdutettiin aidatulla säteilytys keskittynyt veden taajuudella. Spectral käsittely suoritettiin käyttäen Topspin-2 ohjelmistopaketti (Bruker Biospin, Coventry, Iso-Britannia), ja pitoisuuksiin määrällisesti ja normalisoidaan solujen määrä.

Tilastollinen

Data esitetään keskiarvo ± keskivirhettä. Vertailun metabolinen virtaus, metaboliitin pitoisuudet ja suhteet, paritonta Studentin t-testiä käytettiin, joiden P-arvo on ≤0.05 pidetään tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia.

Tulokset

PI-103-hoidon ja nälkään aiheuttaa palautuvia autophagy vuonna HT29 ja HCT116 Bax-ko solujen

induktio autophagy havaittiin in HCT116 Bax-ko ja HT29 käsitelty PI-103, joka on vahvistettu yli-ilmentyminen LC3II Länsi blotteja (kuvio 1a ja b). Induktio autophagy ja yli-ilmentyminen LC3II löydettiin myös HCT116 Bax-ko solujen jälkeen 6 ja 24 tunnin nälkään HCT116 Bax-ko soluja (kuva 1a). Korkeampi LC3I ja LC3II ilmentyminen havaittiin 24 tunnin kuluttua nälkään verrattuna 6 tuntia nälkään. Poistamisen jälkeen PI-103 hoitoon tai täydentäminen normaalin kasvualustan seuraavan 24 tunnin PI-103 käsittelyä tai nälkään, vastaavasti yli-ilmentyminen LC3II palasi perustasoille jälkeen 48 tunnin toipumisen (kuva 1b-d). Siten 48 tunnin aikapisteessä seuraavat 24 tuntia nälkään tai PI-103 käsittely valittiin DNP ja

1 H-MRS elpyminen mittauksia. Ei ollut mitään viitteitä apoptoosin mikä näkyy puute pilkotun PARP tai muutos kaspaasi 3 ilmaisuja PI-103-käsiteltyjen tai nälkään soluja (kuva 1a-d). Saadakseen positiivisena kontrollina apoptoosin apoptoosia indusoitiin HCT116 villityypin (WT) solujen TRAIL-käsittely, kuten TRAIL on raportoitu indusoivan apoptoosia HCT116 WT-soluissa [22]. Kuten odotettua, läsnäolo pilkottiin PARP ja vähentää kaspaasi 3 tasolla havaittiin TRAIL-käsiteltyjen HCT116 WT-soluja verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin (kuvio 1 b ja c).

(a) Western blot -analyysit LC3, lohkaista PARP, kaspaasi 3 ja α-tubuliinin hallinnassa HCT116 Bax-ko soluissa ja 10 uM tai 20 uM PI-103-käsitelty tai 6 tuntia ja 24 tunnin HBSS-käsiteltyjen HCT116 Bax-ko soluja. (B) Western blotit LC3, halkaistut PARP, kaspaasi 3 ja α-tubuliinin hallinnassa HT29 ja 24 tunnin 100pM PI-103-käsiteltyjen HT29 ja 24 tunnin kuluttua, 48 h ja 72 h niiden hyödyntämistä. TRAIL-käsiteltyjen HCT116 WT soluja käytettiin positiivisena kontrollina apoptoosin, kuten TRAIL on raportoitu indusoivan apoptoosia HCT116 WT-soluissa [22]. Kuten odotettua, läsnäolo pilkottiin PARP ja vähenevät suuresti kaspaasi 3 ilmaisuja havaittiin 24 tunnin TRAIL-käsiteltyjen HCT116 WT-soluja verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin. (C) Länsi-blotit LC3, halkaistut PARP, kaspaasi 3 ja α-tubuliinin hallinnassa HCT116 Bax-ko soluissa ja 24 tuntia 20 uM PI-103-käsitellyn HCT116 Bax-ko soluja ja 24 tunnin kuluttua ja 48 tunnin niiden hyödyntämistä . TRAIL-käsiteltyjen HCT116 WT soluja käytettiin positiivisena kontrollina apoptoosin. (D) Länsi-täplien LC3, halkaistut PARP, kaspaasi 3 ja α-tubuliinin hallinnassa HCT116 Bax-ko soluissa ja 24 h HBSS-käsiteltyjen HCT116 Bax-ko soluja ja 24 ja 48 tunnin niiden hyödyntämistä.

läsnäolo autophagic vacuoles vahvistettiin elektronimikroskoopilla suoritettu nälkään (kaksois-kalvo autophagosomes) tai PI-103-käsitelty (pääasiassa kuten myöhemmin autolysosomal rakenteet) HCT116 Bax-ko soluja, mikä osoittaa induktion autophagy (kuvio 2). Autophagic vacuoles puuttuivat ohjaus soluissa.

elektronimikroskopialla kuvia autophagic vacuoles hallinnassa, 10 uM tai 20 uM PI-103-käsitelty tai 6 tuntia ja 24 tunnin HBSS-käsiteltyjen HCT116 Bax-ko soluja. Punaiset nuolet kuvaavat joitakin autophagic onteloita eri vaiheissa autophagy prosessin.

Tasot apoptoosin ja nekroosin HT29 ja HCT116 Bax-ko-soluilla nälkään ja PI-103 käsittelyä arvioitiin tarttuvien solujen anneksiini V /PI-analyysi (kuvio 3a) osoittaa, suurin osa eläviä soluja, joilla on pieni prosenttiosuus nekroottisen (HT29 DMSO-käsiteltyjen (ajoneuvo-ohjaus): 6,5 ± 2,2%; 100 uM PI-103: 10,7 ± 2,7% (p = 0,29), HCT116 Bax-ko DMSO-käsiteltyjen (ajoneuvo-ohjaus): 1,5 ± 0,1%, 6 tunnin nälässä: 1,9 ± 0,2% (p = 0,06) ja 24 tunnin nälässä: 3,0 ± 0,4% (p = 0,01); 10 uM PI-103: 4,6 ± 0,4% (p = 0,02) ja 20 uM PI-103: 6,6 ± 0,4% (p = 0,79)) tai apoptoottiset solut (HT29 DMSO-käsitellyn: 1,0 ± 0,7%; 100 uM PI 103: 2,0 ± 1,4% (p = 0,54), HCT116 Bax-ko ajoneuvo-ohjaus: 6,6 ± 0,5%, 6 tunnin nälässä: 10,5 ± 0,8% (p = 0,001) ja 24 tunnin nälässä: 13,8 ± 0,8% (p = 0,003), 10 uM PI-103: 4,0 ± 0,1% (p = 0,26) ja 20 uM PI-103: 4,1 ± 0,2% (p = 0,30)), valvonta- ja käsitellyissä ryhmissä. Ei kelluva soluja, havaittiin tahansa käsiteltyjen ryhmien.

(a) anneksiini V ja propidiumjodidivärjäys (PI) määritys mittaamalla solujen osuus apoptoosin ja nekroosin HT29-soluissa 24 h 100 uM PI -103 hoito ja HCT116 Bax-ko-soluissa 24 tuntia 10 uM tai 20 uM PI-103 käsittely, tai 6 h tai 24 h nälkään. Data on ilmaistu keinona prosentteina ± s.e.m. (Vähintään

n

= 3 kussakin ryhmässä). Tilastollisesti merkittäviä muutoksia on merkitty (* p 0,05). (B) Cell määrä verrattuna 24 tunnin DMSO-käsiteltyihin kontrolleihin in HT29 seuraavissa 24 h DMSO saaneista elpyminen, 24 h 100 uM PI-103 käsittelyä ja sen 48 tunnin elpymisen ja 24 tunnin ajoneuvon käsiteltyjen valvontaa HCT116 Bax-ko soluissa 24 tuntia 10 uM tai 20 uM PI-103 käsittely, tai 6 h tai 24 h nälkään ja sen toipuminen 24 h 20 uM PI-103 hoitoa tai nälkään. Data on ilmaistu keinona prosentteina ± s.e.m. (Vähintään

n

= 3 kussakin ryhmässä). Tilastollisesti merkittäviä muutoksia on merkitty (* p 0,05). (C) Solusyklianalyysiä. Tiedot ovat keinoja prosenttiyksikköä ± s.e.m. HT29 24 tunnin DMSO hoidettuun kontrolliryhmään, 24 h DMSO-talteen ohjaus, 24 h PI-103-käsitelty 100 uM, 24 h PI-103-talteen, 48 h PI-103-talteen, (

n

= 3 kussakin ryhmässä); HCT116 Bax-ko soluista 24 tunnin DMSO hoidettuun kontrolliryhmään, 24 h DMSO-talteen ohjaus, 24 h PI-103-käsitelty 20 uM, 24 h PI-103-talteen, 48 h PI-103-talteen, (

n

= 3 kussakin ryhmässä); HCT116 Bax-ko soluista 6 tuntia täysin median ohjaus, 6 h nälkään (HBSS), 24 tunnin täydellinen median valvontaa, 24 h nälkään (HBSS), 48 h HBSS-talteen (

n

= 3 kussakin ryhmässä) . * P 0,01.

alennettu Tarttuvien solujen lukumäärä havaittiin kaikissa hoitoryhmissä seuraavat 24 tuntia 100 uM hoidon HT29 (78 ± 2%, p 0,01), 6 tuntia ja 24 h nälkään (46 ± 0,1% ja 36 ± 0,4%, vastaavasti, p 0,01) tai 24 tuntia 10 uM ja 20 uM PI-103 käsittelyä (65 ± 0,1% ja 58 ± 0,1%: lla, p 0,01 ) in HCT116 Bax-ko soluja verrattuna kontrolleihin (kuva 3b). Nostamalla Tarttuvien solujen lukumäärä ylittää 24 tunnin apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään tasot havaittiin PI-103 aiheuttama (170 ± 8%, p 0,05 (HCT116 Bax-ko); 303 ± 16%, p 0,01 ( HT29)) ja nälkään aiheuttama (117 ± 7%, p 0,05) ja autophagic soluissa 48 tunnin toipumisen (kuva 3b), mikä osoittaa, että solupopulaatio nousi yli verrokkitasojen toipumisen jälkeen otetaan autophagy. 24 h ajoneuvon käsiteltyjä soluja käytettiin kontrolleina sekä käsittelyä ja hyödyntämistä ryhmät, kuten kontrollisolut olisi liian yhtenäisiksi 48 h hyödyntämistä.

Solusyklianalyysiä virtaussytometrialla suoritettiin kummassakin hoitoryhmässä , ja sen jälkeen 24 tunnin ja 48 tunnin toipumisen (kuvio 3c). 24 tunnin toipumisajan-pisteen DMSO-käsiteltyihin kontrolleihin sisältyi myös kunkin PI-103 koe kuin solujen määrä näiden ryhmien ovat samanlaisia ​​kuin solujen määrä PI-103-käsitellyissä soluissa seuraavat 48 tuntia elpymisen. G1 pidätys havaittiin HT29 ja HCT116 Bax-ko soluista hoidon jälkeen PI-103, palaten 24 tuntia DMSO-käsitelty tasolla 48 tunnin toipumisen (kuvio 3c). Lisääntynyt G1 faasi löytyy myös 24 tunnin talteen DMSO-käsiteltyjen HT29 (9 ± 3%, p = 0,01) ja HCT116 Bax-ko (11 ± 1%, p = 0,004), solut verrattuna 24 tunnin DMSO-käsiteltyihin soluihin. Prosenttiosuudet 24 tunnin talteen DMSO-käsitellyt solut kunkin vaiheen solusyklin on hyvin samanlainen kuin 48 tunnin ajan talteen PI-103-käsitelty ajankohtaan sekä HT29 ja HCT116 Bax-ko-soluja (kuvio 3c). Tämä voi johtua siitä, että talteen ohjain (DMSO-käsitelty) ja PI-103-käsitellyissä soluissa on enemmän konfluentteja näissä aikapisteissä, joka on sopusoinnussa niiden verrattavissa solujen määrä.

Ei muutosta solusyklin profiilia HCT116 Bax-ko-solujen havaittiin seuraavat 6 tai 24 tuntia nälkään (kuvio 3c). Väheneminen G1 (12 ± 4%, p = 0,04), ja kasvu G2 vaiheessa (5 ± 1%, p = 0,003), havaittiin 48 tunnin talteen HCT116 Bax-ko-soluja verrattuna 24 tunnin media hoidettuun kontrolliryhmään solut ja solujen numerot ovat samankaltaisia ​​näiden kahden ryhmän (kuvio 3c). Mitään merkittävää muutosta solukoko havaittu missään hoitoryhmissä verrattuna kontrolleihin.

PI-103 hoito vähentää AKT ja mTOR-reitin aktivaatio HT29 ja HCT116 Bax-ko solujen ja tämä prosessi on palautuva

The effects of PI-103 kohtelu AKT ja mTORC reittejä tutkittiin HT29 ja HCT116 Bax-ko solujen hoidon aikana 24 ja 48 tunnin elpymisen. Vähentynyt ilmentyminen Pakt ja p4E-BP1 nähtiin HT29 ja HCT116 Bax-ko-soluissa 24 tunnin PI-103 hoidon ilmentymistä näiden proteiinien palaavat hoitoa edeltävälle tasolle sen jälkeen, kun 48 tunnin toipumisen (kuvio 4a ja b). Alennettu PS6 ilmentyminen havaittiin myös PI-103-käsitellyn HCT116 Bax-ko soluista ja sen taso talteen 24 tunnin toipumisen (kuva 4b). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että hoito, jossa PI-103 estää AKT ja mTOR väylän molemmissa solulinjoissa ja tämä prosessi on palautuva, kun lääke poistettiin ja solut annetaan toipua.

Western-blotit PS6 ribosomaalinen proteiini S6 ribsomal proteiini, p4E-BP1, yhteensä 4E-BP1, Pakt yhteensä Akt ja α-Tubulin (kuormituksen valvonta) PI-103-käsitelty ja sen hyödyntäminen HT29 ja HCT116 Bax-ko soluja.

Reaaliaikainen näennäinen

13C-pyruvaatin laktaatti vaihto vähenevät PI-103-ja nälkään aiheuttama autophagy, loput supistuisivat toipuminen PI-103, mutta kasvaa toipuminen nälkään

Hyperpolarisoituneilla [1-

13C] pyruvaatin laktaatti vaihto seurattiin reaaliajassa

13C-MRS mitata vaihdon kinetiikka autophagic soluissa. Kuviossa 5a on esitetty keskiarvo

13C-MR-spektrit laskettiin kullekin ryhmän yhteen koko dynaaminen aikasarjoja HCT116 Bax-ko solususpensioita lisäämisen jälkeen hyperpolarisoidun [1-

13C] pyruvaattia hallinnassa, 24 h nälkään ja 48 h toipuminen autophagy. Kuviossa 5b on esitetty vastaava aika-sarjassa normalisoitu huipun integraali laktaatin signaalin samoihin ryhmiin. Näennäinen vaihtokurssi vakio k

PL mitattiin epälineaarisella pienimmän neliösumman myötäiset dynaamista tietoa kunkin ryhmän ja tiedot esitetään suhteet (käsitelty /24 h ajoneuvon hallinnan) kuviossa 5c.

(a) Hyperpolarisoituneilla

13C-spektri peräisin HCT116 Bax-ko solun määrityksessä osoittaa summa koko dynaaminen aikasarja peräisin säätökenno kokeen jälkeen 6 tuntia nälkään, 24 h nälkään HBSS median ja sen jälkeen 24 tunnin nälkään seurasi 48 h solujen elpymistä. Spektri näyttää piikit pyruvaatti (Pyr), laktaatti (Lac) ja pyruvaatti hydraatti (Pyr H). (B) Plot laktaatin huipun integraali funktiona aika normalisoida pyruvaatti huipun integraali ajankohtana t = 0 s ja normalisoitu miljoonaa solua kohden hankittu HCT116 Bax-ko ohjaus soluissa, 24 tuntia nälkään HBSS median ja 24 tunnin nälkään jonka jälkeen 48 h elpymistä. (C) keskimääräiset suhteet (käsitelty /24 h ajoneuvo-ohjaus) on ilmeisen eteenpäin reaktionopeus pyruvaatin laktaatti vaihto k

PL (johdettu asentamisesta kokeellisten tietojen normalisoidaan solujen määrä) (± sem) varten 24 tunnin DMSO-käsiteltyjen elpyminen, 100pM PI-103 käsiteltyjen ja 48 tunnin toipuminen 100pM PI-103 hoitoa HT29; 10 uM PI-103 käsitellään, 20 uM PI-103 käsitellään ja 48 tunnin toipuminen 20 uM PI-103 käsittely HCT116 Bax-ko soluista; ja 6 tuntia HBSS nälkään, 24 h HBSS nälkään ja 24 tunnin nälkään seurasi 48 tunnin elpyminen HCT116 Bax-ko soluja. Minimi

n

= 3 kussakin ryhmässä. Tilastollisesti merkittäviä muutoksia on merkitty (* p≤0.05).

Vähentynyt k

PL havaittiin HT29 käsitelty PI-103 (82 ± 7% valvonnan; p = 0,05) ( Kuva 5c). Ei ole merkittävää eroa k

PL välillä havaittiin 24 tunnin DMSO ajoneuvon käsiteltyyn ryhmään ja 24 tunnin talteen DMSO-ajoneuvo käsitellyssä ryhmässä (kuvio 5c) in HT29 huolimatta solujen määrä ja väestön solujen G1 vaiheessa on suurempi 24 tunnin talteen DMSO: lla hoidetussa ryhmässä (kuvio 3b ja c). Siten k

PL talteenottoon ryhmissä verrattiin sen vastaavan 24 tunnin apuaineella hoidettuihin kontrolleihin. k

PL pysyi pienempi HT29 seuraavissa 48 h toipuminen PI-103 käsittelyä (74 ± 4% valvonnan; p = 0,02) verrattuna 24 tunnin DMSO-käsiteltyihin kontrolleihin (Kuva 5c).

Alennettu k

PL löytyivät HCT116 Bax-ko soluja käsiteltiin 10 uM (52,5 ± 9,4% valvonta; p = 0,05) ja 20 uM PI-103 (41,1 ± 5,3% valvonta; p 0,0001 ) verrattuna DMSO-vehikkelikontrollit (kuva 5c). Sen jälkeen 48 tunnin elpymisen näennäisen nopeusvakio oli koholla verrattuna hoitoon hinnat, mutta ei palannut 24 tunnin apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään hinnat (65 ± 7% valvonnan; p = 0,004) (kuvio 5c).