Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset todisteet linkit poikkeava aktivaatio Hedgehog (Hh) signalointia patogeneesin useita syöpiä, kuten medulloblastoma, glioblastooma, melanooma sekä haima, peräsuolen ja eturauhasen karsinoomat. Tässä olemme tutkineet rooli transkriptiotekijän Gli1 munasarjasyövän. Tätä varten, ilmaisu profiili Gli1 tutkittiin tavanomaisissa munasarjat, munasarjojen kasvaimia, ja munasarjasyövän solulinjoissa, ja

in vitro

vaikutuksia tietyn Hh-reitin salpaaja, Kaad-syklopamiini tai tietty Gli1 estäjä (GANT58) soluproliferaatioon ja Hh kohdegeenin ilmentyminen arvioitiin myös. Saadut tulokset osoittivat, että epiteelisolujen munasarjasyövän kudoksessa ilmentävät huomattavasti korkeampi ydin- Gli1 kuin normaalissa munasarjakudoksessa, jossa proteiini oli lähes huomaamaton. Lisäksi monimuuttuja-analyysi osoitti, että ydinvoiman Gli1 oli itsenäisesti liittyy huono selviytyminen pitkälle serous munasarjasyöpää sairastavilla potilailla (HR = 2,2, 95% CI 1,0-5,1, p = 0,04).

In vitro

kokeet osoittivat, Gli1 ilmentymistä kolmessa munasarjasyöpäsolulinjoihin testattu, A2780, SKOV-3 ja OVCAR-3. Huomattavasti, vaikka Kaad-syklopamiinilla vähensivät solujen proliferaatiota, tämä hoito ei estänyt hedgehog kohdegeenin ilmentymisen tahansa kolmesta munasarjasyövän solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että soluproliferaation inhibointi oli epäspesifistä tai myrkyllisiä vaikutuksia. Mukaisesti nämä tiedot, ei eroja soluproliferaatioon ei havaittu, kun solulinjoja käsiteltiin GANT58. Kaiken kaikkiaan meidän kliiniset tiedot tukevat rooli Gli1 ennustetyövälineenä merkki pitkälle serous munasarjasyövän ja mahdollisena terapeuttisena kohteena tässä sairaudessa. Kuitenkin meidän

in vitro

havainnot kiinnittää huomiota tarpeeseen sopivien kokeellisissa malleissa että oikea kuva ihmisen kasvaimen testaamiseen tulevaisuuden hoitoihin liittyy Hh-reitin estäjiä.

Citation: CIUCCI A, De Stefano I, Vellone VG, Lisi L, Bottoni C, Scambia G, et ai. (2013) ilmentyminen Gliooma-Associated Oncogene Homologi 1 (Gli1) in Advanced seroosit Munasarjasyöpä liittyy epäedullinen Overall Survival. PLoS ONE 8 (3): e60145. doi: 10,1371 /journal.pone.0060145

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 07 marraskuu 2012; Hyväksytty: 22 helmikuu 2013; Julkaistu: 28 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 CIUCCI et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjan epiteelin syöpä on yksi johtavista syistä kuolemaa naisten pahanlaatuisten valtaosassa kehittyneiden maiden [1]. Todellakin, koska tämä tauti on muutama oireita aiemmissa vaiheissa sen kehittämiseen, suurin osa naisista on diagnosoitu jälkeen primaarikasvaimen on jo metastasized; vaikka ensimmäisen vastauksen kirurgisten debulking ja ensilinjan hoidon karboplatiinin ja paklitakselin, useimmat kasvaimet lopulta kehittää lääkeresistenssin ja 5 vuoden pysyvyys on yleensä alle 30% [2]. Vaikka monet on pyritty selvittämään etiologia munasarjojen syövän synnyn ja molekyylitason mekanismeja leviämisen munasarjakarsinoomasolut, tämä tauti on edelleen yksi vähemmän ymmärretty suurten ihmisen syöpäsairauksia.

Sonic Hedgehog (Shh) signaali -transduction reitti on tärkeä säätelyssä kuviointi, lisääntymistä, eloonjääntiä ja kasvua monissa soluissa ja kudoksissa, että alkio ja aikuisten. Sitovat erityskanavien Hh ligandit (Sonic, Intian tai Desert, SHH, IHH tai DHH) niiden läpäisevään reseptoriin Patched (Ptch1) aloittaa klassisen Hh-signalointireitin vapauttamalla Smoothenedin (SMO) peräisin Ptch1 riippuva tukahduttaminen. Smo moduloi sytoplasmisen kompleksi, joka sisältää kipinähäiriövaimennin Fused (Sufu), mikä aktivoi 3 gliooma liittyvää (Gli) transkription sääntelyviranomaisten. Gli1 indusoi ja Gli3 tukahduttaa Hh kohdegeenien jotka sisältävät

Gli1

,

PTCH1

,

sykliini D1

,

c-Myc

, ja

Bcl -2

, kun taas Gli2 voi toimia joko positiivinen tai negatiivinen tavalla riippuen posttranskriptionaalisella ja translaation jälkeisen käsittelyn tapahtumat [3].

Poikkeava aktivointi Hh-signaloinnin on liitetty useisiin syöpiin, mukaan lukien iho, aivot , paksusuoli, keuhkot, eturauhanen, veri ja haiman muun muassa ohjaa joko ligandin riippuvainen tai ligandista riippumattoman reitin [4], [5]. Ligandin riippuvainen Hh reitti voi olla joko autokriinisten, jossa Hh ligandin tuottaman tuumorisolujen toimia viereisen kasvainsolujen aiheuttaa solun itsenäinen reitin aktivaatio, tai siihen voi liittyä parakriinisellä mekanismilla, jossa Hh ligandin erittyy epiteelin signaloi taustalla strooman osaston luoda suotuisa microenvironment joka tukee kasvaimen kasvua. Autokriinisella signalointi nähdään Keuhkoärsytyksen ja eturauhassyöpä, kun taas tapauksessa munasarjojen ja peräsuolen syövän paracrine mekanismi näyttää vallalla [4], [5]. Vuonna ligandista riippumaton signalointi, Hh-reitin aktivoidaan solussa-luontainen tavalla läpi menettämisestä toiminnon mutaatiot negatiivinen toimiva komponentteja, kuten Ptch1 ja Sufu, tai vahvistus-of-function mutaatiot positiivinen vaikuttavien osien , kuten Smo [4]. Sitä paitsi Hh-Gli signalointi vuorovaikutuksessa muiden signalointireittejä kaksisuuntaisessa ja asiayhteyskohtaisia ​​tavoilla, ja useat tekijät osoittavat, että kontekstisidonnaisia ​​sääntely Gli koodin onkogeenien ja tuumorisuppressoreita muodostaa perustan laajaa osallistumista Gli1 ihmisen syövissä, tämä proteiini tukevat kasvaimen etenemiseen ja metastasoituneen siirtyminen [6], [7]. Yllättävää kyllä, munasarjasyövän, Hh-reitin voi myös vuorovaikutuksessa estrogeenin signaloinnin monimutkaisen verkoston moduloimalla fenotyyppiset plastisuus [8].

Tässä tutkimuksessa pyrittiin määrittämään, onko Hh-reitin aktivoituu munasarjojen syöpä. Tätä varten meidän on ensin tutkittu immunohistokemiallisesti ilmentymistä Gli1 proteiinin normaalin munasarjan pintaepiteelissä ja kehittyneissä serous munasarja- syöpiä ja korreloi sen ilmaisutapoja kliinis parametrien ja hoitotuloksia. Seuraavaksi tutkittiin ekspressiota Gli1 munasarjasyövän solulinjoissa, ja

in vitro

vaikutuksia tietyn hedghehog reitin salpaaja, Kaad-syklopamiini [9], [10], tai tietyn Gli1 estäjä, GANT58 [ ,,,0],11], soluproliferaatioon ja siili kohdegeenin ilmentymisen. Gli1 on todella pidetään lopullisena, ja näin ollen ratkaisevia transkriptionaalisen aktivaattorin Hh-reitin; sen transkription indusoi Hh signalointi, joten se toistaiseksi paras luotettava markkeri aktiivisen reitin, johdonmukaisesti transkriptoidaan Hh-vasteen tuottavien solujen [7]. Lisäksi Gli1 on pidetty sopiva kohde syövän hoidossa, koska se on alavirtaan useista signalointireittien [12].

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä tutkimus on saatu hyväksynnän eettisen komitean katolisen yliopiston Sacred Heart, Rooma, Italia ja potilaat kirjallisen suostumuksensa kudosten keräys ja analysointi.

potilaat

tutkimuksessa oli mukana 56 potilasta, joilla on edennyt vakavien munasarjasyöpä myönsi Gynecologic Oncology Unit, Catholic University of Rome, välillä maaliskuussa 2000 ja joulukuussa 2008. makroskooppisesti ja histopatologisesti normaalin munasarjat, poistetaan ennaltaehkäisevään syistä, saatiin myös 12 postmenopausaalisilla naisilla. Kliinis ominaisuudet yleisen sarjan esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Mukaan vakiosuuntaviivat, maksimaalinen kirurginen vaivaa yritettiin kaikilla potilailla tuloksena täydellinen resektio (jäljellä kasvain 0 mm) 35 (63%) tapauksista. Kaikki potilaat saivat platinapohjaisen kemoterapian (75-100 mg /m

2 Sisplatiiniannos, AUC = 5 Karboplatiinin, kierrosta kohden). Viisikymmentä potilasta (89,3%) sai paklitakselia (135-175 mg /m

2 kullekin syklille). Toistuminen tauti määriteltiin mukaan gÇig CA125 kriteerien [13], [14] ja /tai radiologisten vahvistus syövän etenemisen. Määrittelemään kemosensitiivisyys käytimme yhteistä määritelmää platinaa vastarintaa, jossa määritellään ”aroiksi” potilaat että uusiutuneen vähintään 6 kuukautta sen jälkeen, kun aiempi platinaa sisältäviä kemoterapia, ja kuten ”kestävä” potilaat että uusiutuneen alle 6 kuukauden kuluttua kemoterapian lopetettiin, tai että eteni hoidon aikana [15]. Seuranta oli saatavilla kaikki 56 potilasta (mediaani seuranta-, 35 kuukautta alue, 9-127kuukausi). Aikana seuranta-aikana, eteneminen ja kuolema taudin havaittiin 42 ja 23 potilasta, vastaavasti.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, antigeeni hakuproseduuri suoritettiin mikroaaltouuni kuumentamalla sitraattipuskurissa (pH = 6). Leikkeitä inkuboitiin 20% normaalin vuohen seerumin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Solut, jotka ilmentävät Gli1 (klooni H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, laimennus 1:50), tunnistettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu yli yön 4 ° C: ssa. Vasta-aine, jota käytetään esillä olevassa tutkimuksessa testattiin spesifisyys kuten aiemmin on kuvattu [17] – [20]. Leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen (vuohen anti-kani) 30 min, huoneenlämpötilassa. Lasit kehitettiin diaminobentsidiinillä (DAB alustan System, DakoCytomation), vastavärjättiin Mayerin hema-, dehydratoidaan etanolin ja ksyleenin, ja lopulta asennettu. Tyvisolusyöpä käytettiin positiivisena kontrollina. Värjäys ilman primaarista vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina.

arviointi immunohistokemiallinen värjäys

Expression arvioitiin ottaen huomioon solujen prosenttiosuus, joilla immunoreaktion on vähintään 500 histologisesti tunnistaa kasvainsoluja. Gli1 värjäytyminen havaittiin sekä sytoplasmassa ja tumassa on munasarjakarsinoomasolut. Koska Gli1 on transkriptiotekijä, vain ydin- Gli1 ilmentymistä teki myöhempää tietoanalyysit ja korrelaatio tutkimuksia. Immunovärjäys arvioitiin kaksi riippumatonta tarkkailijaa (GFZ ja VGV), jotka olivat tietoisia potilaan diagnoosin. Voit määrittää raja-arvon Gli1 vertasimme ydinvoiman immunoreaktiivisuus mitattiin normaaleissa verrattuna tuumorikudoksissa. Immunoreaktiivisuus oli poissa epiteelisoluissa kaikki paitsi yksi normaali munasarjat, jossa on yksi näyte osoittaa heikkoa värjäytymistä reaktion noin 10%: ssa soluista. Tuumorisektioiden jossa 10% soluista oli värjäytynyt oli siis pitävät positiivinen.

Cell Culture

munasarjasyöpäsolulinjoihin A2780, SKOV-3 ja OVCAR-3 ostettiin European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK). OVCAR-3 ja A2780-soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Lonza, Basel, Sveitsi), SKOV-3 kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (Lonza). Elatusaine, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Lonza), 2 mM glutamiinia ja antibiootteja (100 mg /ml streptomysiiniä ja 100 IU /ml penisilliiniä) (Lonza). Kaikkia viljelmiä säilytettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO2 ja 95% ilmaa.

Immunosytokemia

Solut (2,0-4,0 x 10

4 solua /kuoppa) päällystetty kahteen-kaivokammio slide (Nunc® Lab-Tek® II Chamber Slide, Nunc, Inc., Naperville, IL). Soluja viljeltiin 24 tuntia, ja käytetään immunovärjäys. Objektilasit pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja permeabilisoitiin 0,5% Triton X-100. Endogeeninen peroksidaasi blokattiin 3% H

2O

2 5 minuuttia. Kun oli pesty kahdesti PBS: llä, soluja inkuboitiin blokkausliuosta, joka sisälsi 20% normaalia hevosen seerumia PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ylimääräinen esto Liuos valutettiin pois, ja näytteitä inkuboitiin 1:50 anti-Gli1-vasta-ainetta (klooni H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology), yön yli 4 ° C: ssa kostutetussa kammiossa. Sitten näytteet huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen, EnVision System-HRP: tä (Dako, Carpinteria, CA), 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Immunoreaktiivisuuden havaittiin käyttäen 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia alustan (DAB alustan System, Dako). Objektilasit vastavärjättiin Mayerin hema-, dehydratoidaan etanolin ja ksyleenin, ja lopulta asennettu.

proliferaatiotestillä

A2780 (3,0 x 10

4 kaivoa kohden), OVCAR-3 (2,0 × 10

4 kuoppaa kohden) ja Skov-3 (2,0 x 10

4 kuoppaa kohti) solua ympättiin 24-kuoppalevyille täydellisessä viljelyalustassa. Yön yli inkuboinnin jälkeen, väliaine vaihdettiin 2% FBS: ää, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia Kaad-syklopamiinin (Santa Cruz Biotechnology), tai GANT58 (Calbiochem, San Diego, CA). Aineet liuotettiin absoluuttiseen DMSO: hon ja laimennettiin sopivassa kasvualustassa välittömästi ennen käyttöä. Kontrollisolut saivat saman määrän DMSO laimennusaineen. 48 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut otettiin talteen trypsinoimalla ja elävät solut laskettiin käyttämällä Nucleocounter (ChemoMetec, Allerod, Tanska). Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa kahtena kappaleena.

MTT-määritys

Kaikki munasarjasyövän solulinjoissa ympättiin (4,0 x 10

3 per kuoppa) 96-kuoppaisille levyille täydelliseen elatusaineesta. Yön yli inkuboinnin jälkeen, väliaine vaihdettiin 2% FBS: ää, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia Kaad-syklopamiinin (Santa Cruz Biotechnology) tai GANT58 (Calbiochem). Sytotoksisuus määritettiin kvantitatiivisesti mittaamalla väheneminen MTT (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5- difenyylitetratsoliumbromidia, tetratsoli) tuottamiseksi tumman sininen formatsaani. MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan 48 h kuluttua alusta loukkaus. 3 tunnin kuluttua inkuboinnin Liuottaminen /Stop Liuos lisättiin viljelykuoppiin liuottamaan formatsaani, ja absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin käyttäen 96-kuoppaisen levyn lukijaa (Victor 1420, Wallac, Perkin Elmer). Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa kahtena kappaleena.

Western blot -analyysi

Koko-solu-uutteet valmistettiin hajotuksen jälkeen puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,2 M NaCl: a, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 10% glyserolia, johon oli lisätty fosfaattia ja proteaasi-inhibiittoreita. Yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug /näyte) erotettiin SDS-gradientilla polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (4-20%) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), siirrettiin PVDF-kalvoille (Immobilon-P siirto kalvo, Millipore, Billerica, MA). Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 5% (w /v) rasvatonta kuivamaitoa Tris puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (TBST), ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (Gli1: H300, Santa Cruz Biotechnology, p-aktiini: A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) TBST 3% rasvatonta maitojauhetta, 4 ° C: ssa yön yli. Kun oli pesty kolme kertaa TBST-liuoksella, kalvot leimattiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunti huoneen lämpötilassa. Spesifiset proteiinit visualisoitiin ECL Western blotting mukainen valmistajan ohjeiden (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). β-aktiini Western blot -analyysi suoritettiin kontrollina yhtä näyte lastaus.

mRNA Analysis in Real Time PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Yhteensä RNA: n eristys NucleoSpin RNA II (Macherey- Nagel GmbH hehkutus ja pidennys 60 ° C: ssa 20 s; käyttämällä Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, USA). PCR-reaktiot suoritettiin 20 ul: n reaktiotilavuudessa on MX3000P reaaliajassa PCR kone (Stratagene). PCR-alukkeet spesifisten transkriptien olivat seuraavat: Gli1, 5′-GCCAGCCAAGAGAGACCAACAG-3 ’ja 5′-CCGACAGAGGTGAGATGGACAG-3′; β-aktiini 5’-ACG TTG CTA TCC AGG CTG TCC AT-3 ’ja 5′-TTA ATG TCA CGC ACG ATT TCC CGC-3’. Suhteellinen mRNA pitoisuudet laskettiin lentoonlähdön pisteen reaktioita (kynnys sykli, Ct) käyttäen vertailevaa kvantifiointimenetelmä suorittaa Stratagene ohjelmistojen ja perustuvat -ΔΔCt menetelmällä. Tämä analyysi suunnilleen tietyn näytteen kohde-mRNA (Gli1) taso suhteessa keskiarvoon kohde-mRNA tasot käsittelemättömien kontrollien ( ”kalibraattori” arvo), mikä mahdollistaa tilastollisen analyysin poikkeama keskiarvosta jopa kesken valvontaa. Ct-arvot β-aktiinin ilmaisu toimi normalisoi signaalin. Kussakin määrityksessä PCR: n tehokkuus laskettiin myös käyttäen sarjalaimennosta yhden kokeellisen näyte; hyötysuhdearvoja välillä 80 ja 100% havaittiin kunkin alukesarjan ja otetaan huomioon vertailevaa kvantitoimiseksi analyysia.

Tilastollinen analyysi

ilmentyminen Gli1 ja sen yhdistyksen kliinis parametreja arvioitiin käyttämällä Mann-Whitney epäparametrisia testi. Tautivapaa elossaolo ja kokonaiselossaoloaika laskettiin alkaen diagnoosi päivämäärästä progression /kuolema, tai päivämäärän viimeksi nähty. Ennustavia vaikutus eri parametrien hoitotulokseen (eli uusiutumisen tai kuoleman tauti) testattiin piirtämällä eloonjäämiskäyrien mukaan Kaplan-Meier menetelmällä, ja vertaamalla ryhmiä käyttäen log-rank testi, sekä Monimuuttuja-analyysissä käytetty Cox mallia . Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet kertyi jona histologisten diagnoosi aikaan viime seurata tai kuolema. Vuonna yhden muuttujan analyysiin, kukin parametri luokiteltiin myöhempää tilastollista analyysiä. Vain muuttujat p-arvo ≤0.2 että yhden muuttujan analyysiin otettiin mukaan monimuuttujatestausta malliin. Saadut tulokset

in vitro

kokeissa ilmaistiin keskiarvona ± SD ja analysoitiin kaksisuuntaisella Studentin t-testiä. Eroja pidettiin merkittävinä, jos P≤0.05. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism5 Software (San Diego, CA, USA). Cox-analyysi suoritettiin käyttäen StatPlus 2009.

Tulokset

Gli1 ilmentäminen Advanced seroosit munasarjasyöpiä

Yhteensä 56 ensisijaisen kehittyneiden serous munasarja- syöpiä ja 12 normaalin munasarjan kudoksia postmenopausaalisilla naisilla arvioitiin. Gli1 immunoreaktiivisuus puuttui pintakudosta, sekä stroomasolujen, normaalin munasarjat (Fig. 1A) kaikissa muissa paitsi yhdessä tapauksessa, tämä viimeinen osoittaa heikkoa tumavärjäystä noin 10%: ssa soluista. Positiivinen ydinreaktiota havaittiin 29%: n vakavien karsinoomien (Fig. 1 B); sytoplasminen immunoreaktiivisuus havaittiin myös useimmissa yksilöitä tutkittiin. Nämä havainnot osoittavat, että Hh signaalireitin aktivoituu munasarjakarsinoomasolut tavanomaiseen verrattuna epiteelisolujen.

edustaja kuvia Gli1 immunovärjäyty- osoittaa ilmentymisen normaalissa munasarjassa epiteelin (A), ja korkea (B) tai matala (C ) ilmentyminen munasarjasyöpä kudoksissa. Tyvisolusyöpä käytettiin positiivisena kontrollina (D). Suurennus 20x ja 40x. (E) Kaplan-Meier selviytymisen käyrää todennäköisyyden tautivapaan elinajan ja (F) yleiseen eloonjäämiseen ilmaisun mukaisesti ydin- Gli1 pitkälle serous munasarjasyöpää sairastavilla potilailla. Positiivinen ( 10%) Gli1 ilmentyminen tumassa liittyy merkittävästi kokonaiselinaikaa haitta (p = 0,04).

Taulukossa 2 mediaani ydin- immunoreaktiivisuus Gli1 pitkälle serous munasarjasyöpä potilaat mukaan kliinis parametrit. Mitään korrelaatiota osoitettiin välillä ydin- Gli1 ilmaisun ja jokin parametrien tutkittiin.

ennustetekijöiden rooli Gli1 ilmaisun sekä DFS ja OS testattiin yhden ja usean analyysit oikaistu kliinis parametreja. Univariate malli DFS ei havainnut mitään yhteyttä välillä Gli1 ilmaisun ja kliinisten tulosten (taulukko 3, kuvio. 1E). Toisaalta, käyttämällä Kaplan-Meier-analyysi huomasimme, että potilailla, joilla on positiivinen Gli1 ilme ollut epäsuotuisa kokonaiselinaikaa ennusteeseen; mediaani kokonaiselinaika tässä potilasryhmässä oli 35 kuukautta, kun taas se pysyi määrittelemätön negatiivisten-Gli1 potilaille, sillä yli 50% heistä olivat vielä elossa ajankohtana analyysi (P = 0,04) (taulukko 4, kuvio 1 F). Erityisesti monimuuttujakalibrointiin mallissa Gli1 ydin- ilmaisu säilytti itsenäisen negatiivinen ennustetekijöitä rooli OS (p = 0,04, taulukko 4).

Klassinen ennustettaessa Advanced seroosit munasarjasyöpiä

ennustetekijöiden rooli ikä diagnoosin, histologinen luokka, jäljellä kasvain, ja kemosensitiivisyys sekä DFS ja OS testattiin yhden ja usean analyysit (taulukot 3 ja 4). Läsnäolo jäljellä kasvain on ensisijainen leikkauksen ( 0 mm) [21] ja platina-vastuksen havaittiin olevan yhteydessä suurempi riski taudin uusiutumisesta, sekä yhden muuttujan (p = 0,003 ja p 0,0001, vastaavasti) ja monimuuttuja analyysit (p = 0,003 ja p 0,0001, vastaavasti). Platina-resistenssi todettiin myös olevan epäedullinen riippumaton ennustetekijöitä muuttuja OS (p = 0,002).

Gli1 on ilmoitettuna munasarjakarsinoomasolut

Tutkiakseen otaksuttu rooli Gli1 munasarjasyövän , ensin määritellään proteiinin taso kolmessa ihmisen munasarjasyöpäsolulinjoihin A2780, SKOV-3 ja OVCAR-3. Immunosytokemiallinen analyysi osoitti Gli1 tumavärjäystä kolmessa solulinjoissa (Fig. 2A). Proteiinin ilmentyminen oli seuraava vahvistettiin Western blot -analyysillä käyttämällä kaupallista vasta-ainetta vastaan, aminohappoja 781-1080 ja Gli1 ihmisestä peräisin (kuvio 2A). Vasta-aine tunnustettu eri muotoja, jotka olivat lähes näkyvissä kaikissa solulinjoissa: 130 kDa isoformin todennäköisesti toimii aktivaattorina, heikko repressori 100 kD [22], ja lisäksi 70 kd: n vyöhyke ei vielä tunnistettu, mutta myös raportoitu pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma solu viljelmät [23].

(A) Kolme ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa, A2780, SKOV-3 ja OVCAR-3 saatettiin immunovärjäys vasta-aineen Gli1. Kaikki kolme solulinjat ilmentävät Gli1. Proteiinin ilmentyminen vahvistettiin myös Western blot -analyysillä. p-Actin käytettiin latauskontrollina. (B) Soluja viljeltiin 2% FBS: ia ja käsiteltiin 2, 5 ja 10 uM Kaad-syklopamiini (K) tai GANT58 48 tuntia. Kaad-syklopamiinihoidon inhiboi soluproliferaatiota kaikissa kolmessa solulinjojen taas GANT58 ei vaikuta solujen kasvua. On esitetty solujen määrä ilmaistaan ​​prosenttiosuutena DMSO-käsiteltyjen solujen (keskiarvo ± SD kolmesta eri kokeissa; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, t-testi). (C) Gli1 mRNA: n ekspressio arvioitiin Q-PCR-analyysi munasarjasyöpäsoluja käsiteltiin 10 uM Kaad-syklopamiinilla 48 tuntia. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen muutos vs. kulloisenkin ohjaus (CTRL), otetaan kalibraattorimatriiseina vertailevaa kvantitoimiseksi analyysi mRNA. Kukin näyte mitattiin kolmena kappaleena, koe toistettiin 2 kertaa samankaltaisilla tuloksilla. Grafiikka näyttää keskiarvo ± SD.

Hoito Kaad-syklopamiinilla Antimikrobiainetta soluproliferaatiota munasarjakarsinoomat Cells

Jotta voidaan tutkia, jos aktivoitu Hh-reitin on tärkeää leviämisen munasarja- solut, A2780, SKOV-3 ja OVCAR-3 altistettiin konsentraation kasvaessa Kaad-syklopamiinin, yhdiste, joka kykenee estämään sekä Hh ligandista riippuvan ja riippumattoman reitin aktivointi, suoran vuorovaikutuksen välityksellä Smo. Suora laskenta elävien solujen osoitti, että Kaad-syklopamiinia indusoi annoksesta riippuvan vähentäminen munasarjojen kasvainsolujen proliferaatiota (kuvio 2B). Solujen elinkelpoisuuden arviointi MTT: llä vahvistettiin inhiboivan vaikutuksen Kaad-syklopamiinin A2780 solujen kasvua, kun taas mitään inhibitorista vaikutusta havaittiin SKOV-3 ja OVCAR-3-soluissa (kuvio. S1). Yli- tai aliarviointiin MTT tuloksia, jos verrataan solujen määrä tuloksia on jo raportoitu useat Tekijät, suuret osatekijöitä tähän ristiriita edustaa erot solukoko, solun muotoon, solujen kasvuun (cluster tai yksikerroksisen) tai mitokondrioiden toimintaa [24] – [26].

vaikutus Kaad-syklopamiinin Hh Signaling

Sen varmistamiseksi, että vähennys soluproliferaation

in vitro

by Kaad-syklopamiini johtui spesifinen esto Hh-reitin, olemme analysoineet muutos mRNA: ta ja proteiinia Gli1 tasoilla lääkkeellä käsiteltyihin munasarjasyöpäsolulinjoihin. Q-PCR-analyysi osoitti, että hoito A2780, SKOV-3 ja OVCAR-3 10pM Kaad-syklopamiinihoidon ei merkittävästi moduloida Gli1 tasoja 48 tunnin kuluttua altistuksen (Fig. 2C). Puute vaikutus Kaad-syklopamiinin Hh signalointi aktiivisuuden lisäksi vahvistanut immunoblottauksella (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot viittaavat siihen, että esto munasarjasyöpä leviämisen

in vitro

by Kaad-syklopamiinilla ei ole Smo-välitteisen tapahtuma.

hoito GANT58 ei estävät solujen proliferaatio munasarjakarsinoomat Cells

jotta voitaisiin vahvistaa puutteen vaikutus Hh-reitin modulaation munasarjasyövän solujen lisääntymistä, A2780, SKOV-3 ja OVCAR-3 altistettiin lisääntyvä keskittyminen GANT58, tietyn Gli1 estäjä. Saadut tulokset osoittivat, että GANT58 ei aiheuttanut vähenemistä munasarjojen kasvainsolujen proliferaatiota (Fig. 2B). Nämä tiedot vahvistettiin MTT: llä (kuvio. S1).

Keskustelu

Vaikka Hh-reitin aktivaatio on osoitettu erilaisissa maligniteetteja [5], on olemassa vain muutamia raportteja, joissa se ihmisen munasarjakarsinooma yksilöt [27] – [30], jossa on vain kaksi tutkimalla ennustetekijöiden roolia Hh-signaalin molekyylien munasarjasyöpä. Lisäksi tulokset näistä kahdesta tutkimuksesta olivat ristiriitaisia: Chen ja työtovereiden [27] todettiin, että joukossa Shh, Dhh, Ptch, Smo ja Gli1, Dhh oli ainoa tekijä liittyy selviytymisen tulokseen, kun taas Liao tutkimuksessa [29] tutkitaan ennustetekijöiden roolin Shh, Ptch, Smo ja Gli1, jälkimmäinen oli ainoa proteiini itsenäisesti liittyvät potilaiden eloonjäämisen. Tietoja ei ole saatavilla tällä hetkellä, joka voisi auttaa selittämään tätä eroa, vaikka se saattaa johtua analyysin eri väestöryhmien suhteen vaiheessa ja /tai kasvaimen histotype. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet prognostisia rooli Gli1 on homogeeninen populaation kehittyneitä vakavien munasarjasyövistä jotka osoittavat, että potilaat, joiden kasvaimet ilmentävät ydin- Gli1 värjäytymistä ( 10%), kokevat lyhyemmän OS verrattuna negatiiviseen tapauksissa (≤10%). Itsenäinen rooli Gli1 ilmaisun kuin merkki huonosta ennusteesta ylläpiti Monimuuttuja-analyysissä, säätämisen jälkeen jäljellä kasvain leikkauksen ja kemosensitiivisyys. Kaiken kaikkiaan meidän havainnot paitsi vahvistaa olettamusta, että Gli1 voi olla uusi merkittävä prognostinen markkeri munasarjasyövän, vaan myös siihen, että Gli1 ilmentäviä kasvaimia huonosti vastaamaan toisen linjan hoitoja, mikä tukee mahdollista terapeuttista hyödyllisyyttä yhdistelmiä Gli kohdistetun aine vakiohoidot munasarjasyöpää sairastavilla potilailla.

tässä yhteydessä olimme nopea tutkia jos aktivoitu Hh-reitin on tärkeää leviämisen munasarjakarsinoomasolut. Tätä varten me ensin arvioidaan immunosolukemiallisten ja immunoblot-analyysi ekspression Gli1 eri munasarjasyövän solulinjoissa, eli A2780, SKOV-3 ja OVCAR-3, nämä tutkimukset paljastavat samanlainen proteiinin ilmentymistä kaikissa 3 solulinjoissa tutkittiin. Koska syklopamiinia estää Hh signalointi sitoutumalla ja ehkäistä aktivaatio Smo [31], seuraavan kerran arvioi osuus autokriininen signaloinnin kasvaimen kasvua tutkimalla vaikutus tämän lääkkeen on

in vitro

solujen lisääntymisen. Erityisesti olemme havainneet, että vaikka tämä kasvi alkaloidi indusoi annoksesta riippuvaisen soluproliferaation inhibointi on testatuissa solu- linjoissa, mutta tämä vaikutus ei korreloi eston Hh-signaloinnin, kuten on päätelty puute Gli1 modulaatiota käsitellyissä soluviljelmissä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että soluproliferaation inhibointi ei ollut seurausta kanoninen Smo välittämän Hh-reitin estäminen, vaan epäspesifistä tai myrkyllisiä vaikutuksia. Mukaisesti nämä tiedot, ei eroja soluproliferaatioon ei havaittu, kun solulinjoja käsiteltiin GANT58, tietyn Gli1 estäjä. Huomattavaa on, että vasteen puute on SKOV-3 ja OVCAR-3-solulinjojen Hh-reitin inhibitio on yhdenmukaista aikaisempien tulosten meidän ja muiden ryhmien, käyttäen syklopamiini tai tietyn Gli1 inhibiittori [32], [33]. Lisäksi Kudo

et al

. [34] äskettäin osoittivat, että hoito anti-Gli1 shRNA ei vaikuttanut Gli1 ilmentymistä A2780 soluissa. Toisaalta, meidän

in vitro

tiedot ovat vastakohtana tutkimuksissa Liao

et al

. [29] ja Kandala ja Srivastava [35] osoittaa, että käsittelyn jälkeen syklopamiinilla, Gli1 ilmentyminen väheni SKOV-3 ja OVCAR-3 tai A2780-soluissa, vastaavasti. Syyt ristiriitaiset tulokset ovat epäselviä, lisätään toinen kerros monimutkaisuutta ponnistuksia, joiden syyksi munasarjojen kasvaimen kasvua liiallisesta Hh toimintaa. Vaikka ne voivat johtua eroista kokeellisissa järjestelmissä (esim solulinjat ovat alttiita genotyyppistä ja fenotyyppisen ajelehtia aikana jatkuva kulttuuri) ja /tai määritysmenetelmiin, on myös mahdollista, että ne saattavat itse asiassa heijastavat heterogeenisuutta autokriinisiä ja paracrine signalointia munasarjasyöpä . Tässä yhteydessä se ansaitsee huomata, että yhdessä värjäys epiteelisyöpäsolujen, myös havaittu satunnaista ydin- ilmentymistä Gli1 ympäröivällä strooman (tuloksia ei ole esitetty), tämä havainto viittaa solujen vuorovaikutus strooman ja epiteelin, jossa on mahdollista esiintyminen paracrine signalointi. Valitettavasti johtuen rajallinen strooman komponentti liittyy yleensä korkea-asteen vaurioita, emme pystyneet määrittämään laajuuden Gli1 ilmaisun kasvaimen mikroympäristössä, ja lisää tutkimuksia tarvitaan selventämiseksi roolia paracrine Hh signaloinnin munasarjasyöpä.

Itse samanlaisia ​​poikkeavuuksia kokeellisia tuloksia on myös raportoitu muissa kasvaimissa, kuten eturauhasen, haiman, ja paksusuolen [36], [37]. Yauch ja kollegat [38] tehnyt mielenkiintoinen havainto, että Smo-antagonisti-välitteistä kasvun estäminen suuri määrä syöpäsolulinjojen epiteelin alkuperää ei korreloi Hh kohdegeenin ilmentymisen näissä soluissa, mikä viittaa siihen, että a) havaittu

in vitro

kasvun tukahduttaminen saattaa johtua off-kohde vaikutuksia, kun näitä yhdisteitä käytetään suurilla pitoisuuksilla, ja b) on paracrine vaatimus Hh ligandin signalointia kasvainten synnyssä Hh ilmentävien syöpien tärkeitä vaikutuksia